KR102549388B1 - 수수의 세포질 웅성불임 판별용 분자 마커 및 이의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 수수의 세포질 웅성불임 판별용 조성물; 이를 포함하는 키트; 이를 이용한 수수의 세포질 웅성불임을 판별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 인델 분자 마커는 수수의 웅성불임 또는 가임과 관련된 유전형을 짧은 시간 내에 판별할 수 있어 수수의 F1 잡종품종의 개발에 유용하게 사용될 수 있으며, 국내외 수수 자원을 대상으로 정확한 유전형질의 분석이 가능하다.
본 발명의 인델 분자 마커는 수수의 웅성불임 또는 가임과 관련된 유전형을 짧은 시간 내에 판별할 수 있어 수수의 F1 잡종품종의 개발에 유용하게 사용될 수 있으며, 국내외 수수 자원을 대상으로 정확한 유전형질의 분석이 가능하다.
Description
본 발명은 수수의 세포질 웅성불임 판별용 조성물; 이를 포함하는 키트; 이를 이용한 수수의 세포질 웅성불임을 판별하는 방법에 관한 것이다.
식물에 있어서 잡종 강세 현상을 이용한 1대 잡종 품종 육성은 오래 전부터 계속되어 오고 있고, 현재 시판되는 채소 종자의 대부분이 F1 잡종 종자이다. F1 잡종 종자 채종 방법으로는 인공교배, 자가불화합성(self-incompatibility), 자웅주, 웅성 불임성, 종간 교잡 등이 있으나 웅성 불임성을 이용하는 방법을 제외하고는 시간, 노력, 균일도 및 경제성에서 어려운 문제가 많으므로 많은 작물에서 웅성 불임 자원을 개발하고 육종에 이용하기 위한 연구가 계속되고 있다.
웅성 불임성이란 화분, 꽃밥, 수술 등의 웅성기관에 이상이 생겨 불임이 생기는 현상으로 여러 종류의 식물에서 이러한 현상을 나타내고 있다. 이는 주로 자연돌연변이, 종속간 잡종 또는 돌연변이 유기제 처리 등에 의해 인위적 또는 자연적으로 발생하고 있다. 웅성 불임의 원인에는 유전적인 원인에 의한 것과 환경적인 원인에 의한 것이 있는데, 대부분 육종에 쓰이는 웅성 불임계통은 유전적인 원인에 의한 웅성 불임계통이다. 이러한 유전적인 원인에 의한 웅성 불임은 3가지 형으로 나눌 수 있는데 핵유전자적 웅성 불임성(Genic Male Sterility; GMS), 세포질적 웅성 불임성(Cytoplasmic Male Sterility; CMS) 및 세포질-유전자적 웅성 불임성(Cytoplasmic-Genic Male Sterility; CGMS)으로 나뉜다. CMS와 CGMS는 모두 세포질 내 미토콘드리아 이상에 의한 것인데 임성회복 유전자의 존재 여부에 따라 CMS와 CGMS를 나누기도 한다.
핵유전자적 웅성 불임성(Genic Male Sterility; GMS)은 주로 열성 유전을 하며 열성동형(homozygous recessive)인 경우에 불임성이 나타나기 때문에 이를 이용하여 F1 잡종종자를 생산하는 경우 채종포에서 50%만의 불임주를 얻을 수 있다. 그러므로 웅성 불임계의 유지 및 증식을 위해서는 각 개체들을 개화시켜 화분 생성 유무를 확인해야하는 과정이 필요하기 때문에 많은 노력과 비용이 발생된다.
한편 세포질적 웅성 불임(Cytoplasmic Male Sterility; CMS) 및 세포질-유전자적 웅성 불임(Cytoplasmic-Genic Male Sterility : CGMS)은 세포질 내 미토콘드리아에 이상이 생겨 비정상적인 화분을 생성함으로서 자가 수정 능력을 상실하는 것이기 때문에 모계 유전을 하는 특징을 가진다. CMS의 경우에는 임성회복 유전자가 없기 때문에 어느 가임계를 교배하여도 100% 불임주가 나오므로 웅성 불임계의 유지가 쉬운 장점이 있다.
