JP6041259B2 - 低酸素耐性ヒラメの識別方法 - Google Patents
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Description
この発明は、ヒラメが低酸素耐性であるか否かを識別する方法及びそのためのＤＮＡマーカーに関する。
従来からヒラメの飼育は、仔魚から成魚まで、海水をポンプで陸上の飼育施設に揚水して、行われている。
このため、夏季の高水温期には、飼育水中の溶存酸素の減少により酸欠やこれらに起因した疾病被害がしばしば発生し、産業的に深刻な被害が生じている。
このため、ヒラメの飼育施設では、飼育密度を低く抑えたり、酸欠を防止するために液体酸素施設や酸素発生器などを設置し、飼育水の溶存酸素濃度の確保を図っている。しかし、これらの対策は、施設の維持や液化酸素などに多額の費用を要し、生産コストを上げる一因となっている。
ニジマスについては、低酸素耐性形質が遺伝することが確かめられている（非特許文献1）。
またヒラメの遺伝子連鎖地図は公開されている（非特許文献２）。
このため、夏季の高水温期には、飼育水中の溶存酸素の減少により酸欠やこれらに起因した疾病被害がしばしば発生し、産業的に深刻な被害が生じている。
このため、ヒラメの飼育施設では、飼育密度を低く抑えたり、酸欠を防止するために液体酸素施設や酸素発生器などを設置し、飼育水の溶存酸素濃度の確保を図っている。しかし、これらの対策は、施設の維持や液化酸素などに多額の費用を要し、生産コストを上げる一因となっている。
ニジマスについては、低酸素耐性形質が遺伝することが確かめられている（非特許文献1）。
またヒラメの遺伝子連鎖地図は公開されている（非特許文献２）。
水産増殖 Vol.50, No.3, Page.369-374 (2002)
BMC Genomics 2010, 11:554
本願発明は、ヒラメの低酸素に対する抵抗性の相違と遺伝要因との関係を客観的に明らかにするとともに、これら系統魚を用いて、低酸素の耐性に関する量的形質解析（ＱＴＬ法）により低酸素耐性の出現原因と関連するＤＮＡマーカーとそのマーカーを用いて低酸素耐性のヒラメを識別する方法を開発して、ヒラメの増養殖事業の発展に貢献することを目的とする。
本発明者らは、長期に亙ってヒラメの養殖研究を行っており、低酸素耐性のあるヒラメを選抜飼育してきた。発明者らは，酸欠により死亡したヒラメを調べた結果、飼育系統によりその死亡率が異なることに気が付いた。そのため、選抜飼育してきた低酸素耐性のある系統と抵抗性のない系統のヒラメを交配し、更に戻し交配により低酸素耐性に遺伝性があることを確認した。
本発明者らは、鋭意検討の結果、ヒラメの低酸素耐性の出現要因と関連する遺伝子が確認できる特定のマイクロサテライトマーカー（ＭＳマーカー）を見出し、このマーカーを用いて低酸素耐性のヒラメを識別する方法を開発した。これらのＤＮＡマーカーを活用し、親魚群から低酸素に対して耐性を有するヒラメを選抜することにより、低酸素の飼育環境における斃死被害を抑制することができる。
本発明者らは、鋭意検討の結果、ヒラメの低酸素耐性の出現要因と関連する遺伝子が確認できる特定のマイクロサテライトマーカー（ＭＳマーカー）を見出し、このマーカーを用いて低酸素耐性のヒラメを識別する方法を開発した。これらのＤＮＡマーカーを活用し、親魚群から低酸素に対して耐性を有するヒラメを選抜することにより、低酸素の飼育環境における斃死被害を抑制することができる。
即ち、本発明は、下記工程から成る低酸素耐性ヒラメの識別方法である。
１）ヒラメ、その卵又はそれらの加工品から抽出したＤＮＡについて、下記ａ）又はｂ）のいずれかのマイクロサテライト領域の配列若しくはその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列を増幅する工程、
ａ）配列番号１の809〜1158番目の塩基配列(Poli1482TUF: Genbank accession No.DQ889045)
ｂ）配列番号１の507〜788番目の塩基配列
２）別途継代飼育の結果、低酸素耐性と認められる系統のヒラメについて、上記１）の工程を実施する工程、及び
３）１）と２）の工程の増幅結果を比較し、これらが一致する場合に、ヒラメが低酸素耐性であると識別する工程
１）ヒラメ、その卵又はそれらの加工品から抽出したＤＮＡについて、下記ａ）又はｂ）のいずれかのマイクロサテライト領域の配列若しくはその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列を増幅する工程、
ａ）配列番号１の809〜1158番目の塩基配列(Poli1482TUF: Genbank accession No.DQ889045)
ｂ）配列番号１の507〜788番目の塩基配列
