KR101883117B1 - 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 snp 마커 - Google Patents

Abstract

본 발명은 토마토 청고병(Bacterial wilt) 저항성 토마토 판별용 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 토마토 청고병 저항성 판별용 키트, 및 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 SNP 마커 및 이를 이용한 HRM 분석 방법은 토마토 청고병 저항성 토마토를 판별할 수 있는 수단으로 사용될 수 있으므로, 육안으로 구별되지 않는 토마토 청고병 저항성 토마토를 객관적으로 평가할 수 있는 수단으로 사용되므로, 토마토 청고병에 대한 저항성을 갖는 토마토 품종을 구별할 수 있으며, 토마토 품종개량 및 개량된 품종에 대한 토마토 청고병 저항성을 평가할 수 있을 것이다.

Description

토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커 {SNP marker for selecting tomato cultivars resistant to tomato Bacterial wilt and use thereof}

본 발명은 토마토 청고병(Bacterial wilt) 저항성 토마토 판별용 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 토마토 청고병 저항성 판별용 키트, 및 (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별 방법에 관한 것이다.

토양 매개 세균인 랄스토니아 슈도솔라나세아룸(Ralstonia pseudosolanacearum; R. solanacearum phylotpye I)에 의한 청고병(Bacterial wilt, 풋마름병)은 토마토에 대한 치명적인 질병 중 하나이다 (Caldwell et al., 2017; Hayward 1991). 병원균은 상처 또는 뿌리의 자연적 개방을 통해 토마토를 침범하고, 뿌리가 자루에서 수평으로 자라면 목부 조직을 감염시켜 감수성 식물의 혈관 시스템에서 물의 흐름을 막는다. 이 치명적인 질병을 통제하기 위해 화학 및 생물학적 방제와 같은 다양한 전략이 사용되었지만 랄스토니아 슈도솔라나세아룸을 줄이는데 효과적이지 못했다. 따라서 질병을 방제하는 가장 좋은 전략은 랄스토니아 슈도솔라나세아룸에 대한 저항성이 강한 저항성 품종을 사육하는 것이다 (Salgon et al. 2017).

랄스토니아 슈도솔라나세아룸에 대한 저항성을 가지는 토마토 품종의 연구가 시작되고, 토마토 청고병에 대해 가장 안정한 저항성을 가지는‘Hawaii7996’(Solanum lycopersicum)이 개발되며 청고병에 대한 유전적 특성이 활발하게 연구되었다. 이후, 맵핑 결과를 통해 SSR 마커를 개발하면서, Bwr-6 및 Bwr-12로 명명된, 각각 6번 및 12번 염색체에 위치하며 청고병 저항성과 밀접한 관계가 있는 두 개의 주요 양적 형질 위치 (quantitative trait loci, QTLs)가 보고되었다.

그러나, 토마토의 청고병 저항성에 대한 QTL 맵핑 연구가 있었지만 분자 마커의 접근 가능성의 한계로 인해 저항성 잡종에 대한 토마토 육종에 실제로 사용된 분자 마커는 거의 없었다. 따라서 효과적인 육종 프로그램을 위한 저항성과 밀접한 관련이 있는 새로운 분자 마커를 개발할 필요가 있다.

이에 본 발명자들은 토마토 청고병 저항성 품종을 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 청고병 저항성 관련 SNP 마커를 개발하였으며, 40여개의 토마토 품종에서 해당 SNP 마커를 이용하여 청고병 저항성 유무를 판별하여 그 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 287번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 287번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 토마토 청고병(Bacterial wilt) 저항성 토마토 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 (a) 토마토 시료의 DNA로부터 제1항의 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커의 다형성 부위인 287번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는, 토마토 청고병 저항성 형질을 나타내는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 287번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 287번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 토마토 청고병(Bacterial wilt) 저항성 토마토 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커를 제공한다.

본 발명에서는 전체 유전체 시퀀싱을 통해 토마토 유전체의 SNP를 탐색한 결과 CDS에 위치한 SNP가 청고병 저항성 QTL이 위치한 6번 및 12번 염색체에 밀집되어 있다는 점에 착안하여 QTL 주변 SNP를 확인하고 토마토 품종의 표현형과 비교 분석하여 청고병 저항성 품종과 감수성 품종을 구별한 후, 가장 정확도가 높은 단일 염기 다형성을 찾아내 토마토 청고병 저항성 특이적인 마커를 제작하였으며, HRM(High Resolution Melting) 분석을 실시하여 시판되고 있는 품종 중에서 저항성 품종과 감수성 품종을 명확하게 구별할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기 마커는 Solyc12g009690.1 유전자의 SNP 부위를 포함하는 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 구체적으로 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 전체 또는 일부 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 보다 구체적으로 서열번호 1로 구성된 폴리뉴클레오티드의 번역시작 위치에서 287번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 287번째 염기를 포함하는 5 내지 200개, 구체적으로 5 내지 150개, 보다 구체적으로 5 내지 100개, 보다 더 구체적으로 5 내지 50개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 토마토 청고병(Bacterial wilt) 저항성 토마토 판단용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커일 수 있다. 또한, 상기 마커는 287번째 염기가 G인 경우, 토마토 청고병 저항성 토마토인 것으로 판별하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, “청고병(Bacterial wilt)”은 막대 모양의 토양 매개 그람음성세균인 랄스토니아 슈도솔라나세아룸에 의해 유발되는 질병이며, 풋마름병이라고도 알려져있다. 청고병을 유발하는 병원균은 상처 또는 뿌리의 자연적 개방을 통해 토마토에 침입하고, 뿌리가 자루에서 수평으로 자라면 도관부 조직을 감염시켜 감수성 식물의 혈관 시스템에서 물의 흐름을 막아 식물이 빠르게 시들어간다. 주로 고온일 경우 쉽게 발생하는 질병이다.

