KR102335934B1 - 들깨에서 염색체별로 유전형 조성을 스캐닝하기 위한 단일염기다형성(snp) 마커 세트 및 이의 용도 - Google Patents

들깨에서 염색체별로 유전형 조성을 스캐닝하기 위한 단일염기다형성(snp) 마커 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 들깨의 염색체별 유전형 조성을 스캐닝 또는 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 SNP 마커 조성물 및 프라이머 세트는 들깨의 품종 육성 과정에서 얻어진 자손 개체에서 부모친 유전형 조성을 판별하여 육종가가 원하는 유전형을 가진 품종을 조기 선발하는데 활용 가능할 것으로 기대된다.

Description

들깨에서 염색체별로 유전형 조성을 스캐닝하기 위한 단일염기다형성(SNP) 마커 세트 및 이의 용도{SNP marker set for scanning genotypic composition in each chromosome of Perilla and uses thereof}
본 발명은 차세대 염기서열분석 기술, GBS 기술 및 생물정보분석 기술을 적용하여 들깨 육종과정 중 자손개체에서 염색체별로 유전형 조성을 스캐닝할 수 있는 SNP 마커 세트 또는 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
재배종 들깨(Perilla frutescens L. Britt)는 4배체(tetraploid) 식물로 20쌍의 염색체로 구성되어 있으며, 종자는 들기름으로, 잎은 쌈 채소로 이용되고 있다.최근에는 들깨의 유용 대사산물인 불포화지방산, 오메가3, 고지방 및 안토시아닌을 포함한 플라보노이드 등이 기능성 물질로 주목을 받으면서 신품종 육종의 대상이 되고 있으며 해마다 수요가 증가하고 있는 경제작물이다.
분자마커를 이용한 분자육종은 전통육종만으로 해결하기 어려운 양적형질(quantitative trait locus, QTL)의 분석과 야생종 등의 유전자원을 통한 유용 유전자의 탐색 및 이용 등에 대한 해법을 제시함으로써 효율적인 작물의 육종이 가능하게 한다. 또한, 최근 차세대 염기서열(next generation sequencing, NGS)을 분석하는 장비의 발달로 다양한 작물에서 표준유전체 서열이 완성되어 유전체 기반의 분자육종이 가능해지면서 유전체에 존재하는 다양한 구조적 변이가 분자마커로 개발되고 있다. 그 중에서 유전체 내에 가장 빈번하게 발생하고, 염색체 상에서 변이정보 확인이 쉬운 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커가 개발되어 작물육종에 적용되고 있다. 들깨의 분자마커는 대부분 단순서열반복(simple sequence repeat, SSR)을 활용한 경우가 대부분이었고, SNP 변이는 엽록체 전장유전체, 45S nrDNA 서열 또는 rDNA ITS 영역과 같은 반복서열에 국한되어서 보고되었다. 들깨에서 SNP 마커가 보고된 사례는 본 발명자들이 2배체 야생종 들깨를 이용한 종간 교배집단의 GBS 데이터를 이용하여 대량의 SNP를 확보하여 유전지도를 작성한 보고가 유일하다. 특히, 재배종 들깨에서 SNP 분자마커가 개발된 사례나 유전지도 작성에 관한 연구는 전무한 상황이다. 유전지도 작성은 유전연구의 기반연구로, 다양한 분자마커가 이용되었다. 최근에는 다양한 작물에서 SNP 마커를 대량으로 확보하여 고밀도 유전지도 작성에 관한 연구가 보고되고 있다. 고밀도 유전지도는 목적 형질과 연관된 QTL의 위치를 예측할 수 있어, 형질연관 마커 개발이 어려운 양적형질의 마커 개발에 중요한 역할을 한다. 특히, 작물의 육종과정 중에 형성되는 교배집단의 자손개체에서 염색체별로 유전형 조성을 스캐닝함으로써 이를 이용한 조기선발(marker-assisted selection, MAS) 및 여교배 육종(marker-assisted breeding, MAB) 등에 활용되어 경제적 가치가 매우 크다.
한편, 한국등록특허 제1993289호에는 '들깨 잎의 보라색 판별용 분자마커 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0781205호에는 '들깨 속 식물에서 분리된 SSR 프라이머 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '들깨에서 염색체별로 유전형 조성을 스캐닝하기 위한 단일염기다형성(SNP) 마커 세트 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 4배체 작물의 특성으로 인해 중복 서열이 많이 존재하는 들깨에 적용 가능한 효율적인 분자마커를 개발하기 위하여 일반적으로 사용하고 있는 차세대 염기서열분석장비에서 얻어진 서열을 정렬 비교하여 SNP를 탐지하는 방법을 거친 이후 추가적으로 2개의 F2 교배집단을 대상으로 유전지도를 작성하여 분자마커의 정밀도를 높였으며, 또한 재배종 들깨 11종 유전체 데이터를 통한 마커 다형성을 검정함으로써 적용범위를 확대하였다. 또한, 들깨 유전체 전체를 스캐닝할 수 있는 96개의 분자마커를 기존의 1마커-다수 시료의 방식이 아닌 다수 마커-다수 시료의 방식으로 들깨의 염색체별로 유전형 조성 스캐닝 또는 품종을 판별할 수 있도록, 상기 개발된 분자마커를 플루이다임(Fluidigm) 방식에 적용하여 양친의 유전형을 짧은 시간 안에 대규모로 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 96의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각각의 염기서열 중 151번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 마커를 이용하여 들깨의 염색체별 유전형 조성을 스캐닝 또는 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한, 들깨의 염색체별 유전형 조성 스캐닝 또는 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 들깨의 염색체별 유전형 조성을 스캐닝 또는 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 들깨 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물의 유전형을 결정하는 단계;를 포함하는, 들깨의 염색체별 유전형 조성 스캐닝 또는 품종 판별 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 들깨의 염색체별 유전형 조성 스캐닝 또는 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 96개의 분자마커를 이용하면 들깨 육종 과정에서 자손세대 염색체의 유전형 조성을 대규모로 빠르게 분석할 수 있으므로, 분석에 소요되는 비용과 시간을 최소화할 뿐 아니라, 염색체 전반에 고르게 분포하는 분자마커들의 유전형 결과를 종합하여 판단하므로 정확도 높은 개체 선발, 들깨의 품종 개발 및 보호에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 재배종 4배체 들깨의 20개 염색체를 스캐닝할 수 있는 본 발명의 96개 마커의 분포를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 96개 마커에 대한 플루이다임(Fluidigm) 분석을 통해 차조기107-1와 남천의 F2 교배집단(973109)에서 유전형을 확인한 일부의 결과이다. 차조기107-1 또는 남천의 유전형을 가진 개체일 경우 동형접합체(XX 또는 YY)로 두개의 형광 중 한개만이(FAM 또는 HEX) 확인되어 들깨 SNP scatter plot에서 초록색 또는 빨간색으로 나타난 반면 차조기107-1과 남천의 유전형을 모두 가지고 있는 개체는 이형접합체(XY)로 두 종류의 형광 시그널이 함께(FAM 및 HEX) 확인되어 들깨 SNP scatter plot에서 파란색으로 나타났다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 96의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각각의 염기서열 중 151번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 마커를 이용한 염색체 스캐닝을 통해 들깨의 염색체별 유전형 조성을 스캐닝 또는 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 SNP 마커를 이용한 염색체 스캐닝을 통해 들깨의 유전형을 결정하고 그에 따른 결과로 염색체별 유전형 조성 스캐닝 또는 품종을 조기에 판별할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8개 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 들깨는 4배체 재배종 들깨로, 푸른차조기, 차조기, 잎푸른차조기, 푸른주름차조기, 주름차조기, 들깨, 대실들깨, 잎들깨1호, 보라들깨, 차조기107-1 또는 푸른차조기115-2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "뉴클레오티드"는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 발명은 상기 서열번호 1 내지 96의 염기서열(표 13 내지 표 19의 PfSNP 1 내지 PfSNP 96 참고)에서 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중 가닥의 gDNA(게놈 DNA)에서 발견되는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서에 제시된 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, 게놈 DNA의 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.
