KR102053753B1 - 탄저병 저항성 딸기 품종 선별용 snp 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 딸기 FaPWP2 (Fragaria x ananassa Periodic tryptophan protein 2 homolog) 유전자의 염기서열 중 3,065번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 이용한 탄저병 저항성 딸기 품종 선별 방법에 관한 것이다.

Description

탄저병 저항성 딸기 품종 선별용 SNP 마커 및 이의 용도{Single nucleotide polymorphism marker for discriminating anthracnose resistance strawberry cultivar and uses thereof}

본 발명은 탄저병 저항성 딸기 품종 선별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

딸기 탄저병(anthracnose)은 잎, 엽병, 런너 및 관부에 발생하여 시들음과 조직 괴사를 유발하고, 심할 경우 묘를 고사시켜 매년 30% 이상의 생산량 소실을 초래하는 주요한 병해이다. 미국 및 유럽에서는 주로 콜레토트리쿰 아쿠타툼 (Colletotrichum acutatum), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides) 및 콜레토트리쿰 프라가레애 (Colletotrichum fragareae) 3종의 콜레토트리쿰 속 병원균들에 의해 발병되는 것으로 알려져 있으나, 국내를 포함한 동아시아 지역에서는 콜레토트리쿰 프럭티콜라 (Colletotrichum fructicola)가 딸기에 탄저병을 일으킨다. 현재 딸기 탄저병균 C. fructicola에 대한 저항성과 관련된 양적형질유전자좌(quantitative trait locus, QTL) 및 그 지역에 위치하는 유전자군에 대한 연구가 미미하다.

본 발명에서는 딸기 탄저병에 대한 이병지수 조사 및 SNP(single nucleotide polymorphism) 유전자형 분석 결과를 이용하여 유전자지도를 작성하고 딸기 탄저병 저항성과 관련된 QTL을 탐색하여 탄저병 저항성 관련 유전자의 SNP를 검출하여 탄저병 저항성 딸기 선발용 SNP 마커를 개발하고자 하였다.

한편, 한국등록특허 제1789948호에는 '딸기속 식물의 탄저병 저항성 관련 마커와 그 이용'이 개시되어 있으나, FaPWP2(Fragaria x ananassa Periodic tryptophan protein 2 homolog) 유전자를 이용한 본 발명의 탄저병 저항성 딸기 품종 선별용 SNP 마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 탄저병 저항성 품종인 '보교조생'과 감수성 품종인 '매향'을 교배한 F₁ 집단을 이용하여 탄저병에 대한 이병지수를 조사하고, SNP 유전형분석을 수행하여 유전자지도를 작성하였으며, 딸기 탄저병 저항성과 관련된 QTL을 분석하였다. 또한, 상기 QTL에 위치한 SNP를 기반으로 HRM용 프라이머 세트를 개발하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 보교조생, 매향 그리고 F₁ 집단의 게노믹 DNA를 이용하여 유전형분석을 수행한 결과, FaPWP2 유전자의 엑손 5 지역에 위치하는 SNP에 대한 프라이머 세트가 탄저병 저항성 개체(이병지수 1.0 미만)와 탄저병 감수성 개체(이병지수 2.5 이상)에서는 상이한 유전형을 보여 딸기 탄저병 저항성 품종을 선발할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 딸기 FaPWP2 (Fragaria x ananassa Periodic tryptophan protein 2 homolog) 유전자의 염기서열 중 3,065번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 탄저병 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 딸기 FaPWP2 유전자의 염기서열 중 3,065번째 염기에 위치한 SNP를 증폭하기 위한, 탄저병 저항성 딸기 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 탄저병 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 딸기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 탄저병 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 딸기 FaPWP2 유전자의 염기서열 중 3,065번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 탄저병 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 프로브를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 딸기 FaPWP2 유전자의 염기서열 중 3,065번째 염기에 위치한 SNP를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 탄저병 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명에 따른 SNP 마커를 딸기 육종에 적용하면, 탄저병 저항성 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 '보교조생' × '매향' F₁ 집단의 204 개체에서 딸기 탄저병 병처리 50일 후 이병지수 분석 결과이다.
도 2는 '보교조생' × '매향' F₁ 집단의 유전형분석 결과를 이용하여 작성한 유전자지도이다.
도 3은 '보교조생' × '매향' F₁ 집단의 딸기 탄저병 저항성 연관 QTL의 위치를 보여준다.
도 4는 탄저병 저항성 연관 마커 AX-123362480-HRM의 유전자 정보 및 HRM 수행 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 딸기 FaPWP2 (Fragaria x ananassa Periodic tryptophan protein 2 homolog) 유전자의 염기서열 중 3,065번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 탄저병 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 탄저병은 콜레토트리쿰 프럭티콜라 (Colletotrichum fructicola)에 의해 유발되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

