CN103667464A - 鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的方法及其专用标记 - Google Patents

鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的方法及其专用标记 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的试剂盒及其方法。该试剂盒含有：a）由序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对和限制性内切酶BstNI；b）由序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对，以及由序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对；c）由序列7和序列8所示的两条单链DNA分子组成的引物对和限制性内切酶Hpy166II。利用本发明可以鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区的单元型（Hap-6B-1、Hap-6B-2、Hap-6B-3、Hap-6B-4），其中Hap-6B-1型小麦的千粒重显著高于Hap-6B-4型小麦，这在提高小麦千粒重的分子标记辅助选择和分子设计育种中意义重大。

Description

鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的方法及其专用标记
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的方法及其专用标记。
背景技术
小麦是世界上主要的粮食作物之一，小麦生产对我国粮食安全十分重要，寻找与高产相关的功能基因及其分子标记对未来小麦高产分子育种具有重要的理论意义和应用价值。小麦的产量主要由三个重要的构成因子决定：亩穗数、每穗粒数和粒重。粒重一般以千粒重表示，是小麦产量的主要构成因素之一，由粒长、粒宽和粒厚三因素协同作用，受数量性状基因控制（Ammiraju J S S,Dholakia B B,Santra D K,et al.Identification of intersimple sequence repeat(ISSR)markers associated with seed size in wheat.Theor Appl Genet,2001,102:726-732）。利用与小麦籽粒大小、粒重主效QTL紧密连锁的分子标记进行辅助选择，可以在很大程度上提高选择效率。在过去的十多年间，尽管在小麦的不同染色体上定位了许多千粒重QTLs（Ammiraju J S S,Dholakia B B,Santra D K,Singh H,Lagu MD,Tamhankar S A,Dhaliwal H S,Rao V S,Gupta V S,Ranjekar P K.Identification of intersimple sequence repeat(ISSR)markers associated with seed size in wheat.Theor Appl Genet,2001,102:726-732），但由于小麦是异源六倍体（2n=6X=42），基因组庞大（17.9×109bp）、重复序列多（>80%），在小麦中直接克隆基因难度较大、周期长。
比较基因组研究发现，禾本科作物间存在着明显的共线性关系（Gale M D,Devos K M.Comparative genetics in the grasses.Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:1971-1974）。作为禾本科作物的模式植物，水稻产量相关基因的克隆（Fan C,Xing Y,Mao H,Lu T,Han B,Xu C,Li X,Zhang Q.GS3,a major QTL for kernel length and weight and minor QTL for kernelwidth and thickness in rice,encodes a putative transmembrane protein.Theor Appl Genet,2006,112:1164-1171），为通过比较基因组学在小麦中进行产量相关基因同源克隆和功能研究奠定了基础。
单元型，也称单倍型，在遗传学上是指在同一染色体上进行共同遗传的多个基因座上等位基因的组合，或者说是一个染色单体里面具有统计学关联性倾向于以整体模式遗传给后代的一类单核苷酸多态性（SNPs）。利用单元型与表型性状进行关联分析优于单个SNP标记。目前，单元型多样性被越来越广泛地应用于群体遗传学研究，首先选择少量样本寻找和鉴定个体单元型，然后开发分子标记，在较大数量的样本中进行单元型分型，最后用所有分型样本进行单元型和表型的关联分析，希望找到具有功能的优异单元型，
从而服务于育种实践或进化等理论方面的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的方法及其专用标记。
本发明提供了一种用于鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的试剂盒。
本发明所提供的用于鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的试剂盒，为如下（A）或（B）：（A）含有如下（a）-（c）；（B）含有如下（a）；
（a）引物对1和限制性内切酶BstNI；所述引物对1为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
（b）引物对2和引物对3；所述引物对2为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述引物对3为由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
（c）引物对4和限制性内切酶Hpy166II；所述引物对4为由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
本发明所提供的用于鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的方法，具体为利用以上所述试剂盒鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型，具体可包括如下步骤：
（1）如下a1）和a2）：
a1）以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述引物对1进行PCR扩增，得到PCR产物1；再用所述限制性内切酶BstNI酶切所述PCR产物1，得到酶切产物1；
a2）根据步骤a1）所得的酶切产物1，按照如下方法确定所述待测小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型：若所得酶切产物1含有1361bp的DNA片段，则所述待测小麦具有或候选具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型，鉴定完毕；若所得酶切产物1不含有1361bp的DNA片段，则所述待测小麦不具有或候选不具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型，继续如下步骤（2）；
（2）如下b1）和b2）：
b1）以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述引物对2和所述引物对3进行PCR扩增，得到PCR产物2；
b2）根据步骤b1）所得的PCR产物2，按照如下方法确定所述待测小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型：若所得PCR产物2含有652bp的DNA片段，则所述待测小麦具有或候选具有Hap-6B-2型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型，鉴定完毕；若所得PCR产物2不含有652bp的DNA片段，则所述待测小麦不具有或候选不具有Hap-6B-2型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型，继续如下步骤（3）；
（3）如下c1）和c2）：
c1）以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述引物对4进行PCR扩增，得到PCR产物3；再用所述限制性内切酶Hpy166II酶切所述PCR产物3，得到酶切产物2；
