CN111138519B - 一种过量表达可提高烟草钾含量的基因及其编码产物和应用 - Google Patents

一种过量表达可提高烟草钾含量的基因及其编码产物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物细胞技术领域，具体公开了一种过量表达可提高烟草钾含量的基因及其编码产物和应用，所述基因为PE1基因，利用所述PE1基因构建高钾含量烟草株系的步骤包括烟草第一链cDNA合成、重组载体pWM101‑35S‑PE1构建及阳性植株的筛选，重组载体pWM101‑35S‑PE1构建通过农杆菌活化、转接、侵染、共培养、选择分化培养、生根培养和移栽等步骤。利用本发明的方法获得的转基因高钾烟草株系中钾含量大幅度提高，在培育高钾烟草品种方面具有广阔的应用前景。

Description

一种过量表达可提高烟草钾含量的基因及其编码产物和应用
技术领域
本发明涉及植物细胞技术领域，具体涉及一种过量表达可提高烟草钾含量的基因及其编码产物和应用。
背景技术
钾是烟草生长所必需的重要营养元素，也是烟叶品质的重要评价指标。较高的钾含量不仅保证烟株正常成熟落黄，还能提高烟叶的香气质和香气量。目前我国黄淮烟区烟叶钾含量偏低，在很大程度上制约了烟叶品质的提升。因此，提高烟草主栽品种烟叶钾含量是烟叶生产中亟待解决的重要问题。
不同烟草品种在钾的吸收、分配、转运和利用效率等方面存在很大差异，富钾基因型烟草品种具有更高的钾含量和钾素吸收效率。发掘富钾烟草品种中的关键富钾基因，对于培育高钾烟草品种具有重要意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种过量表达可提高烟草钾含量的基因，所述基因为PE1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述过量表达可提高烟草钾含量的基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述过量表达可提高烟草钾含量的基因在构建高钾含量烟草株系中的应用。
进一步的，所述PE1基因构建高钾烟草株系的应用，包括以下步骤：
S1，烟草第一链cDNA合成，
提取高钾烟草品系总RNA后反转录，获得第一链cDNA；
设计引物，以上述第一链cDNA为模板，进行PE1基因的PCR扩增，得到扩增产物PE1基因的全长cDNA，所述引物序列为：
上游引物：5′-ATGGTGCTCGCGCCTGTTGG-3′，
下游引物：5′-TCAGGGCAAGCTAGCTGGCC-3′；
S2，重组载体pWM101-35S-PE1的构建
以S1中获得PE1基因的全长cDNA为模板，用含有BamHI和XbaI接头序列的特异引物进行PCR扩增，扩增产物经BamHI和XbaI双酶切、回收后，正向插入植物双元表达载体pWM101的花椰菜花叶病毒35S启动子之后的BamHI和XbaI位点之间，得到重组载体pWM101-35S-PE1；
所述特异引物序列为：
上游引物：5'-ACGGATCCATGGTGCTCGCGCCTGTTG-3'，
下游引物：5'-CATCTAGATCAGGGCAAGCTAGCTGGC-3'；
S3，将S2构建的重组载体通过农杆菌介导的叶盘法转化到烟草低钾品系，后经共培养、选择分化培养、生根培养、种植、检测阳性克隆，连续筛选3代，获得稳定遗传的高钾烟草株系。
进一步的，S1中，PCR扩增体系均为：总体系为50μl，模板cDNA2μl，Taq酶0.5μl，10×buffer 5μl，dNTP 1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddH2O39.5μl；
更进一步的，S1中PCR扩增程序为：95℃4min；94℃45s，55℃45s，72℃50s，35个循环；72℃10min，4℃保存。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明利用高通量转录组测序技术，在烟草全基因组转录水平上从高钾品系中鉴定出一种影响烟叶钾积累的重要基因PE1(Potassium Enrichment)，调节PE1基因的表达能够有效调节烟叶的钾含量；
2、本发明中的PE1基因在提高烟叶品质领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大；
3、通过本发明中PE1基因转化获得转基因烟草株系，获得遗传的PE1基因过量表达的转基因株系的钾含量提高了12.5％～28.1％，获得高钾烟草品系，不仅保证烟株正常成熟落黄，还能提高烟叶的香气质和香气量，提高烟草品质。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明PE1基因的PCR产物电泳图；