본 발명의 SNP 마커를 탄저병 저항성 딸기 품종 판별에 사용할 수 있는 것은 서열번호 1의 딸기 FaPWP2 유전자의 염기서열 중 SNP 변이 위치인 3,065번째 염기가 A 또는 G로 다르게 나타나는 것에 근거한 것이다. 예를 들어, 서열번호 1의 3,065번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP는 A 또는 G로 염기다형성을 나타내는데, 이 SNP에서 AG의 유전자형을 갖는 품종은 탄저병 저항성 딸기 품종으로, GG의 유전자형을 갖는 품종은 탄저병 감수성 딸기 품종으로 판단할 수 있다.

본 발명은 상기 서열번호 1의 서열에서 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중 가닥의 gDNA(게놈 DNA)에서 발견되는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서에 제시된 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, 게놈 DNA의 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 딸기 FaPWP2 유전자의 염기서열 중 3,065번째 염기에 위치한 SNP를 증폭하기 위한, 탄저병 저항성 딸기 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 2로 표시된 올리고뉴클레오티드는 SNP 위치 염기를 포함하는 정방향 프라이머이며, 서열번호 3으로 표시된 올리고뉴클레오티드는 역방향 프라이머로(도 4 참고), 프라이머의 서열 길이에 따라 각 서열 내의 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP(horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, ³²P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴(biotin)) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 탄저병 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

딸기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 탄저병 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 딸기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega, 미국)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 SNP 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), NED, VIC, PET 또는 ROX이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 6-FAM, NED, VIC, PET 또는 ROX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한 상기 표지 물질에는 Cy-5 또는 Cy-3가 포함될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 프라이머는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 HRM(high-resolution melting) 분석, 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Genetic Analyzer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 형광염료를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 있어서, 상기 증폭산물은 서열번호 1의 딸기 FaPWP2 유전자의 염기서열 중 3,065번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP 위치에 A 또는 G의 염기를 가질 수 있으며, 해당 SNP 위치에 A 염기를 갖는 경우에는 탄저병 저항성 딸기 품종으로, G 염기를 갖는 경우에는 탄저병 감수성 딸기 품종으로 판단할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 딸기 FaPWP2(Fragaria x ananassa Periodic tryptophan protein 2 homolog) 유전자의 염기서열 중 3,065번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 탄저병 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 프로브 및 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명에서 용어 "프로브"는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 SNP 뉴클레오티드인 서열번호 1의 3,065번째 뉴클레오티드를 포함하는 8 내지 100 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 하며, 온도, 이온 세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명에서 탄저병 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 마이크로어레이는 본 발명의 SNP 마커가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 의미한다. "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다.

용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐(hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 딸기 식물체 준비

딸기 탄저병 저항성 품종 '보교조생' 및 감수성 품종 '매향'을 이용하여 2016년 1월에 충남 농업기술원에서 '보교조생'을 모본으로, '매향'을 부본으로 하여 교배하였다. 교배하여 채종한 종자는 파종상에 2016년 3월에 파종하여 발아한 F₁ 유식물체를 육묘하여 조합별 실생묘를 각각 8 cm 이색포트에 가식하였다. 이후 '보교조생' × '매향' 204 개체를 육묘하여 30 cm 화분에 정식하였다.

