CN106755527B

CN106755527B - 用于评价草鱼生长性能的snp标记、引物及评价方法

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Publication number: CN106755527B
Application number: CN201710098058.8A
Authority: CN
Inventors: 樊佳佳; 白俊杰; 姜鹏; 马冬梅; 李胜杰
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2017-02-23
Filing date: 2017-02-23
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2037-02-23
Also published as: CN106755527A

Abstract

本发明利用分子遗传学及分子生物学的方法获得用于评价草鱼生长性能的SNP标记(包括SNP1和SNP4)及用于扩增SNP位点所在基因片段的引物对，其中，SNP1位于草鱼MyoD基因全序列的启动子中第940位，且该位置处为T碱基插入或缺失；SNP4位于草鱼MyoD基因全序列的第一内含子中第107位，且该位置处碱基为A或T，通过检测这两个SNP位点的单倍型，判定草鱼的生长性能，由于所用的单倍型是依据MyoD基因内部产生的碱基突变，因此不存在遗传的交换，也不需要表型的进一步验证。利用该SNP标记的单倍型可以简单快速的鉴定快长草鱼，也可用于指导选育快长草鱼新品系。

Description

用于评价草鱼生长性能的SNP标记、引物及评价方法

【技术领域】

本发明属于动物分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及一种草鱼生肌决定因子(MyoD)序列相关SNP标记筛选，所用引物和利用这些标记辅助鉴定草鱼快长品系的方法。

【背景技术】

草鱼(Ctenopharyngodonidella)，俗称鲩、鲩鱼，属雅罗鱼亚科(Leuciscinae)、草鱼属(Ctenopharyngodon)，是我国淡水养殖鱼类中年产量最大的养殖对象，从2007年到2015年草鱼产量从356万吨逐年增加到567万吨，增加了59.27％。由此可见，草鱼养殖业的健康良性发展，不仅为我国乃至发展中国家人民提供了大量优质动物蛋白，同时带动了相关产业如饲料加工、运输和销售行业的发展壮大，解决了大批人员的就业问题。至今，虽然水产工作者已经付出了很多的努力，但草鱼仍未有通过国家良种审定委员会鉴定的人工选育的良种，实际生产上多为野生种直接驯化而成，缺少定向选育，生产上经常出现因亲本质量差，造成后代生长速度慢、规格不齐、抗病力差等问题，养殖户常常面临重大的经济损失，因此，选育高产优质的草鱼良种一直是草鱼育种工作的中心目标。

在开展常规选育研究的同时，开发和应用分子标记辅助育种技术可加快草鱼良种选育进程。SNP是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸变异而产生的多态性，位于基因编码区的非同义SNP可导致氨基酸的变化，从而影响蛋白质的功能，特别是发生在结构功能区域的SNP尤其重要，最终引起生物表型的变化。此外，在SNP标记研究和应用中发现，基因组上相邻SNPs的等位位点倾向以整体形式遗传给后代，这种一组相关联的SNPs等位位点被称作单倍型(haplotype)。为了更有效的鉴定与性状密切相关的分子标记，必须对整个基因序列上的SNPs所构成的单倍型进行关联分析。

生肌决定因子(Myogenic determining factor，MyoD)是生肌调节因子(MRF)家族四成员(MyoD、Myf5、MyoG、MrF4)之一，1987年首次被克隆。参与成肌细胞向肌细胞的分化过程，是对于肌肉组织发育具有重要作用的转录因子。该基因只在骨骼肌细胞和他们的前体细胞中表达。研究猪、牛、羊、鸡和鱼等种类MyoD基因功能，均表明，该基因属于肌肉分化重要的功能基因。在牙鲆MyoD基因内含子1上发现一个SNP在生长性状上影响显著，另外在大口黑鲈中该基因内含子发现3个突变点，同样均与生长性状紧密连锁。研究结果表明，该基因可以作为很好的动物生产性能的候选基因。现有技术中缺乏对草鱼MyoD基因与生长性能之间的研究。

【发明内容】

本发明通过对MyoD基因序列进行克隆，通过直接测序法筛选该基因SNPs，并且通过直接测序分型方法，提供一种与草鱼体生长性能相关的SNP标记，并用于鉴定或选育生长速度较快的草鱼，为筛选和建立草鱼快长新品系奠定基础。