图1中M泳道是Marker，1泳道代表PE1基因的PCR产物样品；
图2为本发明PE1基因在不同钾效率烟草品种中的表达模式柱状图；
图3为本发明PE1基因表达载体构建示意图；
图4为本发明转PE1基因的烟草株系表达水平柱状图；
图5为本发明PE1基因过表达的烟草株系烟叶钾含量柱状图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
PE1基因的发现及克隆
(1)PE1基因的发现：对高钾烟草品系Z111和低钾烟草品系Z121的成熟期叶片，进行转录组测序分析，通过基因的差异表达分析，发现了一个基因转录本在高钾品系Z111中的转录丰度是低钾品系Z121的5倍，与公开的烟草数据库比对，未发现相似的基因序列和功能注释信息，初步判定该基因是一个新基因，定名为Potassium Enrichment 1，PE1；
(2)烟草第一链cDNA合成过程：
烟草高钾品系Z111成熟期叶片总RNA的分离和纯化参照TRIZOL试剂盒(ThermoFisher Scientific，USA)说明书进行，吸取2μg总RNA于1.5ml离心管中，按照RevertAidTMFirst Strand cDNASynthesis Kit(abm,Canada)产品说明进行反转录，获得烟草叶片第一链cDNA；
(3)PE1基因编码区的PCR扩增和测序验证：
以所述的第一链cDNA为模板，进行PE1基因的PCR扩增，得到扩增产物，根据转录组测序信息设计烟草的PE1基因的全长cDNA引物：
上游引物：5′-ATGGTGCTCGCGCCTGTTGG-3′，如SEQ ID NO.3所示，
下游引物：5′-TCAGGGCAAGCTAGCTGGCC-3′，如SEQ ID NO.4所示；
1)PCR扩增体系(50μl)：模板cDNA2μl，Taq酶0.5μl，10×buffer 5μl，dNTP 1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddH2O 39.5μl；
2)PCR扩增程序为：95℃4min，94℃45s,55℃45s,72℃50s,35个循环，72℃10min，4℃保存；
将所述的PCR产物经1.2％的琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像系统检测扩增产物(如图1)，回收纯化所述的PCR产物，经测序证实与预期结果一致。
实施例2：
PE1基因功能确定，
荧光定量PCR(QPCR)法分析PE1基因在不同钾效率烟草品种(系)中的表达情况：
(1)选择实验样品为89112、云烟87、豫烟6号、秦烟96、中烟100、Z111和Z121等7个烟草品系的成熟期叶片；
(2)每个样品中，按照实施例1中所述的方法，取2μg的总RNA反转录成第一链cDNA作为模板；
(3)根据PE1基因全长cDNA序列设计荧光定量PCR特异引物序列为：
上游引物：5'-TCCCGTATCAGAAGAAGTCC-3'，如SEQ ID NO.7所示，
下游引物：5'-AAACTGTAAGGGTGCCAAGT-3'；如SEQ ID NO.8所示；
1)QPCR的反应体系(20μl)：2×SYBR mix 10μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，cDNA模板1μl，ddH2O 8μl；
2)QPCR扩增程序为：95℃3min；95℃10s,58℃20s,72℃20s,40个循环；4℃保存；
(4)烟草Tubulin基因片段作为内参基因，其扩增的特异性引物序列为：
上游引物：5'-GCATCTTTGCGTACACTTTGCT-3'，如SEQ ID NO.9所示，
下游引物：5'-ACATAAGCCCAAAACTAGCTGGA-3'，如SEQ ID NO.10所示；
在实时荧光定量PCR仪进行反应，扩增产物为131bp；
(5)按照公式2-ΔΔC T计算PE1基因的相对表达量，其中：ΔCTPE1＝CTPE1-CTTubulin和ΔΔCTPE1＝实验组ΔCTPE1-对照组CTTubulin。
实施例2利用QPCR检测了PE1基因在7个不同钾效率烟草品系叶片中表达水平，结果表明，PE1基因在高钾品系89112和Z111中表达量较高，而在低钾品系豫烟6号和Z121中表达量较低，因此，PE1基因表达水平与烟叶的钾含量高低密切相关，PE1基因的过表达会提高烟草的钾吸收效率，进而提高了烟草的钾含量。(图2)