본 발명의 SNP 마커를 들깨의 염색체별 유전형 조성 스캐닝 또는 품종 판별에 사용할 수 있는 것은 서열번호 1 내지 96으로 표시되는 염기서열 중 SNP 변이 위치인 151번째가 다르게 나타나는 것에 근거한 것이다. 예를 들어, 서열번호 1의 151번째 뉴클레오티드에 해당하는 SNP는 A 또는 G로 염기다형성을 나타내는데, 이 SNP에서 A를 갖는 들깨 품종은 들깨, 잎들깨1호, 보라들깨이고, G를 갖는 들깨 품종은 푸른차조기, 차조기, 푸른주름차조기, 주름차조기, 대실들깨, 차조기107-1, 푸른차조기115-2로 판단할 수 있다(표 24 내지 표 27 참고).
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 96의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각각의 염기서열 중 151번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한, 들깨의 염색체별 유전형 조성 스캐닝 또는 품종 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 프라이머 세트는 바람직하게는, 서열번호 97 내지 480으로 표시된 올리고뉴클레오티드에서, n이 동일한 값을 갖는 서열번호 4n, 서열번호 4n-1, 서열번호 4n-2 및 서열번호 4n-3의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트(n은 25 내지 120의 자연수)인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 프라이머 세트는 들깨 유전자좌에서 특이적으로 차별화되는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 염기 타입을 검출하는 프라이머 세트이다. 구체적으로, 본 발명의 프라이머 세트는 서열번호 97부터 연속되는 서열번호 4개의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트를 이루며, 4개의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 각각 ASP(SNPtype assay allele specific primer)1, ASP2, LSP(SNPtype assay locus specific primer) 및 STA(SNPtype assay specific target amplification primer)이다. STA와 LSP는 목표 염기서열 증폭을 위해 사용되는 프라이머 세트이며, LSP와 ASP는 SNP 위치 염기를 확인하기 위해 사용되는 프라이머 세트이고, ASP1 및 ASP2는 SNP 위치 염기에서 나타난 다형성에 대해 각각의 대립형질에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머로, ASP의 3' 말단 최종 염기가 SNP 위치 염기를 나타낸다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, n이 동일한 값을 갖는 서열번호 4n-3, 서열번호 4n-2, 서열번호 4n-1 및 서열번호 4n의 올리고뉴클레오티드는 순서대로 ASP1, ASP2, LSP 및 STA 프라이머이다.
또한, 본 발명의 프라이머는 상기 서열번호 97 내지 480;의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 들깨의 염색체별 유전형 조성을 스캐닝 또는 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 97 내지 480으로 표시된 올리고뉴클레오티드에서, n이 동일한 값을 갖는 서열번호 4n, 서열번호 4n-1, 서열번호 4n-2 및 서열번호 4n-3의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트(n은 25 내지 120의 자연수)인 것을 특징으로 하는 96개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함한다.
상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 dNTPs는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, DNA 폴리머라제는 내열성 DNA 중합효소로서 Taq DNA 폴리머라제, Tth DNA 폴리머라제 등 시판되는 폴리머라제를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명의 키트는 바람직하게는 플루이다임(Fluidigm) 기반 DNA 칩 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한,
들깨 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물의 유전형을 결정하는 단계;를 포함하는, 들깨의 염색체별 유전형 조성 스캐닝 또는 품종 판별 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 들깨 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.
상기 증폭 단계 산물의 유전형을 결정하는 방법은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, DNA 칩, 모세관 전기영동 등을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 디데옥시법에 의한 직접적인 핵산의 뉴클레오티드 서열의 결정을 통하여 이루어지거나, SNP(single nucleotide polymorphism) 부위의 서열을 포함하는 프로브 또는 그에 상보적인 프로브를 상기 DNA와 혼성화시키고 그로부터 얻어지는 혼성화 정도를 측정함으로써 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 방법 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 단계 산물의 유전형 결정 방법은 competitive 대립유전자 특이적(allele-specific) PCR을 이용하였으며 SNP의 bi-allelic scoring을 확인하였다. 실험에는 어세이 믹스와 마스터 믹스가 사용되는데 구체적으로는, 어세이 믹스에는 한 개의 역방향 프라이머와 표지되어 있지 않은 두 개의 대립유전자 특이적인 정방향 프라이머가 있는데, 이 프라이머에는 FRET 카세트(FAM, HEX)와 상보적인 서열을 가진 올리고 테일(oligo tail)이 붙어있다. FRET 카세트는 DNA 조각이고 2중 구조이다. 한쪽에는 형광 물질, 다른 한쪽에는 형광 물질을 비활성화 시키는 소광제(quencher)가 붙어있다. PCR 반응이 시작되면서 대립유전자 특이적인 프라이머가 주형(template)에 붙고 연장(elongation)이 진행된다. 이 때 새롭게 만들어진 가닥에 테일(tail) 서열이 붙어있는 상태가 된다. 다음 단계에서 대립유전자 특이적인 테일 서열에 상보적인 서열이 생성된다. 그리고 FRET 카세트가 붙게되고 소광제와 떨어지면서 형광 시그널이 나오게 되는데, 만일 유전형이 동형접합체(XX 또는 YY)라면 두 개의 형광중 한 개만이(FAM or HEX), 이형접합체(XY)라면 두 종류의 형광 시그널이 함께 확인된다(FAM and HEX). 이를 통해 들깨 시료에서 염색체별 유전형 조성을 스캐닝 또는 품종을 구별할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1 내지 96의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각각의 염기서열 중 151번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 들깨의 염색체별 유전형 조성 스캐닝 또는 품종 판별용 마이크로어레이를 제공한다.
바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 푸른 차조기115-2와 남천의 F2 교배집단(973116)을 이용한 유전지도 작성
1-1. GBS 분석을 위한 시료준비 및 게놈 DNA 추출
푸른 차조기115-2를 모본으로, 남천을 부본으로 하여 F1 세대를 얻었고 이들을 자가수정하여 얻은 F2 교배집단에서 96개체를 무작위로 선발하여 확보하였다. 확보한 96개체의 잎을 이용하여 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 방법으로 게놈 DNA를 추출한 후 품질 측정하여 GBS(Genotyping By Sequencing) 라이브러리를 작성하고, 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing)에 사용하였다.