2. 딸기 탄저병 병원균 접종 및 표현형 검정

'보교조생' × '매향' F₁ 집단 204 개체의 딸기 탄저병 이병지수 조사를 위하여 런너 증식묘를 개체(실생묘)별 4주씩 2반복으로 딸기 탄저병균을 접종하였다. 딸기 탄저병균은 논산 딸기시험장의 딸기 병반에서 분리된 분리균 콜레토트리쿰 프럭티콜라(Colletotrichum fructicola) CGF160604(충남 농업기술원 논산 딸기시험장 제공)를 사용하였다. 탄저병균 접종은 탄저병균 C. fructicola CGF160604의 포자 현탁액을 1 × 10⁶ conidia/㎖ 농도로 주당 1 ㎖씩 비닐하우스 내에서 분무 접종하였다. 병원균 접종 후 3일간 비닐로 덮어 포화습도를 유지하였고, 20일 이후 10일 간격으로 나타나는 병징을 4회 조사하였다.

탄저병 발생은 병 접종 후 20일 이후부터 엽병(petiole)의 병징으로 이병지수를 조사하였다. 이병지수는 0, 무발생; 1, <50% 병징 발생; 2, ≥ 50% 병징 발생; 3, 시들음; 4, 고사로 측정하였다.

3. 딸기 DNA 추출

교배 모본으로 사용한 양친들과 각각의 F₁ 집단 개체들의 식물체로부터 IDT(Integrated DNA Technologies) Plant DNA Extraction Protocol을 수정한 방법을 사용하여 각각 DNA를 추출하였다. 각 개체에서 잎 50 ㎎을 2.0 ㎖ 튜브에 담아 3 mm glass beads 및 액체질소를 이용하여 분쇄한 후 150 ㎕ 추출 버퍼 A (2% CTAB, 100 mM Tris(pH 8.0), 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl, 4% polyvinylpyrrolidone(MW 40,000), 0.1% ascorbic acid, 10 mM β-mercaptoethanol), 450 ㎕ 추출 버퍼 B (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 100 mM NaCl, 10 mM β-mercaptoethanol), 50 ㎕ 20% SDS를 넣고 볼텍싱하였다. 65℃에 10분간 배양 후 5 M 아세트산칼륨(-20℃ 보관)을 205 ㎕ 넣고 인버팅(inverting) 후 얼음에서 5분간 배양하였다. 13,200 rpm에 15분간 원심분리 후 상층액을 새로운 1.5 ㎖ 튜브에 옮기고 이소프로판올(-20℃ 보관)을 270 ㎕ 넣고 인버팅 후 얼음에서 20분간 배양하였다. 10,200 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 버리고 70% 에탄올(-20℃ 보관)을 300 ㎕ 넣고 인버팅 후 13,000 rpm에 5분간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 15분간 펠렛을 건조한 후에 100 ㎕ TE 버퍼 (10 mM Tris(pH 8.0), 1 mM EDTA)로 펠렛을 녹여 DNA를 확보하였다. 추출한 DNA는 0.8% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동 결과로 농도를 확인하였다.

