JP5344389B2 - ヒラメのエドワジェラ症感受性判別法 - Google Patents

Description

本発明は、ＤＮＡマーカーを用いたヒラメのエドワジェラ症感受性判別法に関する。

エドワジェラ症は、腸内細菌の一種であるエドワジェラ・タルダの感染により引き起こされる養殖ヒラメの代表的な病気であって、水温の高い時期に出やすく死亡率が高い。ヒラメ養殖におけるエドワジェラ症による被害は、年間約３億円にも達すると推定されている。
従来、ヒラメ、タイ等の魚類のエドワジェラ症に対して有効な不活化ワクチンが開発されている（特許文献１及び特許文献２参照）。
また、特許文献３には、特定の遺伝子マーカーを用いてヒラメのリンホシスチス病耐性を判別する方法が記載されている。
しかし、遺伝的にエドワジェラ症に対するヒラメの感受性を判別する方法は、未だ開発されていない。

特開２００８−５０３００号公報 特開２００７−２３８５０５号公報 特開２００４−８１１５５号公報

本発明が解決しようとする課題は、特定の遺伝子マーカーを用いてエドワジェラ症に罹り易いヒラメを判別し、このようなヒラメを除いて効率的な養殖を可能とするヒラメのエドワジェラ症感受性判別法を提供することにある。

本出願人は、長年継続されてきたヒラメ養殖において、エドワジェラ症に対する感受性の異なる２系統（耐病性系統：ＫＰ-Ｃ・感受性系統：ＫＰ-Ｂ）を明らかにした。
そして、これらエドワジェラ症に対する感受性の異なる２系統から雑種第一代（Ｆ₁：ＫＰ-ＣＢ）を作出した。その後、Ｆ₁（ＫＰ-ＣＢ）を用いて１対１交配を行ない、雑種第二代（Ｆ₂：ＫＰ-ＣＢＣＢ）を作出した。
作出したＦ₂（ＫＰ−ＣＢＣＢ）、Ｆ₁（ＫＰ-ＣＢ）及びその両親（ＫＰ-Ｃ、ＫＰ-Ｂ）に対してＤＮＡマーカーを用いたＱＴＬ解析を行った。

通常、Ｆ₂による解析モデルを適用する際には、親魚であるＫＰ−Ｂ、ＫＰ−ＣはＢＢ、ＣＣようにマーカー型がホモ接合体、Ｆ₁(ＫＰ−ＣＢ)は全てＣＢのヘテロ接合体、さらにＦ₁同士を交配して作出したＦ₂(ＫＰ−ＣＢＣＢ)は、ＢＢ: ＣＢ: ＣＣが1 : 2 : 1の割合で出現することが予想される。そのため、ヘテロ接合体ＣＢのサンプルは除外し、ＢＢおよびＣＣのホモ接合体のみを比較・解析する。
Ｆ₂による解析の結果、発明者らは、既に見出していたヒラメの遺伝子連鎖地図｛Ｍ．Ｍ．Ｃｏｉｍｂｒａ、東京水産大学博士学位論文（２００１）；Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ（２００３）｝と照らし合わせることで、ヒラメエドワジェラ症の感受性に関与するマーカー座として、このヒラメ遺伝子連鎖地図における遺伝子連鎖群（ＬＧ）４のマーカー座Ｐｏｌｉ１５０６ＴＵＦが明らかになった。

ヒラメエドワジェラ症の感受性に関与するマーカー座（連鎖群４：Ｐｏｌｉ１５０６ＴＵＦ）では、感受性系統：ＫＰ-Ｂ由来のマーカー座（アレル）がホモ接合体となると、死亡率が上昇することがわかった。
そして、ＬＧ４のマーカー座Ｐｏｌｉ１５０６ＴＵＦに関する特定のプライマーを用いて、ヒラメ由来の核酸を鋳型とした核酸増幅反応法を行い、得られた増幅産物を解析することにより、エドワジェラ症に罹り易い個体を判別することができる。