２）別途継代飼育の結果、低酸素耐性と認められる系統のヒラメについて、上記１）の工程を実施する工程、及び
３）１）と２）の工程の増幅結果を比較し、これらが一致する場合に、ヒラメが低酸素耐性であると識別する工程
また本発明は、下記いずれかのマイクロサテライト領域の配列若しくはその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列から成るヒラメが低酸素耐性であるか否かを識別するためのＤＮＡマーカーである。
ａ）配列番号１の809〜1158番目の塩基配列
ｂ）配列番号１の507〜788番目の塩基配列
また本発明は、下記いずれかの配列若しくはその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列を増幅するためのＰＣＲ用プライマーである。
ａ）配列番号１の809〜1158番目の塩基配列
ｂ）配列番号１の507〜788番目の塩基配列
また本発明は、ヒラメが低酸素耐性であるか否かを識別するための診断キットであって、上記のＰＣＲ用プライマーを含むキットである。
ａ）配列番号１の809〜1158番目の塩基配列
ｂ）配列番号１の507〜788番目の塩基配列
また本発明は、下記いずれかの配列若しくはその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列を増幅するためのＰＣＲ用プライマーである。
ａ）配列番号１の809〜1158番目の塩基配列
ｂ）配列番号１の507〜788番目の塩基配列
また本発明は、ヒラメが低酸素耐性であるか否かを識別するための診断キットであって、上記のＰＣＲ用プライマーを含むキットである。
本発明は、ＤＮＡマーカーとこのマーカーを用いて低酸素耐性のヒラメを識別する方法を提供する。
発明者らは、ヒラメの遺伝子連鎖地図（非特許文献２）に見出された約１３００のマイクロサテライトマーカーを調べた結果、遺伝子連鎖群ＬＧ２４に存在する下記２つのマイクロサテライト領域が、ヒラメの低酸素耐性の出現に関連していることを見出した（後述の実施例参照）。
本発明のＤＮＡマーカーは、下記いずれかのマイクロサテライト領域の配列若しくはその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列から成る。
ａ）配列番号１（図１）の809〜1158番目の塩基配列(Poli1482TUF: Genbank accession No.DQ889045) このマイクロサテライト領域においては、配列番号１の965〜1000番に、ＣＴＴの反復配列（マイクロサテライト配列と考えられる。）が見出される。なお、このマイクロサテライト領域には、配列番号１の809〜1158番目の塩基配列に反復単位（ＣＴＴ）が１又は複数増減したものや反復配列の一部に１個から数個の塩基が、欠失、置換又は付加されたものも含まれる。
ｂ）配列番号１（図１）の507〜788番目の塩基配列（以下「Poli Hypoxia-1 TUF」と呼ぶ。）
このマイクロサテライト領域においては、配列番号１の629〜750番目にＣＡの反復配列（マイクロサテライト配列と考えられる。）が見出される。なお、このマイクロサテライト領域には、配列番号１の507〜788番目の塩基配列に反復単位（ＣＡ）が１又は複数増減したものや反復配列の一部に１個から数個の塩基が、欠失、置換又は付加されたものも含まれる。
発明者らは、ヒラメの遺伝子連鎖地図（非特許文献２）に見出された約１３００のマイクロサテライトマーカーを調べた結果、遺伝子連鎖群ＬＧ２４に存在する下記２つのマイクロサテライト領域が、ヒラメの低酸素耐性の出現に関連していることを見出した（後述の実施例参照）。
本発明のＤＮＡマーカーは、下記いずれかのマイクロサテライト領域の配列若しくはその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列から成る。
ａ）配列番号１（図１）の809〜1158番目の塩基配列(Poli1482TUF: Genbank accession No.DQ889045) このマイクロサテライト領域においては、配列番号１の965〜1000番に、ＣＴＴの反復配列（マイクロサテライト配列と考えられる。）が見出される。なお、このマイクロサテライト領域には、配列番号１の809〜1158番目の塩基配列に反復単位（ＣＴＴ）が１又は複数増減したものや反復配列の一部に１個から数個の塩基が、欠失、置換又は付加されたものも含まれる。
ｂ）配列番号１（図１）の507〜788番目の塩基配列（以下「Poli Hypoxia-1 TUF」と呼ぶ。）
このマイクロサテライト領域においては、配列番号１の629〜750番目にＣＡの反復配列（マイクロサテライト配列と考えられる。）が見出される。なお、このマイクロサテライト領域には、配列番号１の507〜788番目の塩基配列に反復単位（ＣＡ）が１又は複数増減したものや反復配列の一部に１個から数個の塩基が、欠失、置換又は付加されたものも含まれる。
