CN109593768B - 二球悬铃木PaGL1基因在调控植物表皮毛中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及二球悬铃木PaGL1基因在调控植物表皮毛中的应用。所述的DNA片段为悬铃木表皮毛调控基因PaGL1，该基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。生物学功能验证表明该基因片段能够调控植物的表皮毛发育。将该基因超量表达转化植物，可以使转基因植物的表皮毛减少或完全败育。

Description

二球悬铃木PaGL1基因在调控植物表皮毛中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及二球悬铃木基因PaGL1片段的分离克隆、功能验证及应用。所述的基因与植物表皮毛发育调控相关。将该基因的完整翻译区(CDS区)连到带有35S(花椰菜花叶病毒)启动子的超量表达载体转化模式植物拟南芥，转基因植株表皮毛数量减少甚至完全缺失。

背景技术

植物表皮毛是由表皮细胞向外延伸发育而来的一种发状结构。皮毛作为植物的最外层结构，具有减少或者抵御外界伤害的作用。主要分为腺毛和非腺毛；多细胞表皮毛和单细胞表皮毛；分支表皮毛和不分支表皮毛。一些表皮毛附着在植物表皮毛不会脱落，但是，有些表皮毛随着年龄的增长会逐渐脱落。

二球悬铃木(Platanus acerifolia Willd)是由一球和三球悬铃木杂交而得到的，具有一定的杂种优势，因此被广泛的应用于城市绿化，并享有“行道树之王”的美誉。但是其自身的一些突出问题限制了其应用的广泛性，如飘毛问题。悬铃木的飘毛问题主要来源于两个方面：一方面来源于球果开裂后飘毛问题，另一方面来源于叶片表皮毛的脱落。针对果毛飘落问题，人们可以通过控制其开花结果来解决，但是叶毛飘落的问题则需要从表皮毛发育方面来控制。因此可以通过基因工程方法来调控悬铃木表皮毛发育相关基因的表达，从而培育出不飘毛二球悬铃木，从根本上解决二球悬铃木的飘毛问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，提供一种分离的二球悬铃木基因PaGL1，将该基因应用于植物表皮毛的调控，已经证实该基因与植物表皮毛发育调控相关。

本发明提供了在二球悬铃木中表达的PaGL1基因编码序列及其功能，具体包括：PaGL1基因的核苷酸编码序列的克隆，表达载体的构建，以及将这些基因转化拟南芥，进行分子鉴定和表型观察等等。

本发明的技术方案如下所述：

本发明首先从二球悬铃木中克隆得到PaGL1基因片段。该基因片段为具有特定序列的DNA分子，其开放阅读框长度为663bp，其对应的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0：1所示。本发明还提供了二球悬铃木PaGL1基因的编码序列(编码220个氨基酸残基)，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：1中1-663位所示，PaGL1基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还提供了用于克隆获得二球悬铃木样品中PaGL1基因的引物对。该引物对是根据PaGL1核酸序列设计，以悬铃木不同部位混合样品作为模板进行PCR扩增，获得798bp的片段(序列见实施例1)。扩增上述基因引物对的DNA序列如下所示：

P1正向引物(F):5'GCCACTTCACAAAAATCTATACTGC 3'，

P2反向引物(R):5'ATCCATTAAGGGGTCATTTTCATCC 3'；

本发明还提供了用于检测二球悬铃木PaGL1基因在转基因拟南芥中表达的引物序列。该引物对根据PaGL1核酸序列设计，以转基因拟南芥样品cDNA为模板进行RT-PCR扩增，来检测外源基因PaGL1是否在拟南芥中表达，所得扩增的片段长度为135bp。所述引物对的DNA序列如下所示：

P3正向引物(F):5'AGATCAAAGTTGGTGTCACCTCAG 3'，

P4反向引物(R):5'CTCCAGTCACTTTGGGTTCGAT 3'；

利用农杆菌介导法将克隆得到的PaGL1编码序列导入到植物中。使用本发明的基因片段构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸序列的前面可加上35S(烟草花叶病毒)组成型启动子。此外，为了方便对转基因植株进行鉴定及筛选，对所使用的超量表达载体进行人工改造，如加入具有抗性的抗生素标记基因(例如附加适宜浓度的卡那霉素或潮霉素等)，以提高转基因植株的筛选效率。

附图说明

图1：是本发明涉及的中间载体

-T及重组质粒结构示意图。附图标记说明：图1A为原始中间载体

18-T；图1B为

18-PaGL1重组质粒图。

图2：是本发明所涉及的超量植物表达载体pCAMBIA2300s及重组质粒结构示意图。附图标记说明：图2A为原始载体图；图2B为pCAMBIA2300s-PaGL1重组质粒图。

