CN108220465B - 特异dna分子及其作为启动子或分子标记的应用 - Google Patents

特异dna分子及其作为启动子或分子标记的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了特异DNA分子及其作为启动子或分子标记的应用。本发明首先保护一种特异DNA分子，为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：(a1)序列3第217‑2497位核苷酸所示的DNA分子；(a2)序列4自5’末端第217‑2498位核苷酸所示的DNA分子；(a3)序列3所示的DNA分子；(a4)序列4所示的DNA分子。本发明还保护所述特异DNA分子作为启动子的应用。本发明还保护所述特异DNA分子作为小麦籽粒性状的分子标记的应用。本发明提供了两种启动子，可用于启动目的基因的表达。本发明开发了与小麦籽粒性状相关的SNP位点。本发明对于选育具有不同籽粒性状的小麦具有极好的应用前景。

Description

特异DNA分子及其作为启动子或分子标记的应用
技术领域
本发明涉及特异DNA分子及其作为启动子或分子标记的应用。
背景技术
启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性。转录的起始是基因表达的关键阶段，而这一阶段重要的问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用。研究发现，同一基因可能具有不同的启动子类型，启动子的结构直接影响其与RNA聚合酶的亲和力，从而影响目的基因的表达水平，进而影响基因的功能。
小麦是我国重要的粮食作物之一，直接影响我国人民生活水平的高低和国家的粮食安全。提高小麦单产、使其高产稳产也一直是我国小麦育种家们长期追求的主要目标。因此，克隆小麦产量相关基因并进一步研究其调控序列(包括启动子)类型和活性，对于阐明启动子对产量基因的调控作用以及了解产量基因发挥功能的机制均具有重要的科学意义和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供特异DNA分子及其作为启动子或分子标记的应用。
本发明首先保护一种特异DNA分子，为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)或(a6)：
(a1)序列表中序列3自5’末端第217-2497位核苷酸所示的DNA分子；
(a2)序列表中序列4自5’末端第217-2498位核苷酸所示的DNA分子；
(a3)序列表中序列3所示的DNA分子；
(a4)序列表中序列4所示的DNA分子；
(a5)在严格条件下与以上(a1)至(a4)中任一所述DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；
(a6)与以上(a1)至(a5)中任一所述DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
本发明还保护所述特异DNA分子作为启动子的应用。
本发明还保护所述特异DNA分子在启动目的基因表达中的应用。
本发明还保护所述特异DNA分子作为分子标记在选育具有不同籽粒性状的小麦中的应用。所述小麦籽粒性状为小麦籽粒千粒重和/或小麦籽粒粒长。
本发明还保护一种鉴别或辅助鉴别小麦籽粒性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的基因型为P1纯合型、P1/P2杂合型还是P2纯合型；P1纯合型小麦的籽粒性状优于P2纯合型；所述籽粒性状优体现为千粒重高和/或粒长长。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒千粒重的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的基因型为P1纯合型、P1/P2杂合型还是P2纯合型；如果为P1纯合型、待测小麦候选为高千粒重小麦；如果为P2纯合型、待测小麦候选为低千粒重小麦；所述高千粒重小麦为籽粒千粒重≥35g的小麦；所述低千粒重小麦为籽粒千粒重＜35g的小麦。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒粒长的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的基因型为P1纯合型、P1/P2杂合型还是P2纯合型；如果为P1纯合型、待测小麦候选为长粒长小麦；如果为P2纯合型、待测小麦候选为短粒长小麦；所述长粒长小麦为籽粒粒长≥0.65mm的小麦；所述短粒长小麦为籽粒粒长＜0.65mm的小麦。
所述P1纯合型指的是基因组DNA具有(b1)或(b2)且为纯合型；
(b1)序列表中序列3自5’末端第217-2497位核苷酸所示的DNA分子；
(b2)序列表中序列3所示的DNA分子；
所述P2纯合型指的是基因组DNA具有(b3)或(b4)且为纯合型；
(b3)序列表中序列4自5’末端第217-2498位核苷酸所示的DNA分子；
(b4)序列表中序列4所示的DNA分子。
本发明还保护一种鉴别或辅助鉴别小麦籽粒性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP409-410位点的基因型为TG型、杂合型还是TCG型；TG型小麦的籽粒性状优于TCG型小麦；所述籽粒性状优体现为千粒重高和/或粒长长。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒千粒重的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP409-410位点的基因型为TG型、杂合型还是TCG型；如果为TG型、待测小麦候选为高千粒重小麦；如果为TCG型、待测小麦候选为低千粒重小麦；所述高千粒重小麦为籽粒千粒重≥35g的小麦；所述低千粒重小麦为籽粒千粒重＜35g的小麦。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒粒长的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP409-410位点的基因型为TG型、杂合型还是TCG型；如果为TG型、待测小麦候选为长粒长小麦；如果为TCG型、待测小麦候选为短粒长小麦；所述长粒长小麦为籽粒粒长≥0.65mm的小麦；所述短粒长小麦为籽粒粒长＜0.65mm的小麦。