c2）根据步骤c1）所得的酶切产物2，按照如下方法确定所述待测小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型：若所得酶切产物2含有248bp的DNA片段，则所述待测小麦具有或候选具有Hap-6B-3型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型；若所得酶切产物2含有228bp的DNA片段，则所述待测小麦具有或候选具有Hap-6B-4型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型。
本发明的另一个目的是提供一种鉴定待测小麦是否具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的方法。
本发明所提供的利用所述试剂盒鉴定待测小麦是否具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的方法，具体可包括如下步骤：
（A1）以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求3中所述引物对1进行PCR扩增，得到PCR产物1；再用限制性内切酶BstNI酶切所述PCR产物1，得到酶切产物1；
（A2）根据步骤（A1）所得的酶切产物1，按照如下方法确定所述待测小麦是否具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型：若所得酶切产物1含有1361bp的DNA片段，则所述待测小麦具有或候选具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型；若所得酶切产物1不含有1361bp的DNA片段，则所述待测小麦不具有或候选不具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型。
在上述两个方法中，采用所述引物对1进行PCR扩增的退火温度为64℃；采用所述引物对2进行PCR扩增的退火温度为61℃；采用所述引物对3进行PCR扩增的退火温度为62℃；采用所述引物对4进行PCR扩增的退火温度为63℃。
进一步，采用所述引物对1进行PCR扩增的反应程序为：94℃4min；94℃30s，64℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min；4℃保存。采用所述引物对2进行PCR扩增的反应程序为：94℃4min；94℃30s，61℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min；4℃保存。采用所述引物对3进行PCR扩增的反应程序为：94℃4min；94℃30s，62℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min；4℃保存。采用所述引物对4进行PCR扩增的反应程序为：94℃4min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
在上述两个方法中，采用各引物对进行PCR扩增时，上下游引物在反应体系中的终浓度均为0.67μM
所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述试剂盒的制备方法，具体可包括将各引物对和各限制性内切酶分别单独包装后置于同一个试剂盒中的的步骤。
以上所述试剂盒或以上两种方法在小麦育种中的应用也属于本发明的保护范围。
所述小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型在鉴定或辅助鉴定粒重高的小麦品种中的应用也属于本发明的保护范围。
所述粒重高是指具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的小麦品种的粒重高于具有Hap-6B-4型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的小麦品种的粒重。进一步，进行粒重比较的两个小麦品种需同属于地方品种或同属于育成品种。
本发明的再一个目的是提供一种培育千粒重提高的小麦品种的方法。
本发明所提供的培育千粒重提高的小麦品种的方法，具体可包括采用通过以上两种所述方法鉴定得到的如下小麦作为亲本进行育种的步骤：具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的小麦。
在本发明中，以上所有的所述小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区的核苷酸序列均具体为序列表中序列9所示。
序列表中序列9所示的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区全长2916个核苷酸，该区域共存在11个单核苷酸多态性位点（SNP），即序列9的第38位（G/A）、第76位（T/C）、第573位（A/G）、第782位（C/T）、第1095位（G/A）、第1209位（A/C）、第1523位（C/A）、第1929位（C/T）、第1989位（G/A）、第2197位（G/A）、第2835位（C/T），这些SNP位点在现有小麦品种中共形成4种单元型，即小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型有4种，具体如下：Hap-6B-1型、Hap-6B-2型、Hap-6B-3型和Hap-6B-4型。
所述Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型对应的序列9的第38位为G、第76位为T、第573位为A、第782位为C、第1095位为G、第1209位为A、第1523位为C、第1929位为C、第1989位为G、第2197位为G、第2835位为C。所述Hap-6B-2型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型对应的序列9的第38位为A、第76位为C、第573位为G、第782位为T、第1095位为A、第1209位为C、第1523位为A、第1929位为T、第1989位为G、第2197位为G、第2835位为C。所述Hap-6B-3型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型对应的序列9的第38位为G、第76位为C、第573位为A、第782位为T、第1095位为G、第1209位为C、第1523位为C、第1929位为C、第1989位为A、第2197位为G、第2835位为T。所述Hap-6B-4型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型对应的序列9的第38位为G、第76位为C、第573位为A、第782位为T、第1095位为G、第1209位为C、第1523位为C、第1929位为C、第1989位为A、第2197位为A、第2835位为T。
序列表中序列9所示的DNA分子也属于本发明的保护范围。
本发明得到了小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区序列（序列9），并该序列在不同品种小麦中发现了11个SNP位点，这11个SNP位点紧密连锁，呈现4个单元型（Hap-6B-1、Hap-6B-2、Hap-6B-3、Hap-6B-4）。将单元型和千粒重性状进行关联分析，发现无论是在地方品种中还是在育成品种中，具有Hap-6B-1单元型的小麦品种的千粒重显著高于Hap-6B-4单元型的小麦品种。本发明在提高小麦千粒重的分子标记辅助选择和分子设计育种中具有较好的应用前景。
附图说明
图1为TaGW2-6启动子区11个SNP形成的四种单元型（haplotype，Hap-6B-1、Hap-6B-2、Hap-6B-3、Hap-6B-4），方框表示三个分子标记TaGW2-6B-CAPS、TaGW2-6B-dCAPS、TaGW2-6B-ACAS引物设计的位置，分别为序列9的第1209位、第2197位和第2835位。
图2为TaGW2-6B启动子区TaGW2-6B-CAPS标记的琼脂糖凝胶检测。其中，泳道M为DNA分子量标准；泳道1-6为Hap-6B-1型，仅扩增1361bp谱带；泳道7-16为Hap-6B-2/3/4型，同时扩增约900bp和约460bp两条谱带。
图3为TaGW2-6B启动子区TaGW2-6B-ACAS标记的琼脂糖凝胶检测。其中，泳道M为DNA分子量标准；泳道1-6为Hap-6B-2型，扩增片段为652bp；泳道7-12为Hap-6B-3/4型，扩增片段为467bp。
图4为TaGW2-6B启动子区TaGW2-6B-dCAPS标记的非变性聚丙烯酰胺凝胶检测。其中，泳道M为DNA分子量标准；泳道1-12为Hap-6B-3型，酶切片段为248bp；泳道13-18为Hap-6B-4型，酶切片段为228bp。