본 발명의 용어, “저항성”은 외부의 스트레스에 대해 견디는 성질을 의미하며, 구체적으로 질병 등의 감염에 내성을 가지거나, 해충 등의 피해를 견디는 성질을 의미한다.

본 발명의 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립유전자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다. SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 토마토 청고병 저항성과 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일 염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

본 발명의 용어 "개체"란, 토마토 청고병 저항성을 확인하고자 하는 대상인 토마토를 의미하며, 상기 토마토로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 토마토 청고병 저항성이 있는 토마토를 판단할 수 있다. 상기 검체로는 잎, 뿌리, 줄기, 꽃, 열매, 분리된 조직, 또는 분리된 세포와 같은 시료 등이 될 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 토마토 청고병 저항성 SNP 마커를 발굴하기 위해, 시판되고 있는 토마토 청고병 저항성 및 감수성 8개의 품종을 대상으로 전체 유전체 시퀀싱을 통해 토마토 유전체의 SNP를 탐색한 후, 토마토 청고병 저항성과 연관된 QTL 주변의 SNP로 범위를 좁혀 탐색을 진행한 결과, 6번 염색체의 15개 유전자에서 18개의 비동의 SNP를 발견하였고, 12번 염색체의 26개 유전자에서 59개의 비동의 SNP를 발견하였다. 상기 41개의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 정보를 분석하여, 염색체 12의 SSR 마커 근처에 있는 Solyc12g009690 .1, Solyc12g009740 .1, Solyc12g009770.1, 및 Solyc12g009780 .1 유전자가 고류신반복(leucine-rich repeat, LRR) 수용체 유사 세린/트레오닌 단백질 인산화효소(receptor-like serine/threonine-protein kinase, RLP) 상동체를 코딩하기 때문에 중요한 후보자로 판단하였으며, 상기 후보 유전자에 포함된 16개의 SNP를 7가지의 청고병 저항성 품종 및 2가지의 청고병 감수성 품종에서 확인한 결과, 오직 본 발명의 SNP 마커만이 토마토 청고병의 저항성 또는 감수성의 판별을 정확하게 할 수 있었다(도 4). 또한, 범위를 넓혀 41가지 품종에 대해 HRM 분석을 통해서 SNP 마커를 확인한 결과, 저항성 품종과 감수성 품종이 확연히 구별되는 것을 확인하였다(도 6). 따라서, 상기의 실험을 통해 본 발명의 SNP마커의 신뢰성 및 정확성을 확인할 수 있었고, 상기 SNP 마커의 유전자형을 증폭하고 HRM 분석을 수행하여, SNP 마커의 유전자형을 판독하면, 토마토 청고병 저항성 토마토를 판별할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 SNP 마커는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 검출 또는 증폭을 통해 확인하여 토마토 청고병 저항성 토마토를 판별할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브를 의미한다.

상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 하고, 바람직하게는 서열번호 2 및 3으로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미하며, 주로 특정 구간을 증폭하는 프라이머 세트의 형태로 사용된다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 이때, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.

본 발명의 용어, “프로브”는 다양한 길이의 DNA 또는 RNA 염기서열로 방사성 표지 또는 형광 표지 등을 통해 표지되어 있으며, 단일가닥의 염기서열로 구성되어 상보적인 서열을 가진 단일가닥 DNA 또는 RNA에 특이적으로 결합하여 혼성화하는 것이 특징이며, 혼성화한 프로브의 표지 신호를 탐지하는 방식을 통해 타겟을 검출할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 HRM 분석 키트 또는 DNA 칩 키트일 수 있다.

본 발명의 HRM 분석 키트는 토마토 청고병 저항성 토마토 판단용 마커인 SNP 마커의 유전자형을 증폭하여 판독하거나 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지함으로써 토마토 청고병 저항성 토마토를 판단할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 토마토 청고병 저항성 토마토 판단용 HRM 분석 키트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 287번째 염기의 변이에 따른 이중가닥의 해리 정도의 차이를 감지하여 유전자형을 판단하는 키트일 수 있다. 상기 "고해상도 융해(high resolution melting, HRM) 분석" 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법으로, 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 PCR 기기와 연결되어 사용된 염료를 갖는 보다 개선된 이중가닥 DNA(dsDNA)에 의해 가능하게 된다. dsDNA의 온도에 따른 해리 정도의 차이를 HRM 분석을 위해, 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리할 수 있다. 본 발명에서는 토마토 청고병 저항성 토마토를 선별하기 위해서 HRM 분석을 사용하였다.

