CN110139872A - 植物籽粒性状相关蛋白、基因、启动子和snp以及单倍型 - Google Patents

植物籽粒性状相关蛋白、基因、启动子和snp以及单倍型 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种植物籽粒性状相关蛋白及其编码基因和应用。本发明提供了TaTPP‑7A蛋白，是由序列表中SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列组成的蛋白质。编码TaTPP‑7A蛋白的基因也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将TaTPP‑7A基因导入出发植物，得到转基因植物；所述转基因植物满足如下至少一种：(e1)籽粒千粒重大于所述出发植物；(e2)籽粒粒重大于所述出发植物；(e3)籽粒大于所述出发植物；(e4)籽粒粒长大于所述出发植物；(e5)籽粒粒宽大于所述出发植物；(e6)籽粒粒厚大于所述出发植物。因此，本发明所提供的蛋白质及其编码基因可以用于植物品质改良以及增加植物籽粒产量，具有广阔的应用前景。本发明还提供了与上述籽粒特征相关的SNP标志物以及单倍型。

Description

植物籽粒性状相关蛋白、基因、启动子和SNP以及单倍型
技术领域
本发明涉及编码海藻糖-6磷酸磷酸酶(TPP)的植物籽粒性状相关蛋白以及来自小麦的编码基因(TaTPP)及其用于改变籽粒性状的用途，例如增加籽粒长度，籽粒宽度，千粒重，穗长，籽粒数和最终籽粒产量。本发明还提供了单核苷酸多态性(SNP)标志物，其与TPP编码区中以及启动子区域中增加的籽粒长度，宽度和千粒重(thousand grain or kernelweight)相关。本发明还提供了启动子区域，并鉴定了与籽粒长度、籽粒宽度和千粒重增加相关的更强启动子区域，其可用于增加任何感兴趣的编码区域的谷类植物(例如小麦)中的表达。本发明进一步鉴定了在谷物例如小麦中有利于增加籽粒长度，籽粒宽度，千粒重以及最终的产量的单倍型。
背景技术
小麦是中国和世界上重要的粮食作物之一，直接影响着人民生活水平的高低和国家的粮食安全。提高小麦单产、促其高产稳产、一直以来也是中国小麦育种家们长期追求的主要目标。增加小麦产量的需求与例如粮食种植面积的日益减少、土地沙漠化、盐碱化、全球气候变暖以及人口增长基数等冲突情况相矛盾。因此，提高或增加小麦单产，解决日益增长的口粮需求问题的方法成为越来越突出和重要的育种任务。因此，利用分子生物学技术克隆小麦产量相关功能基因，对其功能进行深入解析，对于小麦分子标志物辅助育种标志物开发、提供重要参考基因资源、加速我国小麦育种进程、提高我国小麦产量等方面具有重要的科学意义和实际应用价值。
粒重是产量的三要素之一，决定粒重的关键因素包括籽粒型和籽粒的灌浆速率。在籽粒生产和育种中，千粒重常被用作为衡量籽粒大小的指标，后者本身主要由粒型性状参数(如粒长、粒宽和粒厚)构成并且是产量的正向指标。
发明概述
本发明提供一种具有海藻糖-6磷酸磷酸酶酶活性的蛋白质，其选自：
a.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质；
b.包含与SEQ ID No：1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；
c.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质，其中一个或多个氨基酸残基被取代或缺失或插入，并且其中蛋白质的存在与增加的籽粒长度，籽粒宽度或增加的千粒重相关，例如根据SEQ ID No：1的蛋白质，其中112位的Asp残基被Glu残基取代，和/或其中241位的Ala残基被Val残基取代。
在另一个实施方案中，本发明提供核酸，例如DNA或RNA分子，其包含编码权利要求1的蛋白质的核苷酸序列。核酸可选自：
a.核酸，例如DNA分子，包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列；
b.核酸，例如DNA分子，包含核苷酸位置23至核苷酸位置2115的SEQ ID NO：3的核苷酸序列；
c.核酸，例如DNA分子，包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列；
d.一种核酸，例如DNA分子，其在严格条件下与上述a至c中任一项的DNA分子杂交，并编码权利要求1的蛋白质；
e.核酸，例如DNA分子，其包含与核苷酸位置23至核苷酸位置2115的SEQ ID NO：3的核苷酸序列或SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了重组表达盒，其包含以下可操作连接的DNA元件：
a.植物可表达启动子，例如异源植物可表达启动子
b.编码权利要求1的蛋白质的DNA区域或权利要求2的DNA区域；
c.作为转录终止和多腺苷酸化区域的DNA区域，例如在植物中起作用的转录终止和多腺苷酸化区域。
本发明还提供了含有本文所述核酸或本文所述重组表达盒的重组表达载体、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物或重组菌株、或籽粒或种子。所述植物可以是谷类植物，例如小麦植物。
在另一个实施方案中，本发明提供了如本文所述的蛋白质在以下方面的用途：
a.调节植物籽粒的大小，例如增加或减少籽粒长度或籽粒宽度，特别是小麦植物籽粒的大小；
b.增加植物籽粒的大小，特别是小麦植物籽粒的大小；
c.调节植物籽粒的千粒重，例如增加或减少籽粒长度或籽粒宽度，特别是小麦植物籽粒的千粒重；
d.增加千粒重，特别是小麦植物籽粒的千粒重；
e.调节植物籽粒的粒重，例如增加或减少籽粒长度或籽粒宽度，特别是小麦植物籽粒的粒重；
f.增加植物籽粒粒重，特别是小麦籽粒的粒重；
g.调节植物籽粒的粒长，例如增加或减少籽粒长度或籽粒宽度，特别是小麦植物籽粒的粒长；
h.增加植物籽粒，特别是小麦植物籽粒的粒长；
i.调节植物籽粒的粒宽，例如增加或减少籽粒长度或籽粒宽度，特别是小麦植物籽粒的粒宽；
j.增加植物籽粒，特别是小麦植物籽粒的粒宽；
k.调节植物籽粒的粒厚，例如增加或减少籽粒长度或籽粒宽度，特别是小麦植物籽粒的粒厚；
1.增加植物籽粒，特别是小麦植物籽粒的粒厚；
m.增加植物，特别是谷类植物如小麦的分蘖长度；
n.增加植物，特别是谷类植物如小麦的穗长；
o.提高植物如谷类植物如小麦的籽粒产量。
在另一个实施方案中，提供了一种生产植物、例如谷类植物、包括小麦植物的方法，包括以下步骤：
a)增加如本文所述蛋白质的水平和/或活性；或
b)增加本文所述核酸在植物细胞或植物中的表达
c)将本文所述的重组表达盒导入植物细胞或植物中，以获得转基因植物，
其中植物具有
1)在籽粒中比所述出发植物或对照植物增加的千粒重；
2)在籽粒中比所述出发植物或对照植物增加的粒重；
3)籽粒大小大于所述出发植物或对照植物的籽粒大小；
4)在籽粒中比所述出发植物或对照植物更长的粒长；
5)在籽粒中比所述出发植物或对照植物更宽的粒宽；
6)在籽粒中比所述出发植物或对照植物更厚的粒厚；
7)比所述出发植物或对照植物增加的分蘖长度；
8)比所述出发植物或对照植物增加的穗长；
9)比所述出发植物或对照植物增加的籽粒数；或
10)比所述出发植物或对照植物增加的籽粒产量；
本发明还提供了一种方法，以
(1)增加籽粒中的千粒重；
(2)增加籽粒中的粒重；
(3)增加籽粒大小；
(4)增加籽粒的长度；
(5)增加籽粒的宽度；
(6)增加籽粒的厚度；
(7)增加植物分蘖长度；
(8)增加植物的穗长；
(9)增加植物中的籽粒数量；或
(10)增加植物的籽粒产量。
包括如下步骤：增加植物中本文所述的蛋白质的含量或活性，所述植物例如谷类植物，包括小麦植物。
在本发明的另一方面，提供了包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的核苷酸序列或含有与其至少90％，95％或99％序列同一性的核苷酸序列的分离的启动子区。
在另一个实施方案中，本发明提供了重组基因，所述重组基因包含以下可操作地连接的DNA片段：
a.如本文所述的启动子区；
b.编码目标RNA分子或蛋白的DNA区域
c.在植物细胞中具有功能的转录终止和多聚腺苷酸化区。
还提供了一种植物，例如谷类植物，包括小麦植物，其含有本发明重组基因。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒性状，例如小麦籽粒的千粒重或小麦籽粒的粒长的方法，包括以下步骤：
检测基于待测小麦基因组DNA中488SNP位点基因型是AA基因型，AC基因型还是CC基因型；AA基因型的小麦比CC基因型的小麦具有更好的籽粒性状；
更好的籽粒性状表现为更高的千粒重和/或更长的粒长；
488SNP位点是指SEQ ID NO：24的5′端22位的核苷酸。
本发明还提供了一种用于检测小麦基因组DNA中基于488SNP位点的基因型的材料的用途，用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒性状；所述籽粒性状是千粒重和/或粒长，以及由488F1、488F2和488C组成的引物组I；
所述引物488F1是(b1)或(b2)，如下所述：
(b1)如SEQ ID NO：21所示的单链DNA分子；
(b2)DNA分子，其通过对SEQ ID NO：21进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加而获得，并具有与SEQ ID NO：21相同的功能；
所述引物488F2是(b3)或(b4)，如下所述：
(b3)如SEQ ID NO：22所示的单链DNA分子
(b4)DNA分子，其通过对SEQ ID NO：22进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加而获得，并具有与SEQ ID NO：22相同的功能；
所述引物488C是(b5)或(b6)，如下所述：
(b5)如SEQ ID NO：23所示的单链DNA分子；
(b6)DNA分子，通过对SEQ ID NO：23进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加而获得，并具有与SEQ ID NO：23相同的功能。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒性状如千粒重或粒长的方法，包括以下步骤：
检测待测小麦基因组DNA中基于2144SNP位点的基因型是AA基因型，AT基因型还是TT基因型；AA基因型的小麦具有比TT基因型的小麦更好的籽粒性状；
更好的籽粒性状表现为更高的千粒重和/或更长的粒长；
2144SNP位点是指SEQ ID NO：30的5′端24位的核苷酸。
本发明还提供了一种引物组I，其由2144F1、2144F2和2144C组成；
所述引物2144F1是(b1)或(b2)，如下所述：
(b1)如SEQ ID NO：27所示的单链DNA分子；
(b2)DNA分子，其通过对SEQ ID NO：27进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加而获得，并具有与SEQ ID NO：21相同的功能；
所述引物2144F2是(b3)或(b4)，如下所述：
(b3)如SEQ ID NO：28所示的单链DNA分子
(b4)DNA分子，其通过对SEQ ID NO：28进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加而获得，并具有与SEQ ID NO：22相同的功能；
所述引物2144C是(b5)或(b6)，如下所述：
(b5)如SEQ ID NO：29所示的单链DNA分子；
(b6)DNA分子，其通过对SEQ ID NO：29进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加而获得，并具有与SEQ ID NO：29相同的功能以及其用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒性状的用途；所述籽粒性状为千粒重和/或粒长；或
用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒的千粒重；或
用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒的粒长；
