UA118173C2 - Спосіб ідентифікації рослини соняшнику, яка має низький вміст пальмітинової кислоти - Google Patents

Спосіб ідентифікації рослини соняшнику, яка має низький вміст пальмітинової кислоти Download PDF

Info

Publication number
UA118173C2
UA118173C2 UAA201411351A UAA201411351A UA118173C2 UA 118173 C2 UA118173 C2 UA 118173C2 UA A201411351 A UAA201411351 A UA A201411351A UA A201411351 A UAA201411351 A UA A201411351A UA 118173 C2 UA118173 C2 UA 118173C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
marker
palmitic acid
sunflower
plant
markers
Prior art date
Application number
UAA201411351A
Other languages
English (en)
Inventor
Сюеі Сюй
Менді Салліван-Гілберт
Ян Ерік Баклунд
Джеймс Т. ГЕРДЕС
Original Assignee
ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі filed Critical ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі
Publication of UA118173C2 publication Critical patent/UA118173C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/02—Methods or apparatus for hybridisation; Artificial pollination ; Fertility
    • A01H1/022—Genic fertility modification, e.g. apomixis
    • A01H1/023—Male sterility
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/14—Asteraceae or Compositae, e.g. safflower, sunflower, artichoke or lettuce
    • A01H6/1464—Helianthus annuus [sunflower]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Винахід стосується способу ідентифікації рослини або генетичного матеріалу соняшнику, які мають низький вміст пальмітинової кислоти, який включає: ампліфікацію з геномної ДНК рослини або генетичного матеріалу соняшника щонайменше одного маркера, зчепленого з низьким вмістом пальмітинової кислоти, для отримання амплікону маркера, де ампліфікація включає: змішування праймера для ампліфікації або пари праймерів для ампліфікації з нуклеїновою кислотою, виділеною з рослини або генетичного матеріалу соняшника, де праймер або пара праймерів комплементарні або частково комплементарні щонайменше частині маркера і здатні ініціювати полімеризацію ДНК ДНК-полімеразою з використанням нуклеїнової кислоти соняшнику як матриці; і виявлення щонайменше одного амплікону маркера.

Description

рослини або генетичного матеріалу соняшника щонайменше одного маркера, зчепленого з низьким вмістом пальмітинової кислоти, для отримання амплікону маркера, де ампліфікація включає: змішування праймера для ампліфікації або пари праймерів для ампліфікації з нуклеїновою кислотою, виділеною з рослини або генетичного матеріалу соняшника, де праймер або пара праймерів комплементарні або частково комплементарні щонайменше частині маркера і здатні ініціювати полімеризацію ДНК ДНК-полімеразою з використанням нуклеїнової кислоти соняшнику як матриці; і виявлення щонайменше одного амплікону маркера.
Домагання на пріоритет"
За даною заявкою запитується пріоритет за тимчасовою патентною заявкою США із серійним номером Мо 61/613383, яка подана 20 березня 2012 року.
Галузь техніки
Даний винахід стосується композицій і способів для ідентифікації рослин соняшнику, які мають низький вміст пальмітинової кислоти, де в способах використовуються молекулярні генетичні маркери для ідентифікації, селекції і/або конструювання рослин із низьким вмістом пальмітинової кислоти. Також винахід стосується рослин соняшнику, які мають низький вміст пальмітинової кислоти, які отримані способами за винаходом.
Рівень техніки
Культурний соняшник (Неїїапіпи5 аппицз5 І.) являє собою основне джерело рослинної олії у світі. У США щорічно висівають приблизно 4 мільйони акрів соняшнику, в основному в Дакотах і
Міннесоті.
Дуже швидке розширення протягом останнього десятиліття кількості акрів, засаджених соняшником у США, частково є наслідком декількох важливих розробок в галузі розведення соняшнику і поліпшення сортів, включаючи відкриття цитоплазматичної чоловічої стерильності і генів для відновлення фертильності. Це відкриття дозволило отримання гібридного соняшнику.
Отримані в такий спосіб гібриди були впроваджені на початку 1970-х років. Опис цитоплазматичної чоловічої стерильності (СМ) і генетичного відновлення фертильності у соняшнику представлений в РіскК, "Вгеедіпд апа Сепеїісв", ЗипПоу/ег Зсіеєпсе апа Тесппоіоду 279-338 (У.Р. Сапег єд. 1978).
Соняшникова олія в основному складається із пальмітинової (16:0), стеаринової (18:0), олеїнової (18:1), лінолевої (18:2) і ліноленової (18:3) жирних кислот. Хоча в рослинах існують інші незвичайні жирні кислоти, пальмітинова, стеаринова, олеїнова, лінолева і ліноленова кислоти становлять приблизно 8895 жирних кислот, які присутні у рослинних оліях, продукованих у світі. 9. С. Нагмооса, "Ріапі Асу! Гіріає: Зігисіиге, бізігіршіоп апа Апаїузів", 4 Піріав:
Зігисіцге апа Еипсіп, Р. К. біитрі апа Е. Е. Сопп ей. (1988). Пальмітинова і стеаринова кислоти являють собою насичені жирні кислоти, для яких у визначених дослідженнях було продемонстровано, що вони роблять внесок у збільшення рівня холестерину в плазмі --
Зо фактора, який бере участь у розвитку коронарної хвороби серця. Відповідно до останніх досліджень, рослинні олії із високим вмістом ненасичених жирних кислот (таких як олеїнова і лінолеїнова кислота) можуть мати здатність знижувати рівень холестерину у плазмі.
Насичені жирні кислоти, як правило, також мають вищі температури плавлення, ніж ненасичені жирні кислоти із тією ж кількістю атомів вуглецю, що приводить до проблем стійкості до низьких температур продуктів харчування, і, крім того, вони можуть додатково забезпечувати відчуття воску або жиру у роті під час вживання продукту харчування. Також відомо, що продукти харчування, виготовлені із жирів і олій, які мають менше ніж приблизно З 95 насичених жирних кислот, як правило, містять менше 0,5 грамів насичених жирів на одну порцію, і в результаті вони можуть бути маркіровані як такі, що містять "нуль насичених жирів" відповідно до сучасних правил маркірування.
У виведенні нового бажаного генетичного матеріалу рослин мається множина стадій.
Програми розведення рослин поєднують бажані ознаки двох або більше сортів або різних універсальних джерел у набір ознак для розведення, із яких виводять сорти за допомогою самозапилення і селекції бажаних фенотипів. Нові сорти оцінюють для визначення того, який із них має комерційний потенціал. Розведення рослин починається із аналізу і визначення проблем і слабостей поточного генетичного матеріалу, встановлення цілей програми і визначення конкретних задач розведення. Наступною стадією є селекція генетичного матеріалу, який має ознаки, які задовольняють мету програми. Метою є об'єднання в одному сорті поліпшеної комбінації бажаних ознак із батьківського генетичного матеріалу. Ці важливі ознаки можуть включати вищий вихід насіння, стійкість до захворювань і комах, поліпшені стебла і корені, стійкість до засухи і спеки і поліпшені агрономічні якості.
Вибір способів розведення або селекції залежить від способу розмноження рослин, наслідуваності ознаки(ознак), яка підлягає удосконаленню, і типу сорту, який використовують комерційно (наприклад, гібридний сорт РЕ, чистолінійний сорт і т. д.). Для ознак із високою наслідуваністю вибір поліпшених індивідуальних рослин, які оцінюють на одній місцевості, може бути ефективним, у той час як для ознак із низькою наслідуваністю селекція повинна бути основана на середніх значеннях, отриманих при повторюваній оцінці сімейств споріднених рослин. Популярні способи селекції звичайно включають селекцію нащадків, модифіковану селекцію нащадків, масову селекцію і рекурентну селекцію.
Складність спадкування впливає на вибір способу розведення. Розведення за допомогою зворотного схрещування використовують для передачі одного або декількох сприятливих генів для ознаки із високою наслідуваністю в бажаний сорт. Цей підхід широко використовують для виведення стійких до захворювань сортів. Для поліпшення кількісно наслідуваних ознак, контрольованих численними генами, використовують різні способи рекурентної селекції.
Використання рекурентної селекції в самозапильних культурах залежить від простоти запилення, частоти успішних гібридів після кожного запилення і кількості гібридних нащадків від кожного успішного схрещування.