所述SNP409-410位点为小麦基因组中序列表的序列3第409位核苷酸和第410位核苷酸。所述TG型指的是基因组DNA中序列表的序列3第409位核苷酸和第410位核苷酸依次为T和G且为纯合型。所述TCG型指的是基因组DNA中序列表的序列3第409位核苷酸T和第410位核苷酸G之间插入了一个核苷酸C且为纯合型。
本发明还保护一种鉴别或辅助鉴别小麦籽粒性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP493位点的基因型为TT型、TC型还是CC型；TT型小麦的籽粒性状优于CC型小麦；所述籽粒性状优体现为千粒重高和/或粒长长。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒千粒重的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP493位点的基因型为TT型、TC型还是CC型；如果为TT型、待测小麦候选为高千粒重小麦；如果为CC型、待测小麦候选为低千粒重小麦；所述高千粒重小麦为籽粒千粒重≥35g的小麦；所述低千粒重小麦为籽粒千粒重＜35g的小麦。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒粒长的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP493位点的基因型为TT型、TC型还是CC型；如果为TT型、待测小麦候选为长粒长小麦；如果为CC型、待测小麦候选为短粒长小麦；所述长粒长小麦为籽粒粒长≥0.65mm的小麦；所述短粒长小麦为籽粒粒长＜0.65mm的小麦。
所述SNP493位点为小麦基因组中序列表的序列7第1位核苷酸。
本发明还保护一种鉴别或辅助鉴别小麦籽粒性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP1208位点的基因型为AA型、AG型还是GG型；AA型小麦的籽粒性状优于GG型小麦；所述籽粒性状优体现为千粒重高和/或粒长长。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒千粒重的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP1208位点的基因型为AA型、AG型还是GG型；如果为AA型、待测小麦候选为高千粒重小麦；如果为GG型、待测小麦候选为低千粒重小麦；所述高千粒重小麦为籽粒千粒重≥35g的小麦；所述低千粒重小麦为籽粒千粒重＜35g的小麦。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒粒长的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP1208位点的基因型为AA型、AG型还是GG型；如果为AA型、待测小麦候选为长粒长小麦；如果为GG型、待测小麦候选为短粒长小麦；所述长粒长小麦为籽粒粒长≥0.65mm的小麦；所述短粒长小麦为籽粒粒长＜0.65mm的小麦。
所述SNP1208位点为小麦基因组中序列表的序列7第716位核苷酸。
本发明还保护一种鉴别或辅助鉴别小麦籽粒性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP1708位点的基因型为TT型、TG型还是GG型；TT型小麦的籽粒性状优于GG型小麦；所述籽粒性状优体现为千粒重高和/或粒长长。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒千粒重的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP1708位点的基因型为TT型、TG型还是GG型；如果为TT型、待测小麦候选为高千粒重小麦；如果为GG型、待测小麦候选为低千粒重小麦；所述高千粒重小麦为籽粒千粒重≥35g的小麦；所述低千粒重小麦为籽粒千粒重＜35g的小麦。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒粒长的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP1708位点的基因型为TT型、TG型还是GG型；如果为TT型、待测小麦候选为长粒长小麦；如果为GG型、待测小麦候选为短粒长小麦；所述长粒长小麦为籽粒粒长≥0.65mm的小麦；所述短粒长小麦为籽粒粒长＜0.65mm的小麦。
所述SNP1708位点为小麦基因组中序列表的序列7第1216位核苷酸。
本发明还保护一种鉴别或辅助鉴别小麦籽粒性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP1980位点的基因型为GG型、GA型还是AA型；GG型小麦的籽粒性状优于AA型小麦；所述籽粒性状优体现为千粒重高和/或粒长长。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒千粒重的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP1980位点的基因型为GG型、GA型还是AA型；如果为GG型、待测小麦候选为高千粒重小麦；如果为AA型、待测小麦候选为低千粒重小麦；所述高千粒重小麦为籽粒千粒重≥35g的小麦；所述低千粒重小麦为籽粒千粒重＜35g的小麦；
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒粒长的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于SNP1980位点的基因型为GG型、GA型还是AA型；如果为GG型、待测小麦候选为长粒长小麦；如果为AA型、待测小麦候选为短粒长小麦；所述长粒长小麦为籽粒粒长≥0.65mm的小麦；所述短粒长小麦为籽粒粒长＜0.65mm的小麦。
