KR102199454B1 - 배의 세포질 웅성불임 판별용 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 배의 세포질 웅성불임 판별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 분자마커는 개화시기에 관계없이 유엽(어린잎)의 게노믹 DNA를 이용하여 신속 정확하게 배의 세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility)을 감별할 수 있으므로, 배의 육종에 드는 비용과 시간을 절감할 수 있을 것으로 사료된다.
Description
본 발명은 배의 세포질 웅성불임 판별용 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
배는 배나무(Pyrus spp.)의 과실로, 사과와 더불어 배나무 아과에서 전 세계적으로 바나나와 감귤 다음으로 세 번째로 많은 8천만 톤이 연간 생산되고 있으며, 장미과 내에서는 연 생산량 25.2백만 톤으로 두 번째로 생산량이 많다(FAO 2013). 배나무는 대부분의 다른 과수들과 같이 파종 후 과실을 맺기까지 오랜 기간이 걸리는 유년성(幼年性)과 자가수분이 불가능한 자가불화합성(self-incompatibility)의 특성으로 인해서 육종 주기가 길다는 단점이 있다. 따라서, 육종 효율의 제고를 위해서 유용형질 연관 분자표지의 개발에 대한 요구가 높아지고 있다.
배는 1976년에 세포질 웅성불임성(cytoplasmic male sterility)의 연구가 보고되었으며, 주로 화분(pollen)의 유무로서 표현형이 나타난다(Thompson, 1976 J. Heredity, 67(6):339-346). 세포질 웅성불임은 미토콘드리아의 변이 유전자에 의해서 발생하며, 미토콘드리아 DNA는 세포질에 존재하며 모계로 유전되기 때문에, 불임 유전자를 지닌 미토콘드리아는 후대에 보존되어 유전된다. 상업적 과원에서는 재배 품종에 따라 S(웅성불임 세포질) 유전자형을 고려하여 수분수(pollinizer)를 재식하거나, 인공 수분을 시행해야 한다. 하지만, 국내 재배면적의 약 80%를 차지하는 배 품종인 '신고' (Pyrus pyrifolia cv. Niitaka) 및 신고배를 모본으로 육성된 다수의 국내 배 품종은 화분이 없거나 적다. 그러므로, 화분의 유무는 안정적인 수분수 확보를 위해 배 육종 프로그램에서 목표 형질이 될 수 있다.
한편, 한국공개특허 제1993-7002520호에는 브라시카 속 식물체에 대한 '세포질적 웅성 불임성을 부여하는 DNA 서열, 미토콘드리아 게놈, 핵 게놈, 상기 서열을 포함하는 미토콘드리아와 식물 및 잡종 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1783347호에는 SNP(Single Nucleotide polymorphism)를 기반으로 한 '배의 화분 유무 판별용 CAPS 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 미토콘드리아 DNA에서 InDel(Insertion/deletion) 다형성에 기반한 '배의 세포질 웅성불임 판별용 분자마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 화분이 있는 2개의 배 품종(미니배 및 화산)과 화분이 없는 2개의 배 품종(황금배 및 그린시스)의 염기서열을 분석하고, 미토콘드리아 DNA 비교분석을 통해 배의 화분 부재와 연관된 것으로 유추되는 InDel 다형성 영역을 탐색하였고, 탐색된 InDel 다형성 영역을 확인할 수 있는 프라이머 세트를 제작하여 PCR을 수행한 결과, 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 13 및 14;의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트가 화분이 있는 배 품종과 화분이 없는 배 품종을 명확하게 판별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 배의 세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility) 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 배의 세포질 웅성불임 판별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 배나무(Pyrus spp.) 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 배의 세포질 웅성불임을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 분자마커는 개화시기에 관계없이 유엽(어린잎)의 게노믹 DNA를 이용하여 신속 정확하게 배(pear)의 세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility)을 감별할 수 있으므로, 본 발명의 마커를 이용하면 수분수(pollinizer) 육종을 위한 교배계획에 화분의 부재를 유발할 수 있는 근원적인 원인 유전자를 가진 교배친을 미리 파악하여 배제함으로써, 배의 육종에 드는 비용과 시간을 절감할 수 있을 것으로 사료된다.
