CN106434875A - 一种水稻表皮毛调控基因gl1的分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种水稻表皮毛调控基因GL1的分子标记和应用，属于植物生物技术领域。本发明的分子标记通过两条正向引物和一条反向引物PCR扩增得到，前述引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑3所示。利用该水稻表皮毛调控基因GL1的分子标记，只需通过简单的PCR即可完成对水稻表皮毛调控基因GL1的基因分型，预测水稻表皮毛是否发生缺失。本发明具有操作简便、分型快速、结果准确、成本低廉等优势，能提高性状选择效率，满足大规模分子标记辅助选择的需求。

Description

一种水稻表皮毛调控基因GL1的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体地说，涉及一种水稻表皮毛调控基因GL1的分子标记及其应用。
背景技术
表皮毛是着生于植物地上部表皮组织上的一种毛状附属结构，由一个或多个细胞构成。在自然条件下，表皮毛为植物和周围环境间构建了一道天然屏障，能减少植物热量和水分的散失，限制昆虫的移动和入侵。有些表皮毛还带有腺体，可以分泌化学物质对植物进行化学保护。然而在农业生产中，表皮毛却并非总是一个有益性状。例如水稻表皮毛在种植过程中会伤害皮肤，在加工过程中会产生粉尘伤害眼睛、皮肤和呼吸道，严重时可导致过敏甚至水稻米勒综合症等长期疾病。此外，有毛稻谷单位仓储容积的仓储量也只有无毛稻谷的80％-85％(柳蕾，孙健，吴殿星等.水稻光叶性状及表皮毛发育研究进展.核农学报，2015，29(11)：2110-2116)。目前我国绝大部分水稻品种都是有毛型，选育和推广无毛品种将更有利水稻生产和加工产业的发展。
目前已定位和克隆的调控水稻表皮毛发育的基因还为数不多，GL1就是其中之一(Li W，Wu J，Weng S，et al.Characterization and fine mapping of the glabrousleaf and hull mutants(gl1)in rice(Oryza sativa L.).Plant Cell Reports，2010，29：617-627)。野生型水稻叶片上有三种表皮毛，其中长毛和微毛为钩状小刺，腺毛呈线装能分泌粘液。长毛主要分布于维管束附近的硅质化细胞上，微毛和腺毛主要沿着气孔细胞分布或者毗邻运动细胞。野生型水稻颖壳上的表皮毛长短不一，越靠近颖壳顶端越粗越长。在gl1突变体中，长毛、微毛和颖壳表皮毛缺失，用手触摸gl1突变体的叶片和谷壳感觉较光滑。遗传分析表明gl1突变体的表型是由隐性单基因控制的。图位克隆结果表明，gl1位于5号染色体短臂上的分子标记ID33和AS6之间约8kb的区间内。通过测序分析，该区间内登录号为LOC_Os05g02754的预测基因的5’UTR中一个A到T的单碱基突变(即SNP)被认为是造成表皮毛缺失的原因，其中野生基因型(有毛)为A，突变基因型(无毛)为T(Li W，Wu J，WengS，et al.Characterization and fine mapping of the glabrous leaf and hullmutants(gl1)in rice(Oryza sativa L.).Plant Cell Reports，2010，29：617-627；洪隽，王启钊，富昊伟等.水稻光叶性状基因gl1的精细定位与候选基因分析.核农学报，2011，25(6)：1088-1093)。
DNA分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组遗传差异的特异DNA片段。目前检测SNP类型分子标记的方法主要有KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)、HRM(high-resolution melting analysis)、LDR(ligase detection reaction)、Taqman探针分型、CAPS(Cleaved Amplified Polymorphism Sequences)、dCAPS(Derived CleavedAmplified Polymorphic Sequences)、芯片分析、测序分析等方法。然而这些方法在稳定性、检测效率或使用成本上各自存在不同程度的局限性。引物扩增受阻突变体系PCR是针对已知的变异位点设计一条或一对外引物和两条内引物，其中外引物在突变位点一侧或双侧，内引物3’末端碱基必须刚好落在变异位点上或离变异位点数个碱基的位置上。通过内引物3’末端碱基与野生型和突变体基因组同源配对程度的不同选择性扩增野生型和突变型基因(管峰，艾君涛，杨利国.一种SNP检测新方法:四引物扩增受阻突变体系PCR技术.生命的化学，2004，24(6)：514-516；王忠华，Redus MARC，贾育林.水稻抗稻瘟病基因Pi-ta共显性分子标记的建立.中国水稻科学，2005，19(6)：483-488)。与其它检测SNP的方法相比，引物扩增受阻突变体系PCR具有操作简便、分型快速、使用灵活、费用低廉等优势。