本発明のヒラメのエドワジェラ症感受性判別法は、５’−ＴＣＴ ＡＧＴ ＧＴＴ ＴＧＡ ＧＣＡ ＧＡＴ ＡＧＧ ＡＡＧ ＧＧ−３’（配列番号１）の内、連続する少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、５’−ＣＴＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＧＣＡ ＣＴＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＡＣＴ Ｇ−３’（配列番号２）の内、連続する少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分をプライマーとして、ヒラメ由来の核酸を鋳型とした核酸増幅反応法を行ない、得られた増幅産物を解析することにより、ヒラメのエドワジェラ症に対する感受性を判別する。

本発明によれば、エドワジェラ症に感受性を有するヒラメを判別できるので、このようなヒラメを排除することにより、ヒラメの養殖においてエドワジェラ症の罹患による死亡率を押えることが可能であり、経済的な効果が高い。
また、このマーカーにより、エドワジェラ症に耐病性を有するヒラメを判定できる可能性もある。

遺伝子連鎖群ＬＧ４上のマーカー座Ｐｏｌｉ１５０６ＴＵＦの遺伝マーカーを用いて、ヒラメのエドワジェラ症に対する感受性の遺伝的背景を判別し、エドワジェラ症に罹り易い個体を排除して飼育する。
以下、本発明の実施例について詳細に説明する。

上記Ｆ₁（ＫＰ-ＣＢ）を用いて１対１交配を行ない、Ｆ₂（ＫＰ-ＣＢＣＢ）を作出した。
このＦ_2;ＫＰ−ＣＢＣＢ（ｎ＝１０９、平均体長1３．２ｃｍ）を供試魚として、エドワジェラ症の原因菌Ｅ.tardaによる感染試験を行なった。供試魚を菌数８×１０⁶/ｍｌの水槽に１０分間浸漬し、各個体の表現型データを得た。この結果、生存魚は１７尾、死亡魚は９２尾であった。
これら供試魚に対し、次のようにＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ法を行い、得られたＰＣＲ産物にゲル電気泳動法を施し、その遺伝子型を確認した。

まず、全てのヒラメからのＤＮＡ抽出は、以下の手順で行った。
尾鰭を１ｃｍ角の大きさで採取し、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔris−ＨＣｌ（pH８．０）、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ Proteinase Ｋを含む消化溶液を６００μＬ加え、３７℃で一晩静置した。
さらに、フェノール／クロロホルム（１：１）抽出を１回行った後、エタノール沈殿にて染色体ＤＮＡを析出させた。回収したＤＮＡは７０％エタノールで洗浄、乾燥後、ＴＥ溶液（０．０１Ｍ Ｔris−ＨＣｌ pH７．４、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ pH８．０）５０μＬに溶解した。

次に、
Ｆ：５’−ＴＣＴ ＡＧＴ ＧＴＴ ＴＧＡ ＧＣＡ ＧＡＴ ＡＧＧ ＡＡＧ ＧＧ−３’（配列番号１）
Ｒ：５’−ＣＴＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＧＣＡ ＣＴＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＡＣＴ Ｇ−３’（配列番号２）
の一組のプライマーを合成し、
０．０７ｐｍｏｌ Ｆプライマーと［γ-³³Ｐ］ＡＴＰ、Ｔ４polynucleotide kinaseによって標識した０．３２ｐｍｏｌ Ｒプライマー、０．２ｍＭ each ｄＮＴＰ、２．０
ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１％ＢＳＡ、０．２５ Ｕ Ex Ｔaq ＤＮＡ polymerase（ＴａｋａｒａＢｉｏ）、５０ｎｇのテンプレートＤＮＡを含む１２μｌの溶液で、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９６００ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）にて、ＰＣＲ法を行った。

なお、このプライマーを用いたＰＣＲ反応組成（１サンプル分）を表１に示し、Ｒプラ
イマーのＲＩ標識用液組成（１００サンプル分）を表２に示す。

ＰＣＲ条件は、９５℃、２分−（９５℃、３０秒−６２℃、１分−７２℃、１分）×３５サイクル−（７２℃、３分）×１サイクルとした。
反応後、等量のLoading dye（９５％ formamide，１０ｍＤ ＥＤＴＡ，0.05％ bromophenol blue and xylene cyanol）とよく攪拌し、ＰＣＲ産物を熱変性によって１本鎖にし、６％アクリルアミドゲルにて電気泳動を行なった。
その後、１時間乾燥させたゲルを、Ｉmaging Ｐlate（ＩＰ）に３〜１２時間感光させ、放射線の感光像が記憶されたＩＰをＢio-imaging Ａnalyzer（ＢＡＳ1000、Ｆuji Ｐhoto Ｆilms）で読み取り、コンピュータで映像化した。
その結果を図１及び図２に示す。