本発明のヒラメが低酸素耐性であるか否かを識別する方法は下記工程から成る。
工程１）
ヒラメ、その卵又はそれらの加工品からＤＮＡを抽出し、上記いずれかのＤＮＡマーカー（マイクロサテライト領域の配列）又はその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列を増幅する。
この増幅（ＰＣＲ反応）に用いるプライマーとしては、上記マイクロサテライト領域のマイクロサテライト配列を増幅できるものであればよく、上記のマイクロサテライト領域の塩基配列と、好ましくはストリンジェントな条件で、特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであれば限定されない。ここで特異的にハイブリダイズするとは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントな条件下において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。ストリンジェントな条件は、例えば、６０℃、６×ＳＳＣの条件である。
工程１）
ヒラメ、その卵又はそれらの加工品からＤＮＡを抽出し、上記いずれかのＤＮＡマーカー（マイクロサテライト領域の配列）又はその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列を増幅する。
この増幅（ＰＣＲ反応）に用いるプライマーとしては、上記マイクロサテライト領域のマイクロサテライト配列を増幅できるものであればよく、上記のマイクロサテライト領域の塩基配列と、好ましくはストリンジェントな条件で、特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであれば限定されない。ここで特異的にハイブリダイズするとは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントな条件下において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。ストリンジェントな条件は、例えば、６０℃、６×ＳＳＣの条件である。
このようなプライマーは、例えば、配列番号１の塩基配列のうち、マイクロサテライト領域のマイクロサテライト配列を挟む塩基配列から成るオリゴヌクレオチドを用いることができる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、下記ａ−１）の塩基配列から成るオリゴヌクレオチド、及びａ−２）の塩基配列から成るオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
ａ−１）配列番号１の1〜964番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
ａ−２）配列番号１の1001〜1303番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
又は下記ｂ−１）の塩基配列から成るオリゴヌクレオチド、及びｂ−２）の塩基配列から成るオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチドである。
ｂ−１）配列番号１の1〜628番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
ｂ−２）配列番号１の751〜1030番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
これらプライマーは好ましくは１８〜２５個、より好ましくは２０〜２５個の塩基から成るオリゴヌクレオチドである。
ａ−１）配列番号１の1〜964番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
ａ−２）配列番号１の1001〜1303番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
又は下記ｂ−１）の塩基配列から成るオリゴヌクレオチド、及びｂ−２）の塩基配列から成るオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチドである。
ｂ−１）配列番号１の1〜628番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
ｂ−２）配列番号１の751〜1030番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