本发明的具体技术方案如下：

一种用于评价草鱼生长性能的SNP标记，包括两个SNP位点SNP1和SNP4，所述SNP1位于草鱼MyoD基因全序列的启动子中第940位，且该位置处为T碱基插入或缺失；所述SNP4位于草鱼MyoD基因全序列的第一内含子中第107位，且该位置处碱基为A或T。

所述草鱼MyoD基因全序列如SEQ ID NO：1所示，总长度为2385bp，其中第1-1073bp是启动子序列，1074-1577bp是第一外显子序列，第1578-1888bp是第一内含子序列，第1889-1967bp是第二外显子序列，第1968-2092bp是第二内含子序列，第2093-2385bp是第三外显子序列。

所述SEQ ID NO：1的核苷酸序列如下：

CGACGGCCCGGGCTGGTCCTAATTAATTCGTTAATTACTTAATTGATTAATTAAAATAATAATAATAATAAAAAACATTTGTAACCTGTCCATGTTGTGCTAGTTTGTGAGTTTAATATGTGTACCAGTGATCCAGTGTTTCATTAAACAAAATATACAAACTAAAAATAATTCAATGTATGTTTTTTTGTTTTTGTTTTTTCAGTTCTGAACAACTTATAGCCTACTGATAAGCATCCTAACATTCAATAGCCTATATTTAATTCTGAACTATTATTCAAATGTGTATCCTAATTTCAATTTTAACGACATTTTATCTATTTATTATTTACGTTTGTTTGAGATTTTCGATGAATGATTGAAGCATTTTATAGTGCTTTTTTATGGAGCACTAGGAAGAAAATATTTACCCATGGAGCACTTTTTTTTCTCTTACATTAGTCAAACAGATATCCCTGTTGTTTGTCGTCTTATCAAATACAGTTATATACTAATATAGCCTATATATTAATAAGAAACAAGTGATAGTTGAAAGATCCCTCTAGAAAATATTAAAAGAAAGTCCTTCCTCGAATTGTTCTTAGGGAAATTCAGGAAATTGTAATTAATTGTAAGCTGAAATCTGTTATTTGATGACAAATAAACAAATAAAAGACATTTAAGTCCAATATACACGCGACAAAAGCAGTAAGAGCAACTTAAATCATTATTTATAAACGAATTTATCATTTTAACATTTTTATGACGCCGTCATTAGCTGCAGTGCCAGGCCGTCAAAACCACGCCCTCTTTCTCAGCGCACATGTTCATTGGTCAAACTGTCATTTACAGGACACGCCCCCGGACTGGCTGGGCTGTATATAAACAGGCCGTGATCTCTCACCAGCAACAAGTACCTGAAGGGTACAAGCAAAGAAACCTTTTGACGACCTGCGGTTTTAAACGGTTGTCTTGAGCAATACGTTGTTTCAGGATCTGAAGGAATTTGTCTTAATATTCCTAAGTCCTTAAAAACTTTACTACTTGAGAAGCATTCAAGTAGCTATAAGCCATTTTTACCTTAACACATAAAGATGGAGTTGTCGGATATTCCCTTCCCCATCTCATCAGCTGATGAATTCTACGACGACCCTTGCTTCAACACCAACGACATGCACTTCTTTGAAGACCTGGACCCCAGGCTCGTCCACGTGAGCCTGCTCAAGCCCGACGAGCATCACCACATCGAGGACGAGCACGTGAGGGCACCCAGTGGGCATCATCAGGCCGGCAGGTGCCTGCTGTGGGCATGCAAAGCCTGCAAGAGAAACGCTGACCGCCGCAAAGCCGCCACCATGAGGGAGAGGAGACGACTGAGCAAAGTCAACGACGCTTTCGAGACCCTCAAGAGATGCACGTCCACCAACCCGAACCAGAGGCTGCCCAAAGTGGAGATTCTGAGAAACGCCATTAGTTACATCGAGTCTCTGCAGGCGCTACTTAGGAGTCAAGAGGAAAACTACTACCCTGTTCTGGAGCATTACAGCGGAGACATCTCTGATGCCTCCAGCCCGAGATCCAACTGCTCTGATGGCATGGTGAGAACTTCATATAGCCAACTACT[A/G]TAGATAGAGATGTATAGAGATGCTTTTATAATAGCCTAATAGCCTAATATATTTTATTGTAAGGCCA[G/A]TATCATTCGTT[A/T]ATGGTTTATTCTTTATTTGAGCAAAGTATATGTGTTTTTATTTTATTATAATTTGGCAACACGTTACATTTTTCATTCAATAGCCAATAGAAAGTTAGCGTTAATAAATGAATCAATATTACAGGCCAAATTAAATTATTTATGTACTTTGTTAATTATCTTTCTTCATAGTAGGCTAAGTAATTTTCTTCTGGTGTTTTCTAGATGGATTTCATGGGTCCTACATGTCAGTCGAGAAGACGGAACAGTTATGACAGCTCTTACTTCAACGACACGCCAAATGGTAGGCCTACCGCCGAAAAATGTCCGGAAATAAATACATATCGACTGACTAAAATCATTACAGTGTTAAAATCATTCGTTCATTTCAGTTGAAGTTAAAATCTGTTATTTATTTATTTTTTACAGCTGACGCACGGAATAATAAAAGCTCAGTGGTGTCGAGTTTGGATTGTCTGTCGAGTATCGTGGAGCGAATTTCCACAGAGACCCCCGCGTGTCCCGTGCTGTCAGTACCGGAGGGGCACGAAGGGAGTCCGTGTTCTCCGCAGGAGGGGTCCGTCCTGAGTGAGAGCGGGGCTCCTGCACAGTCCCCGACCAACTGCCCTCAACAGCAGGCTCAGGATCCCATCTATCAAGTTCTTTAAAGATCCGGTACATTTCAAAACAAATCGAAAGGGACAATTTGAATCAAGAAGCAA