관행적 육종에서는 원하는 형질의 계통을 선발하기 위해 형태학적 마커를 사용하여 왔으나 이러한 방법은 그 수에 있어서 매우 제한적이고 환경적인 요인이 작용하기 때문에 불확실하다는 단점이 있다.
따라서 최근에는 목적 형질과 연관되어 있는 DNA 마커를 이용하여 육종에 이용하는 분자 육종에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 DNA 마커의 이용은 육종 초기 세대에 선발 가능성, 환경영향 배제 및 양적 형질 분석 등을 가능하게 만들어 육종에 있어서 매우 유용하다. 실제로 많은 작물에서 이러한 DNA 마커 개발이 활발하게 이루어지고 있으며 육종의 새로운 기술로서 선발 효율을 증대시키고 있다. 웅성 불임 판별용 DNA 마커들은 대부분 유전자적 변이가 비교적 심한 미토콘드리아 DNA를 기초로 하는 분자마커이다. 그러나 미토콘드리아는 작은 반복 염기 서열(short repeat sequence)을 매개로 사용한 빈번한 유전체 재조환(recombination) 및 재배열(rearrangement)에 의해 같은 염기 서열을 가지는 유전자라 할지라도 여러 가지 형태의 서브지노믹(subgenomic) DNA로 존재하는 복잡한 구조를 가지고 있다(M. Bellaoui, et. al., Mol. Gen. Genet. 257: 177-185, 1998; M. Arrieta-Montiel et. al., Genetics, 158(2), 851-864, 2001). 또한 미토콘드리아 유전체는 양적인 차이를 보이는 여러 가지 유전자 구조가 혼재하기 때문에 DNA 마커 개발 시 유전체의 양적 차이에 의해서 웅성 불임주 및 가임주가 차이 나는 것인지에 대한 실험이 필요하다.
그러나 엽록체 DNA는 유전자적 변이가 적고 안정적인 유전을 하는 것으로 알려져 있고 특정 유전자 구조의 양적인 차이가 없다. 따라서 엽록체 DNA를 기반으로 한 웅성 불임 판별용 분자마커의 개발은 보다 안정적이고 정확한 웅성 불임 판별을 가능하게 할 수 있다(M. J. Havey, et. al., Appl Genet. 90 : 263-268, 1995; T. Motegi, et. al., Euphytica 129: 319-323, 2003). 그 예로, InDel(Insertion/deletion) 다형성에 기반한 배의 세포질 웅성불임 판별용 분자 마커(한국 등록특허 공보 제10-2199454호)에 관해 연구된 바 있으나, 수수의 세포질 웅성불임 판별을 위한 분자 마커는 현재까지 개발되지 않았는 바, 수수의 웅성불임을 판별하고 신규 수수의 F1 잡종품종을 개발하기 위한 정확도가 높은 분자 마커의 필요성이 존재하였다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 수수의 세포질 웅성불임 판별을 위한 분자 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, 엽록체 DNA로부터 유래된 인델 (InDel)마커로서 수수의 웅성불임, 가임과 관련된 유전형을 짧은 시간 내에 판별할 수 있음을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 수수의 웅성불임 판별용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는, 수수의 세포질 웅성불임 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 수수의 세포질 웅성불임을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 수수의 세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility) 판별용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, “수수의 세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility) 판별용 조성물”은 수수(Sorghum bicolor)의 여러 품종 중에서 세포질 웅성불임 여부를 판별하는 조성물을 의미한다. 즉, 상기 프라이머 세트를 이용하여 수수의 게놈 DNA를 추출 및 핵산을 증폭하여 수수의 세포질 웅성불임 인자를 판별하여, N-type인 경우 유지친으로, S-type인 경우 불임친으로 판별할 수 있다.
본 발명의 목적상 수수 세포질 웅성불임 분자마커 개발을 위하여, 공개된 수수 세포질의 엽록체 유전체 정보를 수집하고, 수집한 엽록체 유전체의 비교 분석을 수행하여 인델 마커를 발굴하였다. 본 발명의 인델 마커는 수수의 세포질 웅성불임여부 판별, 즉, 세포질 웅성불임인자가 N-type 또는 S-type인지(유지친 또는 불임친인지) 여부를 판별하는 데에 특징이 있다.