도 1은 본 발명에 이용된 유전분석 집단의 가계도로, 화분이 없는 품종을 빨간색으로 표시하였다.
도 2는 미토콘드리아 변이 영역 4곳에 대한 프라이머(표 2)를 황금배(I, 화분이 없는 배)와 미니배(Ⅱ, 화분이 있는 배)에 적용하여 PCR을 수행하고 이의 증폭산물을 아가로스 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 3은 프라이머 세트 CBpMtid03을 이용한 배 11점에 대한 PCR 증폭 및 아가로스 전기영동 결과를 보여주는 사진이다. M은 100bp DNA ladder이다. A: 신고, B: 황금배, C: 한아름 D: 그린시스, E: 조이스킨, F: 3-14-59, G: 3-9-3, H: 미니배, I: 압리, J: 바틀렛, K: 화산.
도 4는 본 발명에 사용된 배 품종 11점의 화분유무를 평가한 사진이다. A: 신고, B: 황금배, C: 한아름 D: 그린시스, E: 조이스킨, F: 3-14-59, G: 3-9-3, H: 미니배, I: 압리, J: 바틀렛, K: 화산.
도 5는 프라이머 세트 CBpMtid05 내지 CBpMtid08 (표 2)의 증폭 위치(A)와 상기 프라이머 세트를 이용하여 황금배(I)와 미니배(Ⅱ)에 적용하여 PCR을 수행하고 이의 증폭산물을 아가로스 전기영동을 통해 확인한 사진(B)이다.
도 2는 미토콘드리아 변이 영역 4곳에 대한 프라이머(표 2)를 황금배(I, 화분이 없는 배)와 미니배(Ⅱ, 화분이 있는 배)에 적용하여 PCR을 수행하고 이의 증폭산물을 아가로스 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 3은 프라이머 세트 CBpMtid03을 이용한 배 11점에 대한 PCR 증폭 및 아가로스 전기영동 결과를 보여주는 사진이다. M은 100bp DNA ladder이다. A: 신고, B: 황금배, C: 한아름 D: 그린시스, E: 조이스킨, F: 3-14-59, G: 3-9-3, H: 미니배, I: 압리, J: 바틀렛, K: 화산.
도 4는 본 발명에 사용된 배 품종 11점의 화분유무를 평가한 사진이다. A: 신고, B: 황금배, C: 한아름 D: 그린시스, E: 조이스킨, F: 3-14-59, G: 3-9-3, H: 미니배, I: 압리, J: 바틀렛, K: 화산.
도 5는 프라이머 세트 CBpMtid05 내지 CBpMtid08 (표 2)의 증폭 위치(A)와 상기 프라이머 세트를 이용하여 황금배(I)와 미니배(Ⅱ)에 적용하여 PCR을 수행하고 이의 증폭산물을 아가로스 전기영동을 통해 확인한 사진(B)이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 배의 세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility) 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
용어 '웅성불임'이란 화분(pollen), 꽃밥(anther), 수술(stamen) 등의 웅성 기관에 이상이 생겨 불임이 생기는 현상으로, 웅성불임에는 유전적 원인에 의한 것과 환경의 영향에 의한 것이 있는데, 대부분의 육종에 쓰이는 웅성 불임계통은 유전적 원인에 의한 웅성불임 계통이다. 유전적 원인에 의한 웅성불임은 크게 3가지 유형으로 나눌 수 있는데, 핵유전자 웅성불임성(genic male sterility; GMS), 세포질 웅성불임성(cytoplasmic male sterility; CMS) 및 세포질-핵유전자 웅성불임성(cytoplasmic-genic male sterility; CGMS)으로 나뉜다. 이 중, '세포질 웅성불임'은 세포질 요인에 의해 미토콘드리아가 정상적인 기능을 수행하지 못하여 비정상적인 화분을 생성함으로써 자가수정 능력을 갖지 못하는 현상을 말한다. 세포질 웅성불임성은 모계유전(maternal inheritance)이므로 어느 가임계를 교배하더라도 100% 불임주가 나오기 때문에 웅성 불임계의 유지가 쉽고 품종을 자체적으로 보호할 수 있으며, 잎이나 줄기와 같이 영양기관을 이용하는 작물에 적용하기 편리한 특성이 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 화분(pollen)이 있는 배 품종과 화분이 없는 배 품종의 미토콘드리아 DNA에서 나타난 InDel 다형성에 근거한 프라이머 세트이다.