实施例3：
利用PE1基因构建高钾烟草株系
包括以下步骤：
S1，烟草转基因表达载体的构建，
以实施例2中构建的PE1基因全长cDNA片段为模板，用含有BamHI和XbaI接头序列的特异引物进行PCR扩增，扩增产物经BamHI和XbaI双酶切、回收后，正向插入植物双元表达载体pWM101的花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子之后的BamHI和XbaI位点之间，得到重组载体pWM101-35S-PE1；
上述特异引物序列为：
上游引物：5'-ACGGATCCATGGTGCTCGCGCCTGTTG-3'，如SEQ ID NO.5所示，
下游引物：5'-CATCTAGATCAGGGCAAGCTAGCTGGC-3'，如SEQ ID NO.6所示，；
S2，农杆菌介导的叶盘法转化到烟草低钾品系，
将S1构建的重组载体通过农杆菌介导的叶盘法转化到烟草低钾品系，后经共培养、选择分化培养、生根培养、种植、检测阳性克隆，连续筛选3代，获得稳定遗传的高钾烟草株系；
所述农杆菌活化具体操作为：所述农杆菌的活化具体操作为：从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到5mL LB液体培养基，每mL LB液体培养基添加利福平100μg、添加卡那霉素50μg，于28℃，200rpm震荡培养24h至OD600达到1.0；
上述转接过程具体为：活化后的菌液按1：100的比例，转入含有相应抗生素的LB液体培养基中28℃，200rpm摇床震荡培养6h，OD600达到0.6时可用于转化；
上述侵染过程具体为：侵染低的幼嫩叶片，去主脉，将叶片剪成0.5cm2的小块，放入菌液中浸泡4min，取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液；
所述共培养过程为，将侵染后的烟草叶片铺放于含有共培养基培养皿上，用封口膜封好培养皿，28℃黑培养2天；
所述共培养基为：每升MS基本固体培养基中添加1mg 6-BA和0.1mg NAA；
上述选择分化培养过程为；将共培养后的烟草叶片转接到含有选择分化固体培养基的平皿上，在温度为23℃，光照强度为5000lux，16h/8h光暗条件下培养；
上述选择分化固体培养基为：每升共培养基中添加500mg Cef和50mg Hyg；
所述生根培养，选择分化培养3周后，待烟草不定芽长到2cm2时，切下不定芽并移到含有生根培养基的三角瓶里进行生根培养；
上述生根培养基为：每升MS基本固体培养基中添加0.3mg NAA、50mg Hyg和500mgCef；
所述移栽过程具体为：待根生长至2cm，苗高7cm时，移栽于花盆中，温室培养；
所述阳性植株的筛选具体为：
提取转基因烟草幼苗的基因组DNA，PCR扩增后，进一步检测和筛选阳性植株；
所述扩增引物序列为：
上游引物：5'-ACGGATCCATGGTGCTCGCGCCTGTTG-3'，如SEQ ID NO.5所示，
下游引物：5'-CATCTAGATCAGGGCAAGCTAGCTGGC-3'，如SEQ ID NO.6所示；
提取上述所得阳性植株总RNA，做QPCR分析，检测不同转基因株系的基因表达情况，获得稳定遗传的PE1基因过量表达的转基因株系；
上述QPCR特异引物序列为：
上游引物：5'-TCCCGTATCAGAAGAAGTCC-3'，如SEQ ID NO.7所示，
下游引物：5'-AAACTGTAAGGGTGCCAAGT-3'，如SEQ ID NO.8所示；
上述QPCR所用的烟草内参基因Tubulin，其扩增的特异性引物序列为：
上游引物：5'-GCATCTTTGCGTACACTTTGCT-3'，如SEQ ID NO.9所示，
下游引物：5'-ACATAAGCCCAAAACTAGCTGGA-3'，如SEQ ID NO.10所示，；
继续筛选以观察T1代的分离情况，如此重复直至T3代获得遗传稳定的转基因株系，并且检测了遗传稳定的转基因株系和对照株系Z121的钾含量。
所述继续筛选观察中使用潮霉素
所述钾含量检测方式为：火焰光度法；
所述钾含量检测具体过程为：将上述烟草转基因系和对照品系在温室盆栽种植，每个系种10盆，每盆栽1棵，每株按纯氮5g烟草专用复合肥分5次施，成熟期取10位叶，每个株系取3株，样品经105℃杀青15min，65℃烘干，称重后磨粉，采用HNO3-H2O2微波消解体系进行消解，利用火焰光度法测定钾含量，所述钾含量用质量分数表示；
所述烟草专用复合肥为：氮：磷：钾＝10：10：15。