表皮毛缺失属于隐性性状，传统育种不能在同一分离世代中将杂合型植株与野生型植株通过表型观察区分开，进而用于回交转育和多基因聚合育种，这将导致选择效率降低和育种周期延长。分子标记辅助选择可以通过检测与目标基因紧密连锁或共分离的分子标记，对杂交后代和分离世代不同个体的基因型进行准确地鉴定，并进一步预测目标基因所控制的性状以帮助后代选择。因此，开发一种操作简单、快速、准确且高通量的鉴定表皮毛性状的分子标记方法用于分子标记辅助选择将极大促进无毛水稻品种的选育。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种水稻表皮毛调控基因GL1的分子标记。
本发明的第二个目的是提供利用上述分子标记鉴定水稻表皮毛调控基因GL1基因型的方法及其应用。
本发明的第三个目的是提供利用上述分子标记鉴定水稻表皮毛缺失与否或同时鉴定水稻表皮毛调控基因GL1基因型和水稻表皮毛缺失与否的方法及其应用。
本发明提供的一种水稻表皮毛调控基因GL1的分子标记，其通过核苷酸序列如SEQID NO.1-3所示的引物扩增得到。
本发明提供了上述分子标记在鉴定水稻表皮毛调控基因GL1基因型中的应用。
本发明提供了上述分子标记在鉴定水稻表皮毛缺失与否中的应用。
本发明提供了上述分子标记在水稻育种中的应用。
本发明提供了用于检测水稻表皮毛调控基因GL1的特异性引物组合，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。其中，SEQ IDNO.1所示的正向引物GL1F1:AAAAACAAATTAGAGACAGAATCAAGTCATCAA，SEQ ID NO.2所示的正向引物GL1F2:CAAATTAGAGACAGAATCAAGTCACCAT，和SEQ ID NO.3所示的反向引物GL1R:TTGTTGAGTACTTACTTAGTAGGACGAGAG。
本发明上述引物组合是针对GL1的5’UTR中的A到T的单碱基突变设计、筛选后获得。GL1F1和GL1F2的引物结合位置相同，但3’末端碱基分别为A和T，只能分别与野生型(有毛)和突变型(无毛)SNP配对。此外GL1F1的5’端增加了非特异序列AAAAA用以引入扩增片段长度多态性，GL1F2的3’端第4个碱基引入了T到C的突变用以扩大GL1F1和GL1F2对目标序列识别能力的差异。GL1R在A/T SNP下游，可以分别与GL1F1和GL1F2配对扩增出121bp和116bp的PCR产物。
本发明提供了前述特异性引物组合在鉴定水稻表皮毛调控基因GL1基因型中的应用。
本发明提供了前述特异性引物组合在鉴定水稻表皮毛缺失与否中的应用。
本发明提供了前述特异性引物组合在水稻种质资源改良中的应用。
进一步地，本发明提供了检测水稻表皮毛调控基因GL1基因型的方法，首先对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物、SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，
若扩增产物只出现116bp条带，则表明待测样品的GL1为突变基因型；若只出现121bp条带，则表明待测样品的GL1为野生基因型；若同时出现116bp和121bp条带，则表明待测样品的GL1为杂合基因型。
116bp条带的参考序列如SEQ ID NO.4所示，121bp条带的参考序列如SEQ ID NO.5所示。本领域技术人员应当理解，由于水稻品种的差异，设计引物时预测的PCR产物序列只能作为参考序列，而从不同品种中扩增出来的产物的序列可能和参考序列完全一致，也可能与参考序列有部分碱基差异，但这种差异通常不会影响标记的使用。
本发明还提供了一种检测水稻表皮毛缺失与否的方法，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物、SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，
若扩增产物只出现116bp条带，则表明待测样品的表皮毛缺失；若只出现121bp条带或同时出现116bp和121bp条带，则表明待测样品的表皮毛正常。
进一步地，上述PCR的反应体系为：2×Taq master mix 4μL，10μM的两个正向、一个反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA50ng，补ddH2O至10μL；
PCR反应条件为：94℃，4min；94℃，30s，65℃-60℃(梯度降温，每个循环温度下降0.5℃)，30s，72℃，1min，共10个循环；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，共25个循环；72℃，5min，16℃，10min。
在本发明的一个实施例中，是通过PAGE胶电泳对PCR扩增产物长度进行判断，PAGE胶电泳条件为：6％PAGE胶，U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳1h。