Кожна програма розведення повинна включати періодичну об'єктивну оцінку ефективності методики розведення. Критерії оцінки варіюють залежно від мети і задач, однак вони повинні включати прибуток від селекції в рік (на основі порівнянь із відповідним стандартом), загальну вартість удосконалених виведених ліній і кількість успішних сортів, отриманих на одиницю вкладення (наприклад, у рік, на витрачений долар (фунт) і т. д.). Потім перспективні удосконалені виведені лінії ретельно досліджують і порівнюють із відповідними стандартами в умовах навколишнього середовища, типових для комерційної цільової площі (площ), протягом трьох років. Кандидатів для нових комерційних сортів вибирають із найкращих ліній; лінії, які все ще є дефіцитними за декількома ознаками, можна використовувати як батьківські лінії для отримання нових популяцій для подальшої селекції. Ці процеси, які приводять до кінцевої стадії маркетингу і поширення, звичайно віднімають від 8 до 12 років від часу проведення першого схрещування. Таким чином, виведення нових сортів є тривалим процесом, який вимагає точного перспективного планування, ефективного використання ресурсів і мінімальних змін напрямку.
Найважчою задачею при розведенні рослин є ідентифікація особин, які є генетично кращими. Одним із способів ідентифікації поліпшеної рослини є спостереження її характеристик щодо інших експериментальних рослин широко вирощуваного стандартного сорту. Якщо одноразове спостереження є непереконливим, повторні спостереження забезпечують кращу оцінку її генетичної цінності. Ця задача є настільки важкою, оскільки (для більшості ознак) справжня генетична цінність маскується іншими ознаками рослин, які спотворюються, або факторами навколишнього середовища.
Зо Метою виведення рослин соняшнику є виведення нових унікальних і удосконалених сортів і гібридів. Рослинник-селекціонер спочатку вибирає і схрещує дві або більше батьківських ліній, а потім проводить повторюване самозапилення і селекцію, отримуючи множину нових генетичних комбінацій. Рослинник-селекціонер, теоретично може отримати мільярди різних генетичних комбінацій за допомогою схрещування, самозапилення і мутагенезу. Такий фахівець із розведення не має прямого контролю процесів на клітинному рівні. Таким чином, два фахівця із розведення ніколи не виведуть однакові лінії або навіть подібні лінії, які мають однакові ознаки соняшнику.
Щороку рослинник-селекціонер проводить селекцію генетичного матеріалу для переходу до наступного покоління. Цей генетичний матеріал вирощують в унікальних і різних географічних, кліматичних і грунтових умовах. Потім проводять наступну селекцію під час і наприкінці сезону вирощування. Виведені сорти непередбачувані. Ця непередбачуваність є наслідком того, що селекція рослинником-селекціонером здійснюється в унікальних навколишніх умовах і не дозволяє здійснювати контроль на рівні ДНК (при використанні загальноприйнятих методик виведення), причому отримують мільйони різних можливих генетичних комбінацій. Рослинник- селекціонер, який є середнім фахівцем у даній галузі, не може передбачити кінцеві лінії, які він виводить, за винятком, можливо, дуже грубої і загальної оцінки. Аналогічно, один і той самий рослинник-селекціонер не може отримати той же самий сорт двічі із використанням тих же самих вихідних батьківських рослин і тих же самих способів селекції. Це непередбачуваним чином приводить до витрати великих кількостей ресурсів, грошових і інших витрат, щоб вивести поліпшені нові сорти соняшнику.
Виведення нових сортів соняшнику вимагає виведення і селекції сортів соняшнику, схрещування цих сортів і селекції поліпшених гібридних нащадків схрещування. Гібридні насіння отримують за допомогою схрещувань вручну між вибраними чоловічими фертильними рослинами або із використанням систем чоловічої стерильності. Ці гібриди вибирають для визначених ознак одиничних генів (наприклад, колір стручка, колір квітки, колір пушка і стійкість до гербіцидів), які вказують на те, що насіння дійсно є гібридним. Дані про батьківські лінії, а також про фенотип гібриду, впливають на рішення рослинника-селекціонера відносно того, чи продовжувати розведення із конкретним гібридним нащадком схрещування.
Чистопорідне розведення широко використовують для поліпшення самозапильних культур. бо При чистопорідному розведенні дві батьківські рослини, які мають цінні взаємодоповнюючі ознаки схрещують із отриманням потомства Гі. Популяцію Ро» отримують за допомогою самозапилення однієї або декількох рослин із покоління потомства Е:ї. Селекція найкращих особин може починатися в популяції Е2; потім, починаючи із Ез, відбирають найкращих особин у найкращих родинах. Для підвищення ефективності селекції ознак із низькою наслідуваністю, які повторюються, дослідження сімейств можна починати в поколінні Ра. На пізній стадії інбридингу (наприклад, Еє або Е?7), найкращі лінії або суміші ліній із подібними фенотипами досліджують відносно потенційного випуску в продаж як нових сортів. Масову і рекурентну селекцію можна використовувати для поліпшення популяцій або самозапильних, або культур, які перехрестнозапилюються. Генетично мінливу популяцію гетерозиготних особин можна або ідентифікувати, або створювати за допомогою схрещування декількох різних батьківських рослин. Найкращі рослини можна вибирати на основі індивідуальної переваги, видатного потомства або переважної комбінаційної здатності. Відібрані рослини схрещують для отримання нової популяції, у якій можуть бути продовжені подальші цикли селекції.
Розведення способом зворотного схрещування використовують для перенесення генів ознаки із простим і високим спадкуванням у бажаний гомозиготний сорт або інбредну лінію, яка є рекурентним батьком. Джерелом ознаки, яка підлягає перенесенню, є "донорний батько".
Очікується, що отримана рослина буде мати ознаки рекурентного батька (наприклад, сорту) і бажана ознака, перенесена із донорного батька. Після початкового схрещування особи, які мають фенотип донорної батьківської рослини, вибирають і багаторазово схрещують (піддають зворотному схрещуванню) із рекурентним батьком. Очікується, що отримана рослина буде мати ознаки рекурентної рослини і бажана ознака, перенесена із донорного батька.
При розведенні соняшнику "методика покоління одного насіння" стосується посіву сегрегуючої популяції із наступним збором зразка із одного насіння на отриману рослину і використанням зібраного зразка із одного насіння для вирощування наступного покоління. Після переходу популяції від покоління 2 до бажаного рівня інбридингу, кожна із рослин, із яких походять лінії, приведе до різним особин Рг. Кількість рослин у популяції зменшується в кожному поколінні, оскільки деякі насіння не проростають або деякі рослини не продукують щонайменше одного насіння. У результаті не усі із рослин Е», спочатку взяті як зразки, будуть представлені нащадками після завершення переходу із покоління в покоління.
У методиці із множиною насінин рослинники, які здійснюють селекцію соняшників, звичайно збирають насіння від кожної рослин у популяції і змішують їх із утворенням загальної маси.
Частину цієї загальної маси використовують для посіву наступного покоління, а частину із них зберігають. Цю методику називають модифікованим потомством одного насіння. Методику із множиною насінин використовують для економії трудових ресурсів, залучених у збір врожаю.
Значно швидше витягти насіння за допомогою техніки, ніж витягти одну насінину із кожної із рослин вручну, як у методиці із одною насіниною. Методика множини насінин також робить можливим посів тієї самої кількості насінин популяції для кожного покоління інбридингу. Для компенсації кількості рослин, які не проросли або не продукували насіння, збирають достатню кількість насінин.
Належне дослідження повинно виявляти будь-які основні помилки і встановлювати рівень переваги або поліпшення нового сорту щодо поточних сортів. На додаток до демонстрації поліпшених характеристик, повинна існувати потреба у новому сорті, який є сумісним із промисловими стандартами або який створює новий ринок збуту. У дослідженнях, які передують випуску на ринок нового сорту, повинні враховуватися витрати на дослідження і виведення, а також технічна перевага кінцевого сорту. Впровадження нового сорту може залучити додаткові витрати виробника насіння, рослинника-селекціонера, оброблювача і споживача, внаслідок спеціальних потребуючих реклами і маркетингу, дій по виробництву змінених насінин і комерційному виробництву, і освоєння нового продукту. Для сортів, які розмножуються насінням, повинно бути можливим просте і економічне отримання насіння.