发明人发现，SNP1和SNP4两个SNP位点各检测到三种基因型SNP1(TT、TD和DD)和SNP4(AA、AT和TT)，并组成六种单倍型，分别命名为D1(DDAA)、D4(TDAA)、D5(TDAT)、D7(TTAA)、D8(TTAT)和D9(TTTT)，经关联分析表明单倍型D4(TDAA)的草鱼体质量显著高于其它单倍型，单倍型D5(TDAT)的草鱼体质量低于其它单倍型。进而，通过检测草鱼的上述SNP标记的单倍型，能够在相同养殖条件下有效挑选体生长速度较快的草鱼，并淘汰生长速度较慢的草鱼，进一步的，本发明的SNP标记能够用于快长类草鱼的分子标记辅助育种，进而能够根据实际育种需求对草鱼亲本进行基因型鉴定，挑选合适的基因型草鱼亲本进行繁殖，可以获得生长较快的草鱼后代(鱼苗)，对快长草鱼苗种生产有积极意义，并可以大大节约育种时间，成本低廉，准确性高，加快草鱼育种进程。

本发明的另一目的是提供分别用于扩增上述两个SNP位点SNP1和SNP4所在基因片段的引物对SEQ ID No：2-3和引物对SEQ ID No：4-5，所述引物对具有SEQ ID No：2-3和SEQID No：4-5所示的核苷酸序列如下：

SEQ ID No：2(上游引物)：CAGCGCACATGTTCATTGGTC

SEQ ID No：3(下游引物)：TGAGCAGGCTCACGTGGACGA

SEQ ID No：4(上游引物)：TCGAGTCTCTGCAGGCGCTACT

SEQ ID No：5(下游引物)：TTGGCCTGTAATATTGATTCA

本发明的另一目的是提供一种评价草鱼生长性能的方法，具体包括以下步骤：

步骤(1)：提取待评价草鱼样品DNA，贮存备用；

步骤(2)：PCR扩增反应：利用具有SEQ ID No：2-3和SEQ ID No：4-5所示核苷酸序列的引物对，对样品DNA进行PCR扩增，分别获取含有SNP1位点和SNP4位点的目标片段；

(3)分型判定：利用测序仪对PCR产物进行测序，根据测序结果峰图的颜色可判断所测样品的单倍型，若为D4(TDAA)，则判定该样品为快长型草鱼，若为D5(TDAT)，则判定该样品为慢长型草鱼，若为其它单倍型，则判定该样品为普通草鱼。