1-2. GBS 라이브러리 작성 및 차세대 염기서열 생산
GBS 라이브러리는 Elshire et al., 2011. PLoS One 6(5)의 방법을 수정하여 사용하였으며, 제한 효소 MspI 및 PstI를 사용하여 제작하였다. 각 바코드 어댑터의 상단 및 하단 가닥과 공통 어댑터를 포함하는 oligonucleotide를 50 uM의 TE 버퍼(10 mM Tris, 0.1 mM EDTA)에 희석하고 열 순환기(thermocycler)에서 어닐링(annealing)을 진행하였다(95℃, 2 분; 0.1℃/초 씩 25℃로 ramp down; 25℃, 30분; 4℃ 유지). 이후, 10x 어댑터 버퍼(500 mM NaCl, 100 mM Tris-Cl)를 이용하여 바코드 및 일반 어댑터를 10 uM로 희석하고 1:1 비율로 함께 혼합한 다음 2.4 ㎕의 믹스를 96웰 PCR 플레이트에 추가하였다. 샘플 DNA(100 ng/㎕)를 개별 어댑터 가 함유된 웰에 첨가하였고, 샘플(DNA + 어댑터)은 1x NEB 버퍼 3 및 3.6 U MspI 및 PstI을 포함하는 20 ㎕ 부피로 75℃에서 반응시켰다. 샘플을 22℃에서 2시간 동안 배양하고 65℃에서 20분 동안 가열하여 T4 DNA 리가아제를 불활성화시켰다. 이후, 각각 다른 바코드 어댑터를 갖는 96개 DNA 샘플(각각 5 ㎕) 세트를 조합하였고, 키트(QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen, CA)를 사용하여 정제하였다. 풀링된 DNA 단편 2 ㎕, DNA 폴리머라아제(Agilent) 및 25 pmol의 프라이머를 이용하여, Life ECO Thermal Cycler(Bioer Technology Co.)를 통해 PCR을 수행하여 각 라이브러리의 제한 단편을 증폭하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머는 다음과 같다; (F) 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3(서열번호 481)' 및 (R) 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCT CGG CAT TCC TGC TGA ACC GCT CTT CCG ATC T-3(서열번호 482)'.
푸른 차조기115-2와 남천의 F2 교배집단(973116) 96 계통의 DNA를 이용하여 제작된 GBS 라이브러리를 Illumina HiSeq X Ten으로 차세대 염기서열분석을 실시하여 약 109 Gbp 길이의 각 96 계통의 게놈 서열 정보를 확보하였다(표 1).
Figure 112020115964327-pat00001
1-3. GBS 데이터의 역다중화, 전처리 및 맵핑(mapping)
차세대 염기서열 분석 후 바코드 서열를 이용하여 역다중화 (demultiplexing), 어댑터 서열 제거 및 서열 품질 정제(trimming)를 통한 전처리를 수행하였다. 어댑터 서열 제거는 cutadapt(v. 1.8.3) 프로그램을 사용하였고, 서열 품질 정제는 SolexaQA package(v. 1.13)의 DynamicTrim과 LengthSort 프로그램을 사용하였다. DynamicTrim은 phred score에 따라 짧은 리드(short read)의 양쪽 끝에 존재하는 품질이 나쁜 염기를 잘라내고 양질의 리드로 정제하며, LengthSort는 DynamicTrim에서 너무 많은 염기가 잘린 리드를 제거한다. DynamicTrim의 phred score가 20이상이고, LengthSort 결과 짧은 리드 길이가 25bp 이상인 기준을 만족하는 염기서열만 사용하였다.
그 결과, 973116 F2 집단의 역다중화된 리드(demutiplexed reads) 715,551,854개 중, 서열 품질을 만족한 정제된 리드(trimmed reads)로 660,395,486개(92.22%)를 확보하였다(표 2).
전처리 과정을 통과한 정제된 리드를 BWA(Burrows-Wheeler Aligner, v. 0.6.1) 프로그램을 사용하여 자체 확보한 4배체 들깨유전체 초안을 표준유전체로하여 맵핑(mapping)을 수행하였다. 맵핑 조건은 seed length(-l)=30, maximum differences in the seed(-k)=1, number of threads(-t)=16, mismatch penalty(-M) =6, gap open penalty(-O)=15, gap extension penalty(-E)=8을 사용하였고 나머지 옵션은 기본값(default)을 사용하였다.
맵핑 결과, 973116 F2 집단에서는 정제된 짧은 리드(trimmed short reads) 660,395,486개 중에서 622,599,718개의 리드(94.25%)가 맵핑(mapping)되었으며, 맵핑 부위를 확인한 결과, 리드 깊이(read depth)가 평균 103.09X인 것을 확인하여 분석하기에 적합함을 확인하였다 (표 2 내지 표 4).
Figure 112020115964327-pat00002
Figure 112020115964327-pat00003
Figure 112020115964327-pat00004
1-4. 대량 변이 정보(genome-wide SNP) 탐색 및 SNP 매트릭스 작성
전처리를 수행한 짧은 리드(short reads)를 표준유전체에 맵핑(mapping) 후 생성된 BAM 형식의 파일을 SAMtools(v. 0.1.16) 프로그램을 사용하여 raw SNP (In/Del)를 검출하고, 공통 염기서열(consensus sequence)을 추출하였다. 이 때, SNP를 탐지하는 조건은 minimum mapping quality for SNPs(-Q)=30, minimum mapping quality for gaps (-q)=15, minimum read depth(-d)=3, maximum read depth(-D)=202, min indel score for nearby SNP filtering(-G)=30, SNP within INT bp around a gap to be filtered(-w)=15, window size for filtering을 만족하도록 하였다. 분석대상 간의 SNP 비교분석을 수행하기 위해 샘플간 통합 SNP 매트릭스를 작성하였다. 각 샘플을 표준유전체와 비교하여 얻은 raw SNP position을 후보로 하여 합집합의 리스트를 구축하고, 이 때 빈 영역(non-SNP loci)은 샘플의 공통 염기서열로부터 채워 넣는 filling 과정을 거쳐 매트릭스를 작성하였다. 이후 샘플 간의 SNP 비교를 통해 mis-calling된 SNP(In/Del) 좌를 필터하여 최종 SNP 매트릭스를 작성하였다. 해당 좌에 해당하는 리드의 구성에 기반하여 3가지 SNP 유형으로 구분하였다. 동형접합성(Homozygous) SNP는 read depth≥90%, 이형접합성(Heterozygous) SNP는 40%≤read depth≤60%, 기타 SNP는 동형접합성/이형접합성 유형으로 구분되지 않는 나머지 경우로 구분하였다. SNP 매트릭스내 SNP 필터 조건은 SNP좌가 이대립인자성(biallelic)이며, 최소 리드 깊이(read depth)가 3개 이상을 만족하고, minor allele frequency가 5% 이상을 만족하고, SNP좌에서 missing data가 30% 이내를 만족하는 SNP을 선발하였다.
F2 교배집단의 양친 간 존재하는 SNP를 확보하기 위해, 973116 집단은 표준유전체와 푸른차조기115-2 간의 SNP 및 표준유전체와 남천 간의 SNP를 각각 발굴하여 부본과 모본 간 다형성인 SNP를 확인한 결과, 푸른차조기115-2와 남천 간의 다형성인 SNP는 3,659,790개인 것으로 확인하였다(표 5).