상기 HRM 분석 키트는 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 한 쌍의 프라이머, DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), RNAase, DEPC-수(DEPC-water), 테스트 튜브 및 적절한 컨테이너 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 DNA 칩 키트는 토마토 청고병 저항성 토마토 판단용 마커인 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 부착된 칩을 이용하여 특이적으로 타겟 DNA와 혼성화하여 결합하는 것을 특징으로 하며, SNP의 염기 변이에 따라 혼성화 수준의 변화가 나타나는 것을 이용하여 토마토 청고병 저항성 토마토를 판별할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 제공하는 토마토 청고병 저항성 토마토 판단용 DNA 칩 키트는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드의 287번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 서열과 상보적인 올리고뉴클레오티드를 표지자와 함께 칩에 부착하고 타겟 DNA를 칩에 반응시켜 혼성화 수준을 통해 유전자형을 판단하는 키트인 것인, 토마토 청고병 저항성 판별용 키트일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 토마토 시료의 DNA로부터 제1항의 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커의 다형성 부위인 287번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별 방법을 제공한다.

상기 판별 방법은 상기 287번째 염기가 G인 경우, 토마토 청고병 저항성 토마토인 것으로 판별하는 것일 수 있다.

상기 (a) 단계의 DNA 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification) 및 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 (a)단계는 서열번호 2 및 3으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 염기를 증폭 또는 검출하는 것일 수 있다.

상기 방법 중 (b)단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 방법은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.

"HRM 분석" 기술은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 변이 부위가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 변이가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, 상기 변이 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보결합할수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

상기 TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티들의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 단일염기 다형성이 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 변이 부위가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 변이를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택된다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 변이를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 변이를 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 변이를 검출할 수 있다.

구체적으로, 상기 (b)단계는 HRM(high resolution melting) 분석을 통해 이중가닥 DNA의 염기 변이에 따른 해리정도의 차이를 감지하여 다형성 부위의 염기를 결정하는 것일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 구성되는, 토마토 청고병 저항성 형질을 나타내는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명자들은 토마토 청고병 저항성을 갖는 토마토를 판별하기 위해 전체 유전체 시퀀싱을 통해 SNP를 탐색하였고 탐색 과정에서 토마토 청고병 저항성과 관계가 있는 QTL 주변의 유전자를 발견하였다. 또한, 해당 유전자의 CDS 서열에서 SNP를 발견했으며, 해당 SNP가 토마토 청고병 저항성을 정확하게 판별 가능한 SNP 마커임을 입증하였다.

한편, 토마토 청고병 저항성 형질을 갖는 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 토마토 청고병 저항성을 가진다고 판단할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 또한 토마토 청고병 저항성 형질을 가진다고 판단할 수 있다. 게다가 본 발명에서 제공하는 폴리뉴클레오티드는 토마토 청고병 저항성 형질과 관련된 SNP가 추가로 존재하여 상기 폴리뉴클레오티드와 토마토 청고병 저항성 형질과의 관계는 더욱 밀접한 것으로 판단할 수 있다.

따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 염기서열을 갖는 토마토는 토마토 청고병 저항성 형질을 나타낼 수 있음을 시사하며, 이러한 염기서열은 본 발명자들에 의하여 최초로 규명되었다.

상기 폴리뉴클레오티드는 287번째 염기가 G, 401번째 염기가 A, 454번째 염기가 T, 476번째 염기가 A, 569번째 염기가 T, 694번째 염기가 C, 756번째 염기가 G, 784번째 염기가 G, 846번째 염기가 G, 891번째 염기가 C, 1057번째 염기가 A, 또는 1158번째 염기가 C일 경우, 토마토 청고병 저항성 형질을 나타내는 것일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “벡터(vector)”는 DNA 재조합 실험에 있어서 목적하는 DNA 단편을 숙주균 등에 도입시켜 주고 증식할 수 있는 DNA로서 클로닝 운반체(cloning vehicle)라고도 한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 또한 목적하는 단편의 발현 조절을 위한 프로모터를 벡터에 함께 포함시킬 수 있다. 본 발명의 벡터는 토마토 청고병 저항성 형질을 갖는 폴리뉴클레오티드를 가지고 있어, 상기 벡터가 토마토에 주입되었을 경우, 토마토 청고병에 대한 저항성을 가지는 것일 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는, 토마토 청고병 저항성을 갖는 형질전환 토마토를 제공한다.

상기 “형질전환(transformation)”은 외부로부터 주어진 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 말한다.

상기 형질전환 토마토는 인위적으로 상기 폴리뉴클레오티드 또는 상기 재조합 발현 벡터를 도입하여 형질을 전환시킨 토마토일 수 있고, 형질의 전환을 통해 토마토 청고병에 대해 감수성이었던 형질이 저항성으로 전환된 토마토일 수 있다.

따라서, 상기 형질전환 토마토는 토마토 청고병에 저항성을 갖는 형질전환 토마토일 수 있다.