본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 3개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 3개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 모두 포함할 수 있다. 3개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 배(Pyrus spp.)의 세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility)을 더욱 효율적으로 판별할 수 있다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 13 및 14;의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 3의 프라이머(17개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 및 서열번호 13 및 14;의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트에서, 서열번호 3, 5 및 13으로 나타낸 염기서열은 정방향 프라이머를 나타내며, 서열번호 4, 6 및 14로 나타낸 염기서열은 역방향 프라이머를 나타낸다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 배의 세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility) 판별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 프라이머 세트는 전술한 것과 같으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한,
배나무(Pyrus spp.) 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 배의 세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility)을 판별하는 방법를 제공한다.
본 발명의 방법은 배나무 식물의 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 배의 세포질 웅성불임을 판별하는 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 게놈 DNA 추출
본 발명에 이용된 배 품종 및 이의 가계도와, 화분 유무는 하기 표 1과 같다.
| Group | Accessions / 품종명 | Scientific name | Parentage |
| I (화분 없음) |
Niitaka (신고) | Pyrus pyrifolia | Amanogawa × Chojuro |
| Whangkeumbae (황금배) | P. pyrifolia | Niitaka × Nijisseiki | |
| Hanareum (한아름) | P. pyrifolia | Niitaka × Chuwhangbae | |
| Greensis (그린시스) | P. pyrifolia Х P. communis | Whangkeumbae × Bartlett | |
| Joyskin (조이스킨) | P. pyrifolia | Whangkeumbae × Waseaka | |
| 3-14-59 | P. pyrifolia Х (P. pyrifolia Х (P. pyrifolia Х P. ussuriensis)) | Whangkeumbae × Minibae | |
| 3-9-3 | P. pyrifolia Х P. bretschneideri | Whangkeumbae × Yali | |
| Ⅱ (화분있음) |
Minibae (미니배) | (P. pyrifolia Х P. ussuriensis) Х P. pyrifolia | Danbae × Kosui |
| Yali (압리) | P. bretschneideri | - | |
| Bartlett (바틀렛) | P. communis | - | |
| Whasan (화산) | P. pyrifolia | Hosui × Okusankich |
게놈 DNA의 추출을 위해 각 배나무로부터 유엽을 채취하고, 증류수로 세척한 후 개체별로 포장하여 -80℃에서 보관하였고, CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide) 방법을 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 분리한 게놈 DNA는 GBS 분석을 위해 100 ng/㎕으로 정량하였다.
실시예 2. NGS 분석을 통한 미토콘드리아 변이 분석
염기서열 분석 및 유전자형 작성을 위해 화분이 있는 2개의 배 품종(미니배 및 화산)과 화분이 없는 2개의 배 품종(황금배 및 그린시스)을 이용하였다. Illumina Hiseq2000 Sequencer의 표준 프로토콜을 따라 라이브러리의 염기서열을 해독하였다. 이후 생성된 4개 배 품종의 단편서열(read)들을 생물정보분석에 사용하여 미토콘드리아 구조를 비교하였다. 생물정보분석은 사과 'Golden delicious'의 미토콘드리아 whole genome sequence (Goremykin et al. 2012 Plant J. 71(4):615-26)를 참조 유전체로 사용하여 Burrows-Wheeler Aligner (https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btp324)를 이용하여 정렬하였다. 또한, InDel 다형성을 찾기 위해 SAMtools (http://github.com/samtools), Picard (http://broadinstitute.github.io/picard) 및 GATK ( https://software.broadinstitute.org/gatk/)를 사용하였다.
세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility, CMS) 유발 유전자의 대부분은 mtETC(mitochondrial electron transport chain) 경로에 근접하여 발생하기 때문에, 본 발명자는 NCBI 데이터베이스 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/FR714868.1?report=graph)에서 InDel 구조의 상류 및 하류 1 kbp 이내의 영역에서, cytochrome oxidase 및 ATP synthase와 같은 CMS 유발 유전자와 연관된 것으로 보고된 알려진 미토콘드리아 유전자를 검색하고자 하였다.