图5为TaGW2-6B启动子区四种单元型在我国小麦十个生态区的地理分布。a：151份地方品种，b：320份育成品种；I：北部冬麦区；II：黄淮冬麦区；III：长江中下游冬麦区；IV：西南冬麦区；V：华南冬麦区；VI：东北春麦区；VII：北部春麦区；VIII：西北春麦区；IX：青藏春冬麦区；X：新疆冬春麦区。
图6为TaGW2-6B启动子区四种单元型在我国151份小麦地方品种和320份育成品种，以及320份育成品种不同育成年代的分布。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中的小麦品种均获自中国作物种质信息网，表1、表2和表4中的编号为网内编号。网址：http://www.cgris.net/zhongzhidinggou/index.php。
实施例1、小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区核苷酸序列的获得
根据已知的TaGW2-6A启动子序列，设计引物pF147和pR1481，在小麦品种中国春的基因组DNA中扩增出TaGW2-6B启动子区约1.5kb的核苷酸序列。
pF147：5’-CGTTACCTCTGGTTTGGGTGTCGTG-3’；
pR1781：5’-GCGGCACTCTACGGCAGAACAAAT-3’。
PCR反应体系为15μl，包括基因组DNA80ng，上下游引物各3pmol，dNTP120μM，LA Taq0.75U，2×GC Buffer7.5μl（TaKaRa公司，产品目录号：DRR20AG），补ddH2O至15μl。
反应程序：95℃预变性4min；95℃变性30s，退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃终延伸10min；4℃保存。
PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳后挖胶回收。用百泰克时代公司的凝胶回收试剂盒进行纯化。选用全式金公司连接试剂盒连接转化，载体为pEASY-T1，感受态细胞为大肠杆菌TOP10。采用碱裂解法提取经筛选得到的阳性克隆质粒DNA，用BigDye Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit（ABI）进行测序PCR反应，测序使用ABI3730XL DNA分析仪。采用DNAstar中的SeqMan进行序列组装、拼接和比对分析。为保证序列的准确性，PCR反应和DNA测序至少重复三次以上。
为了获得更长的TaGW2-6B启动子序列，参照Genome Walking Kit（TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.Ltd,Product Code No.6108）的方法进行延伸。本试剂盒主要根据已知基因组DNA序列，利用兼并引物与特异性引物之间退火温度的差异进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应即可获取已知序列的侧翼序列。根据已获得的启动子序列设计了三个特异性引物TaGW2-SP1、TaGW2-SP2和TaGW2-SP3（序列见下文），设计方向为待扩增的未知区域，TaGW2-SP2的位置设计在TaGW2-SP1的内侧，TaGW2-SP3位于TaGW2-SP2的内侧。每两个引物之间的距离为60～100bp。
TaGW2-SP1：5’-GGGTCCAGGGGCTTTACAAATGAC-3’；
TaGW2-SP2：5’-CCATTGCTGGAGGAACTAGACAAAC-3’；
TaGW2-SP3：5’-GCATCAAGGGGATGAGCAACATAGG-3’。
三次PCR反应体系均为25μl：模板80ng，dNTP Mixture（2.5mM）4μl，10×LA PCRBuffer II（Mg2+plus）2.5μl，TaKaRa LA Taq（5U/μl）0.25μl，AP Primer（100pmol/μl）0.5μl，SP Primer（10pmol/μl）0.5μl，补ddH2O至25μl。
三次PCR反应程序分别为：
第一次PCR反应：取中国春DNA作为模板，以AP Primer（四种中的任意一种）作为上游引物，TaGW2-SP1为下游引物，进行第一次PCR反应。反应程序为：94℃1min，98℃1min；94℃30s，62℃1min，72℃2min，5个循环；94℃30s，25℃3min，72℃2min；94℃30s，62℃1min，72℃2min，94℃30s，62℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，15个循环；72℃10min，4℃保存。
第二次PCR反应：将第一次PCR反应液稀释100倍后，取1μl作为第二次PCR反应的模板，以AP Primer为上游引物，TaGW2-SP2为下游引物，进行第二次PCR反应。反应程序为：94℃30s，63℃1min，72℃2min，94℃30s，63℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，15个循环；72℃10min，4℃保存。
第三次PCR反应：将第二次PCR反应液稀释100倍后，取1μl作为第三次PCR反应的模板，以AP Primer为上游引物，TaGW2-SP3为下游引物，进行第三次PCR反应。反应程序和第二次PCR反应相同。
取三次PCR的全部反应产物，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。切胶回收清晰的电泳条带，以TaGW2-SP3为引物对PCR产物进行测序分析。一次染色体步移可以获得约700bp序列，以此序列为参照，继续扩增得到更长的序列。通过这种染色体步移的方法，共扩增TaGW2-6B启动子区约2.9Kb的序列，具体如序列表中序列9所示，其中第38位为G、第76位为C、第573位为A、第782位为T、第1095位为G、第1209位为C、第1523位为C、第1929位为C、第1989位为A、第2197位为G、第2835位为T。
进一步，本发明的发明人根据序列9设计了如下引物对（引物1和引物2），对小麦品种中国春的TaGW2-6B启动子区约2.9Kb的序列进行PCR扩增，并对PCR产物进行测序。结果显示，所得PCR产物的序列正如序列表中序列9所示，其中第38位为G、第76位为C、第573位为A、第782位为T、第1095位为G、第1209位为C、第1523位为C、第1929位为C、第1989位为A、第2197位为G、第2835位为T。
引物1：5’-TAGGAGTATCAAACGGACTCCAAAT-3’（序列表中序列9的第1-25位）；
引物2：5’-CCCTCCCAGATCTAGCCTCCT-3’（序列表中序列9的第2896-2916位的反向互补序列）。
实施例2、不同小麦品种粒重基因TaGW2-6B启动子区多态性位点发掘及标记开发
一、TaGW2-6B启动子区多态性位点发掘
选取34份粒宽、千粒重差异较大的材料，包括22份育成品种和12份地方品种（表1），以小麦基因组DNA为模板，用引物1和引物2进行PCR扩增，扩增产物送样测序。对这些材料测序时，首先参考实施例1获得的小麦品种中国春的TaGW2-6B启动子区序列信息，设计了3对引物对这个区域进行测序。其中，TaGW2-BF1140/BR80扩增片段长度为约1.1Kb，TaGW2-BF29/BR1389扩增片段长度约为1.4Kb，TaGW2-BF2978/BR2045扩增片段长度约为900bp。
TaGW2-BF1140：5’-GTGGTGAACATAGCAAATTGATTACAT-3’（序列9的第1749-1775位）；
TaGW2-BR80：5’-TTGCGTAGCTTCTTCTGGTCGATAT-3’。
TaGW2-BF29：5’-GACTCCTCCTCGTCACCCATAAAGT-3’（序列9的第741-764位）；
TaGW2-BR1389：5’-ATAGCACCAGCCCTTTCTCTTC-3’（序列9的第2080-2101位的反向互补序列）。
TaGW2-BF2978：5’-ACTTTGGAGGGATGTTGGGCTAC-3’；
TaGW2-BR2045：5’-AGCCGAGGAAAACCGGTACAG-3’（序列9的第651-671位的反向互补序列）。