所述SNP1980位点为小麦基因组中序列表的序列7第1488位核苷酸。
以上任一所述方法中，用于检测待测小麦基因型的方法具体如下：以小麦的基因组DNA为模板，采用TPP-P-1F和TPP-P-1R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，对PCR扩增产物进行测序。TPP-P-1F为序列表的序列1所示的单链DNA分子。TPP-P-1R为序列表的序列2所示的单链DNA分子。
本发明受到科技部十三五项目“主要农作物产量性状形成的分子基础(项目批号：2016YFD0100402；任务负责人：刘红霞)”的支持。本发明受到国家自然基金“小麦5DS籽粒产量相关重要候选基因的功能分析及其调控机制研究(项目批号：31471492；项目负责人：刘红霞)”的支持。
本发明提供了两种启动子，可用于启动目的基因的表达。本发明开发了与小麦籽粒性状相关的SNP位点。应用本发明提供的SNP位点或分子标记鉴定小麦籽粒性状，具有快捷、方便、准确等优点。本发明对于选育具有不同籽粒性状的小麦具有极好的应用前景。
附图说明
图1为荧光观察时叶片的表型照片。
图2为荧光强度结果(与空载体的差异荧光倍数)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
载体pDONR207：Invitrogen公司产品，质粒图谱登记号：02352。
载体pGWB35：BioVector NTCC保藏中心；Liu J,Zhang T R,Jia J Z,Sun JQ.2016.The wheat mediator subunit TaMED25interacts with the transcriptionfactor TaEIL1to negatively regulate disease resistance against PowderyMildew.Plant Physiology.170:1799–1816.
实施例中所用的烟草为本氏烟(Nicotiana benthamiana)，参考文献：农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究；孙蔓莉、孟玉、张强、黄桂艳、单卫星；西北农业学报,2015,24(1):161-165。
实施例中所用的植物活体成像系统为Nightshade LB985,Bertholdtechnologies。
实施例1、启动子以及特异SNP的发现
供试小麦材料：选择分布于我国不同麦区的，籽粒性状差异较大的34份小麦材料(编号为C1-34，具体材料信息见表1)作为启动子以及多态性位点的发掘材料。
各个供试小麦材料分别进行如下步骤操作：
1、提取供试小麦材料的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用TPP-P-1F和TPP-P-1R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
TPP-P-1F(序列表的序列1)：5’-GAATGTAGCAGTCCACCTAT-3’；
TPP-P-1R(序列表的序列2)：5’-ACGCAGATCAATCATCAGAA-3’。
3、取步骤2得到的PCR扩增产物，进行克隆测序。每份小麦材料测25个克隆。
4、进行序列拼接和比对。
将每份小麦材料的25个克隆测序结果进行A基因组启动子序列评接和比对分析。PCR扩增产物从序列组成来看包括两部分，一部分为启动子区(自5’末端起至ATG前终止)，另一部分为编码区(自ATG起，至3’末端终止)，截取ATG前序列作为该小麦品种的A启动子序列。从34份小麦材料中发现两种A启动子，一种如序列表的序列3所示(命名为P1启动子)，另一种如序列表的序列4所示(命名为P2启动子)。对于A启动子来说，34份小麦材料的基因型均为纯合型，一部分为P1启动子的纯合基因型，另一部分为P2启动子的纯合基因型。
P1启动子和P2启动子存在5个SNP差异。将P1启动子作为标准，P2启动子与其差异如下：①在第409位核苷酸和第410位核苷酸之间存在一个核苷酸“C”的插入；②在第493位核苷酸存在一个SNP，多态形式为T/C；③在第1208位核苷酸存在一个SNP，多态形式为A/G；④在第1708位核苷酸存在一个SNP，多态形式为T/G；⑤在第1980位核苷酸存在一个SNP，多态形式为G/A。
5、供试小麦材料2012年10月种植于中国农业科学院作物科学研究所院内大网室，常规灌溉施肥管理，2013年7月收获籽粒并测量千粒重。
各个供试小麦材料的千粒重见表1。
表1
编号 名称 千粒重 启动子 编号 名称 千粒重 启动子
C1 中优9507 51.7g P1 C18 鲁麦9号 26.45g P2
C2 郑麦9023 44.1g P1 C19 铭贤169 33.2g P2
C3 攀86001-3 52.8g P1 C20 安徽3号 18.29g P2
C4 晋麦8号 41.3g P1 C21 抢场麦 30.4g P2
C5 莱州953 42.05g P1 C22 白冬麦 15.75g P2
C6 小白芒 44.42g P1 C23 兰花麦 28.6g P2
C7 三颗寸 53.66g P1 C24 白芒麦 29.85g P2
C8 紫秸红 44.35g P1 C25 白花麦 24.45g P2
C9 红芒子 37.54g P1 C26 中国春 27.35g P2
C10 鱼鳅麦 44.29g P1 C27 吕旱328 33.7g P2
C11 鲁麦1号 45.658g P1 C28 农大139 32.05g P1
C12 北京15 28.55g P2 C29 泾阳60 27.3g P2
C13 石家庄54 33.28g P2 C30 烟农15 34.05g P2
C14 徐州22 51.3g P1 C31 白麦子 24.45g P2
C15 温麦8号 51.7g P1 C32 麻花板 20.9g P2