これらプライマーは好ましくは１８〜２５個、より好ましくは２０〜２５個の塩基から成るオリゴヌクレオチドである。
上記ａ）Poli1482TUFのマイクロサテライト領域については、例えば、下記（１）の２つのオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行うことができる。
（１）5'-CATGTTGGTCTGAGACGATGAACTC-3' （配列番号2）の３'側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-TAGATCCTGTTGTTTTCCTGCTCG-3' （配列番号3）の３'側末端から連続する少なくとも１８個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくはこの配列全ての塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
このＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動において１１９ｂｐのバンドは低酸素耐性のヒラメに多く見出されることから（後述の実施例１及び図４参照）、低酸素耐性アレルに固有のものといえる。
（１）5'-CATGTTGGTCTGAGACGATGAACTC-3' （配列番号2）の３'側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-TAGATCCTGTTGTTTTCCTGCTCG-3' （配列番号3）の３'側末端から連続する少なくとも１８個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくはこの配列全ての塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
このＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動において１１９ｂｐのバンドは低酸素耐性のヒラメに多く見出されることから（後述の実施例１及び図４参照）、低酸素耐性アレルに固有のものといえる。
また、ｂ）配列番号１の507〜788番目の塩基配列については、例えば、下記（２）の２つのオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行うことができる。
（２）5'-CTCACTGTTCTGAAGCTTCTCT-3' （配列番号4）の３'側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-CGTCTGAGTCGGAATCCTTCTG-3' （配列番号5）の３'側末端から連続する少なくとも１８個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくはこの配列全ての塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
このＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動において２１７ｂｐのバンドは低酸素耐性のヒラメに多く見出されることから（後述の実施例１及び図５参照）、低酸素耐性アレルに固有のものといえる。
（２）5'-CTCACTGTTCTGAAGCTTCTCT-3' （配列番号4）の３'側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-CGTCTGAGTCGGAATCCTTCTG-3' （配列番号5）の３'側末端から連続する少なくとも１８個、好ましくは少なくとも２０個、より好ましくはこの配列全ての塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
このＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲ産物のゲル電気泳動において２１７ｂｐのバンドは低酸素耐性のヒラメに多く見出されることから（後述の実施例１及び図５参照）、低酸素耐性アレルに固有のものといえる。
工程２）
下記の高水温期（低酸素状態）においても死亡率が低く、低酸素耐性と認められる系統のヒラメを、継代飼育する。この継代飼育は通常２世代程度行う。このヒラメに対して、上記工程１）と同様にマイクロサテライト領域の配列又はその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列を増幅する。
下記の高水温期（低酸素状態）においても死亡率が低く、低酸素耐性と認められる系統のヒラメを、継代飼育する。この継代飼育は通常２世代程度行う。このヒラメに対して、上記工程１）と同様にマイクロサテライト領域の配列又はその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列を増幅する。