실시예 3. CMS 판별을 위한 분자마커 개발 및 검증
4개의 배나무 품종 간 미토콘드리아 구조 분석을 통해 4곳의 미토콘드리아 DNA 변이 후보 영역을 탐색하였고, 해당 변이가 CMS 유발과 관련되어 있는지 검증하기 위해 사과 'Golden delicious'의 미토콘드리아 whole genome sequence를 참조하여 프라이머를 제작하였다(표 2).
| 마커명 | 프라이머 염기서열(5'→3') | Tm(℃) | 예상크기(bp) |
| CBpMtid01 | F: CAATCAGGAACAGCCAGGTT (서열번호 1) | 58 | 585 |
| R: CTCTTCGGGAGACCAGTTTG (서열번호 2) | |||
| CBpMtid02 | F: TTGGTAAAGGCCACTTTTGC (서열번호 3) | 57 | 221 |
| R: TTGATCGACAACGTCGAGAG (서열번호 4) | |||
| CBpMtid03 | F: TGGAATGGAAGGCACTACAA (서열번호 5) | 58 | 490 |
| R: CCCACCCCCTAAAGTGGTAA (서열번호 6) | |||
| CBpMtid04 | F: CAAGGAACTTATCCCGAACG (서열번호 7) | 57 | 405 |
| R: ACCAAGGCAAGATCGATTCA (서열번호 8) |
PCR 혼합물 조성은 게놈 DNA 2㎕(20ng), 2×Hot Taq polymerase(GeNetbio, Korea) 5㎕, 프라이머 세트 2㎕(2 pM의 정방향 및 역방향 프라이머 각각 1㎕씩), 증류수 1㎕를 첨가하여 총 10㎕로 만들어 사용하였다. PCR 과정은 94℃에서 5분간 전-변성(pre-denaturation)을 수행하였으며, 이후 94℃에서 30초 변성, 상기 표 2에서 개시된 Tm(melting temperature) 온도에서 어닐링(annealing) 45초, 72℃에서 30초 신장(extension)의 과정을 총 35회 반복 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 7분간 신장하였다. PCR 증폭산물을 황금배와 미니배에 적용하여 다형성을 확인하였다. 그 결과, CBpMtid02 및 CBpMtid03의 증폭산물에서 화분이 없는 황금배와 화분이 풍부한 미니배 간 다형성이 확인되었다(도 2).
실시예 4. CBpMtid03 분자마커를 이용한 '신고배' 품종을 이용하여 육성한 F
1
품종의 화분 유무 분석
상기 실시예 3에서 약 800bp 크기의 증폭산물 차이를 보인 CBpMtid03 분자마커를 이용하여 배 품종 '신고'의 F1 품종 및 상기 F1 품종을 이용하여 육성된 품종들에 대하여 PCR 수행하였다. 그 결과, 도 3에 개시된 것과 같이 CBpMtid03 마커는 '신고'의 미토콘드리아 DNA를 가진 화분이 없는 모든 F1 품종 및 교배실생(레인 A 내지 G, Group I)에 대해 1,000bp이상 크기의 PCR 증폭산물을 생성한 반면, 화분이 있는 미니배, 압리, 바틀렛, 화산(레인 H 내지 K, Group Ⅱ)에 대해서 300bp 이하 크기의 PCR 증폭산물을 생성함으로써, 배의 화분 유무를 성공적으로 구분하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. CBpMtid03의 주변 염기서열의 다형성 확인
상기 실시예 3 및 4를 통해 화분이 있는 배 품종과 화분이 없는 배 품종을 명확하게 구분할 수 있는 CBpMtid03 분자마커에 대해서, 참조 유전체로 사용한 사과 'Golden Delicious' 미토콘드리아 유전체의 위치 상단과 하단에서 cox3(Cyclooxygenase 3)와 atp8(mitochondrially encoded ATP synthase membrane subunit 8) 유전자의 존재를 확인하였으며, 해당 유전자에 대한 변이를 확인하기 위하여 프라이머를 추가적으로 제작하였다(표 3).