C16 兰考906 51.7g P1 C33 红金麦 23.4g P2
C17 矮丰3号 34.464g P2 C34 三月黄 28.85g P2
34份供试小麦材料中，15份供试小麦材料为P1启动子纯合型，19份供试小麦材料为P2启动子纯合型。P1启动子纯合型的供试小麦的籽粒平均千粒重为45.91g，P2启动子纯合型的供试小麦的籽粒平均千粒重为27.54g。
以千粒重为35g为阈值，籽粒千粒重为35g以上的小麦为高千粒重小麦，籽粒千粒重小于35g的小麦为低千粒重小麦。如果待测小麦为P1启动子纯合型，该待测小麦为候选的高千粒重小麦；如果待测小麦为P2启动子纯合型，该待测小麦为候选的低千粒重小麦。用该方法鉴定上述34个供试小麦中的高千粒重小麦的准确率为93％(14/15)，用该方法鉴定上述34个供试小麦中的低千粒重小麦的准确率为100％(19/19)。
实施例2、启动子的功能验证
一、重组质粒的构建
1、合成序列表的序列3所示的双链DNA分子。
2、以步骤1得到的DNA分子为模板，采用TPP-P-TF和TPP-P-TR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。TPP-P-TF中，下划线标注attB1序列。TPP-P-TR中，下划线标注attB2序列。
TPP-P-TF(序列5)：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTCTTGATAAGTGTCGGAGGACC-3’；
TPP-P-TR(序列6)：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCGCACGCAAACAACC-3’。
3、步骤2得到的PCR扩增产物与载体pDONR207进行BP重组，得到具有序列表的序列3第217-2497位核苷酸所示的DNA分子的重组质粒。
4、步骤3得到的重组质粒与载体pGWB35发生LR反应，得到以pGWB35载体为骨架，正向具有序列表的序列3第217-2497位核苷酸所示DNA分子的重组质粒，将其命名为重组质粒-P1。pGWB35载体上具有荧光基因，序列表的序列3第217-2497位核苷酸所示DNA分子插入了荧光基因前面，以验证其启动子活性。
5、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。
6、以步骤5得到的DNA分子为模板，采用TPP-P-TF和TPP-P-TR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
7、步骤6得到的PCR扩增产物与载体pDONR207进行BP重组，得到具有序列表的序列4第217-2498位核苷酸所示的DNA分子的重组质粒。
8、步骤7得到的重组质粒与载体pGWB35发生LR反应，得到以pGWB35载体为骨架，正向具有序列表的序列4第217-2498位核苷酸所示DNA分子的重组质粒，将其命名为重组质粒-P2。pGWB35载体上具有荧光基因，序列表的序列4第217-2498位核苷酸所示DNA分子插入了荧光基因前面，以验证其启动子活性。
二、启动子的功能验证
供试质粒为：重组质粒-P1或重组质粒-P2或载体pGWB35。
1、将供试质粒导入农杆菌菌株GV3101，得到重组农杆菌。
2、取步骤1得到的重组农杆菌，用侵染液重悬，得到OD600nm＝1的菌悬液。
侵染液：含10mM MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)、10mM MgCl2和200μmol/L乙酰丁香酮的液体培养基。
3、取培养至4-6叶期的烟草，将步骤2得到的菌悬液注射至烟草叶片背面(每株烟草植株对2-3片叶片进行注射接种，每片叶片的注射体积为200-300微升)。
4、取完成步骤3的烟草植株，先避光培养24小时，然后光照培养36小时，培养温度为22℃±2℃。
5、完成步骤4后，剪取注射菌悬液的叶片，反面朝上平铺于MS培养基平板上，将20μL底物溶液均匀涂抹于整个接种区域，放入暗箱静置培养2-3min，然后用植物活体成像系统曝光2-3min，进行拍照和荧光值计算。
底物溶液：荧光反应底物甲虫荧光素(Beetle Luciferin,Potassium Salt，Promega公司产品，产品目录号为E1601)用无菌ddH2O水稀释至10倍体积。
结果见图1和图2。图1中，P1代表重组质粒-P1，P2代表重组质粒-P2，EV代表载体pGWB35。图2中，以载体pGWB35相应的荧光值为1，纵坐标为荧光倍数，1#至7#分别代表不同的叶片。采用P1启动子产生的荧光值显著高于采用P2启动子产生的荧光值，在有的叶片中P1启动子的活性比P2启动子的活性提高了3倍以上。结果表明，P1和P2均为有活性的启动子，P1启动子对目的基因的启动活性明显高于P2启动子。结合千粒重分析发现，P1启动子(高活性启动子)对应着高千粒重，P2启动子(低活性启动子)对应着低千粒重。
实施例3、应用P1、P2的基因型检测大样本
各个供试小麦材料见表2。
一、基因型检测
1、提取供试小麦材料的基因组DNA。
2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用TPP-P-1F和TPP-P-1R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
3、取步骤2得到的PCR扩增产物，进行测序。
各个供试小麦材料的基因型检测结果见表2(P1启动子纯合型，简称P1纯合)、表3(P1启动子/P1启动子杂合型，简称P1/P2)和表4(P2启动子纯合型，简称P2纯合)。
二、性状检测
2002、2005和2006年，将供试小麦材料种植于河南洛阳，常规水肥管理，收获籽粒并测量千粒重(TKW)、粒长(KL)和粒宽(KW)。
P1启动子纯合型的供试小麦材料的结果见表2(包括每个供试小麦的结果，以及该基因型的所有供试小麦的平均值)。P1启动子/P1启动子杂合型的供试小麦材料的结果见表3(包括每个供试小麦的结果，以及该基因型的所有供试小麦的平均值)。P2启动子纯合型的供试小麦材料的结果见表4(包括每个供试小麦的结果，以及该基因型的所有供试小麦的平均值)。从大趋势来看，P1启动子纯合型小麦的千粒重大于P2启动子纯合型小麦，P1启动子纯合型小麦的粒长大于P2启动子纯合型小麦。