本发明还提供了一种获得小麦植物的方法，所述小麦植物具有
(1)增加的籽粒千粒重；
(2)增加的籽粒粒重；
(3)增加的籽粒大小；
(4)增加的籽粒长度；
(5)增加的籽粒宽度；
(6)增加的籽粒厚度；
(7)增加的植物分蘖长度；
(8)增加的植物穗长；
(9)增加植物中的籽粒数量；或
(10)增加的植物中的籽粒产量
所述方法包括选择具有单倍型HapI的小麦植物的步骤。
附图描述
图1：来自下述小麦品系的籽粒的籽粒特征：其中TPP表达通过过表达TaTPP嵌合基因(TaTPP-OE)而增加的小麦品系，或通过表达沉默RNA的嵌合基因(TaTPP-RNAi)降低TPP表达的小麦品系。图A.小麦中TaTPP过量表达对籽粒的影响。TaTPP5-3；TaTPP-10-4和TaTPP-13-7是TPP过表达品系。阴性对照：未转化的小麦品种Fielder。图B.小麦中TPP过表达或减少表达对籽粒长度的影响。TaTPP-OE：来自过表达TaTPP的转基因小麦品系的籽粒。TaTPP-RNai：来自转基因小麦品系的籽粒，其中通过沉默RNA降低TPP的表达。
图2显示了每个转基因小麦品系中籽粒的平均籽粒长度和平均千粒重。图A：转基因TPP过表达品系TaTPP5-3，TaTPP-10-4和TaTPP-13-7的平均籽粒长度(GL)(em)。NTCK：未转化的fielder。图B：来自如图A中所示的转基因品系和对照品系的籽粒千粒重(g)。图C：野生型对照小麦品系(WT-左栏)，TPP过表达小麦品系(TPO-中间栏)，TPP减少表达小麦品系(TPR-右栏)的千粒重(TKW)(左Y轴以克计)，籽粒长度(GL)和籽粒重量(GW)(右Y轴以cm-计)的图示。对于TKW和GL，WT和TPO，TPO和TPR以及WT和TPR品系之间的平均TKW和GL存在统计学显着差异。对于GW，TPO和WT以及TPO和TPR品系之间存在统计学上显著的差异。
图3显示了与野生型小麦品系(Fielder，WT)相比，小麦TPP表达增加(TPO)或降低(TPR)对lemma长度、宽度以及palea长度和palea宽度的影响。图A.不同转基因品系的palea和lemma的视觉表示。图B.野生型对照小麦品系(WT-左栏)，过量表达TPP的小麦品系(TPO-中间栏)，TPP减少表达小麦品系(TPR-右栏)的lemma长度(mm)lemma宽度(mm)，palea长度(mm)和palea宽度的图示。对于lemma和palea长度，WT和TPR之间以及TPO和TPR品系之间存在统计学上显著的差异。对于lemma和palea宽度，TPO与WT和TPR品系之间存在统计学上显着的差异。
图4显示了小麦TPP表达增加(TPO系)或减少(TPR系)对穗长和分蘖长度的影响。第1道：Fielder；第2道：TPR 47-1-1；第3道：TPR 7-2-3；第4道：TPR-68-12-4；第5道：TPO-6-5-3；第6道：TPO-5-4-2；第7道：TPO-14-3-9。
图5显示了与未转化的WT拟南芥品系相比，TaTPP过表达在转基因拟南芥品系(TaTPP-OE)中对生长和发育(图A)，以及对豆荚大小和形态(图B)以及籽粒大小和形态(图C)的影响。
图6是TaTPP启动子区和编码区(基因组)的图示，指出了不同SNP。由于在核苷酸序列中使用差异参考点，位置-2090处的SNP对应于SNP409/410，位置-2006处的SNP对应于SNP493，位置-1291处的SNP对应于SNP1208，位置-783处的SNP对应于SNP1708，位置-511处的SNP对应于SNP1980，位置+466处的SNP对应于SNP488，位置1278处的SNP对应于位置1300并且位置2122处的SNP对应于SNP2144。方框对应于TaTPP-7A外显子(对于外显子的核苷酸和位置，参见SEQ ID No.3)。对于启动子区的核苷酸序列，参见SEQ ID Nos14和15。ATG：起始密码子；TSS：转录起始位点；TAG：翻译终止密码子；polyA：多腺苷酸化位点。Hap I，HapII和Hap III代表小麦中经常出现的单倍型，并且表明一起出现的不同单倍型中的不同SNP位置处存在的SNP的核苷酸。
图7与用空载体转化的转基因烟草相比，在烟草(Nicotiana tabacum)中HapI(Luc-HapI P；SEQ ID No 14)和HapII(Luc-HapII P；SEQ ID No 15)的TaTPP启动子控制下的荧光素酶的表达(LUC-EV)。图A：荧光图像和平均值。图B：不同阶段的叶中的荧光。可以看出，HapI启动子在表达方面比HapII启动子显著更强(约强3倍)。
图8.图A.在历史上发展的中国小麦品种中不同单倍型Hap I、Hap II和Hap III的相对发生率。在20世纪30年代，所有分析的中国品种都有Hap II单倍型(中间条)，从20世纪40年代开始，Hap I单倍型的相对发生率稳定增加(左条)，而HapII(中间条)和Hap III发生率逐渐减少。这与千粒重(由虚线表示)随时间的增加相关。图B.不同单倍型的地理分布。在中国，大多数分析的小麦品系都表现出Hap I单倍型。在俄罗斯联邦，Hap I单倍型也主要存在，但Hap III的存在也很显著，甚至Hap II也有代表。在北美和中美洲，欧洲和澳大利亚，分析的品系的主要单倍型是Hap III，仅有HapI的少量相对发生率。
各种定义
也可以使用具有TaTPP基因或其部分的核苷酸序列的探针杂交来鉴定相关单子叶植物物种或其他栽培种或品种中的TaTPP基因。严格杂交条件，例如下文描述的那些，可用于鉴定与给定的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。例如，来自其他单子叶植物物种而不是本文公开的特定序列的TaTPPC基因被认为是实质上相同或基本相似的，如果它们可以通过在严格的，优选高度严格的条件下杂交检测。严格条件依赖于序列，并且在不同情况下会有所不同。通常，将严格条件选择为在定义的离子强度和pH下比特定序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是50％靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在定义的离子强度和pH下)。通常选择这样的严格条件，其中盐浓度在pH 7下为约0.02摩尔且温度为至少60℃。降低盐浓度和/或升高温度会增加严格性。RNA-DNA杂交的严格条件(使用例如100nt的探针的Northern印迹)是例如包括在0.2X SSC中在63℃下洗涤至少一次20分钟或等同条件的条件。
可以提供“高严格条件”，例如，通过在65℃下在水溶液中杂交，所述水溶液含有6xSSC(20x SSC含有3.0M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)、5x Denhardt′s(100X Denhardt′s包含2％Ficoll，2％聚乙烯吡咯烷酮，2％牛血清白蛋白)，0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)和作为非特定的竞争者的20μg/ml变性载体DNA(单链鱼精DNA，平均长度为120-3000个核苷酸)。杂交后，可以在几个步骤中进行高严格性洗涤，在杂交温度下在0.2-0.1×SSC，0.1％SDS中进行最终洗涤(约30分钟)。
“中等严格条件”是指与上述溶液中的杂交相当但在约60-62℃的条件。可以在1xSSC，0.1％SDS中的杂交温度下进行适度的严格洗涤。
“低严格性”是指与上述溶液中的杂交相当但在约50-52℃的条件。可以在2x SSC，0.1％SDS中的杂交温度下进行低严格洗涤。另见Sambrook等人.(1989)和Sambrook和Russell(2001)。
单子叶植物，也称为单子叶类或单子叶的植物，在本领域中是公知的，并且是在其种子中具有一个子叶的植物。单子叶植物包括稻属物种(Oryza sp)(包括稻)、玉蜀黍物种(Zea sp)(包括玉米)，甘蔗属物种(Saccharum sp)(包括甘蔗)、小麦属物种(Triticum sp)(包括小麦)，大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、黑麦草属(Lolium)、羊茅属(Festuca)、Brachypodium distachion、芭蕉属物种(Musa sp)(包括香蕉)。
在本申请中使用的术语“在所述植物中表达”以及“在植物，植物部分，植物器官或植物细胞中表达”涉及由所述核酸的转录产生的核酸的表达产物的出现。结合根据本发明的方法的一些实施方案，该术语可另外包括引入包含待在植物中表达的核酸的嵌合基因。
嵌合基因是通过可操作地连接无关基因或其他核酸序列的片段而构建的人工基因。换句话说，“嵌合基因”表示通常不在植物物种中发现的基因，或指基因的启动子或一个或多个其他调节区在性质上与部分或全部转录的核酸不相关(即对于转录的核酸而言，它们是异源的)的任何基因，。术语“异源的”是指两种或更多种源自不同来源的核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果通常在自然界中不存在这样的组合，则启动子对于可操作地连接的核酸序列(例如编码序列)是异源的。另外，特定序列对于其所插入的细胞或生物可以是“异源的”(即在该特定细胞或生物中不天然存在)。例如，本文公开的嵌合基因是异源核酸。
嵌合基因还可以包含在植物细胞，特别是单子叶植物，更优选谷类或小麦植物细胞中有功能的转录终止或多腺苷酸化序列。作为转录终止或多腺苷酸化序列，可以使用任何相应的细菌来源序列，例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的nos终止子，病毒来源序列，例如CaMV 35S终止子，或植物来源序列，例如，在公开的专利申请EP 0 633317 A1中描述的组蛋白终止子。
增加TATPP蛋白的表达和/或活性可以增加产生的(功能性)TATPP蛋白的量或增加TATPP的表达和/或活性。与具有野生型TATPP表达水平的细胞产生的(功能性)TATPP蛋白的量相比较，所产生的(功能性)TATPP蛋白量的所述增加可以增加至少2倍，4倍，10倍，25倍，50倍，75倍，100倍或甚至更多。所述表达和/或活性的增加可以是所产生的(功能性)TATPP蛋白量的组成性增加。所述增加也可以是产生的(功能性)TATPP蛋白量的暂时减少。如本申请中其他地方所述，可以测量TATPP的量或活性的增加。TATPP的表达和/或活性的增加可以通过例如将TATPP编码区与启动子(例如下文所述的任何启动子)可操作地连接，从而以例如取决于启动子的选择的组成型、诱导型、时间或组织特异性方式驱动TATPP表达。。
在一个实施方案中，核酸编码锌指蛋白，其与编码植物中存在的TATPP蛋白的基因结合，导致靶基因的表达增加。在特定的实施方案中，锌指蛋白结合所述基因的调节区，从而激活其表达。例如，在US6453242中描述了选择用于锌指蛋白靶向的位点的方法，并且例如在US2003/0037355中描述了使用锌指蛋白抑制植物中基因表达的方法，其中每个都在此引入作为参考。
在另一个实施方案中，核酸编码TALE蛋白，其结合编码植物中存在的TATPP蛋白的基因，导致基因表达增加。在特定实施方案中，TALE蛋白结合所述基因的调节区，从而激活其表达。在其他实施方案中，TALE蛋白结合编码所述蛋白质的信使RNA并阻止其翻译。选择TALE蛋白靶向位点的方法已在例如如下中描述：Moscou MJ，BogdanoveAJ(2009)(A simplecipher governs DNA recognition by TAL effectors.Science 326：1501)和MorbitzerR，Romer P，Boch J，Lahaye T(2010)(Regulation of selected genome loci usig denovo-engineered transcription activator-like effector(TALE)-typetranscription factors.Proc Natl Acad Sci USA 107：21617-21622)。
在又一个实施方案中，所述核酸编码TATPP蛋白，例如本申请其他地方所述的TATPP蛋白。