973116 집단을 통해 44,219 SNP좌를 확보하였고, 이 후 결손율(missing)과 MAF(minor allele frequency) 필터링(filtering)을 실시하였다. 이를 교배양친의 다형성 SNP와의 병합을 통해 최종 마커로 3,147개의 SNP를 선발한 뒤, 유전지도 작성용 프로그램을 이용하여 연관군 지도를 작성하였다.
Figure 112020115964327-pat00005
1-5. 지노타입핑 매트릭스 및 유전지도 작성
푸른차조기115-2와 남천 간의 교배집단 SNP 매트릭스를 연관지도 작성용 프로그램이 인지할 수 있도록 4가지 문자 즉, [모친형 SNP→a, 부친형 SNP→b, 모름 →n, 부모혼재형 SNP→h]로 전환하여 지노타이핑 매트릭스(genotyping matrix)를 작성하였다. 이때, SNP 위치에서 들깨 유전체 초안 서열이 "N"인 경우와 부모의 유전형 이외의 SNP가 채워진 경우는 제외하였다. 교배집단의 96개에서 최종 선발된 3,147좌로 joinmap4 프로그램을 사용하여 유전지도를 작성하였다.
푸른차조기115-2와 남천 간의 F2 교배집단(973116)의 유전지도를 작성한 결과 총 2,454개 SNP로 구성된 21개 연관군이 형성된 것을 확인하였으며, 총 유전거리는 2,169,316 cM, 마커 간의 유전거리는 평균 1.00 cM로 분석되었다 (표 6).
Figure 112020115964327-pat00006
실시예 2. 차조기와 남천의 F2 교배집단(973109)을 이용한 유전지도 작성
2-1. GBS 분석을 위한 시료 준비 및 게놈 DNA 추출
2번째 교배집단은 차조기107-1를 모본으로, 남천을 부본으로 하여 F1 세대를 얻었고, 이들을 자가수정하여 구축한 F2 교배집단(973109)에서 96개체를 무작위로 선발하여 확보하였다. 확보한 96개체의 잎을 이용하여 CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) 방법으로 게놈 DNA를 추출한 후 품질 측정하여 GBS 라이브러리를 작성하고, 차세대 염기서열분석(Next Generation Sequencing, NGS)에 사용하였다.
2-2. GBS 라이브러리 작성 및 차세대염기서열 생산
GBS 라이브러리 작성 및 염기서열 생산은 상기 기술한 방법을 동일하게 적용하였다. Illumina HiSeq X Ten으로 차세대 염기서열분석을 실시하여, 약 105 Gbp의 염기서열을 확보하였다(표 7).
Figure 112020115964327-pat00007
2-3. GBS 데이터의 역다중화, 전처리 및 표준유전체로 맵핑 (mapping)
생산된 염기서열의 역다중화, 전처리 및 맵핑은 상기 기술된 방법과 동일하게 진행하였다. 973109 F2 집단에서는 역다중화된 리드(demutiplexed reads)로 684,566,618개, 서열 품질을 만족한 정제된 리드(trimmed reads)로 629,718,268개를 확보하였다. 이는 684,566,618개 역다중화된 리드(demutiplexed reads)의 91.93%에 해당하는 개수인 것으로 확인하였다(표 8 내지 표 10).
들깨 유전체 초안에 맵핑 결과, 973109 F2 집단에서는 정제된 짧은 리드(trimmed short reads) 629,718,268개 중에서 587,492,927개의 리드(94.25%)가 맵핑(mapping) 되었으며, 맵핑 부위를 확인한 결과, 리드 깊이(read depth)가 평균 108.86X인 것을 확인하였다(표 8 내지 표 10).
Figure 112020115964327-pat00008
Figure 112020115964327-pat00009
Figure 112020115964327-pat00010
2-4. 대량 변이 정보(genome-wide SNP) 탐색 및 SNP 매트릭스 작성
대량 변이정보 탐색 및 SNP 매트릭스 작성을 위한 SNP 선발기준은 상기 기술한 내용과 동일하게 진행하였다. F2 교배집단의 양친 간 존재하는 SNP를 확보하기 위해, 973109 집단은 표준유전체와 차조기107-1 간의 SNP 및 표준유전체와 남천 간의 SNP를 각각 발굴하여 부본과 모본 간 다형성인 SNP를 확인하였다. 그 후, 차조기107-1와 남천 간의 다형성인 SNP는 3,531,724개를 확인하였다(표 11).
973109 집단을 통해 39,516개 SNP좌를 확보했고, 이후 결손율(missing)과 MAF(minor allele frequency) 필터링(filtering)을 실시하였다. 이를 교배양친의 다형성 SNP와 병합하여 최종 마커를 2,783개 SNP를 각각 선발한 뒤, 유전지도 작성용 프로그램을 이용하여 연관군 지도를 작성하였다(표 11).
Figure 112020115964327-pat00011
2-5. 유전형 분석(genotyping) 매트릭스 및 유전지도 작성
유전형 분석 매트릭스 및 유전지도 작성 방법은 위에 기술된 내용과 동일하게 진행하였다. 차조기107-1와 남천 간의 F2 교배집단(973109) 의 유전지도를 작성한 결과 총 2,326개 SNP로 16개의 연관군을 형성하였으며, 총 유전거리는 2,133.946 cM, 마커 간의 유전거리는 평균 0.92 cM으로 분석되었다(표 12).
Figure 112020115964327-pat00012
실시예 3. 게놈 선발용 마커 후보 선발
들깨 여교배 육종에 활용가능한 마커후보를 선발하기 위하여, 973116 집단의 유전지도의 연관군을 구성하는 2,454개 SNP마커와 973109 집단의 유전지도 연관군을 구성하는 2,326개 SNP마커들을 비교하여, 두 집단에서 유전지도 작성에 공통으로 사용된 SNP 1,612좌를 확인하였다. 염색체 내의 SNP 위치 정보를 통해 염색체별 및 염색체 내 위치를 고려하여 여교배 육종을 위한 들깨 염색체 전체 스크리닝이 가능한 96개의 SNP를 최종 선발하였다(도 1, 표 13 내지 표 19).
Figure 112020115964327-pat00013
Figure 112020115964327-pat00014
Figure 112020115964327-pat00015
Figure 112020115964327-pat00016
Figure 112020115964327-pat00017
Figure 112020115964327-pat00018
Figure 112020115964327-pat00019
실시예 4. 재배종 들깨 11종 유전체 데이터를 통한 마커 적용 가능성 검정
4-1. 재배종 들깨의 선발 및 차세대 염기서열 분석
재배종 들깨의 교배집단의 양친으로 사용될 수 있는 11개의 품종(푸른차조기, 차조기, 잎푸른차조기, 푸른주름차조기, 주름차조기, 들깨, 대실들깨, 잎들깨 1호, 보라들깨, 차조기107-1, 푸른차조기115-2)에 상기 선발된 SNP 마커 적용 가능성을 검정하였다. 게노믹 DNA 순수 분리정제, GBS 라이브러리 제작 및 차세대 염기서열분석은 상기 기술된 내용과 동일하게 진행하였다.
재배종 들깨 11개의 품종에서 차세대 염기서열로 생산된 데이터로 총 리드수 1,573,471,714개를 확보하였고, 길이로는 약 206,888,201,750bp의 유전체 염기서열을 확보하여, 이는 들깨 유전체 길이를 1.2Gbp로 예상했을 때, 11개의 품종에서 평균적으로 약 15X genome coverage에 해당하는 것을 확인하였다 (표 20).