千粒重≥35g，定义为高千粒重；千粒重＜35g，定义为低千粒重。粒长≥0.65mm，定义为长粒长；粒长＜0.65mm定义为短粒长。将P1启动子纯合型的小麦鉴定为高千粒重小麦、长粒长小麦，准确率结果见表2。将P2启动子纯合型的小麦鉴定为低千粒重小麦、短粒长小麦，准确率结果见表4。
表2
Figure BDA0001187173980000091
Figure BDA0001187173980000101
表3
Figure BDA0001187173980000102
Figure BDA0001187173980000111
表4
Figure BDA0001187173980000112
Figure BDA0001187173980000121
Figure BDA0001187173980000131
Figure BDA0001187173980000141
三、关联分析
供试小麦材料中，选育品种的关联分析的结果见表5。结果显示：P1启动子纯合型的供试小麦的三年平均千粒重为41.50g，而P2启动子纯合型的供试小麦的三年平均千粒重为36.45g，差异达到极显著水平(P<0.01)；在粒长性状上，P1启动子纯合型的小麦材料较P2启动子纯合型的小麦材料籽粒长，差异达到显著或极显著水平(P<0.05或P<0.01)。由此可知，相较于P2启动子纯合型而言，P1启动子纯合型为优良籽粒性状基因型。
表5
Figure BDA0001187173980000151
注：*P<0.05，**P<0.01。
供试小麦材料中，地方品种的关联分析的结果见表6。结果显示：P1启动子纯合型的供试小麦的三年平均千粒重为38.9g，而P2启动子纯合型的供试小麦的三年平均千粒重为31.55g，差异达到极显著水平(P<0.01)；在粒长性状上，P1启动子纯合型的小麦材料较P2启动子纯合型的小麦材料籽粒长，差异达到显著或极显著水平(P<0.05或P<0.01)。由此可知，相较于P2启动子纯合型而言，P1启动子纯合型为优良籽粒性状基因型。
表6
Figure BDA0001187173980000152
注：*P<0.05，**P<0.01。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 特异DNA分子及其作为启动子或分子标记的应用
<130> GNCYX162119
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaatgtagca gtccacctat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgcagatca atcatcagaa 20
<210> 3
<211> 2497
<212> DNA
<213> 小麦
<400> 3
gaatgtagca gtccacctat tgcccctaag cccaacaatc atgtgagctt tacaatcatg 60
acacaacatc ctaatctttt gacgtttgtc tatcacatcc atttcaacct catccttctt 120
gctagatgag atcccttatg ttgtgatccc ttttgaagca ctactagtct caaccctata 180
cttgttggct tccctgtgtg gacacactgg aaaacactct tgataagtgt cggaggacct 240
ttcttctagc cattgttaga agcagctatg tgtgtggcga atcccaattt gaaggcgtag 300
tcattttaga attttttagc atcatcaatc gagtcgaact ctatgccaac atatggtgca 360
agcagttggg atcaaatatt gccatcttct tccttttcat gcattgtgtg gtagcattga 420
gcatgggatc tgaatccacg ccaccgtgag ttgtaaaatg ctctcctcac ctcctatccc 480
accttcggta tcttactaac attgcaacaa aagtagaaca tcattcatca atagcattta 540
gaacaaaagg tagaacataa ttcctttttc ggtgcaaact ttgtttaggt agaaacaata 600
agatcagaga gggccagagt aaccctctat tttggcaaca aacatttata gaccaacact 660
atcaattgaa cattccagat tggtggattt ctttagtaga gcgtgcacaa tttgctattt 720
ttagatagcc atgctcaatg aaagtaaaca acatttgcta caacattctc attttctgaa 780
gactaggtct atttctgcaa catcatgttt ttgaaggatt ttccattcat caaaatatat 840
cattgttact tttgcatcct cacttttttc caaaacaaat actaggttta gagaagggag 900
acaaaaatgt tttctgggtg cacttttttg aattgggttt ttgcgctttc ctgaatcata 960
acatataaat ttgaatggga gccccctctg ctactggtat tcaacatcaa catatagaaa 1020
attgaacttt gtaactttca atgaattcta catcaatggg gatgcaaatt gctgaattga 1080
acattaacat tcagctaatt cggctcacca acattcaatt ttttttagct catcaacatt 1140