Метою рослинника-селекціонера є селекція рослин і збагачення популяції рослин особинами, які мають бажані ознаки, наприклад, знижений вміст пальмітинової кислоти, в кінцевому результаті веде до збільшеного сільськогосподарського виробництва. Відповідно до вищевказаного, постійною метою рослинників-селекціонерів є виведення стабільних сортів із високим виходом, який є агрономічно доцільними. Поточні цілі включають максимізацію кількості зерен, продукованих на використовуваній землі і продовольче постачання як тварин, так і людини. Для здійснення цих цілей рослинник-селекціонер соняшнику повинен вибирати і розробляти рослини соняшнику, які мають ознаки, що приводять до поліпшених сортів найбільш економічним чином. Щоб сприяти ідентифікації і селекції особин або родин особин, які мають наслідувані ознаки, які зв'язані із маркерами, молекулярні маркери можна використовувати в бо процесі селекції за допомогою маркера (МА5).
Опис винаходу
Молекулярні маркери, які зв'язані із низьким вмістом пальмітинової кислоти, можна використовувати для спрощення селекції за допомогою маркера ознаки низького вмісту пальмітинової кислоти у соняшнику. Селекція за допомогою маркера забезпечує значні переваги стосовно часу, затрат і трудових ресурсів порівняно із фенотипуванням вмісту пальмітинової кислоти. У даному описі описані конкретні маркери, ідентифіковані як такі, що знаходяться в межах або поблизу областей ОТІ. низького вмісту пальмітинової кислоти в геномі соняшнику, які є поліморфними у батьківських генотипах і зв'язаними (наприклад, міцно зв'язаними) із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти. Ці маркери забезпечують збільшену застосовність у селекції за допомогою маркера рослин і сортів соняшнику, які мають низький вміст пальмітинової кислоти.
У даному описі описані способи ідентифікації першої рослини соняшнику, яка виявляє низький вміст пальмітинової кислоти, або генетичного матеріалу, який міститься в такій рослині соняшнику. Перша рослина соняшнику або генетичний матеріал, які виявляють низький вміст пальмітинової кислоти, у деяких прикладах можуть являти собою рослину або генетичний матеріал, які мають більш низький вміст (тобто знижений) пальмітинової кислоти, ніж у батьківській клітині або генетичному матеріалі першої рослини або генетичного матеріалу.
Перша рослина соняшнику або генетичний матеріал, які виявляють низький вміст пальмітинової кислоти, у деяких прикладах можуть являти собою рослину або генетичний матеріал, які мають нижчий вміст пальмітинової кислоти, ніж у конкретній загальноприйнятій рослині або генетичному матеріалу того ж виду (наприклад, соняшник), що і перша рослина або генетичний матеріал. Деякі варіанти здійснення таких способів можуть включати виявлення в першій рослині соняшнику або генетичному матеріалі щонайменше одного маркера, зв'язаного із низьким вмістом пальмітинової кислоти, де щонайменше один маркер вибраний із групи, яка складається із: НА0ООЗІВ; НАОЗО8; НА1Т665; НАОЗО4А; НАОВ5О; НАО743; НАОВб70; НАОЗбО;
НАОб612А і маркерів, зчеплених (наприклад, міцно зв'язаних) із будь-яким із НА0ОЗ1В, НАОЗО8,
НА1Т665, НАОЗО4А, НАОВ5О, НАО743, НАОб8В70, НАООО ії НАОб12А. Також описані способи отримання рослини соняшнику або генетичного матеріалу із низьким вмістом пальмітинової кислоти. Деякі варіанти здійснення таких способів можуть включати інтрогресію щонайменше
Зо одного маркера, зв'язаного із низьким вмістом пальмітинової кислоти із першої рослини соняшнику або генетичного матеріалу, у другу рослину соняшнику або генетичний матеріал із отриманням рослини соняшнику або генетичного матеріалу, які, імовірно, мають низький вміст пальмітинової кислоти. У таких прикладах щонайменше один маркер може бути вибраний із групи, яка складається із: НА0ОЗІВ; НАООО8; НА1665; НАОЗ0О4А; НАОВ8ф50; НАО743; НАО870;
НАОЗ907; НАОб12А; і маркерів, зчеплених із будь-яким із НА0ОЗІ1В, НАОЗО8, НА1Т665, НАОЗО4А,
НАО850, НАО743, НАО870, НАОЗУО7 ії НАОЄ1Т2А. Рослина соняшнику або генетичний матеріал, отримані зазначеними вище способами, також включені в конкретні варіанти здійснення.
Деякі варіанти здійснення включають способи отримання трансгенної рослини соняшнику.
Приклади таких способів можуть включати введення однієї або декількох екзогенної молекули(молекул) нуклеїнової кислоти в задану рослину соняшнику або її потомство, де щонайменше одна або декілька екзогенна молекула(молекул) нуклеїнової кислоти містить геномну нуклеотидну послідовність соняшнику, яка зчеплена щонайменше із одним маркером, зв'язаним із низьким вмістом пальмітинової кислоти, або де щонайменше одна із однієї або декількох молекули(молекул) нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, яка специфічно гібридизується із нуклеотидною послідовністю, яка зчеплена щонайменше із одним маркером, який зчеплений із низьким вмістом пальмітинової кислоти. Маркер, зчеплений із низьким вмістом пальмітинової кислоти, може бути вибраний із групи, яка складається із:
НА0ОЗІ1В; НАОЗО8; НА1Т665; НАОЗО4А; НАО850; НАО743; НАО8В70; НАОЗО07; НАОб12А і маркерів, зчеплених із будь-яким із НА0ООЗІВ, НАОЗО8, НА1665, НАОЗО4А, НАО8ф50, НАО743, НАОВ870,
НАОЗ07 і НАОб6Є12А. У визначених прикладах зазначених вище способів отримання трансгенної рослини соняшнику отримана трансгенна рослина соняшнику може мати низький вміст пальмітинової кислоти.
Деякі варіанти здійснення включають системи і набори для ідентифікації рослини соняшнику, яка, імовірно, має низький вміст пальмітинової кислоти. Конкретні приклади таких систем і наборів можуть включати набір зондів нуклеїнової кислоти, кожний із яких містить нуклеотидну послідовність, яка специфічно гібридизується із нуклеотидною послідовністю, яка зчеплена в соняшнику щонайменше із одним маркером, який зчеплений із низьким вмістом пальмітинової кислоти. Маркер, який зчеплений у соняшнику із низьким вмістом пальмітинової кислоти, може бути вибраний із групи, яка складається із: НА0ОЗ1В; НАОЗО8; НА1665; НАОЗО4А; 60 НАО850; НАО743; НАОВ8г70; НАОЗО7; НАОб12А, і маркерів, зчеплених із будь-яким із НАООЗ18В,
НАОЗ908, НА1Т665, НАОЗО4А, НАОВ850, НАО743, НАОВ870, НАОЗО7 і НАОЄ1Т2А. Конкретні приклади систем і наборів для ідентифікації рослини соняшнику, які, імовірно, мають низький вміст пальмітинової кислоти, також можуть включати детектор, який має таку конфігурацію, щоб виявляти один або декілька вихідних сигналів із набору зондів нуклеїнової кислоти або їх амплікона, тим самим, ідентифікуючи присутність або відсутність щонайменше одного маркера, який зчеплений із низьким вмістом пальмітинової кислоти. Конкретні приклади включають інструкції, які корелюють із присутністю або відсутністю щонайменше одного маркера із імовірним зменшенням вмісту пальмітинової кислоти.
Короткий опис креслень
На фіг. 1 представлена хроматограма СС-РІО ЕАМЕ, яка демонструє ідентифікацію піків метилового складного ефіру за допомогою порівняння із часом утримання метилового складного ефіру еталонних стандартів. Індивідуальні процентні площі обчислювали для всіх аналізованих сполук в еталонному стандарті на основі загальних інтегрованих пікових площ.
Також інжектували порожній розчин гептану для ідентифікації якого-небудь забруднення на ос.