본 발명의 용어, “InDel(Insertion/deletion) 마커"는 DNA의 염기서열에서 일부 염기가 중간에 삽입되거나(insertion) 결실된(deletion) 변이를 총칭한다. 본 발명에서는 인델마커, 분자마커 또는 마커의 용어로 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 InDel 마커는 표준유전체와 실험에 사용된 품종의 유전체 정보를 비교 분석하는 방법을 통해 표준유전체보다 삽입(insertion) 또는 결실(deletion)된 영역을 탐색하고 그 정보를 바탕으로 프라이머를 제작하는 것이며, 증폭 결과는 표준유전체와 비교하여 밴드크기가 큰 경우(insertion)와 작은 경우(deletion)의 두 종류 타입을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 인델마커 2종(cp_01마커 및 cp_02마커로 명명함)을 이용하여 수수의 엽록체 염기서열을 분석한 결과, 증폭된 밴드의 크기로 각 형질간에 뚜렷한 차이점을 확인할 수 있었으며, 국내 수수 품종에서 세포질을 검정한 결과, 유지친(N-type)과 불임친(S-type)에서 현저한 차이점을 보여 수수 품종의 세포질 웅성불임 판별에 유용함을 확인할 수 있었다(표 3 및 4).
본 발명의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기세트(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서 인델(InDel)마커 증폭에 사용되는 프라이머는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드의 크기로 사용될 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 인델마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다. 또한, 프라이머는 변형될 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 치환 또는 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.
구체적으로, 상기 프라이머는 수수의 세포질 웅성불임을 판별할 수 있고, 본 발명의 목적상 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
특정 서열번호로 표현되는 염기서열 또는 아미노산 서열의 유전자와 동일 또는 상응하는 활성을 갖는 이상, 특정 서열번호로 표현되는 염기서열과 80% 이상의 상동성(homology) 또는 동일성(identity)을 갖는 서열도 본 발명의 범주에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 특정 서열번호의 염기서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가질 수 있으며, 상응하는 효능 또는 활성을 나타내는 것으로, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 서열 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된 (conserved) 폴리뉴클레오티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나 (homologous) 또는 동일한 (identical) 서열은 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상으로 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
본 발명의 수수의 세포질 웅성불임 판별용 조성물은 수수의 염기서열에서 cp_01 인델마커 또는 cp_02 인델마커를 이용하여 수수의 세포질 웅성불임을 판별하기 위한 것일 수 있다.
상기 수수의 염기서열은 수수의 엽록체 염기서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이때, 상기 인델마커 중 cp_01 인델(InDel)마커는 수수의 유전자 rpoC2와 rps2 사이 genic 영역에서 32bp InDel 부위를 의미할 수 있으며, cp_02 인델마커는 수수의 유전자 cemA와 petA 사이의 22bp InDel 영역을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 수수의 세포질 웅성불임을 판별할 수 있는 특이적 인델마커를 검출할 수 있는 프라이머를 제작하였고(표 1), 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트가, 수수품종의 세포질 웅성불임여부, 즉, 유지친인 N 인자(N-type) 또는 불임친인 S인자(S-type)를 가지고 있는지 그 유전형을 판별할 수 있음을 확인하였다(표 3 및 4).
이는, 상기 프라이머 세트 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물은 수수의 세포질 웅성불임 인자의 정확한 판별이 가능함을 확인하여, 수수의 세포질 웅성불임 판별에 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 수수의 세포질 웅성불임 판별용 조성물을 포함하는 수수의 세포질 웅성불임 판별용 키트를 제공한다,
상기 “수수의 세포질 웅성불임 판별용 조성물”은 전술한 바와 같다.
상기 마커의 유무를 측정하기 위한 프라이머, 프로브뿐만 아니라 분석방법에 적합한 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명에서 "프로브"는 공지의 방법으로 특정 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화 될 수 있는 것이라면 본 발명의 범주에 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성(homology) 또는 동일성(identity)이 높은 유전자끼리, 80% 이상, 85% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1 X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1 X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치 (mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 30℃내지 65℃, 38℃ 내지 60℃, 38℃ 내지 58℃, 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
상기 키트는 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함할 수 있으나, 본 발명의 인델 마커의 존재여부를 검출할 수 있는 프라이머 쌍이면 제한 없이 포함할 수 있다.