图3：PaGL1转基因拟南芥表型图。附图标记说明：从左到右依次为WT(野生型，未转基因)，gl1突变体，3个转基因株系。转基因植株为T3代纯和。

图4：PaGL1基因在转基因植株中的表达量情况。附图标记说明：T3-5，T3-35，T3-38为3个转基因株系；WT为未转基因植株。转基因植株为T3代纯和。

图5：PaGL1转基因拟南芥表皮毛相关基因表达分析。具体说明：WT1,WT2,WT3为3个未转基因植株；PaGL1-5,PaGL1-35,PaGL1-38为3个转基因株系。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表SEQ ID N0：1是本发明分离克隆的包含有PaGL1基因的编码区的DNA片段。序列全长为663bp，编码220个氨基酸残基。

序列表SEQ ID NO：2是PaGL1基因片段编码的蛋白质序列。

实施例1：PaGL1基因的分离克隆

本发明的前期对二球悬铃木不同部位的混样进行了转录组测序，并根据转录组中PaGL1的序列设计引物P1(正向引物)+P2(反向引物)，以二球悬铃木不同部位的混样cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增得到的片段如下所示(序列长度为798bp)：

GCCACTTCACAAAAATCTATACTGCAACTTCATATCTCTTCAACTTCAAAGCTCTCTTTCTCTGTCTCTCGATCTGTGTGTGGTATGCAAATGGAGGAAGGGAATCACTACAAGAAAGGTCTGTGGACAGTGGAGGAAGATAAGATTCTCATGGATTACATAAAGGTTCATGGAAAAGGGCGGTGGAATCGCGTCGCGAAGATGACCGGTTTGAAGAGGTGTGGGAAGAGTTGCAGGTTAAGGTGGATAAATTATCTAAGCCCCAACGTGAAAAGAGACGATTTTTCTGAGGAGGAAGACGACCTCATCATTAGACTTCATAATCTCCTTGGAAACAGGTGGTCACTAATTGCAGGTCGGGTGCCGGGGCGAACCGACAACCAAGTGAAGAACCATTGGAACACTTGCTTGAGCAAGAAGCTCGGGATCAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGATCAAAGTTGGTGTCACCTCAGTAACCCTTTCTAGAGAATGCAGAGAAGTAGGGGAGACTCTCAGGTCCCCGGAAGATTCCAATCCTAAGGTTCCGATTTGCGGCGGCGACATCGAACCCAAAGTGACTGGAGGCTCCCAGGACGCCGTTGACACCTCGGACACACAAGAACCGGTGATGGACGAATCTTATATGGGTTCTTTTTGGTTTTGTAATGATGATTTAAACCTACACACCCCTACCCTAATTGAACTTCTAGATGGGTATCCTCTTGATGTAGTTTGGCATGATTTGTAGCTTAATTTTCCTTTTTCTTTGGCCTGGGATGAAAATGACCCCTTAATGGAT(序列中碱基下划线分别为起始密码子和终止密码子)，

扩增产物中的85-747bp的区段就是本发明需要的编码蛋白质的核苷酸序列。

本实施例的具体操作步骤如下：

1、采用常用的CTAB法(参照：王关林，方宏筠主编，《植物基因工程》，科学出版社，2005年7月)从二球悬铃木叶片中提取叶片总RNA，具体步骤如下：

1)取适量CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(配方为：2％(W/V)CTAB；NaCl1.4mol/L,；EDTA(乙二胺四乙酸)20mmol/L；Tris·Cl 100mmol/L；聚乙烯吡咯烷酮K30 2％(W/V)pvp)和2％的β-巯基乙醇，在水浴锅中65℃预热。

2)将二球悬铃木不同部位样品用液氮研磨成粉末，加入4ml预热的CTAB提取液，混匀，65℃水浴5min。

3)加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比24：1)混合液，颠倒混匀，静置5min，4℃下10000rpm/min离心10min。

4)取上清3ml，重复步骤3)。

5)取上清，加入1/3上清体积的LiCl，-20℃沉淀10-12小时，10000rpm/min，4℃离心10min，弃上清，用75％乙醇清洗沉淀两次，溶于适量的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水中待用。

6)以从二球悬铃木中提取的总RNA为模板，利用反转录酶(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为：42℃2min,37℃15min，85℃5s(参照该公司的反转录试剂盒说明书)。

7)用特异引物P1(正向引物)+P2(反向引物)将PaMYB82从二球悬铃木中扩增出来。反应条件：94℃预变性4min；94℃30sec，Tm(59℃、59℃、58℃、63℃)30sec,72℃30s,37个循环；72℃延伸10min。