На фіг. 2 представлене графічне зображення, яке демонструє розподіл вмісту пальмітинової кислоти в 23040 зразках. Величини, які описують цей розподіл, зазначені в таблицях 1-2, нижче.
На фіг. З представлена гістограма вмісту пальмітинової кислоти в популяції Рг для 384 особин, отриманих за допомогою схрещування елітної лінії соняшнику із лінією, яка має низький вміст пальмітинової кислоти.
На фіг. 4 представлене схематичне представлення основного локусу групи зчеплення 5 (/О5) для низького вмісту пальмітинової кислоти в соняшнику. Було виявлено, що декілька маркерів 55К міцно зчеплені або фланкують локус, як зображено.
На фіг. 5 представлена схема зчеплення між локусом низького вмісту пальмітинової кислоти і декількома маркерами 55К, яка демонструє розташування основного ОТ. низького вмісту пальмітинової кислоти для (535. Показник ГОЮ показаний на осі у, і на осі х представлена відстань маркера від локусу в СМ. Показник ГОЮ визначений із використанням протоколу множинних інтервалів за допомогою програмного забезпечення Мар ОТІ. (9. МУ. Мап Ооїеп, М.
Р. Воег, К. С. дапзеп, С. Маїєераагі (2002) Мар ОТІ 4.0: програмне забезпечення для обчислення положень ОТІ на генетичних картах, Ріапі Кезеагс! Іпіегпайопаї, У/адепіпдеп,
Нідерланди).
Спосіб(и) здійснення винаходу
І. Огляд декількох варіантів здійснення
Через ряд причин є бажаним виробництво соняшникової олії, яка має низькі рівні пальмітинової і стеаринової кислот і високі рівні олеїнової або лінолеїнової кислот. Варіанти здійснення винаходу включають, наприклад, композиції і способи для ідентифікації рослин соняшнику, які мають низький вміст пальмітинової кислоти, і/або генетичного матеріалу, який має генотип, який передбачає і визначає фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти.
Способи отримання таких рослин соняшнику і генетичного матеріалу включені у деякі варіанти здійснення. Такі способи можуть включати, наприклад, але не обмежуючись ними, інтрогресію бажаних маркерних алелів низького вмісту пальмітинової кислоти і/або способи генетичної трансформації. Рослини соняшнику і/або генетичний матеріал, отримані способами, такими як зазначені вище способи, включені у конкретні варіанти здійснення. Системи і набори для селекції рослин соняшнику, які мають низький вміст пальмітинової кислоти, і/або генетичного матеріалу, який має генотип, який передбачає або визначає фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти, також є ознакою визначених варіантів здійснення.
Ідентифікація і селекція рослин соняшнику, які мають низький вміст пальмітинової кислоти, із використанням МАБ5, можуть забезпечити ефективний і екологічно нешкідливий підхід отримання рослин із бажаним вмістом олії. Варіанти здійснення даного винаходу забезпечують ряд маркерних локусів соняшнику і хромосомних інтервалів ОТ, які демонструють статистично значущу косегрегацію із (і таким чином, передбачають і визначають) низьким вмістом пальмітинової кислоти. Виявлення цих маркерів або додаткових локусів, зчеплених із цими маркерами, які, у такий спосіб еквівалентні ним, можна використовувати в програмах селекції за допомогою маркерів для отримання рослин і генетичного матеріалу із низьким вмістом пальмітинової кислоти.
Деякі варіанти здійснення стосуються способів ідентифікації першої рослини соняшнику або генетичного матеріалу (наприклад, лінія або сорт), які мають низький вміст пальмітинової кислоти. У деяких прикладах щонайменше один алель одного або декількох маркерних локусів (наприклад, множина маркерних локусів), які зчеплені (наприклад, міцно зчеплені) із ознакою низького вмісту пальмітинової кислоти, виявляється/виявляються у першій рослині або бо генетичному матеріалі соняшнику. Маркерні локуси можуть бути вибрані із локусів, які представлені на фіг. 4, включаючи: НА0ОЗІВ, НАОбО8, НА1Т665, НАОЗО4А, НАОВ850, НАО743,
НАО870, НАОЗО7, НАОб12А і інші маркери, зчеплені щонайменше із одним із вищевказаних маркерів ОТГ.
У деяких прикладах множина маркерних локусів може бути вибрана або ідентифікована у тій же рослині або генетичному матеріалі. Усі комбінації, наприклад, НА0ОЗІ1В, НАОЗО8, НА1665,
НАОЗО4А, НАОВ5О, НАО743, НАОбВ7О, НАОЗО, НАОбІ1І2А і інших маркерів, які зчеплені щонайменше із одним із зазначених вище маркерів ОТ, можуть бути включені в множину маркерних локусів, вибраних або ідентифікованих у рослині або генетичному матеріалі.
В аспектах деяких варіантів здійснення вміст пальмітинової кислоти у рослині соняшнику можна кількісно визначати із використанням будь-якого придатного засобу або способу, відомих у даній галузі.
Скорочення:
АРІ Р - поліморфізм довжин фрагментів ампліфікації,
АН - алелеспецифічна гібридизація,
ССО - пристрій, з'єднаний із зарядом,
Е5Т - мітка експресованої послідовності,
ЕАМЕ - метиловий складний ефір жирної кислоти,
НІР - полум'яно-іонізаційний детектор, сао - газова хроматографія, | СВ - лігазна ланцюгова реакція,
Іа - група зчеплення,
І МА - замкнута нуклеїнова кислота,
ГО - логарифм (основа 10) імовірностей,
МАЗ5 - селекція за допомогою маркера,
МА5ВА - ампліфікація на основі послідовності нуклеїнової кислоти,
МІВ - ближня інфрачервона (спектроскопія),
ММЕ - ядерний магнітний резонанс (спектроскопія),
ОВЕ - відкрита рамка зчитування,
ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція,
РМА - пептид нуклеїнова кислота,
ОТІ - локус кількісних ознак,
ВАРОБ - випадковим чином ампліфікована поліморфна ДНК,
ВЕГ Р - поліморфізм довжин фрагментів рестрикції,
ВТ-ПЛР - ПЛР із зворотною транскриптазою,
ЗМР - однонуклеотидний поліморфізм,
ЗСР - одноланцюговий конформаційний поліморфізм,
ЗОНА - простий повтор послідовності.
І. Терміни
Як використовують у даній заявці, включаючи формулу винаходу, терміни в однині і форми однини включають множину об'єктів, які згадуються, якщо контекст явно не вказує на інше.
Таким чином, наприклад, вказування на "рослину" також стосується множини рослин. Більше того: залежно від контексту, використання терміна "рослина" також може стосуватися генетично подібного або ідентичного потомства цієї рослини. Аналогічно, термін "нуклеїнова кислота" може стосуватися множини копій молекули нуклеїнової кислоти. Аналогічно, термін "зонд" може стосуватися множини подібних або ідентичних молекул зондів.
Числові діапазони включають числа, які визначають діапазон, і включають кожну цілочислову і нецілочислову частку у визначеному діапазоні. Якщо немає інших вказівок, усі технічні і наукові терміни, які використовують в даному описі, мають ті ж значення, які звичайно має на увазі фахівець у даній галузі.
Щоб спростити огляд різних варіантів здійснення, описаних у даному описі, надається наступне пояснення конкретних термінів.
Виділений: "виділений" біологічний компонент (такий як нуклеїнова кислота або білок), по суті, відділений, отриманий окремо або очищений від інших біологічних компонентів у клітині організму, у якому компонент зустрічається в природі (тобто інші хромосомні і позахромосомні
ДНК ії РНК і білки), при забезпеченні хімічної або функціональної зміни компонента (наприклад, нуклеїнова кислота може бути виділена із хромосоми за допомогою руйнування хімічних зв'язків, які з'єднують нуклеїнову кислоту із іншою ДНК у хромосомі). Молекули нуклеїнової кислоти і білки, які є "виділеними", включають молекули нуклеїнової кислоти і білки, очищені стандартними способами очищення. Також термін охоплюють нуклеїнові кислоти і білки,
отримані за допомогою рекомбінантної експресії в клітині-хазяїні, а також хімічно синтезовані молекули нуклеїнової кислоти, білки і пептиди.