工程３）
１）と２）の工程の増幅結果を比較し、これらが一致する場合に、ヒラメが低酸素耐性であると識別する。一致しない場合は、ヒラメが低酸素耐性ではないと識別する。
１）と２）の工程の増幅結果を比較し、これらが一致する場合に、ヒラメが低酸素耐性であると識別する。一致しない場合は、ヒラメが低酸素耐性ではないと識別する。
本発明のＤＮＡマーカーを用いてヒラメが低酸素耐性であるか否かを識別するための診断キットは、上記ＰＣＲ用プライマーから成り、更に、熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ（Taqポリメラーゼなど）や検出のため増幅産物に対合させるプローブを含んでもよい。更に、このキットは、その他の消耗試薬として、例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)、バッファー等を含んでもよい。
低酸素状態での酸欠や疾病被害による死亡を未然に防ぐため、本発明の方法を利用することにより、例えば以下のようにして、低酸素耐性のヒラメの生産が可能になる。
（１）個体別に低酸素耐性の確認を本発明のＤＮＡマーカーで行い、抵抗性個体のみを選別飼育する。
（２）低酸素耐性の確認を本発明のＤＮＡマーカーで行い、抵抗性の親魚を選抜し、その子孫に低酸素耐性を付与する。この場合、低酸素耐性の確認を本発明のＤＮＡマーカーで行った抵抗性の親魚と他系統の抵抗性のない親魚との交配より作出された子孫に低酸素耐性を付与することも含まれる。
（１）個体別に低酸素耐性の確認を本発明のＤＮＡマーカーで行い、抵抗性個体のみを選別飼育する。
（２）低酸素耐性の確認を本発明のＤＮＡマーカーで行い、抵抗性の親魚を選抜し、その子孫に低酸素耐性を付与する。この場合、低酸素耐性の確認を本発明のＤＮＡマーカーで行った抵抗性の親魚と他系統の抵抗性のない親魚との交配より作出された子孫に低酸素耐性を付与することも含まれる。
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
飼育例１
解析家系として戻し交配家系を作出した（図２）。神奈川県水産技術センターで飼育・維持されている低酸素耐性系統（Ｃ系統）と低酸素非耐性系統（Ｂ系統）を人為交配させ、Ｆ１（ＣＢ系統）を作出し、ＣＢ雌個体とＢ雄個体（低酸素耐性系統）を戻し交配し、戻し交配家系（ＣＢＢ系統）を作出した。
ＣＢＢ戻し交配家系１６７個体の表現型の判定は１歳魚で行った。これらをすべて水温２５℃で飼育し、試験前日に絶食させた。１０００Ｌ水槽に８００Ｌの海水を入れ、これにＣＢＢ家系１６７尾を収容した。水温を２５℃に保ちながら、注水による酸素供給をなくすため注水を停止させて、さらに酸素供給器を停止させて、試験を開始した。これにより、水中の酸素はヒラメの呼吸により消費され、酸素濃度は時間とともに減少する。ＣＢＢ戻し交配家系の約半分が死亡した時点で試験を終了した。死亡個体順に、番号を付け、それぞれの死亡時間を記録した。酸素濃度（ＤＯ）は試験開始から３０分ごとに測定した。
結果を図３に示す。この結果、試験開始約５．７５時間後には、Ｂ系統はすべての供試魚が死亡したのに対して、Ｃ系統及びＣＢ系統においては、殆どの供試魚が生残しており、低酸素の耐性に対する相違に、遺伝要因が関与していることを確認した。
飼育例１
解析家系として戻し交配家系を作出した（図２）。神奈川県水産技術センターで飼育・維持されている低酸素耐性系統（Ｃ系統）と低酸素非耐性系統（Ｂ系統）を人為交配させ、Ｆ１（ＣＢ系統）を作出し、ＣＢ雌個体とＢ雄個体（低酸素耐性系統）を戻し交配し、戻し交配家系（ＣＢＢ系統）を作出した。
ＣＢＢ戻し交配家系１６７個体の表現型の判定は１歳魚で行った。これらをすべて水温２５℃で飼育し、試験前日に絶食させた。１０００Ｌ水槽に８００Ｌの海水を入れ、これにＣＢＢ家系１６７尾を収容した。水温を２５℃に保ちながら、注水による酸素供給をなくすため注水を停止させて、さらに酸素供給器を停止させて、試験を開始した。これにより、水中の酸素はヒラメの呼吸により消費され、酸素濃度は時間とともに減少する。ＣＢＢ戻し交配家系の約半分が死亡した時点で試験を終了した。死亡個体順に、番号を付け、それぞれの死亡時間を記録した。酸素濃度（ＤＯ）は試験開始から３０分ごとに測定した。
結果を図３に示す。この結果、試験開始約５．７５時間後には、Ｂ系統はすべての供試魚が死亡したのに対して、Ｃ系統及びＣＢ系統においては、殆どの供試魚が生残しており、低酸素の耐性に対する相違に、遺伝要因が関与していることを確認した。
実施例１
本実施例では、ＭＳマーカーと低酸素耐性の連鎖について、QTL解析を行った。