| 마커명 | 프라이머 염기서열(5'→3') | Tm (℃) |
Physical position* (bp) Start/End |
| CBpMtid05 | F: TCCACTGTTTCGTTCCTTCA (서열번호 9) | 58 | 362,052 / 362,073 |
| R: ATACAACCGAGGCAAAGTGG (서열번호 10) | 362,888 / 362,870 | ||
| CBpMtid06 | F: CCCACCCCCTAAAGTGGTAA (서열번호 11) | 58 | 362,870 / 362,888 |
| R: GAGGAATAGTGCGGGAAGG (서열번호 12) | 363,316 / 363,298 | ||
| CBpMtid07 | F: CCTTCCCGCACTATTCCTC (서열번호 13) | 57 | 363,298 / 363,316 |
| R: TGGAATGGAAGGCACTACAA (서열번호 14) | 363,417 / 363,398 | ||
| CBpMtid08 | F: TCTCTTCCTAACGACCAAGTCA (서열번호 15) | 58 | 363,438 / 363,459 |
| R: TCAAGAATGCCTCAACTGGA (서열번호 16) | 363,953 / 363,934 |
*: Position of mitochondrial reference genome of 'Golden delicious' (Malus × domestica).
CBpMtid05와 CBpMtid08은 각각 cox3 및 atp8의 변이를 확인하기 위해 제작하였고, cox3와 atp8의 중간 영역의 변이 확인을 위해서 CBpMtid06 및 CBpMtid07을 제작하였다. 상기 분자마커를 이용하여 11점의 배를 분석한 결과, 웅성불임 세포질 후보자를 포함하고 있을 것으로 예상되는 800bp 크기의 미해독 염기서열은 CBpMtid07에 의해 그 위치를 명확하게 알 수 있었다(도 5). 상기의 결과를 통해, CBpMtid02, CBpMtid03 및 CBpMtid07 분자마커는 '신고배'의 화분 불임 유발 미토콘드리아 DNA를 가진 F1 품종 및 교배실생을 판별할 수 있는 마커로서 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있었다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Molecular marker for discriminating cytoplasmic male sterility of
Pyrus spp. and uses thereof
<130> PN19461
<160> 16
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
caatcaggaa cagccaggtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
ctcttcggga gaccagtttg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
ttggtaaagg ccacttttgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
ttgatcgaca acgtcgagag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
tggaatggaa ggcactacaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
cccaccccct aaagtggtaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
caaggaactt atcccgaacg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
accaaggcaa gatcgattca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
tccactgttt cgttccttca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
atacaaccga ggcaaagtgg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
cccaccccct aaagtggtaa 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
gaggaatagt gcgggaagg 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
ccttcccgca ctattcctc 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
tggaatggaa ggcactacaa 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 15
tctcttccta acgaccaagt ca 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 16
tcaagaatgc ctcaactgga 20
Claims (6)
- 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 배의 세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility) 판별용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는, 배의 세포질 웅성불임 판별용 프라이머 세트.
- 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 배의 세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility) 판별용 키트.
- 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 배나무(Pyrus spp.) 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 배의 세포질 웅성불임(cytoplasmic male sterility)을 판별하는 방법. - 제5항에 있어서, 상기 증폭 단계의 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 배의 세포질 웅성불임을 판별하는 방법.
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| KR20220169225A (ko) * | 2021-06-18 | 2022-12-27 | 대한민국(농촌진흥청장) | 수수의 세포질 웅성불임 판별용 분자 마커 및 이의 이용 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20100117170A (ko) * | 2009-04-24 | 2010-11-03 | 충남대학교산학협력단 | 배추의 유전자적 다중대립인자 웅성불임 유전자 Ｍｓ의 마커 및 이의 용도 |
| CN105177122A (zh) * | 2010-10-06 | 2015-12-23 | 陶氏益农公司 | 玉米细胞质雄性不育(cms)c型恢复系rf4基因、分子标志物及其用途 |
| KR101783347B1 (ko) * | 2017-06-22 | 2017-09-29 | 충북대학교 산학협력단 | 배의 화분 유무 판별용 caps 마커 및 이의 용도 |
-
2019
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Patent Citations (3)
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| KR102549388B1 (ko) | 2021-06-18 | 2023-06-29 | 대한민국 | 수수의 세포질 웅성불임 판별용 분자 마커 및 이의 이용 |
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