4. IStraw35 SNP array 분석

유전자지도를 그리기 위해 유전자형을 분석할 유전형분석(genotyping) 방법은 Affymatrix IStraw35 Axiom^® array를 Eurofins사에 의뢰하여 수행하였다. IStraw35 SNP genotyping array 분석에는 '보교조생' 및 '매향'은 각각 3개체씩, 그리고 탄저병에 대한 표현형이 확실한 '보교조생' × '매향' F₁ 집단 170 개체를 사용하였다. 총 38,506 probesets에 대한 SNP 유전형분석 결과에서 딸기 유전자지도를 그리기 위해 3개의 conversion types를 선발하였다: probesets 사용 시 집단 개체들에게서 모든 유전자형의 유형(예시: AA, AB, BB)이 나타나는 PHR(Poly High Resolution), 한쪽의 동형접합자(homozygote)에만 나타나는 경우(예시: AA, AB 또는 BB, AB)인 NMH(No Minor Homozygote), 그리고 A나 B 외 낮은 intensity cluster를 보여주는 OTV(Off-target Variant). 이 중에서 양친의 유전자형 3반복 결과가 모두 일치하거나 하나만 unknown일 경우를 다시 선발하였다. 선발된 데이터에서 유전자지도 작성을 위해 MAF(minor allele frequency) > 0.05 (5%), SNP probesets 간 similarity < 1.0 (100%) 및 missing rate 10% 미만의 조건을 고려하여 데이터를 재선발하였다.

5. 유전자지도 작성

유전자지도 작성을 위한 그룹화(grouping) 및 맵핑(mapping)은 JoinMap 4.0 프로그램을 이용하여 수행하였다. 지도 거리는 Haldane mapping function을 이용하여 계산하였고, regression mapping 분석 방법으로 그룹화 및 맵핑을 수행하였다. 기타 조건은 default 값으로 지정하여 수행하였다. 연관그룹들(linkage groups)은 independence LOD 값이 3.0~31.0 조건에서 총 28개의 그룹들을 선발하였다.

최종 유전자지도는 Windows QTL Cartographer v2.5를 사용하여 작성하였다. CIM(composite interval mapping) 분석방법을 사용하였고, CIM model은 Model 6: Standard model을, regression 방법은 Forward & Backward 방법을 사용하였다. Windows size는 10 cM으로 설정하고, permutation 횟수는 1,000회, 그리고 significance level은 0.05로 설정하여 '보교조생' × '매향' F₁ 집단의 유전자지도를 작성하였다.

6. 딸기 탄저병 저항성 연관 SNP 마커 발굴

유전자지도를 작성하여 탐색된 '보교조생' × '매향' F₁ 집단의 QTL(quantitative trait loci)을 바탕으로 threshold LOD 값 3.0 이상의 지역들을 선발하여 이에 위치한 SNP probesets을 기반으로 HRM(high resolution melting) 마커들을 제작하였다. HRM 반응액에는 1× MeltDoctor™ HRM Master Mix, 0.3 μM 프라이머 세트, 주형 DNA (10 ng/㎕) 1 ㎕를 첨가 후 멸균수로 최종액의 총 부피가 5 ㎕가 되도록 했다. HRM 분석은 StepOne™ Plus System (Applied Biosystems, USA)을 사용하였다. 먼저 95℃에서 10분간 초기 변성시킨 후, 95℃에서 10초 변성, 60℃에서 1분 어닐링/신장의 반응을 40회 수행하였다. PCR 반응이 끝난 후 60-90℃에서 0.1℃/s의 속도로 Tm(melting temperature)값을 측정하였다. 용융곡선(Melting curve) 분석은 High-Resolution Melt Software ver 3.0 (Applied Biosystems, USA)를 사용하였다.

실시예 1. 딸기 탄저병 표현형 검정 및 탄저병 저항성 연관 QTL 분석 및 SNP 마커 발굴

'보교조생' × '매향' F₁ 집단의 204 개체에서 딸기 탄저병 병처리 후 50일에 이병지수를 조사한 결과, 도 1에 개시된 것과 같이 엽병(petiole)의 병징이 50% 미만인 이병지수 1.25 미만의 개체가 44개, 병징이 50% 이상인 이병지수 2.25 이상의 개체가 34개 확인되었다.

딸기 탄저병 처리 후 표현형과 유전자형 데이터를 이용하여 유전자지도를 작성하였다(도 2). Threshold LOD 값이 3.0 이상으로 강하게 나타난 QTL은 각각 LG6i와 LG6iv였다(도 3). LOD값 3.0 이상의 지역들 또는 근접하게 위치한 SNP probesets을 기반으로 총 29개의 HRM 마커를 제작하여 HRM을 수행하였다.