上述评价草鱼生长性能的方法，步骤(1)中，提取样品DNA的方法具体包括以下步骤：

(A)取待评价草鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液(10mmol/L Tris-HCl；0.1mol/L EDTA；0.5％SDS；30mg/L RNase；100mg/L蛋白酶K，pH8.0)，55℃消化1小时；

(B)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)混合物，混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

(C)加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；

(D)沉淀用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE(10mmol/L Tris－HCl；1mmol/L EDTA，pH8.0)溶解DNA，4℃贮存备用。

上述评价草鱼生长性能的方法，步骤(2)中，PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

本发明的优点及应用效果：

本发明利用分子遗传学及分子生物学的方法获得用于评价草鱼生长性能的SNP标记(包括两个SNP位点)及用于扩增SNP位点所在基因片段的引物对，通过检测这两个SNP位点的单倍型，判定草鱼的生长性能，由于所用的单倍型是依据MyoD基因内部产生的碱基突变，因此不存在遗传的交换，也不需要表型的进一步验证。利用该SNP标记的单倍型可以简单快速的鉴定快长草鱼，也可用于指导选育快长草鱼新品系。

【附图说明】

图1为草鱼MyoD内含子电泳图；

图2为草鱼MyoD启动子电泳图。

【具体实施方式】

为了验证本发明的应用效果，下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。在未作说明的情况下，本发明采用的试剂、设备和方法均为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。

实施例1

一、草鱼MyodD基因全序列的获得

根据草鱼MyoD基因的全长cDNA序列(GenBank Accession No.JQ793893.1)，采用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物扩增该基因内含子和启动子。

MyoD基因内含子的克隆：

设计特异性引物iMyOD-F：5′-CACATAAAGATGGAGTTGTCGGA-3′，iMyOD-R：5′-ATGCTTCTTGATTCAAATTGTCC-3′，分别以提取的草鱼基因组DNA和肌肉cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系50μL：

PCR SuperMix High Fidelity(Invitrogen，货号：12532-016)45μL，模板2μL，上下游引物各1μL，灭菌去离子水1μL。PCR扩增参数：94℃2min；94℃30s，62℃30s，68℃90min，共35个循环；72℃延伸10min终止。扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳检测，胶回收目的片段，将纯化产物连接至pLB-Simple载体，转化于高效化学感受态细胞DH5α，送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测出的序列用Vector11.0软件进行序列处理，然后将得到的DNA序列片段，在NCBI网站与草鱼MyoD序列进行在线比对，确定内含子序列。

图1为草鱼MyoD内含子电泳图，利用PCR技术获得草鱼MyoD基因的DNA和cDNA片段。MyoD cDNA近800bp，DNA近1300bp，根据片段大小推测草鱼MyoD内含子约为500bp，测序后与草鱼MyoD cDNA的序列比对分析发现，MyoD含有2个内含子，全长为436bp，其中第一内含子长度为311bp，基因序列如SEQ ID No：6所示，第二内含子长度为125bp，基因序列如SEQ IDNo：7所示。两个内含子的剪接位点都遵循GT-AG规则。

其中，所述SEQ ID No：6的序列如下：

GTGAGAACTTCATATAGCCAACTACTATAGATAGAGATGTATAGAGATGCTTTTATAATAGCCTAATAGCCTAATATATTTTATTGTAAGGCCAGTATCATTCGTTAATGGTTTATTCTTTATTTGAGCAAAGTATATGTGTTTTTATTTTATTATAATTTGGCAACACGTTACATTTTTCATTCAATAGCCAATAGAAAGTTAGCGTTAATAAATGAATCAATATTACAGGCCAAATTAAATTATTTATGTACTTTGTTAATTATCTTTCTTCATAGTAGGCTAAGTAATTTTCTTCTGGTGTTTTCTAG

所述SEQ ID No：7的序列如下：

GTAGGCCTACCGCCGAAAAATGTCCGGAAATAAATACATATCGACTGACTAAAATCATTACAGTGTTAAAATCATTCGTTCATTTCAGTTGAAGTTAAAATCTGTTATTTATTTATTTTTTACAG