飼育例１で表現型の判定を行った戻し交配家系の各個体（１６７個体）の尾鰭を1cm角の大きさで採取し、lysis buffer [125mM NaCl, 10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mMEDTA（Ph8.0）]、Proteinase K（20mg/ml）（Takara）5μl、10%SDS 50μlを含む消化溶液を500 μl加え、37℃で一晩インキュベートした。PCI（phenol : chloroform : isoamylalchorl = 25 : 24 : 1）を等量加えてよく混和し、遠心分離（12000rpm、25℃、10分）、上清を新しいチューブに移した。さらに、CIA（chloroform：isoamylalchorl=24：1）を等量加えて転倒混和した後、遠心分離（12000rpm、25℃、5分）、上清を新しいチューブに移した。そこへ3M酢酸ナトリウムを1/10量、続いて2-propanolを等量加え、転倒混和した。遠心分離（15000rpm、4℃、10分）を行い、DNAペレットが析出していることを確認した後、上清を捨てた。70%エタノールを1ml加えて転倒混和することでDNAペレットおよびチューブの壁面を洗い、その後遠心分離（15000rpm、4℃、5分）を行って上澄みを捨て、5分程度の風乾を行った。風乾の後、TE buffer [10mM Tris-HCl（pH 8.0）, 1mM EDTA（pH 8.0）]を50μl加えてDNAの溶解を行った。
本実施例では、ＭＳマーカーと低酸素耐性の連鎖について、QTL解析を行った。
飼育例１で表現型の判定を行った戻し交配家系の各個体（１６７個体）の尾鰭を1cm角の大きさで採取し、lysis buffer [125mM NaCl, 10mM Tris-HCl（pH7.5）、10mMEDTA（Ph8.0）]、Proteinase K（20mg/ml）（Takara）5μl、10%SDS 50μlを含む消化溶液を500 μl加え、37℃で一晩インキュベートした。PCI（phenol : chloroform : isoamylalchorl = 25 : 24 : 1）を等量加えてよく混和し、遠心分離（12000rpm、25℃、10分）、上清を新しいチューブに移した。さらに、CIA（chloroform：isoamylalchorl=24：1）を等量加えて転倒混和した後、遠心分離（12000rpm、25℃、5分）、上清を新しいチューブに移した。そこへ3M酢酸ナトリウムを1/10量、続いて2-propanolを等量加え、転倒混和した。遠心分離（15000rpm、4℃、10分）を行い、DNAペレットが析出していることを確認した後、上清を捨てた。70%エタノールを1ml加えて転倒混和することでDNAペレットおよびチューブの壁面を洗い、その後遠心分離（15000rpm、4℃、5分）を行って上澄みを捨て、5分程度の風乾を行った。風乾の後、TE buffer [10mM Tris-HCl（pH 8.0）, 1mM EDTA（pH 8.0）]を50μl加えてDNAの溶解を行った。
このようにして得た各ＤＮＡを用いて、ＭＳマーカー型のQTL解析を行った。QTL解析は解析ソフトMap Manager QTXb20（Mammalian Genome 12: 930-932 (2001)等）を用いて行った。QTL解析の結果は、ロッドスコア(LOD score)で表され、ロッドスコアが３．０以上の場合、ＭＳマーカーと低酸素耐性とが有意に連鎖していると考えられる。
PCR法は、10×PCR reaction buffer（Mg2＋）、2.5Mm dNTP, 1%BSA、5U Taq DNA polymerase（Takara: Ex-Tag）50ng のテンプレートDNAを含む11μlの溶液で、GeneAmpPCRSystem9700（AppliedBiosystems）にて、初期変性95℃ 3分間行った後、変性95℃ 30秒、アニーリング62℃ 1分、伸長72℃ 1分を1サイクルとして30サイクル、最終伸長を72℃ 5分間行い、12℃に急冷することでPCRを行った。PCR反応後、得られたPCR産物に等量のloading dyeを加え、95℃ 5分間熱変性によって1本鎖にし、6％変性ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。電気泳動後、ガラス板をバイオイメージングスキャナー （FLA-9000; FUJIFILM）で読み取り、コンピューターで映像化し、マーカーによって増幅されたアリルの分離パターン（マーカー型）を判定した。