양친을 비롯한 '보교조생' × '매향' F₁ 집단으로 HRM을 수행한 결과, LG6iv에 위치하는 SNP probeset AX-123362480 기반의 HRM 마커, AX-123362480-HRM을 사용하였을 때 탄저병 저항성과 감수성의 구별이 가능한 것으로 나타났다(도 4). 정방향 프라이머(5'-CGGGGAAAGTTGGGTTATGA-3', 서열번호 2) 및 역방향 프라이머(5'-AACAACAGGCCTTCCACGAT-3', 서열번호 3)으로 증폭되는 AX-123362480-HRM는 참조서열 게놈(reference genome)인 딸기 2배체 Fragaria vesca subsp. vesca accession 'Hawaii 4' (v1.1) 유전자 gene05851(FvPWP2)의 서열을 기반으로 8배체 Fragaria x ananassa의 유전자 FaPWP2의 엑손 5에 위치한 SNP인 A/G를 포함한 약 60 bp의 산물을 증폭시키는 마커이다(도 4). FaPWP2는 리보솜 (ribosome) 생합성 보조인자인 periodic tryptophan protein 2를 코딩하는 유전자이다.

탄저병 저항성 품종 '보교조생'을 포함한 탄저병 저항성 샘플들(이병지수 < 1.0)과 매향을 포함한 탄저병 감수성 샘플들(이병지수 ≥ 2.5)은 다른 패턴의 용융곡선을 나타내는 것으로 확인되었다(도 4). 용융곡선 패턴은 탄저병 저항성과 감수성 샘플 모두 동형접합의(homozygous) 패턴을 보였으나 염기 차이로 Tm 값이 다르게 나타나는 것을 보였다. 해당 SNP A/G와 Tm 값을 비교해 보았을 때, 보교조생을 포함한 저항성 샘플들은 AG, 매향을 포함한 감수성 샘플들은 GG의 유전자형인 것으로 판단되었다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Single nucleotide polymorphism marker for discriminating anthracnose resistance strawberry cultivar and uses thereof <130> PN18490 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5704 <212> DNA <213> Fragaria x ananassa <400> 1 gagaaaactt aagcagcaat gaacttcagg ttccagaacc ttctcggagc gccgtaccgg 60 ggcggcaaca ccgtgatcgt caacaacacg gagttaatct caccggtcgg taaccgagtc 120 tccgtcacca acctccgtga ctcgacgacc ataaccctac cgatccagtc ctcctgcaac 180 atcagccgca tcgccgcctc ccccgacggc gtcttcctcc tcaccgtcga cgacaaccac 240 cgctgcctct tcatcaacct ccgccgccgc gtcgtgctcc accggatttc cttcaagacc 300 gccgtcgccg ccgccgcgtt cagccccgac ggcggtttca tcgccgtggc caccggtaag 360 gttgtccaga tttggcggtc gccggggttt aagaaggagt tttttccgtt tgagttggtt 420 aagacttttg ctgactgtga tgataaggtg acggcgttgg agtggagccc cgactccgct 480 tatgtgctgg ccgggtcgaa agacttgact gctaggattt tctgtattaa gaagtttaaa 540 ttgggagggg tgaaggttaa gccttttatg tttttggggc atagggatac agtagttggt 600 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cagctacaga ttattttaga gtttttattg tttgctttct tcaggtctgg 1500 aacgtttctt caggattctg ttttgtaaca ttctctgagc atgaaaatgc aatcactgca 1560 ctccactttt tggctaacaa aaacacactc ttaagtgcct ctttggatgg gactgttcgt 1620 gcatgggatt ttttccgtta tcgaaatttt aagacgtata ccaccgcaga accaagacaa 1680 tttgtttctt tgacagcaac tcagagtggt gaagtgattt gtgctggtac tcttgatacc 1740 tttgaggtat ttgttctttg ttgctcgtag tattttgatt ttattgcttt tcagtttctg 1800 tttcctaatt tacctaaaat tatgtgtgcc agatttttgt ttgggatatg aggacaggca 1860 acgtgaagga cattcttagc ggtcatgaag gtcctgttca tggtttggct ttttctccta 1920 cagatgcaag tgtgagtcta ctcatatcat atatgatttt ctatactggt ttgttttgaa 1980 tgcctgagat ttcgattgct aagcctggtg attttagatg tctatgcttc aaaacttttg 2040 agttggtttc tgtttctctt ttgtcaagtg tgtttctcat tggaattcac tgctcttcgc 2100 cttctttaac aactgttctg tccttagagc tgctcacctg agcaattttt ttcttatatc 2160 cttccaacac taggcaattt tagttattgc atgatttgga atcaatcaaa ttgtcatcca 2220 ttagaaacgg ttcaattgca tccaactgct gagttaattg aagagaattt attttttttt 2280 tttgtctctt 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gagcttctca gcagcaacaa ccgagggggt tctagtttat tctattgatg 3180 attccttcat ctttgatcca actgatcttg acatggatgt cacgccagag gtacttcatg 3240 