测序获得34份材料TaGW2-6B启动子序列，应用DNAstar软件（详见如下网址：http://www.dnastar.com/）进行序列比对，寻找不同材料间的序列差异。序列比对发现在34份小麦材料的TaGW2-6B基因起始密码子上游～2.9kb区域（序列9）存在11个单核苷酸多态性位点（SNP），这些SNP位点在现有小麦品种中紧密连锁出现，共形成4种单元型，分别命名为Hap-6B-1、Hap-6B-2、Hap-6B-3和Hap-6B-4（图1）。其中，Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型对应的序列9的第38位为G、第76位为T、第573位为A、第782位为C、第1095位为G、第1209位为A、第1523位为C、第1929位为C、第1989位为G、第2197位为G、第2835位为C（表1中序号为1、3、5、10、12、17、18、20、21）；Hap-6B-2型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型对应的序列9的第38位为A、第76位为C、第573位为G、第782位为T、第1095位为A、第1209位为C、第1523位为A、第1929位为T、第1989位为G、第2197位为G、第2835位为C（表1中序号为4、7、8、9、11、13、14、15、16、19、22、25、27、28、29）；Hap-6B-3型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型对应的序列9的第38位为G、第76位为C、第573位为A、第782位为T、第1095位为G、第1209位为C、第1523位为C、第1929位为C、第1989位为A、第2197位为G、第2835位为T（表1中序号为2、24、31、32）；Hap-6B-4型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型对应的序列9的第38位为G、第76位为C、第573位为A、第782位为T、第1095位为G、第1209位为C、第1523位为C、第1929位为C、第1989位为A、第2197位为A、第2835位为T（表1中序号为6、23、26、30、33、34）。
表134份所用的小麦材料及其TaGW2-6B启动子区单元型
序号 小麦品种 编号 原始来源 单元型
1 北京8号 ZM008963 北京 Hap-6B-1
2 北京15 ZM008970 北京 Hap-6B-3
3 农大139 ZM009018 北京 Hap-6B-1
4 石家庄54 ZM009101 河北 Hap-6B-2
5 晋麦8号 ZM009368 山西 Hap-6B-1
6 铭贤169 ZM009379 山西 Hap-6B-4
7 矮丰3号 ZM009603 陕西 Hap-6B-2
8 泾阳60 ZM009648 陕西 Hap-6B-2
9 冀麦19 ZM013873 河北 Hap-6B-2
10 吕旱328 ZM014050 山西 Hap-6B-1
11 晋麦11 ZM014430 山西 Hap-6B-2
12 烟农15 ZM015719 山东 Hap-6B-1
13 鲁麦1号 ZM015830 山东 Hap-6B-2
14 鲁麦9号 ZM015838 山东 Hap-6B-2
15 徐州22 ZM022308 江苏 Hap-6B-2
16 莱州953 ZM022727 山东 Hap-6B-2
17 攀86001-3 ZM024490 贵州 Hap-6B-1
18 兰考906 ZM025358 河南 Hap-6B-1
19 万年4号 编号不详 江苏 Hap-6B-2
20 温麦8号 编号不详 河南 Hap-6B-1
21 郑麦9023 编号不详 河南 Hap-6B-1
22 中优9507 编号不详 北京 Hap-6B-2
23 麻花板 ZM004422 吉林地方品种 Hap-6B-4
24 中国春 ZM005452 四川地方品种 Hap-6B-3
25 三月黄 ZM002685 河南温县（农家品种） Hap-6B-2
26 江西早 ZM003464 河南商城（农家品种） Hap-6B-4
27 抢场麦 ZM003793 陕西长安（农家品种） Hap-6B-2
28 兰花麦 ZM005017 甘肃泾川（农家品种） Hap-6B-2
29 红冬麦 ZM005188 新疆塔城（农家品种） Hap-6B-2
30 白冬麦 ZM005439 新疆奇台（农家品种） Hap-6B-4
31 白麦子 ZM008547 四川德阳（农家品种） Hap-6B-3
32 白花麦 ZM008598 贵州兴义（农家品种） Hap-6B-3
33 白芒麦 ZM008732 贵州锦屏（农家品种） Hap-6B-4
34 红金麦 ZM020735 甘肃平凉（农家品种） Hap-6B-4
二、TaGW2-6B启动子区标记开发
根据TaGW2-6B启动子区序列（序列9）的第1209位（A/C）、第2835位（C/T）和第2197位（G/A）的SNP位点，开发一套可以有效区分全部4种单元型的分子标记，分别命名为TaGW2-6B-CAPS、TaGW2-6B-ACAS和TaGW2-6B-dCAPS。
1、TaGW2-6B-CAPS标记
在TaGW2-6B启动子区序列（序列9）的11个SNP中，第1209位（A/C）存在一个BstNI内切酶（CCWGG）酶切位点。根据这个位点开发了一个CAPS（Cleaved AmplificationPolymorphic Site）标记，即为TaGW2-6B-CAPS。
TaGW2-6B-CAPS-F：5’-GACTCCTCCTCGTCACCCATAAAGT-3’（序列1）（序列9的第741-764位）；
TaGW2-6B-CAPS-R：5’-ATAGCACCAGCCCTTTCTCTTC-3’（序列2）（序列9的第2080-2101位的反向互补序列）。
PCR反应体系：10×PCR Buffer1.5μl，Mg2+1.2μl，dNTP(25mM)0.15μl，Taq(5U/μl)0.16μl，TaGW2-6B-CAPS-F(10μM)1μl，TaGW2-6B-CAPS-R(10μM)1μl，小麦基因组DNA(30ng/μl)2μl，ddH2O补足至15μl。
PCR反应程序：94℃4min；94℃30s，64℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
酶切反应体系：PCR反应产物5μl，10×buffer1μl，BSA0.1μl，限制性内切酶BstNI0.25μl，ddH2O补足至10μl。
TaGW2-6B-CAPS标记PCR扩增后产物片段长度为1361bp，经内切酶BstNI（NewEngland Biolabs公司）65℃消化30min后，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪检测不同品种间的差异。
理论上，TaGW2-6B-CAPS标记可有效区分Hap-6B-1和其他三种单元型（Hap-6B-2/3/4），Hap-6B-1（无BstNI酶切位点）仅有一条1361bp的谱带，其他三种单元型（有BstNI酶切位点）同时呈现约900bp和约460bp的两条谱带。
经验证，表1中经对TaGW2-6B启动子区测序证实具有Hap-6B-1型的TaGW2-6B启动子区单元型的小麦品种，经上述PCR扩增及BstNI酶切，所得PCR产物均为一条1361bp的谱带；而表1中经对TaGW2-6B启动子区测序证实具有Hap-6B-2型、Hap-6B-3型和Hap-6B-4型的TaGW2-6B启动子区单元型的小麦品种，经上述PCR扩增及BstNI酶切，所得PCR产物均同时呈现约900bp和约460bp的两条谱带（部分小麦品种的鉴定结果如图2所示）。证实了以上方法的可行性。
2、TaGW2-6B-ACAS标记
根据TaGW2-6B启动子区序列（序列9）的第2835位（C/T）的SNP位点设计了ACAS（Agarose gel-based Co-dominant Allele-Specific）PCR引物（如下引物对TaGW2-6B-ACAS-1和TaGW2-6B-ACAS-2），即为TaGW2-6B-ACAS。设计位点特异引物时，在3’末端引入一个人工突变位点，从而使TaGW2-6B-ACAS可以有效区分Hap-6B-2型和其他两种单元型（Hap-6B-3/4）。
TaGW2-6B-ACAS-1-F：5’-GTAGGGATCACGTATTTGCTTGGAT-3’（序列3）（序列9的第2382-2406位）；
TaGW2-6B-ACAS-1-R：5’-CCGCCTCACTGTAGATACATATGA-3’（序列4）（对应序列9的第2835-2858位的反向互补序列，下划线粗体的碱基T为引入的人工突变）。
TaGW2-6B-ACAS-2-F：5’-CTAGCTCACGCCAGGAGAGAGAA-3’（序列5）（序列9的第2207-2229位）；
TaGW2-6B-ACAS-2-R：5’-CCGCCTCACTGTAGATACATAAGG-3’（序列6）（对应序列9的第2835-2858位的反向互补序列，下划线粗体的碱基A为引入的人工突变）。
PCR反应体系：10×PCR Buffer1.5μl，Mg2+1.2μl，dNTP(25mM)0.15μl，Taq(5U/μl)0.16μl，正向引物(10μM)1μl，反向引物(10μM)1μl，小麦基因组DNA(30ng/μl)2μl，ddH2O补足至15μl。