상기 키트는 PCR 키트, RT-PCR 키트(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction) 또는 DNA 칩 키트일 수 있으나, 수수의 세포질 웅성불임을 판별할 수 있다면 그 작동 원리나 형태에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 키트는 수수의 세포질 웅성불임 판별을 위해 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 다른 구성 성분의 일 예로, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 발색단(chromophores), 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체의 일 예로 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체의 일 예로 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 키트는 제한효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함 할 수 있으며, 상기 증폭반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 및 반응완충액을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 키트는 인델 마커의 전사부위를 탐지하기 위한 RT-PCR의 필수 요소를 포함할 수 있다. 상기 요소의 구체적인 예로, 인델 마커에 특이적인 각각의 프라이머 쌍, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), DNA 중합효소, 역전사효소, DNase 억제제, RNase 억제제, 반응완충액, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 “DNA 칩”은 수십만 개의 DNA의 각 염기를 한 번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다. 상기 DNA 칩 키트는 일반적으로 편평한 고체 지지판, 일반적으로 현미경용 슬라이드 보다 크지 않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산 및 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간의 다중 혼성화 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 수수의 세포질 웅성불임을 판별하는 방법을 제공한다. 구체적으로, (a) 대상 시료로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 수수의 세포질 웅성불임 판별용 조성물을 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및 (b) 얻어진 증폭 산물로부터 세포질 웅성불임 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 수수의 세포질 웅성불임을 판별하는 방법을 제공한다.
상기 “수수의 세포질 웅성불임 판별용 조성물”은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 “수수의 세포질 웅성불임을 판별하는 방법”은 수수의 품종 중에서 수수의 세포질웅성불임 인자(세포질 웅성불임 유전형)을 구별, 선별, 판별, 식별하는 방법을 의미한다. 상기 수수의 세포질 웅성불임을 판별하는 방법은 수수의 세포질 웅성불임 인자가 유지친인 N인자 또는 불임친인 S인자 여부를 구별, 선별, 판별 또는 식별할 수 있다면 구체적인 방법에 제한되지 않는다.
상기 수수의 세포질 웅성불임 판별은 인델마커에 의한 것일 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트에 의해 증폭되어 검출될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 증폭은 당업자에게 알려진 어떠한 방법으로도 수행될 수 있으며, 구체적인 예로 PCR, 리가제 연쇄반응(LCR), 전사증폭, 자가유지 서열 복제 또는 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA) 방법 등이 사용될 수 있다.
하나의 구체예로, 상기 단계(b)는 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 방법은 (c) 증폭 산물이 검출되는 경우에 수수의 세포질 웅성불임인자가 유지친인 N 인자 또는 불임친인 S인자인지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (c)의 증폭 산물을 검출은 전기영동, 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 또는 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트가, 증폭된 밴드의 크기로 각 형질간에 뚜렷한 차이점을 확인할 수 있었으며, 국내 수수 품종에서 세포질을 검정한 결과, 유지친(N-type)과 불임친(S-type)에서 현저한 차이점을 보여 수수 품종의 세포질 웅성불임 판별에 유용함을 확인할 수 있었다(표 3 및 4).
이는, 상기 프라이머 세트 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물은 수수의 세포질 웅성불임의 인자를 정확히 판별 가능함을 확인하여, 수수의 세포질 웅성불임 판별에 유용하게 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명의 인델 분자 마커는 수수의 웅성불임 또는 가임과 관련된 유전형을 짧은 시간 내에 판별할 수 있어 수수의 F1 잡종품종의 개발에 유용하게 사용될 수 있으며, 국내외 수수 자원을 대상으로 정확한 유전형질의 분석이 가능하다.