aaacctttat attactaaca aatgacattg cttatgatag aattacagtt gtgaaagatt 3300 gatggtcgtg gaatatttca cttttgcaaa tttatagtga aaacggagat gacattaagg 3360 caactaacta gttagctctc gtattggttt aaagggttgt tatgttgacc ctcagaacga 3420 agatgctcat tggtttatag ggttgttatg ttgaccctca gaacgaagat gatttttttt 3480 gttgtgtgga aaaatgttgc caaactgcca atggcatacc tctgttccag tggcatacct 3540 cttttatgtt actacaatgt tcagtaaagt cattttactt caatttggat atgggaactg 3600 aaaatttcac tcaagtgact tgctgagcca attttgaggg tctaaacagt aaccaccctt 3660 tgttttaatg ggaactattt cttggttata gtagaagttt taccatcggt tttcttttct 3720 ctgacatttg ctttctgttt atattattct acagggagtt gatgcagcac ttaatgaaga 3780 acaagtgacc aaagctttaa tccttagtct aagactaaat gaagactctt taattaagaa 3840 atgtattttt gctgtcaatt ccatagacat ccctgtcgtt gcctcatcaa tcccgaccag 3900 atatttggaa agattaattg aggtatttgc acatctttta gaaaaatgcc cacatttgga 3960 gttcgtactt cagtggtgtc aggtactttt tcttgacttc ttctgttcat tcgtagatgc 4020 tacagacctg ttgcactgtg attgaggtct cactagttgt atgtgattaa tttgtcttgc 4080 aggagatctg caaagctcat gggaactcca ttcaacaaag ttcccaaaaa ctgaagcctg 4140 ctttaatatc cttgcagaaa gcccttacga gaacacatca agatttggca agtacatgtg 4200 attccaacga atgtatgctc cgatatttat gttcaaaacg ccctatcgag aattcatgaa 4260 agaaaatgat tttgatgccg ctaaagcaat tgaggcgaat cttctgagta gcattgctgt 4320 ttgcatctta tttttagctg ccatgtgcta tatcaacaca ctttggcttg gaacccttgt 4380 gacaccagga agtatgggag gtatttttgg tgtcggttca tgtcatggga ggtattcatc 4440 cgtctgatta tcgaattaga ttttcttaaa atatgaattg acgcataggc atagcatcag 4500 gcatcgatct ccagttttgt tgtactaaaa gacacagaat tacatgttga catttcctgt 4560 tctccagatt gcttgtctat gtggagttgg gaatgatatc aaatagtgaa atgatttatc 4620 ttatttgctt ttgtctcatc tcgttccttt aatctgggaa caattcattt ccatgggaga 4680 ttatggtagc aaacaagcaa aggtctgtcg tggtgaatct aatatttgaa atttccatca 4740 ttctggtttc tgccgtccca actttattgt tgaatcttat ccctcttcaa cttagatagc 4800 cttatttaaa tatcaacacc ttagttgcag attctattct ctccccagga cgttattcat 4860 gccatagcag cagctattcc taaacctctt gttcctcaac aacacttgtt cttttgaggt 4920 cccaatagca gtggcaagtt ctcaatttgc tctgcatcta ctctactcac caaagacatt 4980 ccacctcatt ctcaagctaa atttctaaat tctatctggc atctgaaaat tcccccaaga 5040 atgccaagat gtatttgctt ggcaactcat tcgaggtcgt ctttccccca agatgtaatg 5100 ctcatgtgta ttgcaactgt cccttctgct accaacatat ttaaatacat tatcatccct 5160 tccttcaatg cacctctgcc tcacagattt ggtctctcac ctttccttct ctccagctta 5220 aaacattctc ttcttacttg tcctaatatt cggtttcttc tgccacttta tttactcact 5280 acactcaaat ataatccttc tctgtttcca ccccctcata aacctcatgc ctcgctgcgc 5340 tggtttaccc cgcacaacaa ttacctcaaa ctgaattttg atggttctgt caatcagcat 5400 tctgctgcct ctggcgttgt tttcagaaac tctgaaggtt ccccctattc ttgctaccac 5460 aaaaaaactg ggaatcactg atgttcttac tgcagaggct tgtgctcatg ctgcctggat 5520 ccatggtttc cataatattc tagttgaagg tgacaacaaa atacttatcg actgccttaa 5580 ttgtcaagct tctattccct ggcgcatttc taccatttgc tctgatatca aacatttagc 5640 tacttcggtc cgagtctcct cttttctgca tatacaccgc aaacagattt gttgccaacg 5700 ctag 5704 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cggggaaagt tgggttatga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aacaacaggc cttccacgat 20