Figure 112020115964327-pat00020
4-2. 전처리 및 표준유전체로 맵핑(mapping)
상기 기술한 바와 같이 전처리 과정으로 바코드와 어댑터 서열을 제거하고, PCR duplicated 리드를 필터링한 후, 염기서열 품질 값에 따른 품질을 체크하여 낮은 품질의 리드를 제거하였다. 이를 통해 재배종 들깨 11개의 품종에서 정제된 리드(trimmed reads)는 총 1,426,390,270개로 길이로는 약 162,245,596,210bp를 확보하였다. 들깨 유전체 길이를 1.2Gbp로 예상했을 때, 평균적으로 약 7.8X genome coverage에 해당한다(표 21).
Figure 112020115964327-pat00021
확보된 1,426,390,270 정제된 리드를 들깨 유전체 초안을 표준유전체로하여 맵핑한 결과, 평균적으로 정제된 리드의 85.6%에 해당하는 112,767,204개가 맵핑 되었고, 들깨의 예상 유전체 크기를 기준으로 할 때 약 95,4% 영역 (1,099,706,709bp)이 맵핑된 것을 확인하였다(표 22).
Figure 112020115964327-pat00022
4-3. 대량(genome-wide) SNP 탐색 및 필터링
상기 기술한 바와 같이 들깨 유전체 초안 서열에 들깨 11개 품종의 전처리된 짧은 리드를 맵핑한 결과를 공개된 프로그램인 SAMtools(v 0.1.16)를 이용하여 유전체 전반적으로 발생한 대량의 단일염기다형성(SNP)을 탐색하였다. SAMtools 프로그램 적용 옵션은 정확도 높은 SNP를 선발하기 위해 정렬 품질(alignment quality)값을 기본값인 25보다 높은 30으로 적용하고, 적어도 3개 이상의 로우 리드(raw reads; 염기서열을 구성하는 짧은 단편서열)가 정렬된 위치에서 추출된 단일염기다형성(SNP)만을 선발하였다.
들깨 유전체 초안 서열과 비교하여 재배종 들깨 11개 품종의 각각의 단일염기다형성(SNP) 발생 정보를 통합하였다. 이를 매트릭스(matrix) 형태로 작성하였고 5,948,141좌로 구성되었다(표 23).
Figure 112020115964327-pat00023
4-4. 재배종 들깨 11 품종에서 선발마커 다형성 검사
위에서 언급된 여교배 육종을 위해서는 선발한 96개 SNP 마커들을 재배종 들깨 11개 품종에서 확보한 단일염기다형성(SNP) 정보를 활용하여 선발된 96개 마커의 다형성을 확인하였다(표 24 내지 표 27). 재배종 들깨 11개 품종에서 결손되어 유전형을 알 수 없는 경우 n으로 표기하였고, 3개의 유전형으로 확인되어 하나의 유전형으로 표기할 수 없는 경우를 N으로 표기하였으며, 한 개체에 두 가지 유전형이 모두 확인 된 경우를 R, M, Y, S 및 K로 표기하였다.
Figure 112020115964327-pat00024
Figure 112020115964327-pat00025
Figure 112020115964327-pat00026
Figure 112020115964327-pat00027
실시예 5. 플루이다임(Fluidigm)을 통한 실험적 SNP 검증
상기 선발된 들깨 게놈 전체 유전형 진단용 선발된 SNP 마커의 정확성을 검증하기 위하여 플루이다임(Fluidigm) 시스템을 이용하여 SNP 유전형 분석을 F2 교배집단(973116 및 973109)을 사용하여 실시하였다. SNP 검증에 이용된 프라이머 서열은 표 28 내지 표 31에 나타내었다.
SNP 종류에 따라 대립 유전자 특이적 프라이머를 각각 디자인하였고, 상기 대립 유전자 특이적 프라이머와 좌 특이적 프라이머를 사용한 PCR 분석은 플루이다임을 이용하여 제조사의 방법에 따라 실시하였다. SNP 유전형이 동형접합체(XX 또는 YY)라면 두 개의 형광 중 한 개만이(FAM 또는 HEX), 이형접합체(XY)라면 두 종류의 형광 시그널이 함께(FAM 및 HEX) 검출되어 실험적으로 SNP 마커를 확인하였다
Figure 112020115964327-pat00028
Figure 112020115964327-pat00029
Figure 112020115964327-pat00030
Figure 112020115964327-pat00031
SNP 검증 결과는 도 2와 같다. 96개의 마커를 이용하여 푸른차조기와 남천의 F2 교배집단(973116)의 96개 개체와 차조기와 남천의 F2 교배집단(973109)의 96개 개체에 대하여 플루이다임(Fluidigm)사의 BioMark HD System을 이용하여 SNP 유전형 분석을 수행하였다. 96개의 마커를 이용하여 2개 F2 교배집단에서 192 샘플, 총 18,432의 SNP 유전형 분석을 수행한 결과, 푸른차조기와 남천을 교배한 973116 집단에서 5개 마커, 차조기와 남천을 교배한 973109 집단에서 3개 마커의 유전형 분석 결과를 얻지 못하여, 이를 제외한 17,664개의 SNP 유전형을 확인하였다. 이는 약 95%의 검증빈도를 보였다. 재배종 들깨의 SNP 유전형 분석 결과, 모친 또는 부친의 유전형을 가진 개체일 경우 동형접합체(XX 또는 YY)로 두 개의 형광중 한 개만이(FAM 또는 HEX) 확인되어 초록색 또는 빨간색 점으로 나타났고, 모친과 부친의 유전형을 모두 가지고 있는 개체는 이형접합체(XY)로 두 종류의 형광 시그널이 함께(FAM 및 HEX) 확인되어 파란색 점으로 나타났다(도 2). 이상의 결과는 들깨 육종현장에서 들깨의 염색체별 유전형 조성을 스캐닝할 수 있는 마커로 활용가능함을 검증하였다.