含有本发明所述的特异性引物组合的试剂盒也属于本发明的保护范围。
本发明提供了上述含有SEQ ID NO.1-3所示引物的试剂盒在表皮毛缺失水稻选育中的应用。
本发明提供了上述含有SEQ ID NO.1-3所示引物的试剂盒在水稻种质资源改良中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明基于引物扩增受阻突变体系PCR原理，设计开发了一种扩增片段短，特异性强的水稻表皮毛调控基因GL1的分子标记。利用该标记，只需通过简单的PCR即可完成对GL1的基因分型，预测水稻表皮毛缺失与否。本发明具有操作简便、分型快速、结果准确、成本低廉等优势，能提高性状选择效率，满足大规模分子标记辅助选择的需求。
附图说明
图1是S127/谷梅4号F2群体中有毛和无毛单株叶片(A)和颖壳(B)表皮毛比较。有毛样品在左，无毛样品在右，箭头指向毛状体。
图2是本发明分子标记的引物设计示意图。扩增分子标记的引物组合包括正向引物(>)GL1F1和GL1F2，反向引物(<)GL1R。其中GL1R可以分别与野生型GL1基因序列(GL1-W)和突变型GL1基因序列(GL1-M)完全匹配；GL1F1和GL1F2的引物结合位点相同，但3’末端碱基分别与GL1-W和GL1-M的SNP匹配。GL1F1的5’端引入5个A，GL1F2的3’端第4个碱基引入T到C的突变。SNP位点用方框标出，碱基突变用下划线标出。
图3是用本发明分子标记检测S127/谷梅4号的F2代单株的PAGE胶电泳图。泳道1为S127，泳道2为谷梅4号，泳道3-30为不同的F2单株，PCR片段大小标记在左侧。
图4是用本发明分子标记检测12个水稻品种/品系的PAGE胶电泳图。泳道1-12分别为S127，谷梅4号，W188，H794B，H795B，美国稻1，美国稻2，9311，中海香1号，五丰B，青丰1号B，华占。PCR片段大小标记在左侧。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例1S127/谷梅4号的F2群体构建
S127为无毛水稻两系不育系，谷梅4号为有毛常规品种。以S127为母本与谷梅4杂交获得F1。F1自交获得F2，种植F2获得F2分离群体。
实施例2S127/谷梅4号F2植株表皮毛观察
在分蘖期用手指自叶基部向叶尖滑动触摸叶片上表皮，手感光滑为无毛植株，手感粗糙为有毛植株。分别取无毛和有毛植株叶片在体式显微镜下观察拍照，结果显示有毛植株叶片沿叶脉和维管束附近有钩状小刺分布，而无毛植株叶片缺乏钩状小刺(图1的A图)。在灌浆期取有毛和无毛植株谷粒在体式显微镜下观测，结果显示有毛植株谷粒颖壳上有大量表皮毛，而无毛植株谷粒颖壳表面光滑，无明显毛状体(图1的B图)。
实施例3水稻GL1基因分子标记的引物设计及扩增片段分析
1、引物设计
通过对水稻表皮毛调控基因GL1在有毛和无毛品种中等位基因的序列比对，分析得到了有毛和无毛品种在GL1的5’UTR中造成表皮毛缺失表型的A/T SNP。根据A/T SNP上下游的序列设计引物组合：
GL1F1：AAAAACAAATTAGAGACAGAATCAAGTCATCAA(SEQ ID NO.1)，
GL1F2：CAAATTAGAGACAGAATCAAGTCACCAT(SEQ ID NO.2)，和
GL1R：TTGTTGAGTACTTACTTAGTAGGACGAGAG(SEQ ID NO.3)(见图2)。
2、扩增片段分析
用上述引物组合对水稻表皮毛调控基因GL1进行扩增，无毛材料将只能扩出一条116bp条带。有毛材料将能扩出一条121bp条带，或者同时扩出一条121bp和一条116bp条带。116bp和121bp条带的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示
实施例4用本发明分子标记进行分子标记辅助选择
1、实验材料
实施例1所构建S127/谷梅4号的F2群体。
2、表皮毛观察方法
参见实施例2。
3、水稻基因组DNA的提取
采用CTAB法提取水稻基因组DNA，具体步骤如下：在苗期取3cm长的水稻叶片，在800μL抽提缓冲液[1.5％(w/v)CTAB，1.05mol/L NaCl，75mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，15mmol/L EDTA(pH 8.0)]中磨碎，收集到一个1.5mL离心管中。65℃水浴30min，间或颠倒混匀。加入800μL氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)，颠倒混匀15min。12000r/min室温离心10min。吸上清450μL，转移到一个新的1.5mL离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后-20℃沉淀30min。12000r/min离心15min。倒掉95％乙醇，用75％乙醇洗沉淀。倒掉75％乙醇，干燥后加100μL灭菌ddH2O溶解DNA。
4、PCR扩增及检测