본 발명의 신규한 SNP 마커 및 이를 이용한 HRM(high resolution melting) 분석 방법은 토마토 청고병 저항성 토마토를 판별할 수 있는 수단으로 사용될 수 있으므로, 육안으로 구별되지 않는 토마토 청고병 저항성 토마토를 객관적으로 평가할 수 있는 수단으로 사용되므로, 토마토 청고병에 대한 저항성을 갖는 토마토 품종을 구별할 수 있으며, 토마토 품종개량 및 개량된 품종에 대한 토마토 청고병 저항성을 평가할 수 있을 것이다.

도 1은 8개의 토마토 품종에서 청고병에 대한 질병 저항성을 확인한 그래프이다; a, 랄스토니아 슈도솔라나세아룸 접종 후 14일째에 찍은 사진. b 청고병의 질병 중증도의 수치, 접종 후 14일째에 질병의 심각성을 0 점에서 5 점으로 측정 하였으며, 청고병에 대한 증상의 정도는 y 축에 표시된다, 0, 시들음 없음, 1, 잎 하나가 부분적으로 시들음, 2, 하나 또는 두 잎이 완전히 시들음, 3, 대부분의 토마토 잎이 시들음, 4, 모든 잎이 시들음, 5, 식물이 죽음.
도 2는 다형성 SNP의 유전체내 분포를 나타낸 그래프이다; a, 각 염색체에서 확인된 유전체 위치 및 코딩 SNP로 분류 된 모든 SNP의 총 수, 다형성 SNP는 유전자 간 (intergenic) 또는 유전 (genic) 영역으로 분류되었으며, 이들은 코딩 DNA 서열 (CDS), 인트론 및 비번역 영역 (UTR)으로 세분되었다; 각 게놈 부위의 SNP 수는 괄호 안에 표시 하였다; b, 각 염색체의 코딩 SNP 백분율, SNP 밀도는 각 염색체의 코딩 SNP의 수를 코딩 SNP의 총 수로 나눔으로써 계산되었다. *는 청고병에 대한 질병 저항성을 나타내는 두 가지 주요 QTL을 포함한 염색체를 나타내었다.
도 3은 염색체 6번 및 12번의 다형성 SNP를 포함한 추정 유전자의 도식적 위치를 나타낸 도면이다; 블랙 박스, 두 개의 주요 QTL의 예상 위치; 파란 선, 이전 연구에서 개발 된 SSR 마커의 위치, Mbp, 1,000,000 염기쌍.
도 4는 'Heinz1706'의 유전체 서열에 기초한 12번 염색체에서 기능적 SNP를 갖는 추정 RLP 유전자의 개략적인 위치 및 목록을 나타낸 도면이다; SLM12-12 및 SLM12-2는 Bwr-12와 연관된 SSR 마커를 나타낸다; 화살표는 12번 염색체의 추정 RLP 유전자와 SSR 마커의 물리적 위치를 나타낸다. cM, 센티모르간; Mbp, 1,000,000 염기쌍.
도 5는 S2와 R7 사이의 서열 정렬로부터의 SNP의 동정 결과를 나타낸 도면이다. 추정 저항성 유전자인 Solyc12g009690 .1에서 CLUSTALW를 사용하여 서열 비교를 진행하였다. KHU-1 프라이머 세트의 위치와 기능적 SNP는 염기 서열에 표시하였다. 숫자는 유전자 내의 엑손과 인트론의 위치를 나타낸다. 화살표는 두 개의 프라이머의 위치를 나타냅니다. *는 서열의 일치를 의미한다. E, 엑손; I, 인트론.
도 6은 KHU-1 프라이머 세트를 사용한 HRM 분석에 의한 SNP 마커의 검증 결과를 나타낸 그래프이다; 저항성 모체인 '10-BA-4-24 '(R, 파란색 곡선), 이형 접합 F1 (H, 녹색 곡선) 및 감수성 모체인 IL12-2 (S, 주황색 곡선)를 나타낸다. 온도 변화(dT)에 대한 형광 변화(dF)의 첫번째 음의 도함수는 y 축에 -dF/dT로 표시하였다. RFU, 상대 형광 단위.
도 7은 KHU-1 프라이머 세트를 이용한 HRM 분석에 의한 40가지 토마토 품종의 유전자형 분석 결과를 나타낸 그래프이다; 정규화된 용융 곡선 (a)의 결과는 저항성(b), 이형 접합(c) 및 감수성 대립유전자(d)를 갖는 토마토 품종의 용융 곡선을 통해 확인할 수 있다; "R", "H"및 "S"는 저항성(파란색 및 주황색 곡선), 이형 접합(연한 녹색 곡선) 및 감수성(빨간색, 녹색 및 분홍색 곡선) 품종의 그룹을 나타낸다. 온도 변화(dT)에 대한 형광 변화(dF)의 첫 번째 음의 도함수는 y 축에 -dF/dT로 표시하였다. RFU, 상대 형광 단위.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험 재료의 준비