Популяція для картування: як використовують у межах винаходу, термін "популяція для картування" може стосуватися популяції рослин (наприклад, популяція рослини соняшнику), яку використовують для картування генів. Популяції для картування, як правило, отримують за допомогою контрольованого схрещування батьківських генотипів, наданих двома інбредними лініями. Ухвалення рішення про вибір батьківських організмів, моделювання схрещування для отримання популяції для картування і тип використовуваних маркерів залежать від гена, який підлягає картуванню, приступності маркерів і молекулярної карти. Батьківські особини для рослин у популяції для картування повинні мати достатнє варіювання ознаки за ознакою(ами), яка становить інтерес, як на рівні послідовності нуклеїнової кислоти, так і на рівні фенотипу.
Варіювання батьківської послідовності нуклеїнової кислоти використовують для відстеження подій рекомбінації в рослинах популяції для картування. Доступність інформативних поліморфних маркерів залежить від рівня варіювання послідовності нуклеїнової кислоти. Таким чином, інформативні маркери можуть не бути ідентифіковані при конкретних схрещуваннях батьківських генотипів, хоча такі маркери можуть існувати. "Генетична карта" являє собою опис взаємозв'язків генетичного зчеплення серед локусів на одній або декількох хромосомах (або групах зчеплення) у даному виді, що може бути визначене за допомогою аналізу популяції для картування. У деяких прикладах генетична карта може бути зображена у формі діаграми або таблиці. Термін "генетичне картування" може стосуватися процесу визначення взаємозв'язків зчеплення із використанням генетичних маркерів, картування популяцій, сегрегуючих по маркерах, і стандартних генетичних принципах частоти рекомбінації. "Положення на генетичній карті" стосується положення на генетичній карті (щодо навколишніх генетичних маркерів у тій же групі зчеплення або хромосомі), де конкретний маркер може зустрічатися в даного виду. Навпаки, "фізична карта геному" стосується абсолютних відстаней (наприклад, вимірюваних у парах основ або ізольованих і суміжних генетичних фрагментах, які перекриваються, ) між маркерами в даному виді. Фізична карта генів не обов'язково відображує справжню частоту рекомбінації, яка спостерігається при тестовому схрещуванні видів, між різними точками на фізичній карті.
Зо Схрещування: як використовують у межах винаходу, термін "схрещування" або "схрещений" стосується злиття гамет за допомогою запилення із утворенням потомства (наприклад, клітин, насіння і рослин). Цей термін охоплюють як статеве схрещування (тобто запилення однієї рослини іншою), так і селфінг (тобто самозапилення, наприклад, із використанням пилку і яйцеклітини тієї самої рослини).
Зворотне схрещування: для введення послідовності нуклеїнової кислоти в рослини можна використовувати способи зворотного схрещування. Спосіб зворотного схрещування широко використовується протягом десятиліть для введення нових ознак у рослини. М. Уепзеп, Еа. Ріапі
Вгеедіпда МеїподоІюоду, допп УМіеу 5 5оп5, Іпс., 1988. У типовому протоколі зворотного схрещування вихідний сорт (рекурентний батько), який становить інтерес, схрещують із другим сортом (нерекурентний батько), який містить ген, який становить інтерес, що підлягає перенесенню. Потім потомство, отримане за допомогою цього схрещування, знову схрещують із рекурентним батьком, і процес повторюють доти, доки не отримають рослину, де, по суті, усі із бажаних морфологічних і фізіологічних характеристик рекурентної батьківської рослини відтворені в перетвореній рослині, на додаток до перенесеного гена із нерекурентного батька.
Інтрогресія: як використовують у межах винаходу, термін "інтрогресія" стосується перенесення алеля на генетичному локусі в генетичний фон. У деяких варіантах здійснення інтрогресія конкретної форми алеля в локусі може відбуватися шляхом передачі алеля щонайменше одному нащадку за допомогою статевого схрещування між двома батьками того самого виду, де щонайменше один із батьків має конкретну форму алеля в його геномі.
Потомство, яке містить конкретну форму алеля, можна повторно схрещувати із лінією, яка має бажаний генетичний фон. Потомство зворотного схрещування можна вибирати для конкретної форми алеля, щоб отримати новий сорт, де конкретна форма алеля є фіксованою в генетичному фоні. У деяких варіантах здійснення інтрогресія конкретної форми алеля може відбуватися за допомогою рекомбінації двох донорних геномів (наприклад, у злитому протопласті), де щонайменше один із донорних геномів має конкретну форму алеля в його геномі. Інтрогресія може залучати передачу конкретної форми алеля, яка може являти собою, наприклад, але не обмежуючись цим, вибрану форму маркерного алеля; ОТ і/або трансген.
Генетичний матеріал: як використовують у межах винаходу, термін "генетичний матеріал" стосується генетичного матеріалу окремої рослини, групи рослин (наприклад, лінія, сорт і бо родина рослин), і клону, який походить із рослини або групи рослин. Генетичний матеріал може бути частиною організму або клітини, або він може бути окремим (наприклад, виділеним) від організму або клітини. Як правило, генетичний матеріал забезпечує генетичний матеріал із конкретним молекулярним складом, який є основою наслідуваних якостей рослини. Як використовують у межах винаходу, "генетичний матеріал" стосується клітин конкретної рослини; насіння; тканини конкретної рослини (наприклад, тканина, із якої можна вирощувати нові рослини); і частин конкретної рослини, які походять не із насіння (наприклад, листки, стебло, пилок і клітини).
Як використовують у межах винаходу, термін "генетичний матеріал" є синонімом "генетичного матеріалу" і його можна використовувати для позначення насіння (або іншого рослинного матеріалу), за допомогою якого рослину може бути розмножено. "Банк генетичного матеріалу" може стосуватися організованої колекції різного насіння або іншого генетичного матеріалу (де кожен генотип є унікально ідентифікованим), із якого можна культивувати відомий сорт, і із якого можна отримувати новий сорт. У варіантах здійснення генетичний матеріал, який використовують в способі або рослині, як описано в даному описі, походить із лінії або сорту соняшнику. У конкретних прикладах генетичний матеріал являє собою насіння лінії або сорту соняшнику. У конкретних прикладах генетичний матеріал являє собою зразок нуклеїнової кислоти із лінії або сорту соняшнику.
Ген: як використовують у межах винаходу, термін "ген" (або "генетичний елемент") може стосуватися наслідуваної геномної послідовності ДНК, яка має функціональну значущість.
Термін "ген" також можна використовувати для позначення, наприклад, але не обмежуючись цим, КДНК і/або мРНК, яка кодована наслідуваною послідовністю геномної ДНК.
Генотип: як використовують у межах винаходу, термін "генотип" стосується генетичного набору особини (або групи особин) в одному або декількох конкретних локусах. Генотип особини або групи особин визначається і описується алельними формами в одному або декількох локусах, які особина успадкувала від її батьків. Термін "генотип" також можна використовувати для позначення генетичного набору особини в одному локусі, у декількох локусах або у всіх локусах його геному. "Гаплотип" являє собою генотип особини у декількох генетичних локусах. У деяких прикладах генетичні локуси, які описані гаплотипом, можуть бути фізично і генетично зчепленими; тобто локуси можуть бути розташовані на одному і тому ж
Зо самому сегменті хромосоми.
Локус кількісних ознак: у геномі організму можуть бути картовані конкретні хромосомні локуси (або інтервали), які корелюють із конкретним кількісними фенотипами. Такі локуси називають локусами кількісних ознак або ОТ. Як використовують у межах винаходу термін "локус кількісних ознак" (ТІ) може стосуватися ділянок ДНК, які ідентифіковані як ймовірні послідовності ДНК (наприклад, гени, які не кодують послідовності і/або міжгенні послідовності), які лежать в основі кількісної ознаки або фенотипу, ступінь якого варіює, і він може позначати взаємодії між двома або більше послідовностями ДНК (наприклад, гени, які не кодують послідовності і/або міжгенні послідовності) або їх продуктами експресії і їх оточенням. Таким чином, термін "локус кількісних ознак" включає поліморфні генетичні локуси щонайменше із двома алелями, які по-різному забезпечують експресію фенотипічної ознаки щонайменше в одному генетичному фоні (наприклад, щонайменше в одній популяції для розведення або нащадку). На практиці, ОТ можна молекулярно ідентифікувати, щоб полегшити картування областей геному, які містять послідовності, залучені в забезпечення кількісної ознаки, такої як зменшений вміст пальмітинової кислоти.