利用实施例3筛选得到的特异性引物组合(GL1F1，GL1F2，GL1R)对本实施例所述F2单株的DNA进行PCR扩增，反应体系为：2×Taq master mix(Sinobio)4μL，10μM GL1F1、GL1F2、GL1R引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH2O至10μL。
反应程序为：94℃，4min；94℃，30s，65℃-60℃(梯度降温，每个循环温度下降0.5℃)，30s，72℃，1min，共10个循环；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，共25个循环；72℃，5min，16℃，10min。
扩增产物经6％PAGE胶电泳检测，电泳条件为：U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳1h。电泳完成后用0.1％AgNO3染色，观片灯上观察拍照。
5、结果与分析
用本发明实施例3的分子标记(特异性引物组合GL1F1、GL1F2、GL1R通过PCR扩增得到)在苗期检测S127与谷梅4号的46个F2后代单株中GL1的基因型，发现有12个单株只扩增出了121bp条带，有15个单株只扩增出了116bp条带，有19个单株同时扩增出了116bp和121bp条带，结果见图3。在分蘖期和灌浆期分别对所述F2单株的叶片和颖壳表皮毛进行观察，发现能扩出121bp条带的单株表皮毛正常，而剩余只能扩增出116bp条带的单株表皮毛均发生缺失。说明本发明分子标记能有效跟踪表皮毛调控基因GL1并能准确预测水稻表皮毛是否发生缺失。
实施例5用本发明分子标记鉴定水稻种质的GL1基因型
1、实验材料
S127，谷梅4号，W188，H794B，H795B，美国稻1，美国稻2，9311，中海香1号，五丰B，青丰1号B，华占等12个水稻品种/品系。
2、表皮毛观察方法
参见实施例2。
3、水稻基因组DNA的提取
参见实施例4。
4、PCR扩增及检测
参加实施例4。
5、结果与分析
表皮毛观察结果表明水稻品种/品系W188，H794B，H795B，美国稻1，美国稻2和S127一样为无毛品种/品系，其它材料为有毛品种/品系。用本发明实施例3的分子标记的引物组合扩增这些品种/品系，发现所有无毛品种/品系都只能扩增出一条116bp的带，而所有有毛品种/品系都只能扩增出一条121bp的带(见图4)。表皮毛观察的结果与用本发明实施例3的分子标记鉴定的GL1基因型的结果相符合，验证了本发明分子标记鉴定水稻表皮毛缺失与否的准确性和可靠性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种水稻表皮毛调控基因GL1的分子标记，其特征在于，通过核苷酸序列如SEQ IDNO.1-3所示的引物扩增得到。
2.权利要求1所述的分子标记在鉴定水稻表皮毛调控基因GL1基因型中的应用。
3.权利要求1所述的分子标记在水稻育种中的应用。
4.用于检测水稻表皮毛调控基因GL1的特异性引物组合，其特征在于，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的引物。
5.权利要求4所述的特异性引物组合在鉴定水稻表皮毛调控基因GL1基因型中的应用。
6.权利要求4所述的特异性引物组合在水稻种质资源改良中的应用。
7.检测水稻表皮毛调控基因GL1基因型的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物、SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，根据PCR产物大小确定GL1的基因型。
8.一种检测水稻表皮毛缺失与否的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的正向引物、SEQ ID NO.3所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，根据PCR产物大小推测水稻表皮毛是否发生缺失。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，PCR的反应体系为：2×Taq master mix 4μL，10μM的两个正向、一个反向引物各0.5μL，10％DMSO 0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH2O至10μL；
PCR反应条件为：94℃，4min；94℃，30s，65℃-60℃，30s，72℃，1min，共10个循环，前述退火温度65℃-60℃是指首个循环65℃退火，此后每个循环退火温度降低0.5℃，至第10个循环退火温度降低为60℃；然后94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，共25个循环；72℃，5min，16℃，10min。
10.含有权利要求4所述的特异性引物组合的试剂盒。
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