如本文所用，术语“植物可表达的启动子”是指能够在植物细胞中控制(起始)转录的DNA序列。这包括植物来源的任何启动子，以及能够在植物细胞中指导转录的任何非植物来源的启动子，即病毒或细菌来源的某些启动子，例如CaMV35S(Harpster等人(1988)Mol)Gen Genet.212(1)：182-90，地下三叶草病毒启动子No 4或No 7(WO9606932)，或T-DNA基因启动子，但也包括组织特异性或器官特异性启动子，包括但不限于种子特异性启动子(例如，WO89/03887)，器官-原基特异性启动子(An等(1996)Plant Cell 8(1)：15-30)，茎特异性启动子(Keller等，(1988)EMBO J.7(12)：3625-3633)，叶特异性启动子(Hudspeth等(1989)Plant Mol Biol.12：579-589)，叶肉特异性(mesophyll-specific)启动子(例如光诱导型Rubisco启动子)，根特异性启动子(Keller等(1989)Genes Dev.3：1639-1646)，块茎特异性启动子(Keil等(1989)EMBO J.8(5)：1323-1330)，血管组织特异性启动子(Peleman等人(1989)Gen e84：359-369)，雄蕊选择性启动子(WO 89/10396，WO 92/13956)，开裂区特异性启动子(WO 97/13865)等。“植物可表达的启动子”也可以是诱导型启动子，例如温度诱导型启动子或化学诱导型启动子。
适用于本发明的启动子是组成型植物可表达的启动子，其导致本发明的嵌合基因的组成型表达，并因此导致例如TATPP基因和/或蛋白质的表达和/或活性的组成型增加或减少。组成型植物可表达的启动子是本领域熟知的，包括CaMV35S启动子(Harpster等人(1988)Mol Gen Genet.212(1)：182-90)，肌动蛋白启动子，例如来自Rice Actin基因(McElroy等，1990，Plant Cell 2：163)的启动子，木薯叶脉花叶病毒的启动子(Verdaguer等，1996Plant Mol.Biol.31：1129)，GOS启动子(de Pater等，1992，Plant J.2：837)，组蛋白H3启动子(Chaubet等，1986，Plant Mol Biol 6：253)，根癌农杆菌胭脂碱合酶(Nos)启动子(Depicker等，1982，J.Mol.Appl.Genet.1：561)，或泛素启动子，例如玉米泛素-1基因的启动子(Christensen等，1992，Plant Mol.Biol.18：675)。
用于本发明的其他合适的启动子是诱导型启动子，例如诱导型启动子(例如胁迫诱导型启动子，干旱诱导型启动子，激素诱导型启动子，化学诱导型启动子等)，组织特异性启动子，发育调节启动子等。调节基因表达以响应环境、激素、化学、发育信号和以组织活性方式的多种植物基因启动子可用于在植物中表达序列。启动子的选择主要基于感兴趣的表型，并且由诸如组织(例如，种子，果实，根，花粉，维管组织，花，心皮等)，诱导性(例如，响应于创伤、热、冷、干旱、光、病原体等)，时间，发育阶段等因素决定。
可用于实施本发明的启动子的实例是响应胁迫而引发表达的那些，如响应干旱、低温、盐胁迫或暴露于ABA而激活的RD29启动子(Yamaguchi-Shinozaki等，2004，PlantCell，6卷，251-264；WO12/101118)，以及响应热(例如参见Ainley等(1993)PlantMol.Biol.22：13-23)、光(例如豌豆rbcS-3A启动子，Kuhlemeier等(1989)Plant Cell 1：471-478，及玉米rbcS启动子，Schaffher和Sheen(1991)Plant Cell 3：997-1012)、创伤(例如wunl，Siebertz等(1989)Plant Cell 1：961-968)、病原体(如Buchel等(1999)PlantMol.Biol.40：387-396中所述的PR-I启动子和Manners等(1998)Plant Mol.Biol.38：1071-1080中所述的PDF 1.2启动子)和化学品如茉莉酮酸甲酯或水杨酸(例如参见Gatz(1997)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48：89-108)而诱导的启动子。此外，通过使用诸如在衰老(参见例如Gan和Amasino(1995)Science 270：1986-1988)或晚期种子发育(例如参见Odell等(1994)Plant Physiol.106：447-458)时发挥作用的那些启动子的启动子，可以控制表达的时间。
还可以使用盐诱导型启动子，如稻地方品种Pokkali(PKN)的盐诱导型NHXl启动子(Jahan等，第6届International Rice Genetics研讨会，2009，海报摘要4-37页)，来自小盐芥(Thellungiella halophila)的液泡H+-焦磷酸酶的盐诱导型启动子(TsVP1)(Sun等，BMCPlant Biology 2010，10：90)，编码磷脂过氧化氢同种型gpxl的甜橙(Citrus sinensis)基因的盐诱导型启动子(Avsian-Kretchmer等，Plant Physiology 2004年7月，第135卷，1685-1696页)。
在备选实施方案中，使用组织特异性和/或发育阶段特异性启动子，例如仅在该组织内在发育阶段的某时间框内可以促进转录的启动子。参见例如Blazquez (1998)PlantCell10：79l-800，其表征拟南芥LEAFY基因启动子。还参见Cardon(1997)Plant J 12：367-77，其描述识别拟南芥花分生组织同一性基因API的启动子区中的保守序列基序的转录因子SPL3；及Mandel(1995)Plant Molecular Biology，第29卷，第995-1004页，其描述分生组织启动子eIF4。可以使用在特定组织的整个生命周期中具有活性的组织特异性启动子。在一方面，本发明的核酸与主要仅在棉纤维细胞中具有活性的启动子有效连接，在一方面，本发明的核酸与主要在棉纤维细胞伸长阶段具有活性的启动子有效连接，例如，如Rinehart(1996)上文所述。核酸可以与将优先在棉纤维细胞中表达的FbI2A基因启动子有效连接(同上)。还参见John(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5769-5773；John等，美国专利号5,608,148和5,602,321，其描述棉纤维特异性启动子和用于构建转基因棉植物的方法。还可以用根特异性启动子来表达本发明的核酸。根特异性启动子的实例包括来自醇脱氢酶基因的启动子(DeLisle(1990)Int.Rev.Cytol.123：39-60)，及诸如美国专利号5,618,988、5,837,848和5,905,186中所公开的那些的启动子。可用于表达本发明的核酸的其他启动子包括例如胚珠特异性、胚特异性胚乳特异性、珠被特异性、种皮特异性启动子，或其某种组合；叶特异性启动子(参见例如Busk(1997)Plant J.11：12851295，其描述玉米中的叶特异性启动子)；来自发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的ORF 13启动子(其在根中显示高活性，参见例如Hansen(1997)上文)；玉米花粉特异性启动子(参见例如Guerrero (1990)Mol.Gen.Genet.224：161 168)；可以使用在果实成熟、叶片衰老和脱落期间具有活性的番茄启动子，花的(在较小程度上)保卫细胞优先启动子(例如PCT/EP12/065608中所述)(参见例如Blume(1997)Plant J.12：731 746)；来自马铃薯SK2基因的雌蕊特异性启动子(参见例如Ficker (1997)Plant Mol.Biol.35：425431)；来自豌豆的Blec4基因，其在转基因苜蓿的营养枝顶端和花柄顶端(floral shoot apices)的表皮组织中具有活性，使得它可成为将外来基因的表达靶向至活跃生长的茎(shoot)或纤维的表皮层的有用工具；胚珠特异性BELI基因(参见例如Reiser (1995)Cell 83：735-742，GenBank No.U39944)；和/或Klee，美国专利号5,589,583中的启动子，该专利描述了能够在分生组织和/或快速分裂细胞中赋予高水平转录的植物启动子区。可以用于本发明的其他组织特异性启动子包括：种子特异性启动子(如美国专利号5,773,697中所述的油菜籽蛋白、菜豆蛋白或DC3启动子)，在果实成熟期间具有活性的果实特异性启动子(如dru 1启动子(美国专利号5,783,393)，或2AI 1启动子(例如参见美国专利号4,943,674)和番茄多聚半乳糖醛酸酶启动子(例如参见Bird等(1988)Plant Mol.Biol.11：651-662)，花特异性启动子(例如参见Kaiser等(1995)PlantMol.Biol.28：231-243)，花粉活性启动子如PTA29、PTA26和PTAI 3(例如参见美国专利号5,792,929)，如例如Baerson等(1994Plant Mol.Biol.26：1947-1959)中所述，在维管组织(例如参见Ringli和Keller(1998)Plant Mol.Biol.37：977-988)、心皮(例如参见Ohl等(1990)Plant Cell 2：)、花粉和胚珠(例如参见Baerson等(1993)PlantMol.Biol.22：255-267)中具有活性的启动子。在备选实施方案中，用可在暴露于植物激素(如植物生长素)时诱导的植物启动子来表达用于实施本发明的核酸。例如，本发明可以使用大豆{Glycine max L.)中的植物生长素应答元件E1启动子片段(AuxRE)(Liu(1997)Plant Physiol.115：397-407)；植物生长素响应性拟南芥GST6启动子(也响应水杨酸和过氧化氢)(Chen(1996)PlantJ.10：955-966)；来自烟草的植物生长素诱导型parC启动子(Sakai(1996)37：906-913)；植物生物素应答元件(Streit(1997)Mol.Plant Microbe Interact.10：933-937)；及响应胁迫激素脱落酸(ABA)的启动子(Sheen(1996)Science274：1900-1902)。可以使用的其他激素诱导型启动子包括植物生长素诱导型启动子(如van der Kop等(1999)PlantMol.Biol.39：979-990或Baumann等，(1999)Plant Cell 11：323-334中所述的植物生长素诱导型启动子)、细胞分裂素诱导型启动子(例如参见Guevara-Garcia (1998)PlantMol.Biol.38：743-753)、响应赤霉素的启动子(例如参见Shi等(1998)Plant Mol.Biol.38：1053-1060，Willmott等(1998)Plant Molec.Biol.38：817-825)等。
在备选实施方案中，用于实施本发明的核酸也可以与植物启动子有效连接，所述植物启动子是在暴露于可应用于植物的化学试剂如除草剂或抗生素时诱导的植物启动子。例如，可以使用由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2-2启动子(De Vevlder(1997)Plant Cell Physiol.38：568-577)；不同除草剂安全剂的应用诱导不同的基因表达模式，包括根、排水器和茎端分生组织中的表达。编码序列可以处在例如四环素诱导型启动子(例如就包含燕麦(Avena sativa L)精氨酸脱羧酶基因的转基因烟草植物所述(Masgrau(1997)Plant J.11：465-473))或水杨酸应答元件(Stange(1997)PlantJ.11：1315-1324)的控制之下。使用化学{例如激素或杀虫剂)诱导型启动子，即响应可应用于大田中的转基因植物的化学品的启动子，可以在植物的特定发育阶段诱导本发明的多肽表达。还可以用美国专利号6,784,340和Zuo等(2000，Plant J.24：265-273)中所述的雌激素诱导型表达系统来驱动用于实施本发明的核酸的表达。
在备选实施方案中，可以使用这样的启动子，该启动子的宿主范围限于靶植物物种，如玉米、稻、大麦、小麦、马铃薯或其他作物，可在作物的任何发育阶段诱导。
在备选实施方案中，组织特异性植物启动子可以驱动有效连接的序列在特异性靶组织之外的组织中表达。在备选实施方案中，使用驱动优先在靶组织或细胞类型中表达但也可以在其他组织中产生一些表达的组织特异性启动子。