cataaaattt caggtcttgc aacttactga attcaacatc atctttgttg ggatgcaact 1200
atttactaaa ttcaacatta acattcggta aattcatata tgcatgcaac aaggaaattg 1260
tttctcagga aaaaaactag gttcatagaa accaacatat caaatccaat gttgctaggc 1320
agcctcccac ttgctagagc ttaattcgtc ggccagggaa tagtcaaccc ctaagagctt 1380
tgagccatgg cgtaggagag catatctatg acgatatggt gcgccacctg gccagattag 1440
gggcggggtg caagggaggt actatgggtg ccagtgttgc aatggtggtg tagggatgtt 1500
gcggcggaca ccggtcatag attctggatc ccttaccgcg gggcaaaagg ggccgccact 1560
cacgattcac acgcatgggg gaatgcggtt tggaggctgg ttgttgtgtt ccaacacgtc 1620
gtctgttgca acggtcaagt tgggggagga ggctgcgcgt ggtccagctt gcggcaaatc 1680
ggacgactcc gcagcacctg atctaactgc tcgcatgaga gcttactttt ggcatgcatc 1740
acagccacga taaaacaagg ctaacatagt cttggtccat ctataataca tgttggacca 1800
tgcttctctc tccccactaa tcgattgctt tctcctttga ccgtatttga tcttattttt 1860
tcttctagta ttttattttc tcttgacatt gggtttattg gatgtgcgcg gctcccgcat 1920
gtcagtgacc aacatcaaag gacactcctt ccgccaaagt ccctctgatt cttcgagtcg 1980
attttccccc ttgcaacaga tggctatatg tgactgatcg agaaatggcc acacatttca 2040
tccaaaaatg aagaatattt gaatttccac agcctccaga gcaccacttt gatttgaact 2100
cgaaatatga atatagtaaa agggtctaca tataatttga aagtattttg caggacaaaa 2160
acaacaatgt tattctcgaa tcttaatcta tagtcgtcaa ttaaattttc agaatgttaa 2220
ctgttcatat aattgtgcac cctgcaattg tgaatgagaa aacgacacat gtccactccg 2280
gttagaaaaa acgcagtagt tccactagta tgggtaccga cccaacgccg ctccgccttt 2340
ataagtaccg acacttcgcc attggcttct tcacccaggg aaaaccggtc tggtcgcctc 2400
ttcctcgtga actattcccc actgtcactg ctgggcacca ctctcacgca gcgggaggcg 2460
cgtgtcgtga gcacacgtgt ggttgtttgc gtgcgcc 2497
<210> 4
<211> 2498
<212> DNA
<213> 小麦
<400> 4
gaatgtagca gtccacctat tgcccctaag cccaacaatc atgtgagctt tacaatcatg 60
acacaacatc ctaatctttt gacgtttgtc tatcacatcc atttcaacct catccttctt 120
gctagatgag atcccttatg ttgtgatccc ttttgaagca ctactagtct caaccctata 180
cttgttggct tccctgtgtg gacacactgg aaaacactct tgataagtgt cggaggacct 240
ttcttctagc cattgttaga agcagctatg tgtgtggcga atcccaattt gaaggcgtag 300
tcattttaga attttttagc atcatcaatc gagtcgaact ctatgccaac atatggtgca 360
agcagttggg atcaaatatt gccatcttct tccttttcat gcattgtgtc ggtagcattg 420
agcatgggat ctgaatccac gccaccgtga gttgtaaaat gctctcctca cctcctatcc 480
caccttcggt atcctactaa cattgcaaca aaagtagaac atcattcatc aatagcattt 540
agaacaaaag gtagaacata attccttttt cggtgcaaac tttgtttagg tagaaacaat 600
aagatcagag agggccagag taaccctcta ttttggcaac aaacatttat agaccaacac 660
tatcaattga acattccaga ttggtggatt tctttagtag agcgtgcaca atttgctatt 720
tttagatagc catgctcaat gaaagtaaac aacatttgct acaacattct cattttctga 780
agactaggtc tatttctgca acatcatgtt tttgaaggat tttccattca tcaaaatata 840
tcattgttac ttttgcatcc tcactttttt ccaaaacaaa tactaggttt agagaaggga 900