引物对TaGW2-6B-ACAS-1的PCR反应程序：94℃4min；94℃30s，61℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
引物对TaGW2-6B-ACAS-2的PCR反应程序：94℃4min；94℃30s，62℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
TaGW2-6B-ACAS标记检测需进行两次PCR，TaGW2-6B-ACAS-1引物对扩增467bp片段，TaGW2-6B-ACAS-2引物对扩增652bp片段，考虑两次PCR产物的长度差异在100bp以上，故将两次PCR扩增的产物混合后在1.5%琼脂糖凝胶上检测。
理论上，TaGW2-6B-ACAS标记用于区分Hap-6B-2型和其他两种单元型（Hap-6B-3/4），Hap-6B-2扩增片段为652bp，Hap-6B-3/4扩增片段为467bp。
经验证，表1中经对TaGW2-6B启动子区测序证实具有Hap-6B-2型的TaGW2-6B启动子区单元型的小麦品种，经上述PCR扩增，所得PCR产物均为一条652bp的谱带；而表1中经对TaGW2-6B启动子区测序证实具有Hap-6B-3型和Hap-6B-4型的TaGW2-6B启动子区单元型的小麦品种，经上述PCR扩增，所得PCR产物均为一条467bp的谱带（部分小麦品种的鉴定结果如图3所示）。证实了以上方法的可行性。
3、TaGW2-6B-dCAPS标记
比较Hap-6B-3型和Hap-6B-4型发现，这两个单元型只有在序列9的第2197位（G/A）存在一个SNP位点，通过dCAPS（derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）Finder2.0网站设计引物时引入错配，即为TaGW2-6B-dCAPS。在Hap-6B-4引入一个Hpy166II酶切位点（GTNNAC），而Hap-6B-3则无此酶切位点，该标记TaGW2-6B-dCAPS可以区分Hap-6B-3和Hap-6B-4。
TaGW2-6B-dCAP-F：5’-TGATGAGATCCCGTGCAGTAGTTC-3’（序列7）（对应序列9的第2173-2196位，下划线粗体的碱基T为引入的错配）；
TaGW2-6B-dCAP-R：5’-CCCTTTCATCTTTCATCCAAGCA-3’（序列8）（序列9的第2398-2420位的反向互补序列）。
PCR反应体系：10×PCR Buffer1.5μl，Mg2+1.2μl，dNTP(25mM)0.15μl，Taq(5U/μl)0.16μl，TaGW2-6B-dCAPS-F(10μM)1μl，TaGW2-6B-dCAPS-R(10μM)1μl，小麦基因组DNA(30ng/μl)2μl，ddH2O补足至15μl。
PCR反应程序：94℃4min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
酶切反应体系：PCR反应产物5μl，10×buffer1μl，BSA0.1μl，限制性内切酶Hpy166II0.25μl，ddH2O补足至10μl。
理论上，TaGW2-6B-dCAPS标记扩增产物为248bp，产物经Hpy166II（NEB）65℃水浴20min，8%非变性聚丙烯酰胺凝胶检测。该标记可以将Hap-6B-3和Hap-6B-4区分开来，Hap-6B-3（无Hpy166II酶切位点）酶切片段为248bp，而Hap-6B-4（有Hpy166II酶切位点）为约228bp和20bp的酶切片段。
经验证，表1中经对TaGW2-6B启动子区测序证实具有Hap-6B-3型的TaGW2-6B启动子区单元型的小麦品种，经上述PCR扩增及Hpy166II酶切，所得PCR产物均为一条248bp的谱带；而表1中经对TaGW2-6B启动子区测序证实具有Hap-6B-4型的TaGW2-6B启动子区单元型的小麦品种，经上述PCR扩增及Hpy166II酶切，所得PCR产物均同时呈现约228bp的谱带（部分小麦品种的鉴定结果如图4所示，约20bp的另一条带太小，图中未显示）。证实了以上方法的可行性。
综上而言，由TaGW2-6B-CAPS、TaGW2-6B-ACAS和TaGW2-6B-dCAPS组成的这套标记可以有效、简单地区分TaGW2-6B启动子区的4种单元型。
实施例3、TaGW2-6B启动子区单元型的功能验证
本实施例应用实施例2设计的TaGW2-6B启动子区有效区分4种单元型的3个分子标记对包括我国小麦微核心种质在内的265份材料（114份育成品种和151份地方品种）进行了TaGW2-6B启动子区单元型的分析，具体操作参见实施例2相关步骤。全部材料的基本信息及两年（2002年和2006年于洛阳）籽粒表型鉴定数据详见表2。基于地方品种和育成品种两个群体进行了单元型/籽粒性状的关联分析。
结果如表3所示，在地方品种中，Hap-6B-1和Hap-6B-4型小麦的千粒重在2002年和2006年均呈现极显著（P<0.01）或显著差异（P<0.05），Hap-6B-1型小麦在2002与2006两年间较Hap-6B-4型小麦在千粒重上分别增加6.38g和4.68g。这主要表现在两种单元型材料粒长存在显著差异，Hap-6B-1型小麦在2002与2006年较Hap-6B-4型小麦在粒长上分别高出0.43mm和0.49mm。在育成品种中，两年表型数据显示，Hap-6B-1与Hap-6B-4型小麦在千粒重上均存在极显著差异（P<0.01），2002年和2006年Hap-6B-1型小麦较Hap-6B-4型小麦在千粒重上分别高16.68g和15.25g。分析其原因，与地方品种不同的是，携带这两种单元型的育成材料在粒宽和粒厚上存在显著差异，粒宽在两年间分别相差0.45mm和0.39mm，而粒厚相差0.45mm和0.33mm。由此可见，携带Hap-6B-1型的小麦材料籽粒性状优良，在现代育成品种中，它是与粒宽、粒厚和千粒重显著关联的优异单元型。相应地，有效区分Hap-6B-1和其他三种单元型（Hap-6B-2/3/4）的标记TaGW2-6B-CAPS可以作为大粒分子标记。
表2265份小麦品种的TaGW2-6B启动子区单元型及籽粒表型鉴定数据
Figure BDA0000425229880000131
Figure BDA0000425229880000141
Figure BDA0000425229880000151
Figure BDA0000425229880000161
Figure BDA0000425229880000171
注：序号为1-151的小麦为地方品种；序号为152-265的小麦为育成品种。表中，I：北部冬麦区；II：黄淮冬麦区；III：长江中下游冬麦区；IV：西南冬麦区；V：华南冬麦区；VI：东北春麦区；VII：北部春麦区；VIII：西北春麦区；IX：青藏春冬麦区；X：新疆冬春麦区。
表3TaGW2-6B启动子区四种单元型与籽粒性状的关联分析
Figure BDA0000425229880000191
注：表中，大写字母和小写字母分别代表在不同单元型之间P＜0.01和P＜0.05水平的差异显著。*Hap-6B-1：地方品种，N=20；育成品种，N=62。*Hap-6B-2：地方品种，N=44；育成品种，N=41。*Hap-6B-3：地方品种，N=63；育成品种，N=9。
*Hap-6B-4：地方品种，N=24；育成品种，N=2。
实施例4、TaGW2-6B启动子区单元型频率变化趋势及生态型分析
本实施例应用151份地方品种和320份育成品种小麦（表3所示的151份地方品种和114份育成品种，以及表4中所示的206份育成品种），一方面比较分析了TaGW2-6B启动子区不同单元型在这两大遗传群体中的生态分布特征。另一方面，比较我国地方品种和育成品种中TaGW2-6B不同单元型的频率变化。TaGW2-6B启动子区单元型的鉴定具体操作参见实施例2相关步骤。
TaGW2-6B启动子区不同单元型在两大遗传群体中的生态分布特征结果如图5所示，可以看出，在地方品种中（图5中a），生态区对单元型的选择强度并不明显，大粒单元型Hap-6B-1的频率在各生态区较低。非常明显，在育成品种中（图5中b），大粒型Hap-6B-1在各生态区小麦材料中所占的频率显著提高（接近90%），尤其在Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ麦区以Hap-6B-1为主，而Hap-6B-4所占频率均降低，甚至在Ⅸ、Ⅵ、Ⅶ等麦区已经消失。
我国地方品种和育成品种中TaGW2-6B启动子区不同单元型的频率变化比较结果如图6所示，可以看出，在地方品种中各单元型出现频率较均匀，而育成品种中大粒型Hap-6B-1的频率显著提高，小粒型Hap-6B-4则显著降低，表明大粒单元型Hap-6B-1在我国小麦育种中经历了较强的正向选择和累积过程。进一步，对育成品种按育成年份分析，大粒型Hap-6B-1除在早期育成品种中频率较低外，其他年代育成品种中该单元型频率均提高，尤其是2000s后的品种（高达90%以上），它在现代育种过程中已趋于稳定；与此相反，小粒型Hap-6B-4在1970s后的品种中被淘汰，Hap-6B-3则在1990s后的品种中消失。这表明我国小麦育种经历了对TaGW2-6B四种单元型较强的、动态的选择及固定过程。