도 1은 수수 식물체의 엽록체 염기서열 비교 및 본원 인델마커 2종의 증폭결과를 도시한 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 세포질 타입별 수수 엽록체 유전체 분석
수수의 웅성불임 관련 후보유전자를 동정하기 위하여 대표적인 웅성불임친인(male-sterile, S) ATx623, BTx623(male-fertile, N)의 유묘기 잎을 채취하여 NucleoSpin Plant II Mini Kit (Macherey-Nagel, Germany)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
세포질의 타입별 수수 엽록체 유전체를 분석하기 위하여, Illumina Hiseq2000 장비를 이용하여 BTx623의 엽록체 서열을 분석하였다. CLC de novo assemble 프로그램을 이용한 dnaLCW 방법으로 de novo assembly 하고, 이후 엽록체 유전체 유래 contig만을 선별하고, contig를 확장, 통합, gap-filling함으로써, 엽록체 유전체를 어셈블 하였다.
완성된 엽록체 유전체 서열의 길이는 140,754bp로 나타났으며, aligned read 는 490,408개, 엽록체 유전체 average coverage는 316.16 × 로 나타났다.
ATx623 엽록체 서열 분석을 위해, reference 염기서열에 read mapping 하였다. read mappling은 CLC Assembly Cell 프로그램의 clc_mapper 명령어를 사용하여 수행하였다. 표준유전체로 하여 웅성불임친과 유지친의 염기서열 정보를 분석하였다.
실시예 2: 수수의 세포질 웅성불임 판별을 위한 분자마커 개발
상기 실시예 1에서 분석한 염기서열 정보를 통해, 웅성불임친과 유지친의 염기서열을 비교하여 삽입/결실(InDel) 부위를 찾았고, 염기서열이 비교적 안정적인 엽록체 부분에서 전기영동으로 구분 가능한 인델(InDel)마커를 개발을 위해, InDel 부위 양측 인접 염기서열을 이용하여 프라이머를 디자인하여 InDel 마커를 개발하였다.
상기 InDel 부위를 찾기 위해 세포질 엽록체 중 웅성불임 구분가능 SNP와 InDel 부위를 발굴하여 표 1에 기재하였다.
| Location | No. of SNP | No. of InDel | Total | |
| Chloroplast | Genic region | 19 | 142 | 161 |
| Intergenic region | 35 | 68 | 103 | |
| Total | 54 | 210 | 264 |
| Primers | Marker type | 서열번호 |
Sequence (5'-3') | Length (bp) | Tm | Amplicon size (bp) | Location | |
| A lines | B lines | |||||||
| cp_01 | InDel | 1 | AGAGACCCCGTTTACCCCTA | 20 | 59.8 | 270 | 242 | rpoC2 - rps2 |
| 2 | TTGTTCCGATGGAACCTTCT | 20 | 59.5 | |||||
| cp_02 | InDel | 3 | CGTGTTTGAAATTTTGGGTCT | 21 | 58.9 | 265 | 243 | cemA - petA |
| 4 | CGAGTCTGTTGTCATTCTACTGC | 23 | 59.1 | |||||
상기 표 2와 같이 유전자 rpoC2와 rps2 사이 genic 영역에서 32bp InDel 부위를 발굴하고, InDel 마커 cp_01으로 명명하였으며, 유전자 cemA와 petA 사이의 22bp InDel 영역을 발굴하여 InDel 마커 cp_02로 명명하였다. 또한, 각 ATx623, BTx623 엽록체의 염기서열을 비교한 결과 및 발굴한 indel 마커의 증폭결과는 도 1에 도시하였다.
실시예 3: 분자마커를 이용한 수수 품종의 세포질 웅성불임 판별능 확인
상기 실시예 2에서 개발한 InDel 마커의 구별성 및 활용가능성을 검정하기 위해, 첫 번째로 국외에서 개발된 웅성불임친과 유지친 10계통의 DNA를 추출하였고, 두 번째로 국내에서 육성한 품종 및 계통 6품종 1,104개체의 DNA를 추출하여 세포질 검정에 이용하였다.