gacaaaaatg ttttctgggt gcactttttt gaattgggtt tttgcgcttt cctgaatcat 960
aacatataaa tttgaatggg agccccctct gctactggta ttcaacatca acatatagaa 1020
aattgaactt tgtaactttc aatgaattct acatcaatgg ggatgcaaat tgctgaattg 1080
aacattaaca ttcagctaat tcggctcacc aacattcaat tttttttagc tcatcaacat 1140
tcataaaatt tcaggtcttg caacttactg aattcaacat catctttgtt gggatgcaac 1200
tatttactga attcaacatt aacattcggt aaattcatat atgcatgcaa caaggaaatt 1260
gtttctcagg aaaaaaacta ggttcataga aaccaacata tcaaatccaa tgttgctagg 1320
cagcctccca cttgctagag cttaattcgt cggccaggga atagtcaacc cctaagagct 1380
ttgagccatg gcgtaggaga gcatatctat gacgatatgg tgcgccacct ggccagatta 1440
ggggcggggt gcaagggagg tactatgggt gccagtgttg caatggtggt gtagggatgt 1500
tgcggcggac accggtcata gattctggat cccttaccgc ggggcaaaag gggccgccac 1560
tcacgattca cacgcatggg ggaatgcggt ttggaggctg gttgttgtgt tccaacacgt 1620
cgtctgttgc aacggtcaag ttgggggagg aggctgcgcg tggtccagct tgcggcaaat 1680
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cacagccacg ataaaacaag gctaacatag tcttggtcca tctataatac atgttggacc 1800
atgcttctct ctccccacta atcgattgct ttctcctttg accgtatttg atcttatttt 1860
ttcttctagt attttatttt ctcttgacat tgggtttatt ggatgtgcgc ggctcccgca 1920
tgtcagtgac caacatcaaa ggacactcct tccgccaaag tccctctgat tcttcgagtc 1980
aattttcccc cttgcaacag atggctatat gtgactgatc gagaaatggc cacacatttc 2040
atccaaaaat gaagaatatt tgaatttcca cagcctccag agcaccactt tgatttgaac 2100
tcgaaatatg aatatagtaa aagggtctac atataatttg aaagtatttt gcaggacaaa 2160
aacaacaatg ttattctcga atcttaatct atagtcgtca attaaatttt cagaatgtta 2220
actgttcata taattgtgca ccctgcaatt gtgaatgaga aaacgacaca tgtccactcc 2280
ggttagaaaa aacgcagtag ttccactagt atgggtaccg acccaacgcc gctccgcctt 2340
tataagtacc gacacttcgc cattggcttc ttcacccagg gaaaaccggt ctggtcgcct 2400
cttcctcgtg aactattccc cactgtcact gctgggcacc actctcacgc agcgggaggc 2460
gcgtgtcgtg agcacacgtg tggttgtttg cgtgcgcc 2498
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cctcttgata agtgtcggag gacc 54
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ggcgcacgca aacaacc 47
<210> 7
<211> 1488
<212> DNA
<213> 小麦
<400> 7
ttactaacat tgcaacaaaa gtagaacatc attcatcaat agcatttaga acaaaaggta 60
gaacataatt cctttttcgg tgcaaacttt gtttaggtag aaacaataag atcagagagg 120
gccagagtaa ccctctattt tggcaacaaa catttataga ccaacactat caattgaaca 180
ttccagattg gtggatttct ttagtagagc gtgcacaatt tgctattttt agatagccat 240
gctcaatgaa agtaaacaac atttgctaca acattctcat tttctgaaga ctaggtctat 300
ttctgcaaca tcatgttttt gaaggatttt ccattcatca aaatatatca ttgttacttt 360
tgcatcctca cttttttcca aaacaaatac taggtttaga gaagggagac aaaaatgttt 420
tctgggtgca cttttttgaa ttgggttttt gcgctttcct gaatcataac atataaattt 480