<110> SEEDERS <120> SNP marker set for scanning genotypic composition in each chromosome of Perilla and uses thereof <130> PN20308 <160> 482 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 1 caattctgga accgaagcta acgaagcagc aattaagttt tcaagaaagt tccaaatata 60 ttcacgtcca gataaaaagg accctcctgt ggagtttatt gccttctcaa actgctttca 120 tggtagaaca atgggcgctc ttgcgttaac aagcaaagaa cactacagaa caccattcga 180 gcctgttatg cccggtgtca ctttcgtgga atacggtaat actcaagcag cagtggagtt 240 gattcagagt ggaaagatcg ctgcagtgtt tgtggaacca attcaaggcg agggtggtgt 300 a 301 <210> 2 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 2 accctttctg cagcagactc agatgtttgc aagcgctcat ttctgcttct tttattaggc 60 cataatcatt ttcatctgat ttttaagttt ttgaaactgt cctggtattc ttggttgaac 120 cttttggata aatgacaatc actcagtttt caattctaaa gtatggaatg tattttggct 180 ttattgtttg ttacctgtaa catagattga tgctgaagtg cagggtgaag ctatctcttt 240 actcacttta tttttcccgg tacagagttg cgtaatgatc acaaggtgat aacagagaag 300 a 301 <210> 3 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 3 caattctgga accgaagcta acgaagcagc aattaagttt tcaagaaagt tccaaatata 60 ttcacgtcca gataaaaagg accctcctgt ggagtttatt gccttctcaa actgctttca 120 tggtagaaca atgggcgctc ttgcgttaac aagcaaagaa cactacagaa caccattcga 180 gcctgttatg cccggtgtca ctttcgtgga atacggtaat actcaagcag cagtggagtt 240 gattcagagt ggaaagatcg ctgcagtgtt tgtggaacca attcaaggcg agggtggtgt 300 a 301 <210> 4 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 4 atatgaactg cgattaatac ttatgttgta tcctggcaat tctaacaaaa ttggattgcg 60 gattggaaga cactatcacc tgtaataaag atgtgaacag aataatagta tggggtttgt 120 agtgcttgtg tgtagttcgc ctccattcac attctgaaaa aagttcagcc ataaacattt 180 agctgcagtt ggctgtcatg gggggtatat tactatttat ttggacattt ttttttctga 240 aaaatgtgct gctctgcttc ttcactgtta tttgcacctc atctcatatt tcttccttcc 300 a 301 <210> 5 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 5 tactaaatat aaacctacct ccagagccag gaataactcc aaggttgagc tccggcaggc 60 caagttgtgt ctttgtagca gcgatgcgtg catgacatgc 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attctatgca aattaatcac gtttcatatt ctatttcagt ttcgacatgt gggtcatatt 300 c 301 <210> 8 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 8 gtctttagct aaatcaatgg caatgagtcc ggcgctgcac cccattccgc ccaaattgaa 60 gcttttaata tttccacgca gcttatatct gttaacaatc atggcggaga gagacggagt 120 cgggttgaag aggctgcagt tcaccaccag tactccaatg tccttggccg aaactcccgt 180 cgcgccgaac agattatcca acgcgccgaa catcacctgc tccgcctcct cacgcgccgc 240 cgccatcgac ggctgcggcg ggacctggtg catcgcctcc ggcaggtacg tctcctcgcc 300 c 301 <210> 9 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 9 caaactccca cacgccactc accgcctccc acctgaaccc cctccacgtg tccttacacc 60 gttggcttct caatatgtag acgaactgcg ccaccgcgat tatccaccaa gacatgctca 120 gcaccagcgc cgcacctagc aaccccatcc cgatctcgta cactgccatc cagctcacca 180 ccagatgcac cgccagtgtc gccaccgata tcatcgcact cggcgccacg atgctctgcg 240 cctgcagata cttctgcatc ggaaaattca ccgcgtacgc aaacacctgc gggatgagcc 300 c 301 <210> 10 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 10 tcattctaca aaaaaagaaa 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gtgttgatct acttgttaaa 180 taagcaacaa ggaagtcacg caaaaaagac ataaggaaat ttgatggcgt agagcaataa 240 ctgcagcatg ctgccaggta gtcataaaaa gtaaaaccca ttctgaaggt tcatatgaag 300 g 301 <210> 13 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 13 gcgcaagttc ttgaaaacac gaacaggtct cccagtcggt attctcataa tcccataagc 60 aacagctagt ttttcactat gatacttaag catatgctgc ttttcttctt cctccacatc 120 gtgcagcacc aatttcgtgg ccgaaacata tccggcttct ttcatcctca aatccaactc 180 ttccaagaaa gcataaatgt tgtcactatc aggatgggtg aagtctccaa cagaaaacgt 240 gtgaatcttg tttagcactt caacccagct ataacccgtt gttttgctaa tgcccgtatc 300 c 301 <210> 14 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 14 tgtgggggaa atcctcattt ggcagatcat atttcttctt gttcactatt taaacctacg 60 tgtctaatct tttgctgaat gctggttaat gaggatatga tgtgtctttc acaatcttca 120 aagggctgtt actgcatttg tattccaact tataagtcat cttgttcttt aaaaaacact 180 ttacataaat ctggagcatt ataatttatt gttttgattc ctgagatgta ccagtggtta 240 gcatatctgc aggaacagaa ttcaaactta gttttttttt tgcctgtgtc tttaatgtat 300 c 301 <210> 15 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 15 ctcgttcatt ttcttcatgt ctacccagta gtactctctc atatggaacg aaagtgcact 60 gagccggtta ttgatggcca caacgaggtt cttggttgaa tcgttgacgg tgagcatctc 120 acgagagcag cgcaaagcag aatagaacaa tgcctacaag tccaaacaaa gccgattaat 180 caccttctga actcatgtgg gatataaaaa ttactacttg atgcaattac ataagaaaac 240 tggctagtta ttgatttttc gaacaagatt aacgacgaac ttagagaatg agcgtctcct 300 a 301 <210> 16 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 16 gcaataataa ctcagagatc attactcaaa gtacattttt tttagtaagt actgtcgtac 60 tcttaatatt tacccttctt tcccttcaga gacaagacgc actctgccta aactaactga 120 ggacaaatca aagaacatgc ttcagtggct cgtccggtta ttcaaactcc ttaggtcaag 180 gttattaacc aagatatggc agcaagagta caacttcatt ctcttcctca tcatctgagt 240 aaattattac tatttctcga gcaagacaaa attaatgatg agctggtata gttattggtt 300 c 301 <210> 17 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 17 agtatatgtc acgacatcag ggctgcatcc cttcaacaac atttcctcaa taatatcttt 60 agcactatcc attcttccct cctgacaaaa gcaattcact actgcagtgt gccctacttt 120 gtcaatatgg aatcctctct cttctgcttc gcgtagaaac tctaatgcct cgtctccatg 180 accaaacttg cacagcatat gaataagagt attataagtg acttgatccg gctgcaattt 240 actttcttcc agcatcttca ccataagccc cctcagctca tcaatccttt tctccttgca 300 c 301 <210> 18 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 18 catacctata atagctgcag gttttctcat tgaatttttt catttgagaa acagttttct 60 atcttgccat ctgcttattt tgctacacta gctaaagtag tggaagtgtc tctctttaaa 120 actcctagga cccagataaa caaacataga tgttggtgtg ccaaaaattg ttgtttgttg 180 catgctgcat gctgcatgca gttacttagt agtttagaat ctcttttctt ccatcctcct 240 taacttttag ttttcttttg cgtgtatttc tttgctaccc ggtttgttca gtagcttttc 300 t 301 <210> 19 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 19 gtattataca caacaacatt cacctttaca ccgtgattct tcattatctg cagcagctta 60 aacccatcac caattctatt cgtcacgcaa aaacctttca tcagaatccc ataagtgtag 120 tcatcacctt tcaaaccagt tcccataatt ttcttcctat aaaactccct agctatatca 180 atgtcttcct tcaccagaac atcaagaatt gtattcaata atttcaaaga aggcgtagcc 240 ccgaactcgg tcaccatatc aagcactctg