電気泳動を行なった結果、供試魚の内、感受性系統(ＫＰ−Ｂ)のマーカー型であるＢＢとして１４８ｂｐ及び１５１ｂｐの両方を持つ個体は４１尾、耐病性系統(ＫＰ−Ｃ)のマーカー型であるＣＣとして１４２ｂｐのみをもつ個体は１２尾であった。さらにこれらについてＦ₂モデル解析として、バンドの有無と死亡率との関係を調べた。
その結果、表３から明らかなように、１４２ｂｐのみバンドのある群では、生存魚が４尾、死亡魚が８尾であるのに対し、１４８ｂｐ及び１５１ｂｐにバンドのある群では、生存魚が３尾、死亡魚が３８尾であった。
即ち、１４８ｂｐ及び１５１ｂｐの両方にバンドが確認されなかった群の死亡率は６６．７％であり、１４８ｂｐ及び１５１ｂｐにバンドが確認された群の死亡率は９２．７％であって、死亡率の違いは明らかであった。

１４８ｂｐ及び１５１ｂｐのバンドと１４２ｂｐのバンドの有無とエドワジェラ症感受性の有意差検定は、Χ²乗検定解析によるＰ値が０．０１９であって、上記プライマーを用いたＰＣＲ産物に１４８ｂｐ及び１５１ｂｐにバンドがあるヒラメは、エドワジェラ症に罹り易いヒラメであるといえる。

なお、上記実施例では、エドワジェラ症感受性と連鎖するバンドとして１４８ｂｐ、１５１ｂｐを示した。しかし、配列番号１及び配列番号２のプライマーは、ＣＡ繰り返し配列(マイクロサテライト)を含む形でＰＣＲプライマーが設計されている。
マイクロサテライトを含むＰＣＲプライマーは、1つの遺伝子座を位置づけることができるとともに、同種内のその多型性により各個体間では多くのバンドを検出する（DNAMakers：Protocols,Applications,and Overview，GUSTAVO CAETANO-ANOLLES PETER M.GRESSHOFF）。
よって、この実施例で示されるバンドのサイズは、これに限定されるものではない。
また、核酸増幅反応法としてはＬＡＭＰ法なども用いることができる。さらに、増幅産物の解析方法としては質量分析法やキャピラリ電気泳動法なども用いることができる。

本発明に係るゲル電気泳動像であり、（ａ）はＦ₁(ＫＰ−ＣＢ)、(ｂ)はＦ₂(ＫＰ−ＣＢＣＢ)の死亡個体、(ｃ)はＦ₂(ＫＰ−ＣＢＣＢ)の生存個体を示す。 本発明に係るゲル電気泳動の模式図であり、（ａ）はＦ₁(ＫＰ−ＣＢ)、(ｂ)はＦ₂(ＫＰ−ＣＢＣＢ)の死亡個体、(ｃ)はＦ₂(ＫＰ−ＣＢＣＢ)の生存個体、(ｄ)は耐病性系統(ＫＰ−Ｃ)、感受性系統(ＫＰ−Ｂ) を示す。

Claims (1)

1. ５’−ＴＣＴ ＡＧＴ ＧＴＴ ＴＧＡ ＧＣＡ ＧＡＴ ＡＧＧ ＡＡＧ ＧＧ−３’（配列番号１）の内、連続する少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分、及び、５’−ＣＴＣ ＴＴＡ ＧＴＧ ＧＣＡ ＣＴＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＡＣＴ Ｇ−３’（配列番号２）の内、連続する少なくとも１０個の塩基から成るオリゴヌクレオチド部分をプライマーとして、ヒラメ由来の核酸を鋳型とした核酸増幅反応法を行ない、得られた増幅産物を解析することにより、ヒラメのエドワジェラ症に対する感受性を判別することを特徴とする、ヒラメのエドワジェラ症感受性判別法。