实施例3中获得的8株转PE1基因的T0代株系中，与对照品系Z121(CK)相比，OE-1、3、4、5、6、8这6个株系表达水平较高，达到显著或极显著水平(图4)；共获得6个稳定遗传的PE1基因过量表达的转基因株系，与对照品系相比，这6个株系都有不同程度的增加；但有3个转基因株系(OE-4、5、6)的烟叶钾含量有显著或极显著的提高；这3个转基因烟草株系较对照品系的钾含量提高幅度在12.5％～28.1％之间(图5)，表明过表达PE1基因能够提高烟叶的钾含量，获得高钾烟草品系。
综上所述，本发明公开了调节烟草叶片中钾离子含量的基因PE1，该基因在高钾品种中表达量较高，在低钾品种中表达量较低。过量表达该基因能显著提高烟叶的钾含量，PE1基因在培育高钾烟草品种方面具有广阔的应用前景。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<120> 一种过量表达可提高烟草钾含量的基因及其编码产物和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> 烟草
<400> 1
atggtgctcg cgcctgttgg tatgattatg ccatgtgaaa atcattccac gacggttgac 60
ggtaaagtag actacttacg agcctatctt ctgaagcagc aacaaaatgc ctcatcaata 120
gatcactttc tgcattgggt attcgctttt ccattagttt taattcacgg aggacaaaag 180
ttcccgtatc agaagaagtc cttgcagcat aagagcccgt ctgacggttc cggctgtctc 240
aggtccgagc aaatccctat tgttgttggc ataaggagcc tcggccatct cgacttggca 300
cccttacagt ttgagctatg caggtcgtcg tcagctaggc ggccacatat cgggccgcaa 360
cgcatacaca gaggtgatcg tatcccgcta cggagatgca cggcggcagc tatctggacc 420
aaggcgactc gtgcgctccg cggttgtaga ttacgaagga ggagcgtctt gcatgtgact 480
tgtgagaggt ttcgttggat ctatagggtt cctccaccgt ccgtgttggt gggccaccaa 540
gggcaaaatc gcccacgtaa cataattgga cgcagaatca gtcaatactt ttgtcttaaa 600
cggtttatcg ttgagatatc tcgccatgtt ttcgagggag acgtcgggat ctctttgcat 660
cgcgagcgcc ttatcacaca gtccactcga tgcccaaaac gcgcagtcct ctgcaggaaa 720
agcccgggcg ggacaaggcc agctagcttg ccctga 756
<210> 2
<211> 251
<212> PRT
<213> 烟草
<400> 2
Met Val Leu Ala Pro Val Gly Met Ile Met Pro Cys Glu Asn His Ser
1 5 10 15
Thr Thr Val Asp Gly Lys Val Asp Tyr Leu Arg Ala Tyr Leu Leu Lys
20 25 30
Gln Gln Gln Asn Ala Ser Ser Ile Asp His Phe Leu His Trp Val Phe
35 40 45
Ala Phe Pro Leu Val Leu Ile His Gly Gly Gln Lys Phe Pro Tyr Gln
50 55 60
Lys Lys Ser Leu Gln His Lys Ser Pro Ser Asp Gly Ser Gly Cys Leu
65 70 75 80
Arg Ser Glu Gln Ile Pro Ile Val Val Gly Ile Arg Ser Leu Gly His
85 90 95
Leu Asp Leu Ala Pro Leu Gln Phe Glu Leu Cys Arg Ser Ser Ser Ala
100 105 110
Arg Arg Pro His Ile Gly Pro Gln Arg Ile His Arg Gly Asp Arg Ile
115 120 125