atcacttccc ggatcattct agcccgccca 300 a 301 <210> 20 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 20 ctatggtctg acaatagcag tgccattgct tgctgctaat tcagtatttc ttgctcgcac 60 caagtatatt gagattgatg ttcactatgt ccgggagaaa gtgttagatc aaactttaat 120 cgtaggtcat gttcctctga agatcaaatg gccgatatct ttacaaacct ctctccgaat 180 gccgcttcca acttcgtgat cgccacaagt tcaagacctc ctctagtttc cacgaaggtg 240 tatattagag taaattataa taactgccat gcacctgcag cagccatgta tctgcagcag 300 a 301 <210> 21 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 21 actggggcaa gattgttgca tgtgatcaat ccagtcggaa agttaaggca ggatagcaaa 60 gttctacaat tgcatcatat gcaggtaagt gaaattatgt gatgctgata tccgggtttt 120 acgacaatca tgctctctca atctatgaat tgaagtgcgg aaacaagtct ccagtctctg 180 gtaagaaact atagcggaca aaatgttcat gatatagcaa tgtaagctgc agctcactac 240 actttactac aatgccaagt tagaatacaa tggatagaga tatgaaagat aaccaaccag 300 c 301 <210> 22 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 22 actttttgat gatgccggtg ctggtgcacc tttaccaggt gcagcacttt ttgaggatga 60 agcattctca tctttcacag gttttaattc ctgtatccca atgaaagatt tcactcaata 120 aacctactag gcaactacag actgacctac agagagctga agacccgaat aaagtatata 180 aatgatgtta cgccaaacca atctcacatt ttctgttttc actttcttca aaggtgcact 240 gtttggtgtt tttgattcct ccccactgct ttttcttttc ccctttgatg acttcgaatt 300 a 301 <210> 23 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 23 tgcatacggt cggagcccca tccctgacta tggtttcgct ggttcaagtg atcagcagcg 60 attgatggag tctccacctc cctatccatt acatcaaaat gtccatggaa gagagctgca 120 gcagcagcct aatcattggt atcctcctcc gtccactcct cttcgtcatt atcatgaaac 180 tgtgtaccct cctcctcccc ctcctctgca tcaacggaat atagctgctg cttctggtgg 240 gaggagcaca cctgtagcag atagatacgc tcctcggttg gatgaggcgc atcattctat 300 g 301 <210> 24 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 24 cttcaattct aattcaagat tccaccgata tacatcgatg gaaggcgaaa tcaagaatct 60 cagccgcgtt tttgcggcgg tgatcggcgc tctctgttac tgccgtttag tttctgcgag 120 gctgcccaaa ggcaaatggc ggctgatttc aatatcgccg gcgctatacg cattcgccat 180 tcttccactg tatataagct ccgccttcat cacggcggtg acggtattct tcatcacgtg 240 gctcgcctct ttcaagctgc tcctcttcgc cttcgatcac ggccctctcg cgtcggagcc 300 c 301 <210> 25 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 25 aactcaaact caaactcgaa gccaccgatt tgtcaataca accacacaat ccctgcagta 60 atcttctcct ctggcatgac aggaaactta ttccacgaat tcaacgacat tataatccca 120 ctcttcatca ccacaaggca tttccagtcc cgggtcatct tcatcatcga cgactacaac 180 cctcggttcg tcgccaagtt cagcaggatc ctctcccagc tatccagtca cgagatcgtc 240 aatccatcag cgaacgcgag cgtccactgc ctcccgggga tggttctggg gctcaagttc 300 c 301 <210> 26 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 26 cctctttgtg aagcaaggca ccactctaaa cagaaagata ggcagcttca tgatccctcc 60 ggcaagccta gccggatttg tgacgctctc catgctcata tccgtcgtgc tatacgaccg 120 tttcttcatg aaagcggtgc agaaatggac caagaatcca agaggtatta cccttctgca 180 gagaatggga attggcatga tcttccacat catcatcatg gttgttgcat cactaactga 240 gaggcatagg cttcaaacag ctagggcaaa tgacctagtt gagaatggga atcaagtccc 300 t 301 <210> 27 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 27 aaaaatagta ggaaggaaag gaactcgcct caagtgtgct aaatactagt ctcattcggc 60 tggctacaag cgatggttct tcagcccggc ccgtgactgc catttgctcc aactgcagag 120 tctttactgg gagccttgat ttgagtcgac gagagtagga gttagtttgt aaagtgcaat 180 atgaaacagc aagattcata aacagagagc gggatgtcac caggccattc ctctcatgta 240 gtaggcattt gctatgattg cacagaagcc cttccattgg atcaccattt cacccgacac 300 c 301 <210> 28 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 28 ccgcagttat agcatctcca ggcctggtgg agttaccttt tgtttgatgg ttctgacccg 60 tgtgcatggc tgacacgagc acagcagttt cttacaattt acaaacaccg cattacaatt 120 tacagaatac cgcttgcagc ccggtagata gtctttcatc atcatgacag gtgatgctct 180 ctattggctc cagtgggtgc taagtcattc gccacacctt tcatggctcc aattcacaaa 240 aagaatttct gatctgtttc gacaacaatt ccacagccaa ttactatgaa aagcctgggg 300 c 301 <210> 29 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 29 agatttatct gatttgcttc gagaaaagga ttacttggag gggaaatgga acttagtgga 60 tccttgggat atctagggac atttatctca ttgttactta accttgagaa ctctggaata 120 gaaggtggac ttagactgtt cccaagagaa aacacagtta taggcgacaa aggtgacaac 180 tccaagctta tttcaacagg attcaggaaa tgttgatcaa ccggcaacga tgaagcatca 240 ggaacatcat tttcaagacc actctcgttg aatagttctt gttctctatc cagaccacat 300 t 301 <210> 30 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 30 aacagcaaga gcgtcatttc catccacacg aatgctacgg atcccatatg cctgcccctt 60 aacaacaaca ccatcacctg cagccatgaa ttgaatcaaa ttaacggaaa tgtgtgtttt 120 tgtttgtttt atgagtaatg aaatgtgtga gtgtctactt cgaaactgtt gtgatattgg 180 ggtgcttata gcccatccat tgttgcggca tatgaacata accggagctt ccattactgc 240 tgcaaaattc aatgcagcat gaaaatctcc ctaccaaaaa caaacatttc atttcaacat 300 g 301 <210> 31 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 31 gtatttgcat cttattttgc caatcaaatt tacacttggt caatcacttt gcggactggg 60 ttaaccctat tgtttctgac ctgcagcatc cattttgagg gctgacatga aatacagtaa 120 aaaacagttt acggtggatg agagcaggcg cgatacatat agtcaatttc atccccagtc 180 ttctgctaac aattcatctg ttcttgctaa ctccatggga gatatgaagc gactggtgct 240 ggtatgtttg ttgcataact ttctgtttaa aattgtttct gtgggggcat agttaaaact 300 c 301 <210> 32 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 32 aaatctccat cgccgcctcc ggcagtctcc tccgccgcct ctccgacacc gcagccctcc 60 atggactcgt agagcttgca gaactcatca aagtcaatga ggccatctcc attggagtcc 120 accttctgca ccatttcatc aacgtctctc gctcccgctg cgataccaat cttctggagc 180 gactctctca gctcatgcct cgttatgtag ccgtcgttgt tcttgtcgaa agtggcgaac 240 acgcctctca gcctcagact accaccgccg ccgctgcagc tggtggtgga ggtggttttg 300 a 301 <210> 33 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 33 ataatgatat ccagggaaac caaaggttat gctgagttag tctcactcac tctatatata 60 cacatatata cacacacata tatatatgat aggaccggta cacttaacac tcaaatatca 120 ctataggcat atgctctttt agtaactccc tttataacac agaattaaat gtttgaaact 180 caagatatgt tagataaagc tgatgatgga tcttaatata taacactatg caacatatag 240 aagagctagc tagtgactca taaccagtaa accgcagatc atgaagaatt tttaatcagt 300 c 301 <210> 34 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 34 aattactctt tatcaacatt tgaagcatca atcaagtaaa gaaaatatca cgcaataaat 60 aaattatgca acactttgtt gaagaatctt gagatatttt catttcattt ctgcaggatg 120 caaatgcacc ccttgttaca