PCR法は、10×PCR reaction buffer（Mg2＋）、2.5Mm dNTP, 1%BSA、5U Taq DNA polymerase（Takara: Ex-Tag）50ng のテンプレートDNAを含む11μlの溶液で、GeneAmpPCRSystem9700（AppliedBiosystems）にて、初期変性95℃ 3分間行った後、変性95℃ 30秒、アニーリング62℃ 1分、伸長72℃ 1分を1サイクルとして30サイクル、最終伸長を72℃ 5分間行い、12℃に急冷することでPCRを行った。PCR反応後、得られたPCR産物に等量のloading dyeを加え、95℃ 5分間熱変性によって1本鎖にし、6％変性ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。電気泳動後、ガラス板をバイオイメージングスキャナー （FLA-9000; FUJIFILM）で読み取り、コンピューターで映像化し、マーカーによって増幅されたアリルの分離パターン（マーカー型）を判定した。
QTL解析は2段階に分けて行った。
第1段階：
ヒラメ遺伝子連鎖地図（非特許文献２）に基づき、全ての連鎖群において効率よく関連遺伝子座を探索できるように140個のMSマーカーを選び出した。このMSマーカーを用い、実験初期に死亡した個体（44個体）と最後死亡した個体（44個体）の合計88個体とその両親および祖母のマーカー型の情報を収集して、表現型（死亡・生残）とマーカー型の対応関係を調べた（結果は示さない）。
第2段階：
解析個体数を全個体である167個体（死亡75個体、生残92個体）に増やし、第1段階の検定で有意であった７種のMSマーカー（p<0.05）とその同一連鎖群上に位置する近傍のMSマーカー（Poli Hypoxia-1 TUF）を用いた。Poli Hypoxia-1 TUF以外のＭＳマーカーは既報告のＭＳマーカーである（非特許文献２）。各ＭＳマーカーの判定のために用いるＰＣＲ用プライマーとして、表１に示す各プライマーを用いた。forward primerの5' 側に蛍光標識（TET）した。これらのＭＳマーカーを用いて、表現型とマーカー型との対応関係を調べた。表現型は死亡・生残と各個体の死亡時間の2つを用いた。
第1段階：
ヒラメ遺伝子連鎖地図（非特許文献２）に基づき、全ての連鎖群において効率よく関連遺伝子座を探索できるように140個のMSマーカーを選び出した。このMSマーカーを用い、実験初期に死亡した個体（44個体）と最後死亡した個体（44個体）の合計88個体とその両親および祖母のマーカー型の情報を収集して、表現型（死亡・生残）とマーカー型の対応関係を調べた（結果は示さない）。
第2段階：
解析個体数を全個体である167個体（死亡75個体、生残92個体）に増やし、第1段階の検定で有意であった７種のMSマーカー（p<0.05）とその同一連鎖群上に位置する近傍のMSマーカー（Poli Hypoxia-1 TUF）を用いた。Poli Hypoxia-1 TUF以外のＭＳマーカーは既報告のＭＳマーカーである（非特許文献２）。各ＭＳマーカーの判定のために用いるＰＣＲ用プライマーとして、表１に示す各プライマーを用いた。forward primerの5' 側に蛍光標識（TET）した。これらのＭＳマーカーを用いて、表現型とマーカー型との対応関係を調べた。表現型は死亡・生残と各個体の死亡時間の2つを用いた。
結果を表１に示す。表中、死亡欄及び生残欄は、低酸素耐性のバンドを示した個体の割合を示す。
Poli 1482 TUF及びPoli Hypoxia-1 TUFのＭＳマーカーを用いた場合には、ロッドスコア(LOD score)が３．０以上であり、これらのＭＳマーカーが、ヒラメの低酸素耐性を識別するために有効であることを示している。
また、図４と５に、Poli 1482 TUF及びPoli Hypoxia-1 TUFのＭＳマーカーを用いた検出結果を示す。図４（Poli 1482 TUF）において、119bpのバンドは低酸素耐性のヒラメ、125bpのバンドは非低酸素耐性のヒラメに帰属すると考えられる。図５（Poli Hypoxia-1 TUF）において、217bpのバンドは低酸素耐性のヒラメ、215bpのバンドは非低酸素耐性のヒラメに帰属すると考えられる。
Claims (6)
- 下記工程から成る低酸素耐性ヒラメの識別方法。
１）ヒラメ、その卵又はそれらの加工品から抽出したＤＮＡについて、下記ａ）又はｂ）のいずれかのＤＮＡマーカー配列若しくはその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列を増幅する工程、
ａ）配列番号１の809〜1158番目の塩基配列（その965〜1000位がマイクロサテライト配列に相当する。）
ｂ）配列番号１の507〜788番目の塩基配列（その629〜750位がマイクロサテライト配列に相当する。）
２）別途継代飼育の結果、低酸素耐性と認められる系統のヒラメについて、上記１）の工程を実施する工程、及び