Як використовують у межах винаходу, термін "інтервал ОТ" може стосуватися ділянок ДНК, які зчеплені із генами, які лежать в основі ознаки ОТ. Інтервал ОТІ звичайно, але не обов'язково, має більший розмір, ніж сам ОТ. Інтервал ОТ може містити ділянки ДНК, які знаходяться із 5'-сторони і/або 3'-сторони від ОТ.
Була розроблена множина експериментальних моделей для ідентифікації і аналізу ОТГ.
Див., наприклад, дапзеп (1996) Тгепа5 Ріапі 5сі. 1:89. Більшість із опублікованих повідомлень про картування ОТІ у сільськогосподарських культурах було основано на використанні схрещування двох батьків (Гупсп апа М/аі5п (1997) Сепеїїс5 апа Апаїувзі5 ої Оцапійайме Тгаїйв5,
Зіпацег Авз5осіаїезх, Зипадепапа). Як правило, ці моделі утягують схрещування однієї або декількох батьківських пар, які можуть являти собою, наприклад, одну пару, яка походить із двох інбредних ліній або множини споріднених або неспоріднених батьків різних інбредних штамів або ліній, кожний із який має відмінні характеристики щодо фенотипічної ознаки, яка становить інтерес. Як правило, цей експериментальний протокол залучає отримання від 100 до 300 сегрегуючих нащадків від одного схрещування двох дивергентних інбредних ліній, які, наприклад, вибрані так, щоб максимізувати фенотипічні і молекулярні відмінності маркерів між бо лініями. Батьківські рослини і сегрегуючі нащадки генотипують по множині маркерних локусів і оцінюють відносно від одного до декількох кількісних ознак (наприклад, стійкість до захворювання). Потім ОТ ідентифікують як значущі статистичні асоціації між генотипічними величинами і фенотипічною варіабельністю серед сегрегуючих нащадків. Ефективність цього експериментального протоколу є результатом використання інбредного схрещування, оскільки всі отримані батьківські організми Еї мають одну і ту ж саму фазу зчеплення (те, як алелі об'єднані в батьківському поколінні). Таким чином, після самозапилення рослин НЕ: усі сегрегуючі нащадки Р» є інформативними, і нерівновага по зчепленню є максимізованою, фаза зчеплення відома, існує тільки два алеля ОТІ і (за винятком нащадків зворотного схрещування) частота кожного алеля ОТ. становить 0,5.
Численні статистичні методи для визначення того, чи є маркери генетично зчепленими із
ОТІ (або із іншим маркером), відомі фахівцям у даній галузі і включають, наприклад, але не обмежуючись ними, стандартні лінійні моделі, такі як АМОМА чи регресійне картування (Наїеєу апа Кпой (1992) Негеййу 69:315); і способи максимальної імовірності, такі як алгоритми очікування-максимізації (наприклад, ІГападег апа Воївівїп (1989) Сепеїйс5 121: 185-99; дап5еп (1992) Тнеог. Аррі. Сепеї. 85:252-60; дапзеп (1993) Віотеїгісв 49:227-31; дапзеп (1994) "Марріпд ої доапійаййме Май осі Бу ивіпд депеїїс таКегв: ап омегміем/ ої Біотейіса! тодеїв, " У. М. мап
Оої|еп апа 9. дапзеп (єдвз.), Віотеїйнісв іп Ріапі Бгеєдіпо: арріїсайопв ої тоЇІесціаг тагКегзв, рр. 116- 24, СРВО-ОГО МеїШепапав; дЧапвоеп (1996) Сепеїйсв 142:305-11; і дапзеп апа 5Зіат (1994)
Сепеїїісв 136:1447-55).
Ілюстративні статистичні методи включають одноточковий аналіз маркерів; картування інтервалів (Іапдег апа Воїбхівїп (1989) Сепеїс5 121: 185); комбіноване картування інтервалів; регресійний аналіз із штрафами; комплексний аналіз нащадків; аналіз МСМС; аналіз МОМ (Чапзеп (1994) Сепеїйс5 138:871); аналіз НАРІ О-ІМк, аналіз НАРГО-МОМ і аналіз НАРІ О-
МОМ»; байєсівський МСМС; гребневу регресію; аналіз ідентичності по спадкуванню; і регресію
Назетап-ЕїЇв5іоп, будь-які із яких є придатними у контексті конкретних варіантів здійснення винаходу. Альтернативні статистичні методи, застосовувані для комплексних популяцій для розведення, які можна використовувати для ідентифікації і локалізації ОТ, у конкретних прикладах описані в патенті США 6399855 і міжнародній публікації патенту РСТ Мо МУ/О0149104
Аг. Усі із цих підходів вимагають великого об'єму обчислень, і їх звичайно виконують за
Зо допомогою комп'ютерної системи і спеціалізованого програмного забезпечення. Придатні статистичні пакети є доступними від різних суспільних і комерційних джерел і відомі фахівцям у даній галузі.
Маркер: хоча конкретні послідовності ДНК, які кодують білки, як правило, є висококонсервативними у виді, інші області ДНК (наприклад, некодуюча ДНК і інтрони) мають тенденцію до розвитку ії нагромадження поліморфізму, і, таким чином, можуть варіювати між особинами одного і того ж самого виду. Геномна варіабельність може мати будь-яке походження, наприклад, варіабельність може бути наслідком інсерцій, делецій, дуплікацій ДНК, елементів ДНК, які повторюються, точкових мутацій, подій рекомбінації і присутності і послідовності транспозованих елементів. Такі області можуть містити придатні молекулярні генетичні маркери. Як правило, будь-яка диференціально наслідувана поліморфна ознака (включаючи поліморфізми нуклеїнових кислот), яка сегрегує у нащадків, є потенційним маркером.
Як використовують у межах винаходу, терміни "маркер" і "молекулярний маркер" стосується нуклеотидної послідовності або кодованого нею продукту (наприклад, білка), який використовується як вихідна точка при ідентифікації зчепленого локусу. Таким чином, маркер може стосуватися гена або нуклеотидної послідовності, які можна використовувати для ідентифікації рослин, які мають конкретний алель. Маркер може бути описаний як зміна в даному геномному локусі. Генетичний маркер може являти собою коротку послідовність ДНК, таку як послідовність, яка оточує зміни однієї пари основ (однонуклеотидний поліморфізм або "ЗМР"), або довгу послідовність, наприклад, мікросателітний/простий повтор послідовності (55К"). "Маркерний алель" або "форма маркерного алеля" стосується версії маркера, яка є присутньою у конкретній особині. Термін "маркер", як використовують у межах винаходу, може стосуватися клонованого сегмента хромосомної ДНК, і він також або альтернативно може стосуватися молекули ДНК, яка комплементарна клонованому сегменту хромосомної ДНК.
Також термін стосується послідовностей нуклеїнової кислоти, комплементарних геномним маркерним послідовностям, таких як праймери і зонди нуклеїнової кислоти.
Маркер може бути описаний, наприклад, як конкретний поліморфний генетичний елемент у конкретному положенні в генетичній карті організму. Генетична карта може являти собою графічне представлення геному (або частини геному, такої як одна хромосома) де відстані між бо пізнавальними орієнтирами на хромосомі вимірюють по частоті рекомбінацій між пізнавальними орієнтирами. Генетичний пізнавальний орієнтир може являти собою будь-який тип відомих поліморфних маркерів, наприклад, але не обмежуючись ними: маркери у формі простого повтору послідовності (59К); маркери у формі поліморфізму довжин фрагментів рестрикції (ЕЕГ Р) ії маркери у формі однонуклеотидного поліморфізму (ЗМР). Як один приклад, маркери
ЗЗК можуть походити із геномних або експресованих нуклеїнових кислот (наприклад, експресовані мітки послідовності (Е5Т)).