8)将扩增获得的PCR产物连入

18-T载体(

18-T载体结构见图1A，购自宝生物工程大连有限公司)，筛选得到阳性克隆并测序，获得所需的基因全长。该克隆被命名为

18-PaMYB82质粒(图1B)。

实施例2 PaGL1基因超量表达载体的构建及转化拟南芥

为了能更好地阐明这些基因的功能，申请人将其在拟南芥中进行超量表达，根据转基因植株的表型来进行功能验证。具体操作步骤：首先将实施例1中得到的阳性克隆

18-PaGL1质粒用KpnⅠ和SalⅠ进行双酶切，回收目的片段；同时，用同样的酶切位点将超量表达载体pCAMBIA2300s进行双酶切(超量表达载体pCAMBIA2300s为华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室构建和赠送)。双酶切之后，将包含PaGL1基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA2300s(一种超量表达载体，见图2A,)载体用T4连接酶(购自宝生物工程大连有限公司)进行连接，转化大肠杆菌DH5α。挑选阳性克隆并进行酶切检测，获得转化载体，将其命名为pCAMBIA2300s-PaGL1质粒(图2B)，并将其电转到GV3101的农杆菌菌株中。

通过花序蘸染法侵染拟南芥，经过筛选具有卡那霉素抗性的转化苗得到转基因植株。

本发明的遗传转化的主要步骤和应用试剂如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的抗生素缩写表示如下：Kan(Kanamycin，卡那霉素)；Cef(Cefotaxime，头孢霉素)。

本发明中所用到的表面活性剂缩写表示如下：吐温-77(silwet-77)。

(2)拟南芥侵染的步骤

1)农杆菌的培养

首先，将含有目的载体的农杆菌GV3101在含有对应抗性(Km)选择的固体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L NaCl+Kan100mg/L+琼脂1.5g/L)上28℃培养2-3天，挑取阳性单克隆接种于对应抗性(Km)选择的液体LB培养基(10g/L蛋白胨+5g/L酵母提取物+10g/L NaCl+Kan100mg/L)中，于28℃200rpm摇床培养过夜，至菌液浓度OD₆₀₀值大约为0.6-0.8。

2)拟南芥花序蘸染法

将摇好的菌液于5000rpm离心5min，用5％的蔗糖溶液(附加20ul/100ml的拟南芥转化表面活性剂)重悬，将拟南芥花序在重悬液中浸泡30s左右，遮光保湿12-24h。

3)拟南芥阳性苗的筛选

将收获的南芥阳性苗种子用95％酒精1-2min和0.1％Hgcl2 8-10min进行消毒，无菌水洗2-3次后平铺于MS+50mg/LKm+50mg/LCef的培养基上进行筛选；对筛选出的阳性拟南芥植株进行PCR检测和在田间观察表型。

实施例3：PaGL1转基因植株表型观测与RT-PCR检测

移栽后的拟南芥(转基因和未转基因)在16h光照/8h黑暗的长日照条件下进行培养，并进行表型观察。结果发现转基因植株表皮毛完全败育(图3)。

为了验证转基因拟南芥表皮毛的败育与外源基因PaGL1有关，本发明采用了RT-PCR方法对部分转基因拟南芥植株进行了外源基因表达检测(图4)。具体步骤如下：采用TRIZOL试剂(购自宝生物工程大连有限公司)从转基因拟南芥的3个株系中提取叶片总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书操作)，利用反转录酶(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为42℃2min,37℃15min，85℃5s(参照该公司的反转录试剂盒说明书)。先用看家基因AtACT2(基因登录号：NM_112764)(正向引物：5-CCAGAAGGATGCATATGTTGGTGA和反向引物：5-GAGGAGCCTCGGTAAGAAGA)对反转录得到的cDNA进行检测和浓度调整，并进行PCR检测。PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃30sec，60℃30sec,72℃30sec,26个循环；72℃延伸10min。试验结果如图4所示，看家基因AtACT2在野生型拟南芥和转基因拟南芥中均能扩增出来，并且亮度一致。利用引物P3(正向引物)+P4(反向引物)进行RT-PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min；94℃30sec，60℃30sec,72℃30s,26个循环；72℃延伸10min。实验结果表明，不同转基因株系拟南芥内均检测到外源目的基因的表达，而为转基因植株中检测不到。

同时通过qRT-PCR检测了不同株系转基因拟南芥中表皮毛发育的下游基因AtGL2的表达，结果AtGL2表达量明显上调(图5)。说明PaGL1基因在转基因拟南芥中是通过调控下游基因AtGL2的表达来调控表皮毛发育的。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 二球悬铃木PaGL1基因在调控植物表皮毛中的应用

<141> 2019-01-06

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 663

<212> DNA

<213> 二球悬铃木(Platanus acerifolia Willd)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(663)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(663)