根据本发明，还可以与启动子一起使用位于启动子和编码序列之间的其他调节序列，例如转录激活因子(“增强子”)，例如申请WO 87/07644中所述的烟草花叶病毒(TMV)翻译激活因子，或例如Carrington&Freed 1990，J.Virol.64：1590-1597所述的烟草蚀纹病毒(TEV)的翻译激活因子。
增强本发明核酸表达的其他调节序列也可位于嵌合基因内。这种调节序列的一个例子实例是内含子。内含子是存在于前mRNA中的间插序列，但是在通过精确的剪接机制切除后在成熟RNA中不存在。天然内含子增强基因表达的能力，称为内含子介导的增强(IME)的过程，已在各种生物中已知，包括哺乳动物、昆虫、线虫和植物(WO 07/098042，第11-12页)。IME通常被描述为转录后机制，其通过稳定转录物导致基因表达增加。内含子需要以正常方向位于启动子和编码序列之间。然而，一些内含子也被描述为影响翻译，起启动子作用，或作为位置和方向独立的转录增强子发挥作用(Chaubet-Gigot等，2001，Plant MolBiol.45(1)：17-30。第27-28页)。
关于本发明，含有这种内含子的基因的合适实例包括来自以下的5’内含子：稻肌动蛋白1基因(参见US5641876)、稻肌动蛋白2基因、玉米蔗糖合酶基因(Clancy和Hannah，2002，Plant Physiol.130(2)：918-29)、玉米醇脱氢酶-1(Adh-1)和Bronze-1基因(Callis等1987Genes Dev.1(10)：1183-200；Mascarenhas等1990，Plant Mol Biol.15(6)：913-20)、玉米热休克蛋白70基因(参见US5593874)、玉米皱缩1基因、马铃薯(Solanumtuberosum)光敏感1基因、矮牵牛(Petunia hybrida)热休克蛋白70基因(参见US5659122)、来自首蓿的替换组蛋白H3基因(Keleman等2002Transgenic Res.11(1)：69-72)和拟南芥替换组蛋白H3(组蛋白H3.3样)基因(Chaubet-Gigot等，2001，Plant Mol Biol.45(1)：17-30)。
其他适宜的调节元件包括5’UTR。本文所用的5’UTR(也称为前导序列)是信使RNA(mRNA)的位于转录起始位点和编码区的起始密码子之前的特定区域。它涉及mRNA稳定性和翻译效率。例如，可以利用35S转录起始位点下游的矮牵牛叶绿素a/b结合蛋白基因的5’非翻译前导序列来增强报告基因表达的稳态水平(Harpster等，1988，Mol Gen Genet.212(1)：182-90)。WO95/006742描述了用源自编码热休克蛋白的基因的5’非翻译前导序列来增加转基因表达。本文所用的“参与转录终止和植物多聚腺苷酸化的”3′末端区域是驱动新生RNA裂解的序列，然后在得到的RNA 3′末端加入poly(A)尾，作用于植物细胞。在植物细胞中起作用的转录终止和多腺苷酸化信号包括但不限于3′nos、3′35S、3′his和3′g7。
在这方面，“引入”涉及通过人工方法(例如转化)将遗传信息置于植物细胞或植物中。这可以通过本领域已知的用于将RNA或DNA引入植物细胞、组织、原生质体或整个植物的任何方法来实现。除了如上所述的人工引入之外，“引入”还包括如下文进一步定义的基因渐渗。
植物的转化意指以导致序列的稳定或瞬时表达的方式将核酸分子引入植物。单子叶植物和双子叶植物细胞的转化和再生现在都是常规操作，最适合的转化技术的选择将由实施者决定。方法的选择将随待转化的植物类型而变：本领域技术人员将意识到具体方法对给定植物类型的适合性。适宜的方法包括但不限于：植物原生质体电穿孔；脂质体介导转化；聚乙二醇(PEG)介导转化；用病毒转化；植物细胞显微注射；植物细胞微射弹轰击；真空渗入；及农杆菌介导转化。
在备选实施方案中，本发明使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化。还可以使用能够将核酸分子转移到植物细胞中的其他细菌，例如某些根瘤菌目(Rhizobiales)的土壤细菌，如根瘤菌科(Rhizobiaceae)(例如根瘤菌属物种(Rhizobiumspp.)、中华根瘤菌属物种(Sinorhizobium spp.)、农杆菌属物种(Agrobacterium spp.))；叶杆菌科(Phyllobacteriaceae)(例如中生根瘤菌属物种(Mesorhizobium spp.)、叶杆菌属物种(Phyllobacterium spp.))；布鲁氏菌科(Brucellaceae)(例如慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)(例如慢生根瘤菌属物种(Bradyrhizobium spp.))；及黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)(例如固氮根瘤菌属物种(Azorhizobium spp.))、农杆菌属物种、根瘤菌属物种、中华根瘤菌属物种、中生根瘤菌属物种、叶杆菌属物种、苍白杆菌属物种(Ochrobactrum spp.))和慢生根瘤菌属物种，其实例包括苍白杆菌属物种、根瘤菌属物种、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。根瘤菌的实例包括豌豆根瘤菌三叶草生物变种(R.leguminosarumbv，trifolii)、豌豆根瘤菌菜豆生物变种(R.leguminosarum bv，phaseoli)和豌豆根瘤菌蚕豆生物变种(Rhizobiumleguminosarum，bv，viciae)(美国专利7,888,552)。能够转化植物细胞并诱导DNA引入植物基因组的可用于实施本发明的其他细菌有固氮菌属(Azobacter)(需氧)、新月藻属(Closterium)(严格厌氧)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(选择性需氧)和红螺菌属(Rhodospirilllum)(厌氧，具有光合活性)的细菌。还发现Ti质粒的转移赋予若干根瘤菌科成员如三叶草根瘤菌(Rhizobium trifolii)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)和紫金牛叶杆菌(Phyllobacterium myrsinacearum)肿瘤诱导能力，而根瘤菌属物种NGR234、苜蓿中华根瘤菌和百脉根中生根瘤菌实际上可修饰为介导基因转移至许多多样的植物(Broothaerts等，2005，Nature，433：629-633)。
在备选实施方案中，制备转基因植物或种子包括引入用于实施本发明的序列，并且在一个方面(任选地)，将标记基因引入靶表达构建体(例如质粒)；以及启动子和终止子序列的定位。这可涉及通过合适的方法将修饰的基因转移到植物中。例如，可以使用诸如电穿孔和显微注射植物细胞原生质体的技术将构建体直接引入植物细胞的基因组DNA中，或者可以使用弹道方法(例如DNA粒子轰击)将构建体直接引入植物组织。例如参见如Christou(1997)Plant MoI.Biol.35：197-203；Pawlowski(1996)MoI.Biotechnol.6：17-30；Klein(1987)Nature327：70-73；Takumi(1997)Genes Genet.Syst.72：63-69，讨论使用粒子轰击将转基因引入小麦；和Adam(1997)同上，使用粒子轰击将YAC引入植物细胞中。例如，Rinehart(1997)同上，使用粒子轰击来产生转基因棉花植物。用于加速颗粒的装置描述于美国专利号5,015,580；和市售的BioRad(Biolistics)PDS-2000粒子加速仪；还参见John，美国专利号5,608,148；和Ellis，美国专利号5,681,730，描述了裸子植物的粒子介导的转化。
在备选实施方案中，可以固定原生质体并注射核酸，例如表达构建体。尽管谷物不易从原生质体再生植物，但使用来自原生质体来源的愈伤组织的体细胞胚胎发生的豆科植物可以进行植物再生。有组织的组织可以使用基因枪技术用裸DNA转化，其中DNA被涂在钨微粒上，射出细胞大小的1/100，将DNA深入细胞和细胞器。然后通常通过体细胞胚胎发生诱导转化的组织再生。这种技术在包括玉米和稻的几种谷物中已经成功。
在备选实施方案中，第三步可涉及选择和再生能够将引入的靶基因传递给下一代的整株植物。这类再生技术依赖于在组织培养生长培养基中操作某些植物激素，通常依赖于与所希望的核苷酸序列一起引入的杀生物剂和/或除草剂标志。Evans等，ProtoplastsIsolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，第124-176页，MacMillilanPublishing Company，New York，1983和Binding，Regeneration of Plants，PlantProtoplasts，第21-73页，CRC Press，Boca Raton，1985中描述了从培养的原生质体再生植物。还可以从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得再生。这类再生技术概述于Klee(1987)Ann.Rev.ofPlant Phys.38：467-486中。为了从转基因组织如未成熟胚获得整株植物，可以在一系列包含营养物和激素的培养基中在受控环境条件下培养它们(称为组织培养的方法)。一旦产生整株植物并产生种子，即开始评价子代。
根据病毒基因组的性质，病毒转化(转导)也可用于基因的瞬时或稳定表达。将所需的遗传物质包装到合适的植物病毒中，并使修饰的病毒感染植物。感染植物的后代不含病毒，也不含插入的基因。用于病毒转化的合适方法描述或进一步详述在WO 90/12107、WO03/052108或WO 2005/098004中。
在备选实施方案中，在嵌合基因稳定引入转基因植物中后，可通过有性杂交或基因渐渗将其引入其它植物中。根据待杂交的物种，可以使用许多标准育种技术中的任意种。由于本发明核酸的转基因表达导致表型变化，包含本发明重组核酸的植物可与第二植物进行有性杂交，以获得最终产物。因此，本发明的种子可以源自本发明的两种转基因植物之间的杂交，或本发明的植物与另一种植物之间的杂交。当两种亲本植物表达多肽，例如本发明的TaTPP基因时，可以增强所需的效果(例如，本发明多肽的表达以产生其中开花行为改变的植物)。通过标准传播方式可以将期望的效果传递给未来的植物世代。
通过用克隆序列转化来修饰植物特征的成功实例，其用于说明该技术领域中的当前知识，并且包括例如：美国专利号5,571,706；5,677,175；5,510,471；5,750,386；5,597,945；5,589,615；5,750,871；5,268,526；5,780,708；5,538,880；5,773,269；5,736,369和5,619,042。
在一些实施方案中，在转化后，使用引入转化载体中的显性选择标记选择植物。这种标记可以赋予转化植物抗生素或除草剂抗性，并且可以通过将植物暴露于适当浓度的抗生素或除草剂来完成转化体的选择。
在一些实施方案中，在选择转化植物并使其生长至成熟后，鉴定显示出修饰性状的那些植物。修饰的性状可以是上述任何性状。在备选实施方案中，为了确认修饰的性状是由于转基因多肽或核酸的表达水平或活性的变化导致的，可以通过使用Northern印迹、RT-PCR或微阵列分析mRNA表达，或使用免疫印迹、Western印迹或凝胶阻滞分析来分析蛋白质表达。
“渐渗”意指通过自然手段使核酸整合在植物基因组中，即通过使包含本文所述嵌合基因或突变等位基因的植物与不包含该嵌合基因或突变等位基因的植物杂交。可以针对包含嵌合基因或突变等位基因的那些选择子代。
谷类植物，也称为谷类植物，包括但不限于稻(Oryza sativa)、小麦(Triticumaestivum)硬粒小麦、硬粒小麦(Triticum durum)、玉米或玉米(Zea mays)、薏苡仁、salay、tigbe、pawas(Coix lachryma-jobi)、大麦(Hordeum vulgare)、小米(Panicum miliaceum、Eleusine coracana、Setaria italica、Pennisetum glaucum)、高粱(Sorghum bicolor)、燕麦(Avena sativa)、黑麦(Secale cereale)、小黑麦(xTriticosecale)、埃塞俄比亚画眉草(Teff)、taf或khak shir(Eragrostis tef)、Fonio(Digitaria exilis)、野生稻、加拿大大米、印度大米、Zizania spp.、小麦(Triticum spelta)、金丝雀草(虉草属物种(Phalarissp.))。