실시예 1-1. 식물의 준비 및 성장 조건

본 발명에서는 41개의 토마토 품종을 사용하였다 (표 1). 그 중 유전체 SNP 분석 및 SNP 마커 개발을 위해 7가지의 청고병 저항성 품종(Hawaii 7996, Hawaii 7998, BWR-1, BWR-22, BWR-23, 10-BA-3-33 및 10-BA-4-24)과 2가지의 청고병 감수성 품종(‘BWS-3’ 및 ‘Heinz1706’)을 우선적으로 사용하였다. 본 발명에서 개발된 SNP 마커의 검증을 위해 솔라눔 라이코페르시쿰(S. lycopersicum, cv. M82) 및 솔라눔 페넬리(S. pennellii, Eshed and Zamir 1995) 사이의 침투교잡종 중 하나인 저항성 모체(resistant parent) '10-BA-4-24' 와 감수성 모체(susceptible parent) 'IL12-2’를 교잡한 F1 하이브리드를 생성하여 사용하였으며, 상업용 F1 잡종을 포함한 31 종의 토마토 재배 품종을 사용하였다. 각 토마토 씨를 Baroker 토양 (서울 바이오, 한국)으로 채워진 32개의 분으로 이루어진 트레이에 파종 하였다. 4 내지 5주 후에 각 토마토 품종의 3 내지 4개의 어린 잎에서 유전체 DNA를 추출하였다. 트레이는 60%의 습도 및 63.03μmol/m.s의 빛 강도 조건에서 14시간의 빛/10시간의 암흑 주기 하에 28℃의 생육상(growth chamber)에 4 내지 5주 동안 보관하였다.

[표 1a]

[표 1b]

실시예 1-2. 유전체 DNA 추출

변형된 세틸트리메틸암모늄브로마이드 (cetyl-tri-methyl-ammonium bromide, CTAB) 방법(Murray and Thompson 1980)을 사용하여 토마토 모종의 어린 잎에서 유전체 DNA를 분리하였다. 어린 잎은 녹이기 전 액체질소를 이용하여 급속 동결 시킨 후 갈았다. 그 후, 이들 샘플을 CTAB 완충액과 혼합하고 65℃에서 30분 동안 배양하였다. 클로로포름을 샘플에 첨가하고, 혼합물을 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 상등액을 새로운 미세 다공 튜브 (microfuge tube)로 옮긴 후 100% 이소프로판올을 첨가하였다. DNA 펠렛을 원심분리 후 70% 에탄올로 세척하고, 건조시키고, 멸균수로 용해시켰다. 분리된 유전체 DNA의 최종 농도는 나노드롭 2000/UV-Vis 분광광도계 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 10 ng/ml로 조정 하였다.

실험예 1. 토마토 품종별 청고병 저항성 분석

각 토마토 품종에 따른 토마토 청고병 저항성을 확인하기 위해, 토마토에서 분리한 랄스토니아 슈도솔라나세아룸(R. pseudosolanacearum) 균주 SL882 (race 1, biovar 4, phylotype 1)를 사용하였다. 상기 균주를 Casamic acid-Peptone-Glucose (CPG) 배지 (Casamino acid 1g/L, Bacto peptone 10g/L, Glucose 5g/L, Agar 15g/L, pH 7.2)를 함유한 배양기에서 30℃에 2일 동안 배양하였다. 균주 배양 현탁액을 증류수로 희석하고 나노드롭 2000/UV-Vis 분광광도계 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 최종 농도를 mL 당 108 CFU (OD 600nm = 0.1)로 조정하였다. 4 내지 5주된 묘목에 각 분(pot)당 약 10㎖의 박테리아 현탁액을 접종한 다음, 습도 60%, 28℃의 조건에서 2주간 병의 증상을 관찰하였다. 토마토 품종당 10 내지 15 개의 식물을 접종하였으며, 개별 식물의 시들음 증상에 대해 매일 관찰하였다. 토마토의 증상 정도에 따라 랄스토니아 슈도솔라나세아룸 균주 SL882에 의한 청고병의 진행 정도를 0 에서 5로 분류하였다 (0, 시들음 없음, 1, 잎 하나가 부분적으로 시들음, 2, 하나 또는 두 잎이 완전히 시들음, 3, 대부분의 토마토 잎이 시들음, 4, 모든 잎이 시들음, 5, 식물이 죽음.).

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, ‘Hawaii7996’, ‘Hawaii7998’, ‘10-BA-4-24’, ‘10-BA-3-33’, ‘BWR-1’, ‘BWR-22’및 ‘BWR-23’이 강한 저항성을 나타내어 R7로 그룹화 하였고, ‘BWS-3’은 청고병에 약해 ‘Heinz1706’과 함께 S2로 분류되어 전체 유전체 서열의 이용이 가능해졌다. 본 발명에서 확인한 표현형 결과는 기존에 알려진 해당 품종의 저항성 정보와 일치하였으며, 상기 토마토 품종을 통해 전체 유전체 리시퀀싱(Whole genome resequencing) 분석으로 'Heinz1706'의 유전체 서열과 비교하여 토마토 품종 간의 다형성 SNP를 탐색하였다.