Claims (8)

1. 서열번호 1의 딸기 FaPWP2 (Fragaria x ananassa Periodic tryptophan protein 2 homolog) 유전자의 염기서열 중 3,065번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 콜레토트리쿰 프럭티콜라(Colletotrichum fructicola)에 의해 유발된 탄저병에 대한 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
2. 삭제
3. 서열번호 1의 딸기 FaPWP2 (Fragaria x ananassa Periodic tryptophan protein 2 homolog) 유전자의 염기서열 중 3,065번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 증폭하기 위한, 콜레토트리쿰 프럭티콜라(Colletotrichum fructicola)에 의해 유발된 탄저병에 대한 저항성 딸기 품종 판별용 프라이머 세트.
4. 제3항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 것을 특징으로 하는 콜레토트리쿰 프럭티콜라에 의해 유발된 탄저병에 대한 저항성 딸기 품종 판별용 프라이머 세트.
5. 제3항 또는 제4항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 콜레토트리쿰 프럭티콜라(Colletotrichum fructicola)에 의해 유발된 탄저병에 대한 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 키트.
6. 딸기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제3항 또는 제4항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 콜레토트리쿰 프럭티콜라(Colletotrichum fructicola)에 의해 유발된 탄저병에 대한 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 방법.
7. 서열번호 1의 딸기 FaPWP2 (Fragaria x ananassa Periodic tryptophan protein 2 homolog) 유전자의 염기서열 중 3,065번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 콜레토트리쿰 프럭티콜라(Colletotrichum fructicola)에 의해 유발된 탄저병에 대한 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 프로브.
8. 서열번호 1의 딸기 FaPWP2 (Fragaria x ananassa Periodic tryptophan protein 2 homolog) 유전자의 염기서열 중 3,065번째 염기에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism)를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 콜레토트리쿰 프럭티콜라(Colletotrichum fructicola)에 의해 유발된 탄저병에 대한 저항성 딸기 품종을 판별하기 위한 마이크로어레이.

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