gaatgggagc cccctctgct actggtattc aacatcaaca tatagaaaat tgaactttgt 540
aactttcaat gaattctaca tcaatgggga tgcaaattgc tgaattgaac attaacattc 600
agctaattcg gctcaccaac attcaatttt ttttagctca tcaacattca taaaatttca 660
ggtcttgcaa cttactgaat tcaacatcat ctttgttggg atgcaactat ttactaaatt 720
caacattaac attcggtaaa ttcatatatg catgcaacaa ggaaattgtt tctcaggaaa 780
aaaactaggt tcatagaaac caacatatca aatccaatgt tgctaggcag cctcccactt 840
gctagagctt aattcgtcgg ccagggaata gtcaacccct aagagctttg agccatggcg 900
taggagagca tatctatgac gatatggtgc gccacctggc cagattaggg gcggggtgca 960
agggaggtac tatgggtgcc agtgttgcaa tggtggtgta gggatgttgc ggcggacacc 1020
ggtcatagat tctggatccc ttaccgcggg gcaaaagggg ccgccactca cgattcacac 1080
gcatggggga atgcggtttg gaggctggtt gttgtgttcc aacacgtcgt ctgttgcaac 1140
ggtcaagttg ggggaggagg ctgcgcgtgg tccagcttgc ggcaaatcgg acgactccgc 1200
agcacctgat ctaactgctc gcatgagagc ttacttttgg catgcatcac agccacgata 1260
aaacaaggct aacatagtct tggtccatct ataatacatg ttggaccatg cttctctctc 1320
cccactaatc gattgctttc tcctttgacc gtatttgatc ttattttttc ttctagtatt 1380
ttattttctc ttgacattgg gtttattgga tgtgcgcggc tcccgcatgt cagtgaccaa 1440
catcaaagga cactccttcc gccaaagtcc ctctgattct tcgagtcg 1488

Claims (7)

1.一种DNA分子，为如下（a1）或（a2）或（a3）或（a4）：
（a1）序列表中序列3自5’末端第217-2497位核苷酸所示的DNA分子；
（a2）序列表中序列4自5’末端第217-2498位核苷酸所示的DNA分子；
（a3）序列表中序列3所示的DNA分子；
（a4）序列表中序列4所示的DNA分子。
2.权利要求1所述DNA分子作为启动子的应用。
3.权利要求1所述DNA分子在启动目的基因表达中的应用。
4.权利要求1所述DNA分子作为分子标记在选育具有不同籽粒性状小麦中的应用；所述籽粒性状为千粒重和/或粒长。
5.一种鉴别或辅助鉴别小麦籽粒性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的基因型为P1纯合型、P1/P2杂合型还是P2纯合型；P1纯合型小麦的籽粒性状优于P2纯合型；所述籽粒性状优体现为千粒重高和/或粒长长；
所述P1纯合型指的是基因组DNA具有（b1）或（b2）且为纯合型；
（b1）序列表中序列3自5’末端第217-2497位核苷酸所示的DNA分子；
（b2）序列表中序列3所示的DNA分子；
所述P2纯合型指的是基因组DNA具有（b3）或（b4）且为纯合型；
（b3）序列表中序列4自5’末端第217-2498位核苷酸所示的DNA分子；
（b4）序列表中序列4所示的DNA分子。
6.一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒千粒重的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的基因型为P1纯合型、P1/P2杂合型还是P2纯合型；如果为P1纯合型、待测小麦候选为高千粒重小麦；如果为P2纯合型、待测小麦候选为低千粒重小麦；所述高千粒重小麦为籽粒千粒重≥35g的小麦；所述低千粒重小麦为籽粒千粒重＜35g的小麦；
所述P1纯合型指的是基因组DNA具有（b1）或（b2）且为纯合型；
（b1）序列表中序列3自5’末端第217-2497位核苷酸所示的DNA分子；
（b2）序列表中序列3所示的DNA分子；
所述P2纯合型指的是基因组DNA具有（b3）或（b4）且为纯合型；
（b3）序列表中序列4自5’末端第217-2498位核苷酸所示的DNA分子；
（b4）序列表中序列4所示的DNA分子。
7.一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒粒长的方法，包括如下步骤：检测待测小麦的基因型为P1纯合型、P1/P2杂合型还是P2纯合型；如果为P1纯合型、待测小麦候选为长粒长小麦；如果为P2纯合型、待测小麦候选为短粒长小麦；所述长粒长小麦为籽粒粒长≥0.65mm的小麦；所述短粒长小麦为籽粒粒长＜0.65mm的小麦；
所述P1纯合型指的是基因组DNA具有（b1）或（b2）且为纯合型；
（b1）序列表中序列3自5’末端第217-2497位核苷酸所示的DNA分子；
（b2）序列表中序列3所示的DNA分子；
所述P2纯合型指的是基因组DNA具有（b3）或（b4）且为纯合型；
（b3）序列表中序列4自5’末端第217-2498位核苷酸所示的DNA分子；
（b4）序列表中序列4所示的DNA分子。
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