本文使用的小麦植物是小麦属物种(Triticum ssp)的植物，例如小麦和硬粒小麦或小麦。
如本文所用，至少80％的序列同一性可以是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
如本文所用，核酸或多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA。核酸可以化学合成或通过体外或甚至体内的生物表达产生。可以使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪化学合成核酸。RNA合成试剂的供应商例如是Proligo(Hamburg，德国)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，美国)、Pierce Chemical(Perbio Science的一部分，Rockford，IL，美国)，Glen Research(Sterling，VA，美国)、ChemGenes(Ashland，MA，美国)和Cruachem(Glasgow，英国)。就本公开的嵌合基因而言，DNA包括cDNA和基因组DNA。
本文所用的术语“蛋白质”或“多肽”描述了由超过30个氨基酸组成的一组分子，而术语“肽”描述了由最多30个氨基酸组成的分子。蛋白质和肽可以进一步形成二聚体、三聚体和更高级的寡聚体，即由一个以上(多)肽分子组成。形成这种二聚体、三聚体等的蛋白质或肽分子可以是相同的或不同的。因此，相应的更高级结构称为同二聚体或异二聚体，同源或异源三聚体等。术语“蛋白质”和“肽”也指天然修饰的蛋白质或肽，其中所述修饰例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化等实现。这些修饰在本领域中是公知的。
术语“包含”应解释为指定部分、步骤或组分的存在，但不排除存在一个或多个另外的部分，步骤或组分。因此，包含特定性状的植物可以包含另外的性状。
应当理解，当提及单数(例如植物或根)中的词汇时，本文还包括复数(例如多株植物，多条根)。因此，不定冠词“一”或“一个”对元件的引用并不排除存在多于一个元件的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个元件。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意味着“至少一个”。
为了本发明的目的，两个相关核苷酸或氨基酸序列的表示为百分比的“序列同一性”指两个最佳比对的序列中具有相同残基的位置数除以所比较的位置数(x100)。将缺口(即比对中在一个序列中存在残基但在另一个序列中不存在残基的位置)视为具有不同残基的位置。
通过Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970，1970，J Mol Biol 48(3)：443-53)进行两个序列的比对。使用标准软件程序，如作为Wisconsin PackageVersion 10.1(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin，USA)的部分的GAP，使用缺口产生罚分50和缺口延伸罚分3的默认评分矩阵，可以方便地进行以上计算机辅助序列比对。
根据The European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS，Rice等，2000，Trends in Genetics 16(6)：276—277；参见例如http：//www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html)中的Needleman和Wunsch全局比对算法(Needleman和Wunsch，1970，JMol Biol 48(3)：443-53)，使用默认设置(缺口开放罚分＝10(对于核苷酸)/10(对于蛋白质)和缺口延伸罚分＝0.5(对于核苷酸)/0.5(对于蛋白质))，通过在整个长度上比对两个序列，找到两个序列的“最佳比对”。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是EDNAFULL，对于蛋白质，默认评分矩阵是EBLOSUM62。
如本文所用，“基本上相同的”或“基本上相似的”是指序列，其在如上定义的最佳比对时，共享至少一定的最小百分比的序列同一性(如下文进一步定义)。
每当提及根据本发明的“植物”或“多株植物”时，应理解为包括植物部分细胞、组织或器官、种子荚、种子、分离的部分，例如根、叶、花、花粉等。每当提及根据本发明的“植物”或“多株植物”时，应理解植物的后代也保留了亲本的区别特征(特别是调节的开花时间、种子发育、种子成熟或调节的种子萌发)，所述后代是例如通过自交或交叉获得的种子，例如除非另有说明，杂交种子(通过杂交两个近交亲本系获得)、杂交植物和由其衍生的植物部分包括在本文中，例如包含根据本发明的嵌合基因或突变/敲除TATPP等位基因的后代。
如本文所用，“产生繁殖材料”涉及本领域已知的用于产生其他植物、植物部分或种子的任何手段，并且尤其包括营养繁殖方法(例如空气或地面压条、分枝、(芽)嫁接、微繁殖，匍匐茎或者纤匐枝、储存器官，如鳞茎，球茎，块茎和根茎，打击或切割(striking或cutting)，双鳞(twin-scaling))，有性繁殖(与另一种植物杂交)和无性繁殖(如无融合生殖、体细胞杂交)。
除非实施例中另有说明，所有重组DNA技术均按Sambrook等(1989)MolecularCloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY中及Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA的第1和2卷中所述的标准流程进行。BIOS Scientific Publications Ltd (UK)和BlackwellScientific Publications，UK联合出版的R.D.D.Cray的Plant Molecular BiologyLabfax(1993)中描述了用于植物分子研究的标准材料和方法。标准分子生物学技术的其他参考文献包括Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Brown(1998)Molecular BiologyLabFax，第2版，Academic Press(UK)的第I和II卷。用于聚合酶链反应的标准材料和方法可见于Dieffenbach和Dveksler (1995)PCR Primer：ALaboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press中，及McPherson等(2000)PCR-Basics：From Background toBench，第1版，SpringerVerlag，德国中。
本文中提到或引用的所有专利、专利申请和出版物或公开(包括互联网上的出版物)以其整体引入作为参考。
本发明的工作受到科技部十三五项目“主要农作物产量性状形成的分子基础(项目批号：2016YFD0100402；任务负责人：刘红霞)”以及国家自然基金“小麦5DS籽粒产量相关重要候选基因的功能分析及其调控机制研究(项目批号：31471492；项目负责人：刘红霞)”的支持。
在整个说明书中，参考序列表中的以下条目：
SEQ ID No.1：TaTPP-7A的氨基酸序列
SEQ ID No.2：TaTPP-7A的编码区(cDNA)的核苷酸序列
SEQ ID No.3：TaTPP-7A的基因组区(gDNA)的核苷酸序列
SEQ ID No.4：正向引物TaTPP-F1
SEQ ID No.5：反向引物TaTPP-R1
SEQ ID No.6：正向引物TaTPPcDNA-F1
SEQ ID No.7：反向引物TaTPPcDNA-R1
SEQ ID No.8：正向引物QST-TPP-7A-F
SEQ ID No.9：反向引物QST-TPP-7A-R
SEQ ID No.10：正向引物(克隆)TPP-TaA-F
SEQ ID No.11：反向引物(克隆)TPP-TaA-R
SEQ ID No 12：正向引物TPP-P-1F(启动子扩增)
SEQ ID No 13：反向引物TPP-P-1R(启动子扩增)
SEQ ID No 14：TPP-7A启动子版本1
SEQ ID No 15：TPP-7A启动子版本2
SEQ ID No 16：正向引物TPP-P-TF
SEQ ID No 17：反向引物TPP-P-TR
SEQ ID No 18：如SEQ ID NO：14中的，SNP493和SNP1980之间的核苷酸序列
SEQ ID No 19：PCR扩增TaTPP版本1的5’端位置467-514之间的核苷酸序列
SEQ ID No.20：PCR扩增TaTPP版本2的5’端位置467-514之间的核苷酸序列
SEQ ID No.21：基于KASP的引物488F1的核苷酸序列
SEQ ID No.22：基于KASP的引物488F2的核苷酸序列
SEQ ID No.23：KASP引物488C的核苷酸序列
SEQ ID No.24：SNP 488标志物的核苷酸序列
SEQ ID No 25：PCR扩增TaTPP版本1的5’末端位置2121-2168之间的核苷酸序列
SEQ ID No.26：PCR扩增TaTPP版本2的5’末端位置2121-2168之间的核苷酸序列
SEQ ID No.27：基于KASP的引物2144F1的核苷酸序列
SEQ ID No.28：基于KASP的引物2144F2核苷酸序列
SEQ ID No.29：KASP引物2144C的核苷酸序列
SEQ ID No.30：SNP 2144C标志物的核苷酸序列
实施例
提供以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不意图限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的测试材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pCambia3301载体：优宝生物，产品编号VT1386。
pWMB003载体：余茂云、殷桂香、张平治、叶兴国，三种适用于作物遗传转化的载体构建与验证，2014学术年会：转基因作物研究及安全管理，58-67。
根癌农杆菌GV3101：参考文献：Yadav S，Sharma P，Srivastava A，Desai P，Shrivastava N.Strain specific Agrobacterium-mediated genetic transformationof Bacopa monnieri.Journal of Genetic Engineering and Biotechnology.2014.12：89-94。
小麦Fielder：参考文献：Richardson T，Thistleton J，Higgins T J，Howitt C，Ayliffe M.Efficient Agrobacterium transformation of elite wheat germplasmwithout selection.Plant Cell Tiss Organ Cult.2014.DOI 10.1007/s11240-014-0564-7。
实施例1、TaTPP-7A蛋白及其编码基因的克隆
根据实验室前期在小麦自然群体(239份小麦品系)中的粒重关联分析、SSR分子标志物在作图群体(小麦粒重F2分离群体)中的精细定位分析、BAC文库筛选以及比较基因组学方法获得的候选基因的基因组序列信息，设计引物，分别从二倍体祖先种A基因组小麦(乌拉尔图小麦)和普通六倍体小麦(中国春小麦)中扩增目的TPP基因。
提取乌拉尔图小麦的基因组DNA，采用TaTPP-F1和TaTPP-R1组成的引物对进行PCR扩增，PCR扩增产物进行TA克隆测序，取15个阳性克隆进行测序。