실험예 2. 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커 탐색

실험예 2-1. 전체 유전체 시퀀싱( WGS )을 이용한 SNP 발굴

유전자형 분석을 위해 8개의 토마토 품종에서 추출한 유전체 DNA를 사용하여 마크로젠(서울, 한국)의 HiSeq-X 플랫폼을 통해 전체 유전체 리시퀀싱(Whole genome resequencing)을 수행하였다. 전체 유전체에서의 유전체 범위는 Sol Genomics Network (SGN) SL2.5 (Consortium 2012)에서 얻은 토마토 레퍼런스 유전체를 기반으로 설정하였다. 다형성 SNP는 Seeders Inc.(대전, 한국)에서 확보한 청고병 감수성 그룹 (S2 : 'Heinz1706' 및 'BWS-3')과 청고병 저항성 그룹 (R7 : 'Hawaii7996', 'Hawaii7998', '10-BA-3-33', '10-BA-4-24', 'BWR-1', 'BWR-22' 및 'BWR-23')을 이용하여 구분하였다. solexaQA (v.1.13) 패키지의 DynamicTrim 및 LengthSort 프로그램은 짧은 구간의 서열 전처리에 사용되었으며, 샘플의 SNP 검출을 위해 BWA (0.6.1-r104) 프로그램과 SAMtools (0.1.16) 프로그램을 사용하여 정리된 짧은 구간을 기준 유전체에 정렬하였다. 그 후, SEEDERS 사내 스크립트를 사용하여 샘플과 SNP 필터링간에 SNP 매트릭스를 생성하였다. 유전체의 여러 유전자 내에서 비동의(non-synonymous) SNP를 발견하기 위해, 국립 생명공학 정보센터 (NCBI)의 다중 서열 정렬(Multiple Sequence Alignment, MSA)과 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 통해 두 그룹의 서열을 정렬하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 두 그룹간의 비교를 통해 총 5,259개의 다형성 SNP를 확인하였으며, 이러한 다형성 SNP 중 265 개 (다형성 SNP의 약 5 %)가 CDS(coding DNA sequence)에서 발견되었으며, 인트론, UTR(untranslated region), 유전자 간 영역(intergenic region)에서 각각 619, 25 및 4,350개의 SNP를 발견하였다. 또한 CDS의 SNP를 각 염색체별로 분류한 결과, 6번 염색체에서 53개, 12번 염색체에서 168개의 SNP가 발견되어 두 염색체에 SNP가 밀집되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2-2. Bwr -6 및 Bwr -12 QTL 주변의 SNP 탐색

상기 실험예 2-1에서 확인된 바와 같이, CDS의 SNP가 6번 및 12번 염색체에 밀집되어 있는 것을 확인하였고, 흥미롭게도 토마토 청고병 저항성과 관련된 QTL인 Bwr-6 및 Bwr-12가 각각 6번과 12번 염색체에 존재한다는 것이 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 실험예 2-1에서 발견한 SNP가 토마토 청고병 저항성과 관련성이 있다고 가정하고 Bwr-6 및 Bwr-12 주변의 다형성 코딩 SNP에 초점을 맞춰 탐색을 진행하였다. 최근의 연구에서 SSR 마커가 Bwr-6 (SLM6-118 및 SLM6-17)과 Bwr-12 (SLM12-12 및 SLM12-2)에 할당된 것을 확인하여, 상기 분자 마커를 이용하여 QTL 주변 SNP를 탐색하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 6번 염색체의 15개 유전자에서 18개의 비동의(non-synonymous) SNP를 발견하였고, 12번 염색체의 26개 유전자에서 59개의 비동의 SNP를 발견하였다. 41개의 유전자에 의해 코딩된 단백질의 정보가 분석되었고, 염색체 12의 SSR 마커 근처에 있는 Solyc12g009690 .1, Solyc12g009740.1, Solyc12g009770 .1, 및 Solyc12g009780 .1 유전자가 고류신반복(leucine-rich repeat, LRR) 수용체 유사 세린/트레오닌 단백질 인산화효소(receptor-like serine/threonine-protein kinase, RLP) 상동체를 코딩하기 때문에 중요한 후보자로 판단하였으며, 상기 유전자의 SNP들을 이용하여 토마토 품종에 대한 청고병 저항성과 유전자형간의 관계를 분석하였다.

실험예 3. 토마토 청고병 저항성 SNP 마커의 개발 및 검증

실험예 3-1. 토마토 청고병 저항성 SNP 마커 후보군 분석

4가지 유전자 중 하나가 Bwr-12 QTL에 관여하는지를 확인하기 위해, 총 14개의 다른 SNP 마커가 발굴되었다. 13개의 프라이머 세트 (도 5 및 표 2)는 4개의 후보 유전자로부터 100-200bp의 증폭 산물(amplicon)을 생산하도록 설계되었으며, 일부 증폭 산물은 SNP가 매우 밀접하게 위치하고 있기 때문에 하나 이상의 SNP를 포함하도록 설계하였다.