表4206份育成品种小麦TaGW2-6B启动子区单元型分析
序号 小麦品种 原始来源 编号 育成年份 生态区 TaGW2-6B
1 核不育6068 北京 ZM018397 1980 Ⅰ Hap-6B-2
2 科城1号 北京 ZM013801 1970 Ⅰ Hap-6B-1
3 品冬904110-3 北京 ZM021283 1990 Ⅰ Hap-6B-2
4 品抗244 北京 ZM021317 1988 Ⅰ Hap-6B-1
5 中大89-60192-2 北京 ZM020851 1989 Ⅰ Hap-6B-3
6 廊8302 河北 ZM013820 1983 Ⅰ Hap-6B-2
7 唐85-5032 河北 ZM017736 1980 Ⅰ Hap-6B-1
8 河农3号 河北 ZM009155 1958 Ⅰ Hap-6B-3
9 晋麦31（临汾0744） 山西 编号不详 1983 Ⅰ Hap-6B-1
10 长治5557 山西 ZM014020 1983 Ⅰ Hap-6B-1
11 长治6406 山西 ZM014022 1982 Ⅰ Hap-6B-1
12 工农4号 山西 ZM013925 1968 Ⅰ Hap-6B-2
13 清水15-41(2) 甘肃 ZM017341 1980 Ⅰ Hap-6B-2
14 品39（冀麦7号） 河北 ZM009132 1974 Ⅱ Hap-6B-2
15 冀93C6156-2 河北 ZM024138 1993 Ⅱ Hap-6B-1
16 晋865096 山西 ZM014398 1980 Ⅱ Hap-6B-1
17 临远129 山西 ZM014183 1981 Ⅱ Hap-6B-2
18 齐大195 山东 ZM009436 1940 Ⅱ Hap-6B-1
19 鲁麦22 山东 编号不详 1991 Ⅱ Hap-6B-2
20 山农PH85-4 山东 ZM022692 1980 Ⅱ Hap-6B-1
21 鲁农784081 山东 ZM015795 1970 Ⅱ Hap-6B-2
22 鲁农86(5)174 山东 ZM022743 1987 Ⅱ Hap-6B-1
23 鲁资0884142 山东 ZM022802 1980 Ⅱ Hap-6B-1
24 昌潍20 山东 ZM015621 1966 Ⅱ Hap-6B-1
25 圆柱55 河南 ZM024576 1962 Ⅱ Hap-6B-1
26 花852895-2 河南 ZM022864 1989 Ⅱ Hap-6B-1
27 豫30691-1-3 河南 ZM016116 1986 Ⅱ Hap-6B-1
28 郑87305-0-13 河南 ZM022905 1991 Ⅱ Hap-6B-1
29 郑资R84019-0-7-4-0-1 河南 ZM022919 1991 Ⅱ Hap-6B-1
30 金光麦 陕西 ZM009579 1965 Ⅱ Hap-6B-2
31 泾阳30 陕西 ZM009650 1950 Ⅱ Hap-6B-3
32 宝麦5号 陕西 ZM024725 1978 Ⅱ Hap-6B-2
33 陕农229 陕西 ZM023528 1990 Ⅱ Hap-6B-1
34 陕7219-8-11-2-1 陕西 ZM018288 1970 Ⅱ Hap-6B-2
35 高优503 陕西 ZM024742 1993 Ⅱ Hap-6B-1
36 淮麦11 江苏 ZM015121 1977 Ⅱ Hap-6B-3
37 徐州21 江苏 ZM015105 1986 Ⅱ Hap-6B-1
38 阜84111 安徽 ZM022471 1984 Ⅱ Hap-6B-1
39 宛原28大粒 河南 ZM016022 1970 Ⅲ Hap-6B-1
40 安徽11 安徽 ZM010260 1966 Ⅲ Hap-6B-2
41 安徽3号 安徽 ZM010261 1958 Ⅲ Hap-6B-2
42 蒙丰8号 安徽 ZM010270 1968 Ⅲ Hap-6B-1
43 安徽9号 安徽 ZM010279 1959 Ⅲ Hap-6B-1
44 皖85-50-繁3 安徽 ZM022501 1986 Ⅲ Hap-6B-2
45 皖89193 安徽 ZM022511 1990 Ⅲ Hap-6B-2
46 皖品8337 安徽 ZM022583 1989 Ⅲ Hap-6B-1
47 皖品8410 安徽 ZM022597 1990 Ⅲ Hap-6B-2
48 望麦17 江苏 ZM010244 1959 Ⅲ Hap-6B-2
49 抗R16 江苏 ZM024931 1989 Ⅲ Hap-6B-2
50 宁麦资44 江苏 ZM025016 1996 Ⅲ Hap-6B-2
51 扬麦158 江苏 编号不详 1993 Ⅲ Hap-6B-1
52 华东10号 江苏 ZM014912 1950 Ⅲ Hap-6B-3
53 宁8537 江苏 ZM014838 1985 Ⅲ Hap-6B-3
54 宁麦资13 江苏 ZM014861 1985 Ⅲ Hap-6B-1
55 南大8910 江苏 ZM015073 1989 Ⅲ Hap-6B-1
56 九兰 浙江 ZM010296 1959 Ⅲ Hap-6B-3
57 丽麦16 浙江 编号不详 1984 Ⅲ Hap-6B-3
58 加麦25 浙江 ZM015150 1970 Ⅲ Hap-6B-2
59 南中早 浙江 ZM015197 1970 Ⅲ Hap-6B-3
60 浙选78-23 浙江 ZM015231 1970 Ⅲ Hap-6B-2
61 荆州2号 湖北 ZM010328 1965 Ⅲ Hap-6B-2
62 鄂811(鄂恩1号) 湖北 ZM016328 1980 Ⅲ Hap-6B-1
63 襄麦8号 湖北 ZM016513 1978 Ⅲ Hap-6B-2
64 湘麦12 湖南 编号不详 1984 Ⅲ Hap-6B-2
65 中吉万（1） 湖南 ZM016527 1960 Ⅲ Hap-6B-2
66 湘791-2 湖南 ZM018068 1970 Ⅲ Hap-6B-2
67 中安阿875 湖南 ZM016533 1970 Ⅲ Hap-6B-1
68 合场45 四川 ZM010488 1950 Ⅳ Hap-6B-3
69 四川51麦 四川 ZM010435 1951 Ⅳ Hap-6B-2
70 川麦10号 四川 ZM010442 1968 Ⅳ Hap-6B-1
71 川麦19 四川 ZM016706 1977 Ⅳ Hap-6B-2
72 川麦22 四川 编号不详 1986 Ⅳ Hap-6B-2
73 雅安早 四川 ZM010448 1962 Ⅳ Hap-6B-2
74 西昌反修麦 四川 ZM010477 1969 Ⅳ Hap-6B-1
75 川育12 四川 编号不详 1987 Ⅳ Hap-6B-2
76 绵阳11 四川 ZM016788 1976 Ⅳ Hap-6B-2
77 绵阳26 四川 ZM023888 1991 Ⅳ Hap-6B-2
78 川83C-1001 四川 ZM016639 1980 Ⅳ Hap-6B-2
79 川7911 四川 ZM023824 1970 Ⅳ Hap-6B-2
80 毕麦13 贵州 ZM023311 1980 Ⅳ Hap-6B-2
81 兴竹矮3号 贵州 ZM023324 1990 Ⅳ Hap-6B-1
82 贵775 贵州 ZM023934 1990 Ⅳ Hap-6B-1
83 肯贵阿1号 贵州 ZM016918 1980 Ⅳ Hap-6B-2
84 云麦28 云南 ZM010548 1970 Ⅳ Hap-6B-1
85 云麦29 云南 ZM010556 1972 Ⅳ Hap-6B-3
86 云麦33 云南 ZM016964 1982 Ⅳ Hap-6B-1
87 南原1号 云南 ZM010571 1972 Ⅳ Hap-6B-2
88 普170 云南 ZM017010 1970 Ⅳ Hap-6B-1
89 龙溪35 福建 ZM010390 1977 Ⅴ Hap-6B-1
90 粤汕 广东 ZM010419 1960 Ⅴ Hap-6B-3
91 台中选2号 台湾 ZM015504 1983 Ⅴ Hap-6B-1
92 台中23 台湾 ZM013082 1945 Ⅴ Hap-6B-1
93 佳6268A-549 黑龙江 ZM014721 1960 Ⅵ Hap-6B-1
94 克群 黑龙江 ZM009718 1963 Ⅵ Hap-6B-1
95 垦北1号 黑龙江 ZM014758 1970 Ⅵ Hap-6B-1
96 垦红15 黑龙江 ZM024033 1995 Ⅵ Hap-6B-2
97 龙辐麦2号 黑龙江 编号不详 1980 Ⅵ Hap-6B-1
98 龙麦18 黑龙江 ZM024048 1987 Ⅵ Hap-6B-1
99 龙麦19 黑龙江 ZM021989 1987 Ⅵ Hap-6B-1