提取中国春小麦的基因组DNA，先采用TaTPP-F1和TaTPP-R1组成的引物对进行第一轮PCR扩增，然后将第一轮PCR扩增产物作为模板，再采用TaTPP1cDNA-F1和TaTPP1cDNA-R1组成的引物对进行第二轮PCR扩增，PCR扩增产物进行TA克隆测序，取15个阳性克隆进行测序。
测序结果表明，乌拉尔图小麦相应的PCR扩增产物如序列表的SEQ ID NO：3所示，中国春小麦相应的第二轮PCR扩增产物如序列表的SEQ ID NO：3自5’末端第23-2115位核苷酸所示。
将序列表的SEQ ID NO：1所示的蛋白质命名为TaTPP-7A蛋白。将编码TaTPP-7A蛋白的基因命名为TaTPP-7A基因，其基因组序列如序列表的SEQ ID NO：3所示，其cDNA序列如序列表的SEQ ID NO：2所示。
通过比对分析，设计特异的亚基因组定位引物(QST-TPP-7A-F和QST-TPP-7A-R)，并利用小麦第7同源群缺四体材料对上述序列再次进行染色体定位分析，将TaTPP-7A基因定位于小麦7A染色体，进一步将TaTPP-7A基因精细定位于小麦7As上。
TaTPP-F1：5’-CGTGTGGTTGTTTGCGTG-3’(SEQ ID NO：4)；
TaTPP-R1：5’-CTAGATATAGGCGAGGGTTATTAC-3’(SEQ ID NO：5)。
TaTPP1cDNA-F1：5’-ATGGCGAACCAGGACGT-3’(SEQ ID NO：6)；
TaTPP1cDNA-R1：5’-CTACACTCTTGCGCGCAT-3’(SEQ ID NO：7)。
QST-TPP-7A-F：5′-CCATGCCTTGTCCTTGATGT-3′(SEQ ID NO：8)；
QST-TPP-7A-R：5′-AAACCAAGAAAAGCGAGAGATC-3′(SEQ ID NO：9)。
实施例2、过表达TaTPP的转基因小麦植物的生产和鉴定
I、重组质粒的构建
1、合成包含序列表的SEQ ID NO：2的核苷酸序列的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的DNA分子为模板，采用TPP-TaA-F和TPP-TaA-R组成的引物组进行PCR扩增。
TPP-TaA-F：5′-CGGGATCCATGGCGAACCAGGACGT-3′(SEQ ID NO：10)
TPP-TaA-R：5′-CGGAATTCCTACACTCTTGCGCGCAT-3′(SEQ ID NO：11)
3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Bam HI和Eco RI进行双酶切，回收酶切产物。
4、构建重组质粒pWMB110
(1)取pCambia3301载体，用限制性内切酶EcoRI和PmlI进行双酶切，回收载体骨架(约8.5kb)。
(2)取pWMB003载体，用限制性内切酶HindIII和EocRI进行双酶切，回收约2.2kb的Ubi-MCS-Nos片段。
(3)采用In-Fusion HD Cloning Kit(Takara公司产品)将步骤(1)得到的载体骨架和步骤(2)得到的Ubi-MCS-Nos片段连接，得到重组质粒pWMB110。
5、取重组质粒pWMB110，用限制性内切酶Bam HI和Eco RI进行双酶切，回收约10.6kb的载体骨架。
6、将步骤3的酶切产物和步骤5得到的载体骨架连接，得到重组质粒pWMB110-TaTPP-7A。根据测序结果，对重组质粒pWMB110-TaTPP-7A进行结构描述如下：Bam HI和EcoRI酶切位点之间的小片段如序列表的SEQ ID NO：2所示。
II、转基因植物的产生
1、将重组质粒pWMB110-TaTPP-7A导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
2、取步骤1得到的重组农杆菌，对小麦Fielder的幼胚愈伤组织进行遗传转化，然后培养，获得T0再生植株。T0再生植株自交得到T1代植株。T1代植株自交得到T2代植株。
对T0再生植株、T1代植株和T2代植株进行“Bar基因”鉴定和靶基因鉴定。具体步骤如下：先取植株的叶片，采用PAT/bar转基因试剂盒并按说明书操作鉴定Bar基因；Bar基因鉴定呈阳性的植株再进行靶基因鉴定(提取叶片的基因组DNA，采用TPP-TaA-F和TPP-TaA-R组成的引物对进行PCR鉴定，如果得到1.1kb的扩增产物，根据PCR鉴定认为该植株为阳性)。对于特定对于被认为是一个纯合的转基因株系。
随机取三个纯合的转基因株系(TaTPP-5-3株系、TaTPP-10-4株系和TaTP被认为是一个纯合的转基因株系。
随机取三个纯合的转基因株系(TaTPP-5-3株系、TaTPP-10-4株系和TaTPP-13-7株系)进行性状鉴定。
III、空载体转化的对照植株的生产
用重组质粒pWMB110代替重组质粒pWMB110-TaTPP-7A，从而按照部分II所述转化小麦植物，得到空载体转化的对照品系。
IV、性状鉴定
测试的转基因品系为：TaTPP-5-3品系的T2代植株、TaTPP-10-4品系的T2代植株、TaTPP-13-7株系的T2代植株、转空载体的T2代植株品系以及小麦Fielder作为对照植物。
每个株系由50株植株组成。
将各个测试品系进行平行培养(即种植于同一地块，在完全相同的条件下进行培养)，收获期收获籽粒。测量每个株系的籽粒的平均粒长、平均粒宽、平均粒厚和平均千粒重。
图1显示了与未转化的对照植物(Fielder)和转化的对照植物(其中TaTPP的表达降低)相比，来自过表达TaTPP的转基因小麦品系的籽粒的照片。TaTPP-10-4株系的籽粒的表型、TaTPP-13-7株系的籽粒的表型与图1中TaTPP-5-3株系的籽粒的表型没有显著差异。转空载体品系对照植物的籽粒的表型与图1中未转化的对照小麦Fielder的籽粒的表型没有显著差异。来自TaTPP过表达小麦品系的籽粒确实显示出相对于对照植物的籽粒长度，千粒重和籽粒宽度的增加。
图2显示了与未转化的对照植物(Fielder)和转化的对照植物(其中TaTPP的表达降低)相比，来自过表达TaTPP的转基因小麦品系的籽粒长度，千粒重的测量值。
图3显示了测量和照片，其证明过表达Ta TPP的转基因植物具有增加的lemma长度，宽度，palea长度和palea宽度。
图4显示了与未转化的对照植物(Fielder)和转化的对照植物(其中TaTPP的表达降低)相比，过表达TaTPP的转基因植物中分蘖长度和穗长增加的照片。
各株系的籽粒的平均粒长、平均粒宽、平均粒厚和平均千粒重见表1。部分结果见图2。各个转基因株系的籽粒的粒长、粒宽和粒厚均高于小麦Fielder，差异显著。转空载体株系的籽粒的粒长、粒宽和粒厚与小麦Fielder基本一致。三个转基因株系的平均千粒重分别为41.6g、38.53g和40.1g，与小麦Fielder(26.5g)相比，千粒重大幅度提高，差异达极显著水平(P＜0.001)。结果表明，TaTPP-7A蛋白对小麦产量存在正调控作用，有提高千粒重和增长粒长的功效。
表1
实施例3：过表达TaTPP的转基因拟南芥植物的产生和鉴定
如实施例2中所述的重组载体和农杆菌也用于产生过表达TaTPP的转基因拟南芥植物。如图5所示，与未转化的拟南芥对照植物相比，这些转基因植物表现出增加的营养生长的生物质产生、改变的荚形态和增加的种子大小。
实施例4.从各种小麦品种的TaTPP中分离启动子区域
I.材料和方法
载体pDONR207：Invitrogen Corporation的产品，质粒图谱登录号：02352
pGWB35：BioVector NTCC Liu J，Zhang TR，Jia J Z，Sun JQ.2016。小麦介质亚基TaMED25与转录因子TaEIL1相互作用，负调节抗白粉菌(Powdery Mildew)的抗病性。PlantPhysiology.170：1799-1816。
在这些实施例中使用的烟草是Nicotiana benthamiana。参考文献：农杆菌介导的烟草瞬时表达影响因素研究；孙蔓莉、孟玉玲、张强、黄桂艳、单卫星；西北农业学报，2015，241)：161-165。
实施例中使用的植物成像系统是Nightshade LB985，Berthold technologies。
II.从小麦中分离两种不同类型的Ta TPP-7A启动子
选择具有不同籽粒性状的34个小麦品系(编号C1-34见表2)作为分离TaTPP-7A的启动子区域的材料。
每条测试品系都经过以下步骤：
1.提取测试小麦品系的基因组DNA
2.使用步骤1中提取的基因组DNA作为模板，通过使用由TPP-P-1F和TPP-P-1R组成的引物对进行PCR扩增，以获得PCR扩增产物。
TPP-P-1F(序列表中的SEQ ID No：12)：5′-GAATGTAGCAGTCCACCTAT-3′；
TPP-P-1R(序列表的SEQ ID No：13)：5′-ACGCAGATCAATCATCAGAA-3”。
3.取步骤2中得到的PCR扩增产物，克隆并测序。每小麦品系二十五个克隆。
4.组装序列并进行比较。
对每种小麦材料的二十五个克隆进行测序并分析TaTPP的A基因组启动子序列。PCR扩增产物由两部分组成，一部分是启动子区(从5′端到ATG起始密码子)，另一部分是编码区(从ATG到3′端)。从34个小麦栽培种中发现了两个版本的TaTPP-7AA启动子，一个在SEQID No 14中显示(命名为P1启动子)，另一个如SEQ ID No 15所示(命名为P2启动子)。
III.启动子区域的功能验证
重组质粒
1.合成如SEQ ID NO：14所示的双链DNA分子。
2.使用步骤1中获得的DNA分子作为模板，通过使用由TPP-P-TF和TPP-P-TR组成的引物对进行PCR扩增，以获得PCR扩增产物。TPP-P-TF，attB1序列加下划线。在TPP-P-TR中，attB2序列加下划线。
TPP-P-TF(SEQ ID NO：16)
5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTCTTGATAAGTGTCGGAGGACC-3′；
TPP-P-TR(SEQ ID NO：17)：
5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCGCACGCAAACAACC-3′
3.将步骤2中获得的PCR扩增产物与载体pDONR207进行BP重组，以获得具有SEQ IDNo：14的第217至4997位核苷酸所示的DNA分子的重组质粒。
4.步骤3中获得的重组质粒与载体pGWB35进行LR反应，得到重组质粒，其中SEQ IDNo：14的第217至4997位核苷酸所示的DNA分子在pGWB35载体的正向中可操作地连接荧光基因，产生重组质粒-P1。pGWB35载体具有荧光基因，并且将SEQ ID No：14的第217位至第497位核苷酸所示的DNA分子插入荧光基因的前面以验证其启动子活性。
5.合成SEQ ID NO：15中所示的双链DNA分子。
6.使用步骤5中获得的DNA分子作为模板，通过使用由TPP-P-TF和TPP-P-TR组成的引物对进行PCR扩增，以获得PCR扩增产物。
7.将步骤6中获得的PCR扩增产物与载体pDONR207进行BP重组，得到具有SEQ IDNO：15的核苷酸编号217-2498所示DNA分子的重组质粒。
8.步骤7中获得的重组质粒与载体pGWB35进行LR反应，得到重组质粒，其中SEQ IDNo：15的第217至4997位核苷酸所示的DNA分子在pGWB35载体的正向中可操作地连接荧光基因，产生重组质粒-P2。pGWB35载体具有荧光基因，并且将SEQ ID No：15的第217位至第497位核苷酸所示的DNA分子插入荧光基因的前面以验证其启动子活性。
启动子区域的功能验证
测试的质粒是：重组质粒-P1或重组质粒-P2或载体pGWB35(空载体作为对照)。
1.将测试质粒导入农杆菌菌株GV3101中以获得重组农杆菌。
2.将步骤1中获得的重组农杆菌重新悬浮于溶液中，得到OD600nm＝1的细菌悬浮液。该溶液含有10mM MES(2-(N-吗啡)乙磺酸)，10mM MgCl2和200μmol/L乙酰丁香酮
3.使用生长到4-6叶期的烟草植物将步骤2中获得的细菌悬浮液注入烟叶背面(通过接种接种每株烟草植物的2-3片叶子，每片叶子的注射量为200-300μl)。
4.完成步骤3后的烟草植物在黑暗中保持24小时，然后在约22℃下进行光培养36小时。