[표 2]

SNP 마커를 증폭하기 위해, 50ng의 유전체 DNA, EvaGreen™ 형광 염료를 포함한 2X Real-Time PCR 마스터 믹스(바이오팩트, 대전, 한국), 및 10pmol의 각 프라이머 세트로 구성된 20μL 혼합물을 이용하여 표준 PCR을 수행하였다. 표준 PCR 반응에서 95℃에서 15분의 예비 변성을 시작으로 95℃에서 20초, 55 내지 58℃에서 40초, 72℃에서 15초 및 72℃에서 5분을 30회 반복하는 단계를 통해 증폭 산물을 제조하였다. 이 프라이머 세트가 각 토마토 품종에서 단 하나의 PCR 밴드를 증폭 하는지를 확인한 후, HRM 분석 과정에서 증폭 산물을 CFX Connect Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 통해 매 10초마다 0.2℃의 온도 상승으로 65℃ 내지 95에서 용융시켜 Precision Melt Analysis Software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 SNP 마커를 가진 토마토 품종의 유전형을 확인하였으며, 이들 SNP 마커의 감수성 또는 저항성 그룹에 속한 토마토 품종의 청고병 저항성에 대한 정확도를 확인하였다.

결과적으로 다른 SNP 마커는 정확도가 떨어지는 반면, Solyc12g009690 .1 유전자에서 고안된 KHU-1 프라이머 세트에 의해 증폭되는 단 하나의 SNP 마커만이 본 연구에서 사용된 토마토 품종의 유전자형을 매우 효율적으로 결정할 수 있었다. 이 SNP 마커를 이용한 HRM 분석은 마커 발달에 대한 8가지 품종을 표현형 결과와 일치하는 저항성 및 감수성 품종으로 완벽하게 분류하였다 (표 1).

실험예 3-2. 토마토 청고병 저항성 SNP 마커의 유효성 분석

이 SNP 마커의 유효성을 확인하기 위해 저항성 모체인 ‘10-BA-4-24’와 감수성 모체인 ‘IL12-2’를 교접하여 F1을 생성하였고, 실험예 3-1과 동일한 방법을 이용하여 HRM 분석을 진행한 결과, 본 발명의 SNP 마커는 세 가지 품종을 완벽하게 구별하였다(도 6). ‘10-BA-4-24’, F1 하이브리드 및 ‘IL12-2’의 용융 피크는 각각 78.6, 78.4 및 78.2℃로 확인되어 염기 변화에 따른 용융 피크의 차이를 확인할 수 있었다.

실험예 3-3. 상업용 토마토 품종을 통한 토마토 청고병 저항성 SNP 마커의 검증

SNP 마커의 사용 범위를 확인하기 위해 상업용 F1 교잡종을 포함한 31 가지 토마토 품종을 HRM 분석에 추가하였다 (표 1). 'Heinz1706'을 제외한 총 40 종의 토마토 재배 품종 중 '10-BA-4-24 품종', 'IL12-2'및 F1 잡종을 각각 저항성, 감수성 및 이형성 유전자형을 나타내는 표준 유전자형으로 사용하였다.

그 결과, 도 7a에 나타낸 바와 같이, 토마토 품종의 유전형은 KHU-1 프라이머 세트를 사용하는 HRM 분석에서 표준화 된 용융 곡선에 기초하여 6개의 상이한 군으로 나누어졌다. 이 분석에서 ‘10-BA-4-24’ 및 ‘Hawaii7996’과 같은 저항성 대립유전자를 포함한 11 종의 토마토 재배 품종은 두 개의 용융 곡선 (파란색과 주황색)을 나타냈으며,‘IL12-2’ 및 ‘BWS-3’은 3개의 용융 곡선 (빨강, 녹색 및 분홍색)을 나타냈다. HRM 분석에서, 저항성 및 감수성 그룹의 용융 피크에 대한 정보도 확인하였다. 2 개의 용융 곡선을 갖는 저항성 그룹으로 분류 된 11 개의 토마토 품종은 용융 온도가 78.4 내지 78.6℃ 였고, 3 개의 용융 곡선을 갖는 감수성 그룹으로 분류된 29개의 토마토 품종은 용융 온도가 78.0 내지 78.2℃로 약간 낮았다 (도 7b 및 7c). 상기 결과를 통해 SNP 마커의 유전자형 결과는 표현형 결과와 상관관계가 있는 것으로 판단된다.