MyoD基因启动子的克隆：

启动子克隆采用Universal Genome Walker TM 2.0试剂盒(Clontech，货号：636405)，同时加以修改，具体方案如下：首先用Dra I、EcoRV、PvuII及StuI限制性内切核酸酶酶切并纯化，然后将酶切产物与Genome Walker接头连接，接着用特异引物GSP1(MyoD：5'–GCCCTGACGTGCTCGTCCTCCTCAGA-3')与人工接头AP1对MyoD基因的启动子进行首轮扩增，首轮PCR的扩增参数为：94℃3min，接着94℃25s，72℃3min进行7个循环，然后94℃25s，67℃3min进行32个循环，67℃延伸5min终止。将首轮PCR产物稀释50倍，取1μL作为第二轮PCR反应的模板，用特异引物GSP2(MyoD：5'-GCTTCAGGAGATGAGGCACAGGCACT-3')和人工接头引物AP2进行PCR反应，反应参数同首轮。取10μL第二轮PCR产物进行电泳分离，找单一分子量最大的条带进行切胶回收，连接pLB-Simple载体，转化高效化学感受态细胞DH5α，送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，利用Vector 11.0软件比对，获得启动子。

图2为草鱼MyoD启动子的电泳图，采用染色体步移法获得了MyoD启动子，选择StuI文库PCR产物进行测序，启动子全长1066bp，基因序列如SEQ ID No：8所示。所述SEQ IDNo：8的序列如下：

CGACGGCCCGGGCTGGTCCTAATTAATTCGTTAATTACTTAATTGATTAATTAAAATAATAATAATAATAAAAAACATTTGTAACCTGTCCATGTTGTGCTAGTTTGTGAGTTTAATATGTGTACCAGTGATCCAGTGTTTCATTAAACAAAATATACAAACTAAAAATAATTCAATGTATGTTTTTTTGTTTTTGTTTTTTCAGTTCTGAACAACTTATAGCCTACTGATAAGCATCCTAACATTCAATAGCCTATATTTAATTCTGAACTATTATTCAAATGTGTATCCTAATTTCAATTTTAACGACATTTTATCTATTTATTATTTACGTTTGTTTGAGATTTTCGATGAATGATTGAAGCATTTTATAGTGCTTTTTTATGGAGCACTAGGAAGAAAATATTTACCCATGGAGCACTTTTTTTTCTCTTACATTAGTCAAACAGATATCCCTGTTGTTTGTCGTCTTATCAAATACAGTTATATACTAATATAGCCTATATATTAATAAGAAACAAGTGATAGTTGAAAGATCCCTCTAGAAAATATTAAAAGAAAGTCCTTCCTCGAATTGTTCTTAGGGAAATTCAGGAAATTGTAATTAATTGTAAGCTGAAATCTGTTATTTGATGACAAATAAACAAATAAAAGACATTTAAGTCCAATATACACGCGACAAAAGCAGTAAGAGCAACTTAAATCATTATTTATAAACGAATTTATCATTTTAACATTTTTATGACGCCGTCATTAGCTGCAGTGCCAGGCCGTCAAAACCACGCCCTCTTTCTCAGCGCACATGTTCATTGGTCAAACTGTCATTTACAGGACACGCCCCCGGACTGGCTGGGCTGTATATAAACAGGCCGTGATCTCTCACCAGCAACAAGTACCTGAAGGGTACAAGCAAAGAAACCTTTTGACGACCTGCGGTTTTAAACGGTTGTCTTGAGCAATACGTTGTTTCAGGATCTGAAGGAATTTGTCTTAATATTCCTAAGTCCTTAAAAACTTTACTACTTGAGAAGCATTCAAGTAGCTATAAGCCATTTTTACCTTAACACATAAAG

二、SNP位点的筛选

用于筛选草鱼SNP位点的草鱼来源于4个不同群体(沅江群体、佛山群体、监利群体和肇庆群体)，每个群体选取5个样品，每对引物分别用20个样品进行筛选。利用所获得的MyoD基因全序列与草鱼全基因组测序序列进行比较，在启动子，外显子和内含子上筛选到个SNPs位点。

利用所获得的Myod基因全序列(如SEQ ID NO：1所示)与草鱼全基因组测序序列进行比较，在启动子，外显子和内含子上共筛选到8个SNPs位点。我们利用8个SNPs位点在20个样品中进行验证，获得4个多态性高、分型稳定的SNPs位点，分别命名为：SNP1(启动子第940位有T碱基插入缺失)，SNP2(第一内含子中第27位置A突变成G)、SNP3(第一内含子中第95位置A突变成G)、SNP4(第一内含子中第107位置A突变成T)。