5.在步骤4之后，切割烟草植物的叶子并在MS培养基平面上培养，并且将20μL底物溶液(用无菌ddH2O水稀释至10体积的Beetle Luciferin(Potassium Salt，Promega，目录号E1601))施用于整个接种区域并在黑暗中放置2-3分钟。然后使用植物成像系统获得照片并允许计算荧光值。
结果如图7所示。在图7中，P1代表重组质粒-P1，P2代表重组质粒-P2，EV代表载体pGWB35。在图B中，载体pGWB35的相应荧光值是1，纵轴是荧光倍数，1#到8#的数字分别代表不同的叶子。P1启动子产生的荧光显著高于P2启动子产生的荧光。在一些叶片中，P1启动子的活性比P2启动子的活性高3倍以上。结果显示P1和P2均为活性启动子，但P1启动子具有比P2启动子显著更高的启动子活性。图7中的图像A(对应于P1的HAPI和对应于P2的Hap II)显示类似的结果。
实施例5.鉴定TaTPP-7A的启动子区域中的SNP和与各种小麦品种中的籽粒性状的相关性
P1启动子(SEQ ID No：14)和P2启动子(SEQ ID No：15)之间存在5个SNP差异。使用P1启动子作为标准，P2启动子在以下核苷酸位置上不同：
1)在第409和第410核苷酸之间插入核苷酸“C”；
2)SEQ ID No：14的第493位核苷酸处的SNP：多态形式是T/C(SEQ ID No：14中T；SEQ ID No.15中C)
3)SEQ ID No：14的核苷酸1208处的SNP，多态性形式是A/G(SEQ ID No：14中A；SEQID No.15中G)；
4)第1708位核苷酸的SNP，多态性形式为T/G；(SEQ ID No：14中T；SEQ ID No.15中G)
5)第1980位核苷酸处的SNP，多态性形式为G/A(SEQ ID No：14中G；SEQ ID No.15中A)
5.测试小麦品系于2012年10月在中国农业科学院作物科学研究所院内种植，经过常规灌溉和施肥管理，2013年7月收获谷粒，测量其千粒重。。
用于测试的每种小麦材料的千粒重显示在表2中。
表2
在34个测试的小麦栽培种中，15个基因型对于P1启动子是纯合的，19个对于P2启动子是纯合的。包含P1启动子的小麦的籽粒平均千粒重为45.91g，含有P2启动子的小麦的籽粒平均千粒重为27.54g。
以千粒重为35g为阈值，籽粒千粒重为35g以上的小麦为高千粒重小麦，籽粒千粒重小于35g的小麦为低千粒重小麦。如果要测试的小麦的基因型对于P1启动子是纯合的，则小麦品系被分类为高千粒重的小麦的候选物；如果要测试的小麦的基因型对于P1启动子是纯合的，则待测小麦品系被分类为低千粒重的小麦候选物。用该方法鉴定上述34个供试小麦中的高千粒重小麦的准确率为93％(14/15)，用该方法鉴定上述34个供试小麦中的低千粒重小麦的准确率为100％(19/19)。
2002、2005和2006年，将供试小麦材料种植于河南洛阳，常规水肥管理，收获籽粒并测量千粒重(TKW)、粒长(KL)和粒宽(KW)。
测试的P1基因型小麦材料的结果如表3所示(包括每个测试小麦的结果，以及具有所述基因型的所有测试小麦的平均值)。测试的P1/P2基因型小麦材料的结果如表4所示(包括每个测试小麦的结果，以及具有所述基因型的所有测试小麦的平均值)。测试的P2基因型小麦材料的结果如表5所示(包括每个测试小麦的结果，以及具有所述基因型的所有测试小麦的平均值)。从总体趋势来看，P1基因型小麦的千粒重比P2基因型小麦重，P1基因型小麦的粒长比P2基因型小麦长。
千粒重≥35g定义为高千粒重；千粒重＜35g定义为低千粒重。粒长≥0.65mm定义为长粒长；粒长＜0.65mm定义为短粒长。将P1基因型小麦鉴定为高千粒重，长粒长的小麦，准确度结果如表3所示。将P2基因型小麦鉴定为低千粒重，短粒长小麦，准确度结果如表5所示。
表3
表4
表5
实施例5 SNP488和SNP 2144的鉴定和特异性引物组的设计
I.特定SNP的探索
用于测试的小麦品系：选择34个小麦品系(这些品系分布在中国不同的小麦区域，具有显著不同的籽粒性状(No.C1-34，对于材料的具体信息参见表21)，作为探索多态性位点的材料。
2.序列比对
用于测试的每个小麦品系进行以下步骤：
1.提取用于测试的小麦材料的基因组DNA。
2.使用从步骤1提取的基因组DNA作为模板，将由TaTPP-F1和TaTPP-R1组成的引物组用于PCR扩增，得到PCR扩增产物。
TaTPP-F1(SEQ ID NO：4)：5′-CGTGTGGTTGTTTGCGTG-3′；
TaTPP-R1(SEQ ID NO：5)：5′-CTAGATATAGGCGAGGGTTATTAC-3′。
3.将从步骤2获得的PCR扩增产物进行克隆和测序。对每个小麦品系测序24个克隆。
4.组装序列并比对。
对每种小麦材料的24个克隆的测序结果进行基因组A序列组装和比对分析。获得了来自不同小麦品系的基因组A的两种PCR扩增产物。两个PCR扩增产物的长度均为2254bp，5′末端都与TaTPP-F1一致，3′末端都与TaTPP-R1反向互补，但一个PCR扩增产物包含如SEQID NO：19所示的位于自5′末端467-514位的核苷酸，并且另一PCR扩增产物包含如SEQ IDNO：20所示的位于自5端的467-514位的核苷酸。在分析位置2121-2168时观察到类似的结果。一个PCR扩增产物包含如SEQ ID NO：25所示的位于自5′末端2121-2168位的核苷酸，另一个PCR扩增产物包含SEQ ID NO：26所示的位于自5端2121-2168位的核苷酸。
基于来自所有测试的小麦品系的PCR扩增产物的序列比对，发现一个SNP并命名为488SNP，具有A/C多态性，另一个SNP被发现并命名为2144SNP，其具有A/T多态性。488SNP对应于SEQ ID NO：24的5′末端22位的核苷酸，2144SNP对应于SEQ ID NO：30的5′末端30位的核苷酸。
每种测试的小麦品系的基于488SNP的基因型和基于2144SNP的基因型显示在表1中。
II.特定引物组的设计
基于如上所述的特定SNP，设计了以下基于KASP的引物组：
488F1(SEQ ID NO：21)：
5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGTCGTGTTCCTGGACTACGAC-3’；
488F2(SEQ ID NO：22)：
5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGTCGTGTTCCTGGACTACGAA-3’；
488C(SEQ ID NO：23)：
5′-TCGGCGACGATGGGCGAGAGCGT-3’
基于如上所述的特定SNP，设计了以下基于KASP的引物组：
2144F1(SEQ ID NO：27)：
5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCACAGACTGCCACATCAGCGGCT-3’；
2144F2(SEQ ID NO：28)：
5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCACAGACTGCCACATCAGCGGCA-3’；
2144C(SEQ ID NO：29)：
5’-TCTTGATAAATCAGTGCCAGGAG-3’；
III.特异引物组分析更大集合的小麦品系的用途
引物用于分析表3、4和5的不同小麦品种，并且将结果总结在其中。
针对SNP 488的AA基因型或SNP 2144的AA基因型的测试小麦材料的结果如表3所示(包括每个测试小麦的结果，以及具有所述基因型的所有测试小麦的平均值)。针对SNP488的A/C基因型或SNP 2144的A/T基因型的测试小麦材料的结果如表4所示(包括每个测试小麦的结果，以及具有所述基因型的所有测试小麦的平均值)。针对SNP 488的CC基因型或SNP 2144的TT基因型的测试小麦材料的结果如表5所示(包括每个测试小麦的结果，以及具有所述基因型的所有测试小麦的平均值)。从总体趋势来看，针对SNP 488的AA基因型或针对SNP 2144的AA基因型的小麦具有比针对SNP 488的CC基因型或针对SNP 2144的TT基因型的小麦更重的千粒重，以及针对SNP 488的AA基因型或对于SNP 2144的AA基因型的小麦具有比针对SNP488的CC基因型或针对SNP 2144的TT基因型的小麦更长的粒长。
IV.对SNP488的关联分析
供试小麦材料中，对选育品种的关联进行分析，结果见表6。结果显示：AA基因型的供试小麦的三年平均千粒重为41.50g，而CC基因型的供试小麦的三年平均千粒重为36.45g，差异达到极显著水平(P＜0.01)；在粒长性状上，AA基因型的小麦材料较CC基因型的小麦材料粒长更长，差异达到显著或极显著水平(P＜0.05或P＜0.01)。由此可知，相较于CC基因型而言，AA基因型为优良籽粒性状基因型。
表6
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
供试小麦材料中，地方品种的关联分析的结果见表7。结果显示：AA基因型的供试小麦的三年平均千粒重为38.9g，而CC基因型的供试小麦的三年平均千粒重为31.55g，差异达到极显著水平(P＜0.01)；在粒长性状上，AA基因型的小麦材料较CC基因型的小麦材料粒长更长，差异达到显著或极显著水平(P＜0.05或P＜0.01)。由此可知，相较于CC基因型而言，AA基因型为优良籽粒性状基因型。
表7
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
V.对SNP2144的关联分析
对SNP2144进行类似的分析
注：*P＜0.05，**P＜0.0l。
VI.对P1/P2启动子的关联分析
对P1/P2进行类似的分析
注：*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例6基于TaTPP-7A启动子区和编码序列中的SNP鉴定不同的单倍型
图6总结了在TaTPP-7A启动子区域和编码序列中发现的SNP的不同单倍型，其可在分析大量小麦品种时被鉴定。
单倍型I(Hap I)代表针对不同SNP的下列等位基因
·SNP409/410：TG
·SNP493T
·SNP1208：A
·SNP 1708：T
·SNP1980：G
·SNP 488：A
·SNP1300：T
·SNP 2144：A
单倍型II(Hap II)代表针对不同SNP的下列等位基因：
·SNP409/410：TCG
·SNP493C
·SNP1208：G
·SNP 1708：G
·SNP1980：A
·SNP 488：C
·SNP1300：C
·SNP 2144：T
单倍型III(Hap III)代表针对不同SNP的下列等位基因：
·SNP409/410：TCG
·SNP493C
·SNP1208：G
·SNP 1708：G
·SNP1980：G
·SNP 488：C
·SNP1300：T
·SNP 2144：T
图8a显示了中国小麦品种中单倍型随时间的相对发生率。在20世纪30年代，所有分析的中国品种都有Hap II单倍型(中间条)，从20世纪40年代开始，Hap I单倍型的相对发生率稳定增加(左条)，而HapII(中间条)和Hap III发生率逐渐减少。这与千粒重(由虚线表示)随时间的增加相关。图8的图B代表不同单倍型的地理分布。在中国，大多数分析的小麦品系都表现出Hap I单倍型。在俄罗斯联邦，Hap I单倍型也主要存在，但Hap III的存在也很显著，甚至Hap II也有代表。在北美和中美洲，欧洲和澳大利亚，分析的品系的主要单倍型是Hap III，仅有HapI的少量相对发生率。

Claims (26)

1.具有海藻糖-6磷酸磷酸酶酶活性的蛋白质，其选自：
a.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质；
b.包含与SEQ ID No：1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的蛋白质；
c.包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质，其中一个或多个氨基酸残基被取代或缺失或插入，并且其中蛋白质的存在与增加的籽粒长度，籽粒宽度或增加的千粒重相关，例如根据SEQ ID No：1的蛋白质，其中112位的Asp残基被Glu残基取代，和/或其中241位的Ala残基被Val残基取代。
2.核酸，例如DNA或RNA分子，其包含编码权利要求1的蛋白质的核苷酸序列。
3.根据权利要求2的核酸，其特征在于核酸选自：