100 丰强3号 吉林 ZM014510 1979 Ⅵ Hap-6B-1
101 小冰麦33 吉林 ZM021954 1994 Ⅵ Hap-6B-1
102 品春14 北京 ZM021346 1985 Ⅶ Hap-6B-1
103 雁北8号 山西 ZM014458 1979 Ⅶ Hap-6B-1
104 陇春7号 甘肃 ZM009825 1974 Ⅷ Hap-6B-2
105 临农12 甘肃 ZM009909 1976 Ⅷ Hap-6B-1
106 武都5号 甘肃 ZM009987 1971 Ⅷ Hap-6B-2
107 张春9号 甘肃 ZM010069 1975 Ⅷ Hap-6B-2
108 甘麦46 甘肃 ZM017295 1960 Ⅷ Hap-6B-2
109 金麦303 甘肃 ZM017331 1973 Ⅷ Hap-6B-2
110 宏图 宁夏 ZM009793 1968 Ⅷ Hap-6B-1
111 石886 宁夏 ZM023678 1980 Ⅷ Hap-6B-2
112 高原602 青海 编号不详 1982 Ⅷ Hap-6B-1
113 日喀则7号 西藏 ZM010588 1965 Ⅸ Hap-6B-2
114 定县72 北京 ZM009170 1936 Ⅰ Hap-6B-3
115 华北672 北京 ZM008960 1956 Ⅰ Hap-6B-4
116 北京15 北京 ZM008970 1970 Ⅰ Hap-6B-3
117 农大311 北京 ZM009028 1963 Ⅰ Hap-6B-1
118 东方红3号 北京 ZM009038 1968 Ⅰ Hap-6B-2
119 科遗23 北京 ZM009046 1962 Ⅰ Hap-6B-2
120 京农94-32 北京 ZM024431 1994 Ⅰ Hap-6B-1
121 京花1号 北京 ZM013398 1982 Ⅰ Hap-6B-2
122 京核91-P19 北京 ZM021117 1991 Ⅰ Hap-6B-2
123 京农86-89 北京 ZM021016 1986 Ⅰ Hap-6B-2
124 小山8号 北京 ZM013098 1980 Ⅰ Hap-6B-1
125 丰抗8号(京农79-8) 北京 ZM013106 1979 Ⅰ Hap-6B-1
126 桥梁BW41 北京 ZM013517 1980 Ⅰ Hap-6B-1
127 北京8694(CA8694) 北京 ZM020971 1985 Ⅰ Hap-6B-1
128 太辐1号 山西 ZM009192 1965 Ⅰ Hap-6B-1
129 晋麦16（太原633） 山西 ZM009208 1977 Ⅰ Hap-6B-1
130 晋麦11（临汾10号） 山西 ZM014430 1977 Ⅰ Hap-6B-1
131 太原351 山西 ZM013968 1993 Ⅰ Hap-6B-1
132 延安18 陕西 ZM017102 1970 Ⅰ Hap-6B-2
133 平凉32 甘肃 ZM023599 1977 Ⅰ Hap-6B-1
134 石家庄4号 河北 ZM009098 1958 Ⅱ Hap-6B-2
135 早辛石 河北 ZM024359 1960 Ⅱ Hap-6B-3
136 衡水7004 河北 ZM013920 1960 Ⅱ Hap-6B-1
137 邯4564 河北 编号不详 1998 Ⅱ Hap-6B-1
138 燕大1817 山西 ZM009378 1936 Ⅱ Hap-6B-4
139 莱农品系22 山东 ZM022725 1970 Ⅱ Hap-6B-2
140 鲁麦9号 山东 ZM015838 1981 Ⅱ Hap-6B-3
141 郑州8761 河南 ZM025443 1994 Ⅱ Hap-6B-1
142 豫麦14 河南 ZM022976 1982 Ⅱ Hap-6B-1
143 淮麦12 江苏 ZM015122 1980 Ⅱ Hap-6B-1
144 萧农76189 安徽 ZM015328 1976 Ⅱ Hap-6B-1
145 张冬29 甘肃 编号不详 1976 Ⅱ Hap-6B-2
146 宜麦1号 湖北 ZM016228 1958 Ⅲ Hap-6B-3
147 靖麦2号 云南 编号不详 1987 Ⅳ Hap-6B-1
148 敌锈早 福建 ZM010368 1965 Ⅴ Hap-6B-1
149 福繁904 福建 ZM015564 1984 Ⅴ Hap-6B-2
150 合作3号 黑龙江 ZM009682 1950 Ⅵ Hap-6B-1
151 黑78-1259 黑龙江 ZM014764 1970 Ⅵ Hap-6B-1
152 甘麦6号 甘肃 ZM009801 1958 Ⅷ Hap-6B-2
153 定西24 甘肃 ZM009893 1969 Ⅷ Hap-6B-3
154 金麦4号 甘肃 ZM009972 1971 Ⅷ Hap-6B-2
155 西峰9号 甘肃 ZM010002 1971 Ⅷ Hap-6B-2
156 西峰10号 甘肃 ZM010003 1971 Ⅷ Hap-6B-1
157 庆丰1号 甘肃 ZM010038 1977 Ⅷ Hap-6B-2
158 会宁5号 甘肃 ZM017311 1970 Ⅷ Hap-6B-3
159 武春1号 甘肃 ZM017328 1979 Ⅷ Hap-6B-1
160 青春25 青海 ZM017380 1972 Ⅷ Hap-6B-1
161 昌冬5号 新疆 编号不详 1982 Ⅹ Hap-6B-1
162 托克逊1号 新疆 ZM010136 1966 Ⅹ Hap-6B-2
163 吐春6号 新疆 ZM017438 1980 Ⅹ Hap-6B-2
164 淮麦17 江苏 编号不详 2000 III Hap-6B-1
165 中育6号 河南 编号不详 2001 II Hap-6B-1
166 豫麦69号 河南 编号不详 2003 II Hap-6B-1
167 豫麦66号 河南 编号不详 2003 II Hap-6B-2
168 周麦17 河南 编号不详 2004 II Hap-6B-1
169 长旱58 陕西 ZM027159 2004 II Hap-6B-1
170 丰强7号 吉林 ZM026663 2004 VI Hap-6B-1
171 长春7号 吉林 ZM026668 2004 VI Hap-6B-1
172 中原98-68 河南 编号不详 2004 II Hap-6B-1
173 GS郑麦005 河南 编号不详 2004 II Hap-6B-1
174 川农19 四川 ZM027026 2005 IV Hap-6B-1
175 衡7228 河北 ZM025535 2005 I Hap-6B-1
176 新麦208 河南 编号不详 2005 II Hap-6B-1
177 连麦2号 江苏 编号不详 2005 III Hap-6B-1
178 西农9718 陕西 编号不详 2006 II Hap-6B-1
179 克旱20 黑龙江 ZM026658 2006 VI Hap-6B-1
180 农麦2号 内蒙古 ZM026660 2006 VI Hap-6B-1
181 科农199 北京 编号不详 2006 I Hap-6B-1
182 同舟麦916 河南 编号不详 2006 II Hap-6B-1
183 花培5号 河南 编号不详 2006 II Hap-6B-1
184 内麦9号 四川 ZM014493 2006 IV Hap-6B-2
185 平安6号 河南 编号不详 2006 II Hap-6B-2
186 轮选518 北京 编号不详 2007 I Hap-6B-1
187 新麦9817 河南 编号不详 2007 II Hap-6B-1
188 洛旱7号 河南 编号不详 2007 II Hap-6B-1
189 京花9号 北京 编号不详 2007 I Hap-6B-1
190 京冬17 北京 编号不详 2007 I Hap-6B-1
191 淮麦25 江苏 编号不详 2007 III Hap-6B-1
192 邢麦4号 河北 编号不详 2007 I Hap-6B-1
193 川育20 四川 ZM027022 2007 IV Hap-6B-2
194 京冬22 北京 编号不详 2007 I Hap-6B-2
195 北麦3号 黑龙江 ZM026639 2008 VI Hap-6B-1
196 中麦175 北京 编号不详 2008 I Hap-6B-1
197 漯麦9号 河南 编号不详 2008 II Hap-6B-1
198 金禾9123 河北 编号不详 2008 I Hap-6B-1
199 龙辐麦16（龙辐98-0819） 黑龙江 ZM026632 2009 VI Hap-6B-1
200 轮选988（轮选01-1） 北京 编号不详 2009 I Hap-6B-1
201 洛麦21号 河南 编号不详 2009 II Hap-6B-1
202 洛麦23 河南 编号不详 2009 II Hap-6B-1
203 郑育麦9987 河南 编号不详 2009 II Hap-6B-1