Додаткові маркери включають, наприклад, але не обмежуючись ними, Е5Т; поліморфізми довжин ампліфікованих фрагментів (АРІ Р) (моз еї аї. (1995) Мисі. Асій5 Ке5. 23:4407; ВескКег еї аІ. (1995) Мої. Сеп. Сепеї. 249:65; МеКзет еї аІ. (1995) Мої. Сеп. Сепеї. 249:74); випадковим чином ампліфіковану поліморфну ДНК (КАРБ) і ізоферментні маркери. Ізоферментні маркери можна використовувати як генетичні маркери, наприклад, для відстеження ізоферментних маркерів або інших типів маркерів, які зчеплені із конкретним першим маркером. Ізоферменти являють собою множинні форми ферментів, які відрізняються один від одного амінокислотною послідовністю (і, таким чином, послідовностями нуклеїнової кислоти, які їх кодують). Деякі ізоферменти являють собою мультимерні ферменти, які містять субодиниці, які трохи відрізняються. Інші ізоферменти є або мультимерними, або мономерними, але відщеплені від проферменту у різних ділянках амінокислотної послідовності проферменту. Ізоферменти можуть бути охарактеризовані і проаналізовані на білковому рівні або на рівні нуклеїнової кислоти. Таким чином, у конкретних прикладах будь-який із способів на основі нуклеїнових кислот, описаних у даному описі, можна використовувати для аналізу ізоферментних маркерів. "Генетичні маркери" включають алелі, які є поліморфними у популяції, де алелі можуть бути виявлені і охарактеризовані одним або декількома аналітичними способами (наприклад, аналіз
КЕРІ Р, аналіз АРІР, аналіз ізоферментних маркерів, аналіз ЗМР і аналіз 55К). Термін "генетичний маркер" також може стосуватися генетичного локусу ("маркерний локус"), який можна використовувати як вихідну точку при ідентифікації генетично зчепленого локусу (наприклад, ОТ). Такий маркер також може бути позначений як "маркер ОТІ". Природа зазначених вище фізичних пізнавальних орієнтирів (і способи, які використовують для їх виявлення) варіює, однак всі із цих маркерів фізично відмінні один від одного (а також від множина алелів будь-якого конкретного маркера), виходячи із довжини і/або послідовності
Зо полінуклеотиду. Численні способи виявлення молекулярних маркерів і ідентифікації маркерних алелів є загальновідомими. Фахівцю в даній галузі відомий широкий діапазон протоколів для виявлення цієї варіабельності, і ці протоколи часто є специфічними до типу поліморфізму, для виявлення якого вони розроблені. Такі протоколи включають, наприклад, але не обмежуючись ними, ампліфікацію способом ПЛР; виявлення одноланцюгового конформаційного поліморфізму (55СР), наприклад, за допомогою електрофорезу; і реплікацію послідовностей (З35К), яка самопідтримується (див. Спап апа Рох (1999) Кеміему5 іп Медіса! Місгобіоіоду 10: 185-96).
Головною мотивацією для розробки технологій молекулярних маркерів із точки зору рослинників-селекціонерів є збільшення ефективності розведення за допомогою МАФб.
Молекулярний маркер, який демонструє нерівновагу по зчепленню із бажаною фенотипічною ознакою (наприклад, ОТ), забезпечує придатний інструмент для селекції бажаної ознаки в популяції рослин. Ключовими компонентами для здійснення підходу МАЗ є створення щільної (інформаційно-збагаченої) генетичної карти молекулярних маркерів у генетичному матеріалі рослин; виявлення щонайменше одного СТІ. на основі статистичних асоціацій між маркерною і фенотипічною варіабельністю; визначення набору конкретних придатних маркерних алелів на основі результатів аналізу ОТІ ; і використання і/або екстраполяція цієї інформації до поточного набору генетичного матеріалу для розведення, щоб стало можливим прийняття рішень про селекцію, виходячи із маркера.
Генетичну варіабельність, наприклад, при визначенні в популяції для картування, можна спостерігати між різними популяціями одного і того ж самого виду (наприклад, соняшник).
Незважаючи на варіабельність генетичної карти, яка може існувати між популяціями одного і того ж виду, генетична карта і інформація про маркер, отримані для однієї популяції, як правило, залишаються придатними для множини популяцій для цілей ідентифікації і/або селекції рослин і/або генетичного матеріалу, які містять ознаки, які зчеплені із маркерами, і негативної селекції рослин і/або генетичного матеріалу, які містять небажані ознаки.
Два типи маркерів, які використовуються у конкретних протоколах МА5, описаних у даному описі, являють собою маркери 55К і маркери ЗМР. Маркери 55К включають будь-який тип молекулярної гетерогенності, який приводить до варіабельності довжини послідовності нуклеїнової кислоти. Ілюстративні маркери З5К являють собою короткі (аж до декількох сотень пар основ) сегменти ДНК, які складаються із множини тандемних повторів двох або трьох бо послідовностей пар основ. Ці повторювані послідовності приводять до високополіморфних областей ДНК варіабельної довжини внаслідок низької точності реплікації (наприклад, внаслідок прослизання полімерази). 55К, імовірно, випадковим чином розподілені по геному і генетично фланкуються консервативними областями. Маркери 5З5К також можуть походити із послідовностей РНК (у формі кКДНК, часткової кДНК або Е5Т), а також геномного матеріалу.
Гетерогенність маркерів 55К робить їх високопридатними для застосування як молекулярних генетичних маркерів. Наприклад, геномна варіабельність 55К успадковується, і вона є мультиалельною, кодомінантною і відтворено виявлюваною. Поширення усі в більшому ступені складних способів виявлення на основі ампліфікації (наприклад, способи на основі ПЛР) забезпечує множину чуттєвих способів для виявлення гетерогенності нуклеотидної послідовності між зразками. Зонди (наприклад, праймери нуклеїнової кислоти) можна конструювати так, щоб вони гібридизувалися із консервативними областями, які фланкують 5ОЗЕ, і зонди можна використовувати для ампліфікації варіабельної області 55К. Амплікони різних розмірів, отримані із області 595К, мають характерні і відтворені розміри. Амплікони 55 різних розмірів, які спостерігаються на двох гомологічних хромосомах особини або різних особин у популяції рослин, визначають маркерні алелі З5К. Оскільки існує щонайменше два маркерних алелі ЗК, які продукують продукти ПЛР різних розмірів, 59К можна використовувати як маркер. (Не)рівновага по зчепленню: як використовують у межах винаходу, термін "рівновага по зчепленню" стосується ситуації де два маркери незалежно сегрегують; тобто маркери не розподіляються випадковим чином серед нащадків. Маркери, які демонструють нерівновагу по зчепленню, вважають незчепленими (незалежно від того, чи лежать вони на одній і тій же хромосомі). Як використовують у межах винаходу, термін "нерівновага по зчепленню" стосується ситуації, де два маркери сегрегують невипадковим чином; тобто маркери мають частоту рекомбінації менше 50 95 (і, таким чином, за визначенням розділені менше ніж на 50 см на одній і тій же групі зчеплення). У деяких прикладах маркери, які демонструють нерівновагу по зчепленню, вважають зчепленими.
Зчеплений, міцно зчеплений і дуже міцно зчеплений: як використовують у межах винаходу, зчеплення між генами і маркерами може стосуватися явища, коли гени або маркери на хромосомі демонструють імовірність передачі разом у наступне покоління, що піддається
Зо вимірюванню. Таким чином, зчеплення одного маркера із іншим маркером або геном можна вимірювати і/або виражати як частоту рекомбінацій. Що ближче два гени або маркери знаходяться один до одного, то ближче ця імовірність до "1". Таким чином, термін "зчеплений" може стосуватися одного або декількох генів або маркерів, які передаються разом із геном із імовірністю більше 0,5 (яка очікується внаслідок незалежної розбіжності, де маркери/гени розташовані на різних хромосомах). Коли присутність гена приводить до фенотипу у особини, маркери, які зчеплені із геном, можна називати зчепленими із фенотипом. Таким чином, термін "зчеплений" може стосуватися взаємозв'язку між маркером і геном, або між маркером і фенотипом.