a.核酸，例如DNA分子，包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列；
b.核酸，例如DNA分子，包含核苷酸位置23至核苷酸位置2115的SEQ ID NO：3的核苷酸序列；
c.核酸，例如DNA分子，包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列；
d.一种核酸，例如DNA分子，其在严格条件下与上述a至c中任一项的DNA分子杂交，并编码权利要求1的蛋白质；
e.核酸，例如DNA分子，其包含与核苷酸位置23至核苷酸位置2115的SEQ ID NO：3的核苷酸序列或SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。
4.重组表达盒，其包含以下可操作连接的DNA元件：
a.植物可表达启动子，例如异源植物可表达启动子
b.编码权利要求1的蛋白质的DNA区域或权利要求2的DNA区域；
c.作为转录终止和多腺苷酸化区域的DNA区域，例如在植物中起作用的转录终止和多腺苷酸化区域。
5.含有根据权利要求2或3所述核酸或根据权利要求4所述重组表达盒的重组表达载体、转基因细胞系、转基因植物组织、转基因植物或重组菌株，或籽粒或种子。
6.根据权利要求5的植物，所述植物是谷类植物，例如小麦植物。
7.根据权利要求1所述的蛋白质、或根据权利要求2或3所述的核酸或根据权利要求4所述的重组表达盒或根据权利要求5所述的载体的用途，用于
a.调节植物籽粒的大小，例如增加或减少籽粒长度或籽粒宽度，特别是小麦植物籽粒的大小；
b.增加植物籽粒的大小，特别是小麦植物籽粒的大小；
c.调节植物籽粒的千粒重，例如增加或减少籽粒长度或籽粒宽度，特别是小麦植物籽粒的千粒重；
d.增加千粒重，特别是小麦植物籽粒的千粒重；
e.调节植物籽粒的粒重，例如增加或减少籽粒长度或籽粒宽度，特别是小麦植物籽粒的粒重；
f.增加植物籽粒粒重，特别是小麦籽粒的粒重；
g.调节植物籽粒的粒长，例如增加或减少籽粒长度或籽粒宽度，特别是小麦植物籽粒的粒长；
h.增加植物籽粒，特别是小麦植物籽粒的粒长；
i.调节植物籽粒的粒宽，例如增加或减少籽粒长度或籽粒宽度，特别是小麦植物籽粒的粒宽；
j.增加植物籽粒，特别是小麦植物籽粒的粒宽；
k.调节植物籽粒的粒厚，例如增加或减少籽粒长度或籽粒宽度，特别是小麦植物籽粒的粒厚；
l.增加植物籽粒，特别是小麦植物籽粒的粒厚；
m.增加植物，特别是谷类植物如小麦的分蘖长度；
n.增加植物，特别是谷类植物如小麦的穗长；
o.提高植物如谷类植物如小麦的籽粒产量。
8.一种生产植物、例如谷类植物、包括小麦植物的方法，包括以下步骤：
a)增加根据权利要求1所述蛋白质的水平和/或活性；或
b)增加根据权利要求2或3所述核酸在植物细胞或植物中的表达
c)将根据权利要求4所述的重组表达盒导入植物细胞或植物中，以获得转基因植物，
其中植物具有
1)在籽粒中比所述出发植物或对照植物增加的千粒重；
2)在籽粒中比所述出发植物或对照植物增加的粒重；
3)籽粒大小大于所述出发植物或对照植物的籽粒大小；
4)在籽粒中比所述出发植物或对照植物更长的粒长；
5)在籽粒中比所述出发植物或对照植物更宽的粒宽；
6)在籽粒中比所述出发植物或对照植物更厚的粒厚；
7)比所述出发植物或对照植物增加的分蘖长度；
8)比所述出发植物或对照植物增加的穗长；
9)比所述出发植物或对照植物增加的籽粒数；或
10)比所述出发植物或对照植物增加的籽粒产量；
9.一种方法，以
(1)增加籽粒中的千粒重；
(2)增加籽粒中的粒重；
(3)增加籽粒大小；
(4)增加籽粒的长度；
(5)增加籽粒的宽度；
(6)增加籽粒的厚度；
(7)增加植物分蘖长度；
(8)增加植物的穗长；
(9)增加植物中的籽粒数量；或
(10)增加植物的籽粒产量。
包括如下步骤：增加植物中根据权利要求1所述的蛋白质的含量或活性，所述植物例如谷类植物，包括小麦植物。
10.根据权利要求1的蛋白质或根据权利要求2或3的核酸或根据权利要求7的方法在植物育种中的用途。
11.包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15的核苷酸序列或含有与其至少90％，95％或99％序列同一性的核苷酸序列的分离的启动子区。
12.重组基因，所述重组基因包含以下可操作地连接的DNA片段：
a.如权利要求11所述的启动子区；
b.编码目标RNA分子或蛋白的DNA区域
c.在植物细胞中具有功能的转录终止和多聚腺苷酸化区。
13.一种植物，例如谷类植物，包括小麦植物，其含有根据权利要求12的重组基因。
14.一种用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒性状的方法，包括以下步骤：
检测基于待测小麦基因组DNA中488SNP位点基因型是AA基因型，AC基因型还是CC基因型；AA基因型的小麦比CC基因型的小麦具有更好的籽粒性状；
更好的籽粒性状表现为更高的千粒重和/或更长的粒长；
488SNP位点是指SEQ ID NO：24的5′端22位的核苷酸。
15.一种用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒千粒重的方法，包括以下步骤：
检测基于待测小麦基因组DNA中488SNP位点基因型是AA基因型，AC基因型还是CC基因型；如果基因型是AA基因型，则将待测小麦选择为高千粒重的小麦候选；如果基因型是CC基因型，则将待测小麦选择为低千粒重的小麦候选；
所述高千粒重的小麦是指这样的小麦，其籽粒具有≥35g的千粒重；所述低千粒重的小麦是指这样的小麦，其籽粒具有＜35g的千粒重；
488SNP位点是指SEQ ID NO：24的5′端22位的核苷酸。
16.一种用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒粒长的方法，包括以下步骤：
检测基于待测小麦基因组DNA中488SNP位点基因型是AA基因型，AC基因型还是CC基因型；如果基因型是AA基因型，则将待测小麦选择为长粒长的小麦候选；如果基因型是CC基因型，则将待测小麦选择为短粒长的小麦候选；
所述长粒长的小麦是指这样的小麦，其籽粒具有≥0.65mm的粒长；所述短粒长的小麦是指这样的小麦，其籽粒具有＜0.65mm的粒长；
488SNP位点是指SEQ ID NO：24的5′端22位的核苷酸。
17.用于检测小麦基因组DNA中基于488SNP位点的基因型的材料的用途，用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒性状；所述籽粒性状是千粒重和/或粒长。
18.由488F1、488F2和488C组成的引物组I；
所述引物488F1是(b1)或(b2)，如下所述：
(b1)如SEQ ID NO：21所示的单链DNA分子；
(b2)DNA分子，其通过对SEQ ID NO：21进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加而获得，并具有与SEQ ID NO：21相同的功能；
所述引物488F2是(b3)或(b4)，如下所述：
(b3)如SEQ ID NO：22所示的单链DNA分子
(b4)DNA分子，其通过对SEQ ID NO：22进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加而获得，并具有与SEQ ID NO：22相同的功能；
所述引物488C是(b5)或(b6)，如下所述：
(b5)如SEQ ID NO：23所示的单链DNA分子；
(b6)DNA分子，通过对SEQ ID NO：23进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加而获得，并具有与SEQ ID NO：23相同的功能。
19.根据权利要求18的引物组的用途，
用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒性状；所述籽粒性状是千粒重和/或粒长；或
用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒的千粒重；或
用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒的粒长。
20.一种用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒性状的方法，包括以下步骤：
检测待测小麦基因组DNA中基于2144SNP位点的基因型是AA基因型，AT基因型还是TT基因型；AA基因型的小麦具有比TT基因型的小麦更好的籽粒性状；
更好的籽粒性状表现为更高的千粒重和/或更长的粒长；
2144SNP位点是指SEQ ID NO：30的5′端24位的核苷酸。
21.一种用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒千粒重的方法，包括以下步骤：
检测待测小麦基因组DNA中基于2144SNP位点的基因型是AA基因型，AT基因型还是TT基因型；如果基因型是AA基因型，则将待测小麦选择为高千粒重的小麦候选；如果基因型是TT基因型，则将待测小麦选择为低千粒重的小麦候选；
所述高千粒重的小麦是指这样的小麦，其籽粒具有≥35g的千粒重；所述低千粒重的小麦是指这样的小麦，其籽粒具有＜35g的千粒重；
2144SNP位点是指SEQ ID NO：30的5′端24位的核苷酸。
22.一种用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒粒长的方法，包括以下步骤：
检测待测小麦基因组DNA中基于2144SNP位点的基因型是AA基因型，AT基因型还是TT基因型；如果基因型是AA基因型，则将待测小麦选择为长粒长的小麦候选；如果基因型是TT基因型，则将待测小麦选择为短粒长的小麦候选；
所述长粒长的小麦是指这样的小麦，其籽粒具有≥0.65mm的粒长；所述低短粒长的小麦是指这样的小麦，其籽粒具有＜0.65mm的粒长；
2144SNP位点是指SEQ ID NO：30的5′端24位的核苷酸。
23.用于检测小麦基因组DNA中基于2144SNP位点的基因型的材料的用途，用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒性状；所述籽粒性状是千粒重和/或粒长。
24.一种引物组I，其由2144F1、2144F2和2144C组成；
所述引物2144F1是(b1)或(b2)，如下所述：
(b1)如SEQ ID NO：27所示的单链DNA分子；
(b2)DNA分子，其通过对SEQ ID NO：27进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加而获得，并具有与SEQ ID NO：21相同的功能；
所述引物2144F2是(b3)或(b4)，如下所述：
(b3)如SEQ ID NO：28所示的单链DNA分子
(b4)DNA分子，其通过对SEQ ID NO：28进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加而获得，并具有与SEQ ID NO：22相同的功能；
所述引物2144C是(b5)或(b6)，如下所述：
(b5)如SEQ ID NO：29所示的单链DNA分子；
(b6)DNA分子，其通过对SEQ ID NO：29进行一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加而获得，并具有与SEQ ID NO：29相同的功能。
25.根据权利要求24的引物组的用途，
用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒性状；所述籽粒性状为千粒重和/或粒长；或
用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒的千粒重；或
用于鉴定或辅助鉴定小麦籽粒的粒长；
26.一种获得小麦植物的方法，所述小麦植物具有
(1)增加的籽粒千粒重；
(2)增加的籽粒粒重；
(3)增加的籽粒大小；
(4)增加的籽粒长度；
(5)增加的籽粒宽度；
(6)增加的籽粒厚度；
(7)增加的植物分蘖长度；
(8)增加的植物穗长；
(9)增加植物中的籽粒数量；或
(10)增加的植物中的籽粒产量，
所述方法包括选择具有单倍型HapI的小麦植物的步骤。
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