204 淮麦28（淮麦0566） 江苏 编号不详 2009 III Hap-6B-1
205 淮麦29（淮麦0454) 江苏 编号不详 2009 III Hap-6B-1
206 淮麦31 江苏 编号不详 2009 III Hap-6B-1
Figure IDA0000425229960000011
Figure IDA0000425229960000021
Figure IDA0000425229960000031
Figure IDA0000425229960000041

Claims (10)

1.用于鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的试剂盒，含有如下（a）-（c）：
（a）引物对1和限制性内切酶BstNI；所述引物对1为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
（b）引物对2和引物对3；所述引物对2为由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA分子组成的引物对；所述引物对3为由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA分子组成的引物对；
（c）引物对4和限制性内切酶Hpy166II；所述引物对4为由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
2.用于鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的试剂盒，含有引物对1和限制性内切酶BstNI；所述引物对1为由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对。
3.利用权利要求1所述的试剂盒鉴定小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的方法，包括如下步骤：
（1）如下a1）和a2）：
a1）以待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述引物对1进行PCR扩增，得到PCR产物1；再用所述限制性内切酶BstNI酶切所述PCR产物1，得到酶切产物1；
a2）根据步骤a1）所得的酶切产物1，按照如下方法确定所述待测小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型：若所得酶切产物1含有1361bp的DNA片段，则所述待测小麦具有或候选具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型，鉴定完毕；若所得酶切产物1不含有1361bp的DNA片段，则所述待测小麦不具有或候选不具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型，继续如下步骤（2）；
（2）如下b1）和b2）：
b1）以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述引物对2和所述引物对3进行PCR扩增，得到PCR产物2；
b2）根据步骤b1）所得的PCR产物2，按照如下方法确定所述待测小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型：若所得PCR产物2含有652bp的DNA片段，则所述待测小麦具有或候选具有Hap-6B-2型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型，鉴定完毕；若所得PCR产物2不含有652bp的DNA片段，则所述待测小麦不具有或候选不具有Hap-6B-2型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型，继续如下步骤（3）；
（3）如下c1）和c2）：
c1）以所述待测小麦的基因组DNA为模板，采用所述引物对4进行PCR扩增，得到PCR产物3；再用所述限制性内切酶Hpy166II酶切所述PCR产物3，得到酶切产物2；
c2）根据步骤c1）所得的酶切产物2，按照如下方法确定所述待测小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型：若所得酶切产物2含有248bp的DNA片段，则所述待测小麦具有或候选具有Hap-6B-3型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型；若所得酶切产物2含有228bp的DNA片段，则所述待测小麦具有或候选具有Hap-6B-4型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型。
4.利用权利要求2所述试剂盒鉴定待测小麦是否具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的方法，包括如下步骤：
（A1）以待测小麦的基因组DNA为模板，采用权利要求3中所述引物对1进行PCR扩增，得到PCR产物1；再用限制性内切酶BstNI酶切所述PCR产物1，得到酶切产物1；
（A2）根据步骤（A1）所得的酶切产物1，按照如下方法确定所述待测小麦是否具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型：若所得酶切产物1含有1361bp的DNA片段，则所述待测小麦具有或候选具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型；若所得酶切产物1不含有1361bp的DNA片段，则所述待测小麦不具有或候选不具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：采用所述引物对1进行PCR扩增的退火温度为64℃；采用所述引物对2进行PCR扩增的退火温度为61℃；采用所述引物对3进行PCR扩增的退火温度为62℃；采用所述引物对4进行PCR扩增的退火温度为63℃。
6.权利要求1或2所述试剂盒的制备方法，其特征在于：所述方法包括将各引物对和各限制性内切酶分别单独包装后置于同一个试剂盒中的的步骤。
7.权利要求1-6中任一所述的试剂盒或方法在小麦育种中的应用；或
小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型在鉴定或辅助鉴定粒重高的小麦品种中的应用。
8.一种培育千粒重提高的小麦品种的方法，包括采用通过权利要求3或4的方法鉴定得到的如下小麦作为亲本进行育种的步骤：具有Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型的小麦。
9.根据权利要求1-8中任一所述的试剂盒或方法或应用，其特征在于：所述小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区的核苷酸序列为序列表中序列9所示；
所述小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型有如下四种：Hap-6B-1型、Hap-6B-2型、Hap-6B-3型和Hap-6B-4型；
所述Hap-6B-1型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型对应的序列9的第38位为G、第76位为T、第573位为A、第782位为C、第1095位为G、第1209位为A、第1523位为C、第1929位为C、第1989位为G、第2197位为G、第2835位为C；
所述Hap-6B-2型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型对应的序列9的第38位为A、第76位为C、第573位为G、第782位为T、第1095位为A、第1209位为C、第1523位为A、第1929位为T、第1989位为G、第2197位为G、第2835位为C；
所述Hap-6B-3型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型对应的序列9的第38位为G、第76位为C、第573位为A、第782位为T、第1095位为G、第1209位为C、第1523位为C、第1929位为C、第1989位为A、第2197位为G、第2835位为T；
所述Hap-6B-4型的小麦粒重基因TaGW2-6B启动子区单元型对应的序列9的第38位为G、第76位为C、第573位为A、第782位为T、第1095位为G、第1209位为C、第1523位为C、第1929位为C、第1989位为A、第2197位为A、第2835位为T。
10.DNA分子，为序列表中序列9所示的DNA分子。
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