<400> 1

atg caa atg gag gaa ggg aat cac tac aag aaa ggt ctg tgg aca gtg 48

Met Gln Met Glu Glu Gly Asn His Tyr Lys Lys Gly Leu Trp Thr Val

1 5 10 15

gag gaa gat aag att ctc atg gat tac ata aag gtt cat gga aaa ggg 96

Glu Glu Asp Lys Ile Leu Met Asp Tyr Ile Lys Val His Gly Lys Gly

20 25 30

cgg tgg aat cgc gtc gcg aag atg acc ggt ttg aag agg tgt ggg aag 144

Arg Trp Asn Arg Val Ala Lys Met Thr Gly Leu Lys Arg Cys Gly Lys

35 40 45

agt tgc agg tta agg tgg ata aat tat cta agc ccc aac gtg aaa aga 192

Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Ser Pro Asn Val Lys Arg

50 55 60

gac gat ttt tct gag gag gaa gac gac ctc atc att aga ctt cat aat 240

Asp Asp Phe Ser Glu Glu Glu Asp Asp Leu Ile Ile Arg Leu His Asn

65 70 75 80

ctc ctt gga aac agg tgg tca cta att gca ggt cgg gtg ccg ggg cga 288

Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Val Pro Gly Arg

85 90 95

acc gac aac caa gtg aag aac cat tgg aac act tgc ttg agc aag aag 336

Thr Asp Asn Gln Val Lys Asn His Trp Asn Thr Cys Leu Ser Lys Lys

100 105 110

ctc ggg atc aag aag aag aag aag aag aag atc aaa gtt ggt gtc acc 384

Leu Gly Ile Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Val Gly Val Thr

115 120 125

tca gta acc ctt tct aga gaa tgc aga gaa gta ggg gag act ctc agg 432

Ser Val Thr Leu Ser Arg Glu Cys Arg Glu Val Gly Glu Thr Leu Arg

130 135 140

tcc ccg gaa gat tcc aat cct aag gtt ccg att tgc ggc ggc gac atc 480

Ser Pro Glu Asp Ser Asn Pro Lys Val Pro Ile Cys Gly Gly Asp Ile

145 150 155 160

gaa ccc aaa gtg act gga ggc tcc cag gac gcc gtt gac acc tcg gac 528

Glu Pro Lys Val Thr Gly Gly Ser Gln Asp Ala Val Asp Thr Ser Asp

165 170 175

aca caa gaa ccg gtg atg gac gaa tct tat atg ggt tct ttt tgg ttt 576

Thr Gln Glu Pro Val Met Asp Glu Ser Tyr Met Gly Ser Phe Trp Phe

180 185 190

tgt aat gat gat tta aac cta cac acc cct acc cta att gaa ctt cta 624

Cys Asn Asp Asp Leu Asn Leu His Thr Pro Thr Leu Ile Glu Leu Leu

195 200 205

gat ggg tat cct ctt gat gta gtt tgg cat gat ttg tag 663

Asp Gly Tyr Pro Leu Asp Val Val Trp His Asp Leu

210 215 220

<210> 2

<211> 220

<212> PRT

<213> 二球悬铃木(Platanus acerifolia Willd)

<400> 2

Met Gln Met Glu Glu Gly Asn His Tyr Lys Lys Gly Leu Trp Thr Val

1 5 10 15

Glu Glu Asp Lys Ile Leu Met Asp Tyr Ile Lys Val His Gly Lys Gly

20 25 30

Arg Trp Asn Arg Val Ala Lys Met Thr Gly Leu Lys Arg Cys Gly Lys

35 40 45

Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Ser Pro Asn Val Lys Arg

50 55 60

Asp Asp Phe Ser Glu Glu Glu Asp Asp Leu Ile Ile Arg Leu His Asn

65 70 75 80

Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Val Pro Gly Arg

85 90 95

Thr Asp Asn Gln Val Lys Asn His Trp Asn Thr Cys Leu Ser Lys Lys

100 105 110

Leu Gly Ile Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ile Lys Val Gly Val Thr

115 120 125

Ser Val Thr Leu Ser Arg Glu Cys Arg Glu Val Gly Glu Thr Leu Arg

130 135 140

Ser Pro Glu Asp Ser Asn Pro Lys Val Pro Ile Cys Gly Gly Asp Ile

145 150 155 160

Glu Pro Lys Val Thr Gly Gly Ser Gln Asp Ala Val Asp Thr Ser Asp

165 170 175

Thr Gln Glu Pro Val Met Asp Glu Ser Tyr Met Gly Ser Phe Trp Phe

180 185 190

Cys Asn Asp Asp Leu Asn Leu His Thr Pro Thr Leu Ile Glu Leu Leu

195 200 205

Asp Gly Tyr Pro Leu Asp Val Val Trp His Asp Leu

210 215 220

Claims (1)

1.一种分离自二球悬铃木的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示的PaGL1基因片段在调控拟南芥表皮毛中的应用，其特征在于将所述的PaGL1基因构建超量表达载体转化拟南芥并观察表皮毛表型。

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