３）１）と２）の工程の増幅結果を比較し、これらが一致する場合に、ヒラメが低酸素耐性であると識別する工程 - 前記工程１）における増幅がＰＣＲ反応により行われ、前記工程３）における増幅結果の比較が、増幅されたＤＮＡ断片をゲル電気泳動により分離して、その長さを比較することにより行われ、その長さが一致する場合に増幅結果が一致したとする、請求項１に記載の方法。
- 下記工程から成る低酸素耐性ヒラメの識別方法。
１）ヒラメ、その卵又はその加工品から抽出したＤＮＡについて、（１）又は（２）のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行う工程、及び
（１）5'-CATGTTGGTCTGAGACGATGAACTC-3' （配列番号2）の３'側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-TAGATCCTGTTGTTTTCCTGCTCG-3' （配列番号3）の３'側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド、
（２）5'-CTCACTGTTCTGAAGCTTCTCT-3' （配列番号4）の３'側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-CGTCTGAGTCGGAATCCTTCTG-3' （配列番号5）の３'側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
２）（１）の２つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた場合に、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動において１１９ｂｐのバンドがある場合、又は（２）の２つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた場合に、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動において２１７ｂｐのバンドがある場合に、ヒラメが低酸素耐性であると識別する工程 - ヒラメが低酸素耐性であるか否かを識別するための診断キットであって、下記いずれかの配列若しくはその一部であってマイクロサテライト配列を含む配列を増幅するためのＰＣＲ用プライマーを含むキット。
ａ）配列番号１の809〜1158番目の塩基配列（その965〜1000位がマイクロサテライト配列に相当する。）
ｂ）配列番号１の507〜788番目の塩基配列（その629〜750位がマイクロサテライト配列に相当する。） - 前記ＰＣＲ用プライマーが、
下記ａ−１）の塩基配列から成るオリゴヌクレオチド、及びａ−２）の塩基配列から成るオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
ａ−１）配列番号１の1〜964番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
ａ−２）配列番号１の1001〜1303番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
又は下記ｂ−１）の塩基配列から成るオリゴヌクレオチド、及びｂ−２）の塩基配列から成るオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
ｂ−１）配列番号１の1〜628番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
ｂ−２）配列番号１の751〜1030番目の塩基配列のうち連続する少なくとも18個の塩基配列
から成る請求項４に記載のキット。 - 前記ＰＣＲ用プライマーが、下記いずれかである請求項４に記載のキット。
（１）5'-CATGTTGGTCTGAGACGATGAACTC-3' （配列番号2）の３'側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-TAGATCCTGTTGTTTTCCTGCTCG-3' （配列番号3）の３'側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
（２）5'-CTCACTGTTCTGAAGCTTCTCT-3' （配列番号4）の３'側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、及び5'-CGTCTGAGTCGGAATCCTTCTG-3' （配列番号5）の３'側末端から連続する少なくとも１８個の塩基から成るオリゴヌクレオチド、又はこれらに相補的な配列の２つのオリゴヌクレオチド
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