atgttatgta caaaaaatga atcaaatata tgtttgtgta 180 taattataac tatcaactat gaatatcatg accaagagaa agaagtataa gttgaacaac 240 aaaaaaagaa gcaatattgt aaacttaagt taggctcctc ctcctctggc tctgaggctg 300 a 301 <210> 35 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 35 gtaggtgtaa ctaccatctg cagaatcttg gccgcttcaa caaacttgaa tcgctacagt 60 taacttataa ctatccaggt ggtgatttgt tgctaaaatt gccgagttcc atcaagaagt 120 tgacattata tggttgcaag cttccgtgga gtgatatggc aatgatagct tccttgcctc 180 atcttcaatt tcttcaattg tgggatcaag catttgtagg agccgagtgg aatttgggca 240 gtgaggaatt cccttgcttg aaacacttga gaattattct ctgtagtgat ctgattcact 300 g 301 <210> 36 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 36 caatccgacg tggagcttcg tcgccggtta cacggtaagc gaggcggccg tgcagtttcc 60 gggagtcaac ctcgttgtga agctgctgtg caagagaact ataggagaca agctcatagg 120 tgaagtcaaa atacctctca agaatctttt tgatgcggca catgaatctg cagatcaaga 180 caagattctg aggtacgatg tggaggggac tcccaatggg gtactcgtta tctcctatag 240 tttcggccaa aagatggcca tcgtccctga ccgagttcca ctgccgtcga gctcacatca 300 g 301 <210> 37 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 37 caaccatatc attgtccagt atttccactt ctgcaggaac agttctacta ctttctcctt 60 taaaacattt tccatcactc ttcttaaatg gggttgagca tctagtacgc ttggcatttc 120 taatttggca atcgattcct tttgtaggcc aatgagtttt cacagagtga taaggctcct 180 ttttgacagc agcattacca aaagcagtct tcttacttga aagtccatcc tccagccggc 240 catcttgaac aactgctttc tttcccttgt ccaatctctg taaacatatc tgacctcgta 300 c 301 <210> 38 <211> 301 <212> DNA <213> Perilla frutescens <400> 38 cagcacgctt ggtaattgaa gaaggccaac agctgaacaa ttctggtccc agagattcaa 60 tcttaataga tcacgactat tattcaagag cactgcttca taaccggaga aggggtggtg 120 aatcttccaa cggaccgctc tctggttcaa gcatcgacac actctcaaag aaaagaataa 180 ggtcatcacg acttgattct ctgatgtttg atagagatgc tagcatgaga aaaatgttat 240 cccagaaaga 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<220> <223> primer <400> 458 agcttcagtt cgaccggc 18 <210> 459 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 459 acgtgatagg tgccttgcca 20 <210> 460 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 460 catgacagaa tctgacagaa tcca 24 <210> 461 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 461 cggcctaata acatcccatg taactc 26 <210> 462 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 462 cggcctaata acatcccatg taactt 26 <210> 463 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 463 gcctccttgt ggccaacat 19 <210> 464 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 464 ctgacatcgt accggcct 18 <210> 465 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 465 ctaaacgagc cagcatttta aatggta 27 <210> 466 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 466 acgagccagc attttaaatg gtc 23 <210> 467 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 467 gccacaagct cgcacct 17 <210> 468 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 468 gccgtaaacg ataagctact gc 22 <210> 469 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 469 agaaatgaat tagaccatca aattaaagtc cg 32 <210> 470 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 470 cagaaatgaa ttagaccatc aaattaaagt cct 33 <210> 471 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 471 gacacccttt gaattaattt gtacatctca ct 32 <210> 472 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 472 tcttagctag gtttgtcact gca 23 <210> 473 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 473 gggaaatccc acatcaccga 20 <210> 474 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 474 ggaaatccca catcaccgc 19 <210> 475 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 475 ccctcacggt gcagaacttg 20 <210> 476 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 476 aggtacatct tcccctcacc 20 <210> 477 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 477 ggaaacctct cacatggggt a 21 <210> 478 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 478 ggaaacctct cacatggggt c 21 <210> 479 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 479 ctccatccga gccacgaac 19 <210> 480 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 480 tgaccctttt gaaacactgc tg 22 <210> 481 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 481 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58 <210> 482 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 482 caagcagaag acggcatacg agatcggtct cggcattcct gctgaaccgc tcttccgatc 60 t 61

Claims (9)

  1. 서열번호 1 내지 96의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 있어서, 각각의 염기서열 중 151번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 마커를 이용하여 들깨의 염색체별 유전형 조성을 스캐닝 또는 품종을 판별하기 위한 SNP 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8개 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 SNP 마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 들깨는 4배체 재배종 들깨인 것을 특징으로 하는 SNP 마커 조성물.
  4. 제1항에 기재된 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한, 들깨의 염색체별 유전형 조성 스캐닝 또는 품종 판별용 프라이머 세트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 97 내지 480으로 표시된 올리고뉴클레오티드에서, n이 동일한 값을 갖는 서열번호 4n, 서열번호 4n-1, 서열번호 4n-2 및 서열번호 4n-3의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트(n은 25 내지 120의 자연수)인 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
  6. 제4항 또는 제5항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 들깨의 염색체별 유전형 조성을 스캐닝 또는 품종을 판별하기 위한 키트.
  7. 들깨 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제4항 또는 제5항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물의 유전형을 결정하는 단계;를 포함하는, 들깨의 염색체별 유전형 조성 스캐닝 또는 품종 판별 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 들깨는 4배체 재배종 들깨인 것을 특징으로 하는 들깨의 염색체별 유전형 조성 스캐닝 또는 품종 판별 방법.
  9. 제1항에 기재된 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 들깨의 염색체별 유전형 조성 스캐닝 또는 품종 판별용 마이크로어레이.
KR1020200143378A 2020-10-30 2020-10-30 들깨에서 염색체별로 유전형 조성을 스캐닝하기 위한 단일염기다형성(snp) 마커 세트 및 이의 용도 KR102335934B1 (ko)

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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20120063814A (ko) * 2010-12-08 2012-06-18 강원대학교산학협력단 나리 속 식물에서 분리한 ｓｓｒ프라이머 및 이의 용도
KR20190037609A (ko) * 2017-09-29 2019-04-08 대한민국(농촌진흥청장) 엽록체 유전체와 45Ｓ ｎｒＤＮＡ 염기서열 정보를 활용한 들깨 배수체간 품종 판별용 분자 마커 및 이의 용도
KR20190048451A (ko) * 2017-10-31 2019-05-09 주식회사 씨더스 농업회사법인 들깨 잎의 보라색 판별용 분자마커 및 이의 용도

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