三、测定草鱼样品在上述SNPs位点的基因型并验证其与生长性能的关联性

1、提取样品DNA

从现有的珠江水产研究所良种基地同塘养殖的草鱼混合家系群体中随机挑选商品规格296尾，平均体质量为1460.95g，用MS-222麻醉后测量体质量，剪鳍条保存于无水乙醇中。按照以下步骤提取样品DNA：

2、PCR扩增反应：

利用具有SEQ ID No：2-3和SEQ ID No：4-5所示核苷酸序列的引物对，对样品DNA进行PCR扩增，分别获取含有SNP1位点和SNP4位点的目标片段。其中，PCR反应体系为：DNA 1μL，10×buffer 2.0μL，MgCl₂(25mM)0.8μL，dNTP(10mM)0.3μL，引物混合(10P)2.0μL，Taq(5U/μL)0.5μL，加H₂O补至20μL；PCR反应条件为：95℃4min，94℃30s，56℃30s，72℃1min，30个循环，72℃7min。

3、分型判定：

利用ABI 3730XL测序仪对PCR产物进行测序，进行SNaPshot分型，根据测序结果峰图的颜色可判断各个样品草鱼的单倍型，若为D4(TDAA)，则判定该样品为快长型草鱼，若为D5(TDAT)，则判定该样品为慢长型草鱼，若为其它单倍型，则判定该样品为普通草鱼。

4、关联性分析与验证：

将筛选到的4个SNPs在296个草鱼样品中进行生长关联分析，结果表明，SNP1三种基因型在体质量上差异显著(P<0.05)，优势基因型为DD，而TD属于劣势基因型；SNP2和SNP3三种基因型在体质量上差异均不显著(P>0.05)；SNP4位点在体质量上差异显著(P<0.05)，其中TT型属于优势基因型，具体数值见表1所示。

表1：草鱼MyoD基因4个SNP位点不同基因型与体质量性状的关联分析

注：同一列数值中，肩标含相同字母表示两种基因型之间差异不显著(P>0.05)，不同小写字母代表差异显著(P<0.05)

将SNP1和SNP4组成8种单倍型，其中D2(DDAT)和经D6(TDTT)各为2个样品，样品量太少，不符合统计学意义，就删除。将其余6个单倍型进行多重比较，结果表明D4(TDAA)体质量显著高于其它单倍型，该单倍型属于优势基因型，而D5(TDAT)体质量显著低于其它单倍型，属于劣势基因型。说明具有D4(TDAA)草鱼个体生长速度比较快，D5(TDAT)草鱼个体生长较慢，与预期一致，说明采用本发明所述的SNP1和SNP4及其扩增引物对评价草鱼生长性能的方法准确率高。

表2：草鱼MyoD基因中SNP1和SNP4两个位点形成的单倍型与草鱼群体体质量的关联分析

注：同一列数值中，肩标含相同字母表示两种基因型之间差异不显著(P>0.05)，不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。D2和D6不参与多重比较分析。

以上所述，仅为本发明的较佳的具体实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> 用于评价草鱼生长性能的SNP标记、引物及评价方法