Pro Leu Arg Arg Cys Thr Ala Ala Ala Ile Trp Thr Lys Ala Thr Arg
130 135 140
Ala Leu Arg Gly Cys Arg Leu Arg Arg Arg Ser Val Leu His Val Thr
145 150 155 160
Cys Glu Arg Phe Arg Trp Ile Tyr Arg Val Pro Pro Pro Ser Val Leu
165 170 175
Val Gly His Gln Gly Gln Asn Arg Pro Arg Asn Ile Ile Gly Arg Arg
180 185 190
Ile Ser Gln Tyr Phe Cys Leu Lys Arg Phe Ile Val Glu Ile Ser Arg
195 200 205
His Val Phe Glu Gly Asp Val Gly Ile Ser Leu His Arg Glu Arg Leu
210 215 220
Ile Thr Gln Ser Thr Arg Cys Pro Lys Arg Ala Val Leu Cys Arg Lys
225 230 235 240
Ser Pro Gly Gly Thr Arg Pro Ala Ser Leu Pro
245 250
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggtgctcg cgcctgttgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcagggcaag ctagctggcc 20
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acggatccat ggtgctcgcg cctgttg 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
catctagatc agggcaagct agctggc 27

Claims (6)

1.一种过量表达可提高烟草钾含量的基因，其特征在于，所述基因为PE1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述过量表达可提高烟草钾含量的基因编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述基因在构建高钾含量烟草株系中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1，烟草第一链cDNA合成，
提取高钾烟草品系总RNA后反转录，获得第一链cDNA；
设计引物，以上述第一链cDNA为模板，进行PE1基因的PCR扩增，得到扩增产物PE1基因的全长cDNA，所述引物序列为：
上游引物：5′-ATGGTGCTCGCGCCTGTTGG-3′，
下游引物：5′-TCAGGGCAAGCTAGCTGGCC-3′；
S2，重组载体pWM101-35S-PE1的构建
以S1中获得PE1基因的全长cDNA为模板，用含有BamHI和XbaI接头序列的特异引物进行PCR扩增，扩增产物经BamHI和XbaI双酶切、回收后，正向插入植物双元表达载体pWM101的花椰菜花叶病毒35S启动子之后的BamHI和XbaI位点之间，得到重组载体pWM101-35S-PE1；
所述特异引物序列为：
上游引物：5'-ACGGATCCATGGTGCTCGCGCCTGTTG-3'；
下游引物：5'-CATCTAGATCAGGGCAAGCTAGCTGGC-3'；
S3，将S2构建的重组载体通过农杆菌介导的叶盘法转化到烟草低钾品系，后经共培养、选择分化培养、生根培养、种植、检测阳性克隆，连续筛选3代，获得稳定遗传的高钾烟草株系。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，S1中，PCR扩增体系均为：总体系为50μl，模板cDNA 2μl，Taq酶0.5μl，10×buffer 5μl，dNTP 1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，ddH2O39.5μl。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，PCR扩增程序为：95℃4min；94℃45s，55℃45s，72℃50s，35个循环；72℃10min；4℃保存。
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