상기 cp_01 및 cp_02 마커를 이용하여 국외에서 개발된 대표적인 웅성불임과 유지친 10계통 수수의 유전자형을 분석한 결과, cp_01과 cp_02 마커 모두 세포질 형질간에 뚜렷한 차이를 보여 세포질 웅성불임 판별에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다(표 3 및 표 4).
| No. | Lines | Genotypes | Cytoplasmic male sterile factor | Amplicon sizes of InDel markers (bp) | |
| cp_01 | cp_02 | ||||
| 1 | ATx630 | Male sterile line (Srfrf) | S | 270 | 265 |
| 2 | BTx630 | Maintainer line(Nrfrf) | N | 242 | 243 |
| 3 | ATx631 | Male sterile line (Srfrf) | S | 270 | 265 |
| 4 | BTx631 | Maintainer line(Nrfrf) | N | 242 | 243 |
| 5 | ATx2928 | Male sterile line (Srfrf) | S | 270 | 265 |
| 6 | BTx2928 | Maintainer line(Nrfrf) | N | 242 | 243 |
| 7 | A03017 | Male sterile line (Srfrf) | S | 270 | 265 |
| 8 | B03017 | Maintainer line(Nrfrf) | N | 242 | 243 |
| 9 | A-arg | Male sterile line (Srfrf) | S | 270 | 265 |
| 10 | B-arg | Maintainer line(Nrfrf) | N | 242 | 243 |
| Cultivars | No. of individual plants | No. of S cytoplasm | No. of N cytoplasm |
| 남풍찰 | 195 | 0 | 195 |
| 동안메 | 170 | 170 | 0 |
| 소담찰 | 236 | 236 | 0 |
| 황금찰 | 313 | 0 | 313 |
| 바르메 | 95 | 95 | 0 |
| 노을찰 | 95 | 0 | 95 |
| 총 합 | 1,104 | 501 | 603 |
상기 표 3의 결과를 통해, 본원 2종의 마커는 국내 수수 일대교잡종 육종 프로그램에 선발 마커로 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
또한, cp_01 마커로 국내 육성 수수 6품종 1,104개체를 대상으로 유전자형을 분석한 결과 표 4와 같이, 남풍찰, 황금찰, 노을찰의 세포질은 N-type으로 유지친으로 관찰되었고, 동안메, 소담찰, 바르메는 S-type인 불임친으로 판별할 수 있음을 확인하였다.
상기 결과로써, 국내 육성 수수 품종을 포함한 수수 품종에서 본원 2종의 마커(cp_01마커, cp_02마커)의 세포질 웅성불임 판별능을 확인할 수 있었다.
즉, 본원 분자 마커를 이용하여 수수 품종의 세포질 검정결과, 증폭된 밴드 크기로 각 형질간에 뚜렷한 차이점을 확인할 수 있어, 유지친(N-type)과 불임친(S-type)을 명확히 구별할 수 있음을 확인하였는 바, 본원 분자마커는 수수 품종의 세포질 웅성불임 판별에 유용하게 활용할 수 있을 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Molecular marker for discriminating cytoplasmic male sterility of
Sorghum bicolor and uses thereof
<130> KPA210115-KR
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cp_01 primer
<400> 1
agagaccccg tttaccccta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cp_01 primer
<400> 2
ttgttccgat ggaaccttct 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cp_02 primer
<400> 3
cgtgtttgaa attttgggtc t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cp_02 primer
<400> 4
cgagtctgtt gtcattctac tgc 23
Claims (10)
- 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 수수의 세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility) 판별용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 수수의 세포질 웅성불임 인자가 유지친인 N 인자(N-type) 또는 불임친인 S인자(S-type)인지 여부를 판별하는 것인, 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항의 수수의 세포질 웅성불임 판별용 조성물을 포함하는, 수수의 세포질 웅성불임 판별용 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 키트는 PCR 키트, RT-PCR(Reverse transcription Polymerase Chain Reaction) 키트 또는 DNA 칩 키트인 것인, 키트.
- (a) 대상 시료로부터 유래된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 수수의 세포질 웅성불임 판별용 조성물을 이용하여 핵산을 증폭하는 단계; 및
(b) 얻어진 증폭 산물로부터 세포질 웅성불임 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 수수의 세포질 웅성불임을 판별하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 단계 (b)는 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 게놈 DNA는 대상시료인 수수의 종자, 잎, 줄기 또는 그의 조합으로부터 유래되는 것인, 방법
- 제7항에 있어서, 상기 단계 (b)는 수수의 세포질 웅성불임 인자가 유지친인 N인자(N-type) 또는 불임친인 S인자(S-type)인지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것인, 수수의 세포질 웅성불임을 판별하는 방법.
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