<130> 0000

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2385

<212> DNA

<213> 草鱼

<400> 1

cgacggcccg ggctggtcct aattaattcg ttaattactt aattgattaa ttaaaataat 60

aataataata aaaaacattt gtaacctgtc catgttgtgc tagtttgtga gtttaatatg 120

tgtaccagtg atccagtgtt tcattaaaca aaatatacaa actaaaaata attcaatgta 180

tgtttttttg tttttgtttt ttcagttctg aacaacttat agcctactga taagcatcct 240

aacattcaat agcctatatt taattctgaa ctattattca aatgtgtatc ctaatttcaa 300

ttttaacgac attttatcta tttattattt acgtttgttt gagattttcg atgaatgatt 360

gaagcatttt atagtgcttt tttatggagc actaggaaga aaatatttac ccatggagca 420

cttttttttc tcttacatta gtcaaacaga tatccctgtt gtttgtcgtc ttatcaaata 480

cagttatata ctaatatagc ctatatatta ataagaaaca agtgatagtt gaaagatccc 540

tctagaaaat attaaaagaa agtccttcct cgaattgttc ttagggaaat tcaggaaatt 600

gtaattaatt gtaagctgaa atctgttatt tgatgacaaa taaacaaata aaagacattt 660

aagtccaata tacacgcgac aaaagcagta agagcaactt aaatcattat ttataaacga 720

atttatcatt ttaacatttt tatgacgccg tcattagctg cagtgccagg ccgtcaaaac 780

cacgccctct ttctcagcgc acatgttcat tggtcaaact gtcatttaca ggacacgccc 840

ccggactggc tgggctgtat ataaacaggc cgtgatctct caccagcaac aagtacctga 900

agggtacaag caaagaaacc ttttgacgac ctgcggtttt aaacggttgt cttgagcaat 960

acgttgtttc aggatctgaa ggaatttgtc ttaatattcc taagtcctta aaaactttac 1020

tacttgagaa gcattcaagt agctataagc catttttacc ttaacacata aagatggagt 1080

tgtcggatat tcccttcccc atctcatcag ctgatgaatt ctacgacgac ccttgcttca 1140

acaccaacga catgcacttc tttgaagacc tggaccccag gctcgtccac gtgagcctgc 1200

tcaagcccga cgagcatcac cacatcgagg acgagcacgt gagggcaccc agtgggcatc 1260

atcaggccgg caggtgcctg ctgtgggcat gcaaagcctg caagagaaac gctgaccgcc 1320

gcaaagccgc caccatgagg gagaggagac gactgagcaa agtcaacgac gctttcgaga 1380

ccctcaagag atgcacgtcc accaacccga accagaggct gcccaaagtg gagattctga 1440

gaaacgccat tagttacatc gagtctctgc aggcgctact taggagtcaa gaggaaaact 1500

actaccctgt tctggagcat tacagcggag acatctctga tgcctccagc ccgagatcca 1560

actgctctga tggcatggtg agaacttcat atagccaact actatagata gagatgtata 1620

gagatgcttt tataatagcc taatagccta atatatttta ttgtaaggcc aatatcattc 1680

gttaatggtt tattctttat ttgagcaaag tatatgtgtt tttattttat tataatttgg 1740

caacacgtta catttttcat tcaatagcca atagaaagtt agcgttaata aatgaatcaa 1800

tattacaggc caaattaaat tatttatgta ctttgttaat tatctttctt catagtaggc 1860

taagtaattt tcttctggtg ttttctagat ggatttcatg ggtcctacat gtcagtcgag 1920

aagacggaac agttatgaca gctcttactt caacgacacg ccaaatggta ggcctaccgc 1980

cgaaaaatgt ccggaaataa atacatatcg actgactaaa atcattacag tgttaaaatc 2040

attcgttcat ttcagttgaa gttaaaatct gttatttatt tattttttac agctgacgca 2100

cggaataata aaagctcagt ggtgtcgagt ttggattgtc tgtcgagtat cgtggagcga 2160

atttccacag agacccccgc gtgtcccgtg ctgtcagtac cggaggggca cgaagggagt 2220

ccgtgttctc cgcaggaggg gtccgtcctg agtgagagcg gggctcctgc acagtccccg 2280

accaactgcc ctcaacagca ggctcaggat cccatctatc aagttcttta aagatccggt 2340

acatttcaaa acaaatcgaa agggacaatt tgaatcaaga agcaa 2385

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagcgcacat gttcattggt c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgagcaggct cacgtggacg a 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcgagtctct gcaggcgcta ct 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttggcctgta atattgattc a 21