종합하면 이 결과는 RLP 단백질을 암호화하는 Solyc12g009690 .1 유전자가 Bwr-12 QTL의 원인이 되는 유전자일 수 있으며, 본 연구에서 개발된 SNP 마커는 청고병에 저항성이 있는 토마토 품종을 생성하는 데 유용하게 사용할 수 있음을 시사한다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> SNP marker for selecting tomato cultivars resistant to tomato Bacterial wilt and use thereof <130> KPA171015-KR <160> 27 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1158 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Solanum lycopersicum Solyc12g009690.1 cDNA sequence <400> 1 atgggcctca aaattgggct gatcctatta aacatggttg ggcctctctt ctttctaatg 60 ggccttatgc tgcggggaac acatatcaac tttcctagtc tagcaatttt gtccttatca 120 tcttgtgaac tgagggattt tccgcacttg ttgaaaaatg taaagacact caagttcttg 180 gatatttcta ataataagat tcggggtcaa atccctaact ggtttagcag tccactacct 240 tcatccattt gttacacgaa caagcttaaa tttctagatt tatcacgcaa caacttcagt 300 aattcaattc caagttgcat gggaagtatg gctaatctaa cggtgttgga cttaagaagg 360 aacaatttca cagggagtat tccaccatta tgtgcgcaga acacttcatt gagaaccatt 420 gtcctgaatg gtaatcaatt cgaaggacct gtctcgatgt cattgctcaa ctgtgatggt 480 ctagaaatcc ttgatgtggg gaaaaacgct atagatgaca catttccagc ttggctcgga 540 actcttcaag agctacaggt ccttatatta aagtcaaaca agttccgcgg acctataagt 600 acttgtcaag ctaaattttg ctttcccaag ttgcgaattt ttgatgtttc tcgtaatgaa 660 ttcagtggct cacttcctgc aaaagttttt ggacacttca aggcaatgat caaattagat 720 ggcggagaca aaggagagac caagtacatg aaaccgctga ttcagaatga atttagtgac 780 atagggattg acaaatcatc gaggtatatg atagaaatag tcagcgatga agtgtacaag 840 gattcgttga ggttggtgat caaaggtcag gatattgagg tagaaagaat cagcacaatt 900 atgacaacca tagatctctc aagcaaccat tttgaaggtg tcattccgaa aacactaaag 960 gaactcaact cactttggca actcaattta tcccataaca atctcacagg tcatattcca 1020 atgggttcct catatattag catatgtaca agtcgaaggt ctacagaaac aactaccttc 1080 tcaaggtaca cactacttgt ggaattaatt acactaaata tgctatgtta ttactccgat 1140 tctttgttga atacctaa 1158 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-1 forward primer <400> 2 tcaaggtcca ctaccttcat cc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-1 reverse primer <400> 3 agccatactt cccatgcaac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-2 forward primer <400> 4 gttggactta agaaggaaca 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-2 reverse primer <400> 5 gacaggtcct tcgaattgat t 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-3 forward primer <400> 6 ttgagaacca ttgtcctgaa tg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-3 reverse primer <400> 7 gtgtcatcta tagcgttttt cc 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-4 forward primer <400> 8 tggggaaaaa cgctatagat g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-4 reverse primer <400> 9 gcaacttggg aaagcaaaat 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-5 forward primer <400> 10 gcgaattttt gatgtttctc g 21 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-5 reverse primer <400> 11 racttggtct ctcctttgtc tccgc 25 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-6 forward primer <400> 12 ttagatggcg gagacaaagg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-6 reverse primer <400> 13 caccaacctc aatgaatcct 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-7 forward primer <400> 14 gaaggagttt taccaaagag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-7 reverse primer <400> 15 gttaggttgc ctatggaatc 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-8 forward primer <400> 16 gacacgtctt gaacacttag g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-8 reverse primer <400> 17 ggagggacac tgaatatagc 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-9 forward primer <400> 18 taatctgcga ggtgttctc 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-9 reverse primer <400> 19 ccagagatgc ctgtgtatga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-10 forward primer <400> 20 gcttcatcgg tttgtttccc 20 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-10 reverse primer <400> 21 gctcttgaag gatgctcaca tta 23 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-11 forward primer <400> 22 gtctttcaac tcactgaatg 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-11 reverse primer <400> 23 tgcttaaatg cagttcata 19 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-12 forward primer <400> 24 cacctttctt agcctatcat c 21 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-12 reverse primer <400> 25 gccgctaaac cagttaggaa 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-13 forward primer <400> 26 tcttcagtgt cgctccaaca 20 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHU-13 reverse primer <400> 27 tgattgagga aaagaaccac tg 22

Claims (12)

1. 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 287번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 287번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 토마토 청고병(Bacterial wilt) 저항성 토마토 판별용 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 마커 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 287번째 염기가 G인 경우 토마토 청고병 저항성 토마토인 것으로 판별하는 것인, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커 조성물.
   
3. 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 조성물로서,
   상기 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 287번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 287번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 조성물.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 제제는 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 프라이머 세트 또는 프로브인 것인, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 조성물.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3의 염기서열로 구성되는 것인, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 조성물.
   
6. 제3항의 조성물을 포함하는, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 키트.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 키트는 HRM 분석 키트 또는 DNA 칩 키트인 것인, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 키트.
   
8. (a) 토마토 시료의 DNA로부터 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커의 다형성 부위인 287번째 염기를 증폭하거나 검출하는 단계로서, 상기 토마토 청고병 저항성 토마토 판별용 SNP 마커는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드에서 287번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 287번째 염기를 포함하는 5 내지 200개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 증폭 또는 검출된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별 방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 287번째 염기가 G인 경우, 토마토 청고병 저항성 토마토인 것으로 판별하는 것인, 판별 방법.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 (a)단계는 서열번호 2 및 3으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 염기를 증폭 또는 검출하는 것인, 판별 방법.
    
11. 제8항에 있어서,
    상기 (b)단계는 HRM(high resolution melting) 분석을 통해 이중가닥 DNA의 염기 변이에 따른 해리정도의 차이를 감지하여 다형성 부위의 염기를 결정하는 것인, 토마토 청고병 저항성 토마토 판별 방법.
    
12. 서열번호 1의 염기서열로 구성되는, 토마토 청고병 저항성 형질을 나타내는 폴리뉴클레오티드.
    

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