<210> 6

<211> 311

<212> DNA

<213> 草鱼

<400> 6

gtgagaactt catatagcca actactatag atagagatgt atagagatgc ttttataata 60

gcctaatagc ctaatatatt ttattgtaag gccagtatca ttcgttaatg gtttattctt 120

tatttgagca aagtatatgt gtttttattt tattataatt tggcaacacg ttacattttt 180

cattcaatag ccaatagaaa gttagcgtta ataaatgaat caatattaca ggccaaatta 240

aattatttat gtactttgtt aattatcttt cttcatagta ggctaagtaa ttttcttctg 300

gtgttttcta g 311

<210> 7

<211> 125

<212> DNA

<213> 草鱼

<400> 7

gtaggcctac cgccgaaaaa tgtccggaaa taaatacata tcgactgact aaaatcatta 60

cagtgttaaa atcattcgtt catttcagtt gaagttaaaa tctgttattt atttattttt 120

tacag 125

<210> 8

<211> 1073

<212> DNA

<213> 草鱼

<400> 8

cgacggcccg ggctggtcct aattaattcg ttaattactt aattgattaa ttaaaataat 60

aataataata aaaaacattt gtaacctgtc catgttgtgc tagtttgtga gtttaatatg 120

tgtaccagtg atccagtgtt tcattaaaca aaatatacaa actaaaaata attcaatgta 180

tgtttttttg tttttgtttt ttcagttctg aacaacttat agcctactga taagcatcct 240

aacattcaat agcctatatt taattctgaa ctattattca aatgtgtatc ctaatttcaa 300

ttttaacgac attttatcta tttattattt acgtttgttt gagattttcg atgaatgatt 360

gaagcatttt atagtgcttt tttatggagc actaggaaga aaatatttac ccatggagca 420

cttttttttc tcttacatta gtcaaacaga tatccctgtt gtttgtcgtc ttatcaaata 480

cagttatata ctaatatagc ctatatatta ataagaaaca agtgatagtt gaaagatccc 540

tctagaaaat attaaaagaa agtccttcct cgaattgttc ttagggaaat tcaggaaatt 600

gtaattaatt gtaagctgaa atctgttatt tgatgacaaa taaacaaata aaagacattt 660

aagtccaata tacacgcgac aaaagcagta agagcaactt aaatcattat ttataaacga 720

atttatcatt ttaacatttt tatgacgccg tcattagctg cagtgccagg ccgtcaaaac 780

cacgccctct ttctcagcgc acatgttcat tggtcaaact gtcatttaca ggacacgccc 840

ccggactggc tgggctgtat ataaacaggc cgtgatctct caccagcaac aagtacctga 900

agggtacaag caaagaaacc ttttgacgac ctgcggtttt aaacggttgt cttgagcaat 960

acgttgtttc aggatctgaa ggaatttgtc ttaatattcc taagtcctta aaaactttac 1020

tacttgagaa gcattcaagt agctataagc catttttacc ttaacacata aag 1073

Claims

1.用于扩增SNP位点SNP1和SNP4所在基因片段的引物对，其特征在于，所述扩增SNP位点SNP1所在基因片段的引物对为SEQ ID No：2-3所示的核苷酸序列；所述扩增SNP位点SNP4所在基因片段的引物对为SEQ ID No：4-5所示的核苷酸序列；

所述SNP1位于草鱼MyoD基因全序列的启动子中第940位，且该位置处为T碱基插入或缺失；

所述草鱼MyoD基因全序列的启动子的基因序列如SEQ ID No：8所示；

所述SNP4位于草鱼MyoD基因全序列的第一内含子中第107位，且该位置处碱基为A或T；

所述草鱼MyoD基因全序列的第一内含子的基因序列如SEQ ID No：6所示。

2.一种评价草鱼生长性能的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤(1)：提取待评价草鱼样品DNA，贮存备用；

步骤(2)：PCR扩增反应：利用核苷酸序列为SEQ ID No：2-3和SEQ ID No：4-5所示的引物对，对样品DNA进行PCR扩增，分别获取含有SNP1位点和SNP4位点的目标片段；

(3)分型判定：利用测序仪对PCR产物进行测序，根据测序结果峰图的颜色可判断所测样品的单倍型，若为TDAA，则判定该样品为快长型草鱼，若为TDAT，则判定该样品为慢长型草鱼，若为其它单倍型，则判定该样品为普通草鱼。

3.根据权利要求2所述的评价草鱼生长性能的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取样品DNA的方法具体包括以下步骤：

(A)取待评价草鱼的鳍条组织3mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液，pH 8.0，55℃消化1小时；

所述裂解液由以下组分组成：10mmol/L Tris-HCl，0.1mol/L EDTA，0.5％SDS，30mg/LRNase，100mg/L蛋白酶K；

(B)加入等体积的体积比为25：24：1的酚/氯仿/异戊醇混合物，混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；

(D)沉淀用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μL TE，溶解DNA，4℃贮存备用；

其中，所述TE由以下组分组成：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0。

4.权利要求1所述的引物对在鉴别或选育快长型草鱼品种中的应用。