Відносна генетична відстань (обумовлена по частотах кросинговера і вимірювана в сантиморганах (СМ)), як правило, пропорційно фізичній відстані (вимірюваному в парах основ), на яку два зчеплені маркери або гени відділені один від одного на хромосомі. Один сантиморган визначають як відстань між двома генетичними маркерами, які демонструє частоту рекомбінації 1 95 (тобто подія кросинговера відбувається між двома маркерами один раз кожні 100 розподілів клітин). Як правило, що ближче один маркер до іншого маркера або гена (незалежно від того, чи вимірюють відстань між ними в значеннях генетичної відстані або фізичної відстані), то більш міцно вони зчеплені. Оскільки хромосомна відстань приблизно пропорційна частоті подій рекомбінації між ознаками, існує приблизна фізична відстань, яка корелює із частотою рекомбінації. Наприклад, у соняшнику 1 СМ корелює, у середньому, приблизно із 400 т. п. н.
Таким чином, термін "зчеплений" у рамках даного винаходу може стосуватися одного або
БО декількох генів або маркерів, які фізично розташовані в межах приблизно 4,0 Мб один від одного на одній і тій же хромосомі соняшнику (тобто приблизно 10 СМ). Таким чином, два "зчеплених" гени або маркери можуть бути розділені на 4,1 Мб; приблизно на 4,0 Мб; приблизно на 3,0 Мб; приблизно на 2,5 Мб; 2,1 Мб; 2,00 Мб; приблизно на 1,95 Мб; приблизно на 1,90 Мб; приблизно на 1,85 Мб; приблизно на 1,80 Мб; приблизно на 1,75 Мб; приблизно на 1,70 Мб; приблизно на 1,65 Мб; приблизно на 1,60 Мб; приблизно на 1,55 Мб; приблизно на 1,50 Мб; приблизно на 1,45 Мб; приблизно на 1,40 Мб; приблизно на 1,35 Мб; приблизно на 1,30 Мб; приблизно на 1,25 Мб; приблизно на 1,20 Мб; приблизно на 1,15 Мб; приблизно на 1,10 Мб; приблизно на 1,05 Мб; приблизно на 1,00 Мб; приблизно на 0,95 Мб; приблизно на 0,90 Мб; приблизно на 0,85 Мб; приблизно на 0,80 Мб; приблизно на 0,75 Мб; приблизно на 0,70 Мб; 60 приблизно на 0,65 Мб; приблизно на 0,60 Мб; приблизно на 0,55 Мб; приблизно на 0,50 Мб;
приблизно на 0,45 Мб; приблизно на 0,40 Мб; приблизно на 0,35 Мб; приблизно на 0,30 Мб; приблизно на 0,25 Мб; приблизно на 0,20 Мб; приблизно на 0,15 Мб; приблизно на 0,10 Мб; приблизно на 0,05 Мб; приблизно на 0,025 Мб і приблизно на 0,01 Мб.
Як використовують у межах винаходу, термін "міцно зчеплений" може стосуватися одного або декількох генів або маркерів, які розташовані в межах приблизно 2,0 Мб один від одного на одній і тій же хромосомі. Таким чином, два "міцно зчеплених" гени або маркери можуть бути розділені на 2,1 Мб; приблизно 1,75 Мб; приблизно 1,5 Мб; приблизно 1,0 Мб; приблизно 0,9
Мб; приблизно 0,8 Мб; приблизно 0,7 Мб; приблизно 0,6 Мб; приблизно 0,55 Моб; 0,5 Мб; приблизно 0,45 Мб; приблизно 0,4 Мб; приблизно 0,35 Мб; приблизно 0,3 Мб; приблизно 0,25
Мб; приблизно 0,2 Мб; приблизно 0,15 Мб; приблизно 0,1 Мб; і приблизно 0,05 Мб.
Як використовують у межах винаходу, термін "дуже міцно зчеплений" може стосуватися одного або декількох генів або маркерів, які розташовані в межах приблизно 500 т. п. н. один від одного на одній і тій же хромосомі. Таким чином, два "дуже міцно зчеплених" гени або маркери можуть бути розділені приблизно на 600 т. п. н.; приблизно на 450 т. п. н.; приблизно на 400 т. п. н.; приблизно на 350 т. п. н.; приблизно на 300 т. п. н.; приблизно на 250 т. п. н.; приблизно на 200 т. п. н.; приблизно на 175 т. п. н.; приблизно на 150 т. п. н.; приблизно на 125 т. п. н.; приблизно на 120 т. п. н.; приблизно на 115 т. п. н.; приблизно на 110 т. п. н.; приблизно на 105 т. п. н.; 100 т. п. н.; приблизно на 95 т. п. н.; приблизно на 90 т. п. н.; приблизно на 85 т. п. н.; приблизно на 80 т. п. н.; приблизно на 75 т. п. н.; приблизно на 70 т. п. н.; приблизно на 65 т. п. н.; приблизно на 60 т. п. н.; приблизно на 55 т. п. н.; приблизно на 50 т. п. н.; приблизно на 45 т. п. н.; приблизно на 40 т. п. н.; приблизно на 35 т. п. н.; приблизно на 30 т. п. н.; приблизно на 25 т. п. н.; приблизно на 20 т. п. н.; приблизно на 15 т. п. н.; приблизно на 10 т. п. н.; приблизно на 5 т. п. н. і приблизно на 1 т. п. н.
Чим ближче конкретний маркер знаходиться до гена, який кодує поліпептид, який вносить вклад у конкретний фенотип (незалежно від того, чи вимірюється відстань у значеннях генетичної або фізичної відстані), тим міцніше зчеплений конкретний маркер із фенотипом.
Через вищесказане, буде зрозуміло, що маркери, зчеплені із конкретним геном або фенотипом, включають маркери, які міцно зчеплені, і маркери, які дуже міцно зчеплені, із геном або фенотипом. У деяких варіантах здійснення чим ближче конкретний маркер знаходиться гену,
Зо який кодує поліпептид, який забезпечує фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти (незалежно від того, чи вимірюється відстань у значеннях генетичної або фізичної відстані), тим міцніше зчеплений конкретний маркер із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти.
Таким чином, зчеплені, міцно зчеплені і дуже міцно зчеплені генетичні маркери фенотипу низького вмісту пальмітинової кислоти в соняшнику, можуть бути придатними в програмах МА5 для ідентифікації сортів соняшнику, які мають знижений вміст пальмітинової кислоти (порівняно із батьківськими сортами і/або щонайменше одним конкретним загальноприйнятим сортом), для ідентифікації рослин соняшнику, які мають знижений вміст пальмітинової кислоти і для виведення цієї ознаки в інших сортах соняшнику для зниження вмісту пальмітинової кислоти.
У деяких варіантах здійснення взаємозв'язок зчеплення між конкретним маркером і фенотипом можна виражати як "імовірності" або "імовірності із виправленням". У даному контексті, величина імовірності являє собою статистичну імовірність того, що конкретна комбінація фенотипу і присутності або відсутності конкретної форми маркерного алеля є випадковими. Таким чином, чим нижче показник імовірності, тим більшою є імовірність того, що фенотип і конкретна форма маркерного алеля будуть косегрегувати. У деяких прикладах показник імовірності може бути описаний як "значущий" або "незначущий". У конкретних прикладах показник імовірності 0,05 (р-0,05 (імовірність 5 95)) випадкової розбіжності вважається "значущим" показником косегрегації. Однак в інших прикладах значуща імовірність може являти собою будь-яку імовірність менше 50 95 (р-0,5). Наприклад, значима імовірність може бути менше 0,25; менше 0,20; менше 0,15 чи менше 0,1.
У деяких варіантах здійснення маркер, який зчеплений із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти, може бути вибраний із маркерів ОТІ. групи зчеплення 5 соняшнику, які проілюстровані на фіг. 4. У деяких варіантах здійснення маркер, який зчеплений із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти, вибраний із маркерів, які розташовані в межах приблизно 10 СМ від маркера ОТ, проілюстрованого на фіг. 4. Таким чином, маркер, який зчеплений із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти, може знаходитися, наприклад, у межах 10 СМ; 9 СМ; 8 СМ; 7 СМ; б СМ; 5 сМ;4 СМ; З СМ; 2 СМ; 1 СМ; 0,75 СМ; 0,5 СМ; 0,25 сМ або менше, від маркера ОТ, проілюстрованого на фіг. 4.
Рослинник-селекціонер, може переважно використовувати молекулярні маркери для ідентифікації бажаних особин за допомогою ідентифікації маркерних алелів, які демонструють бо статистично значущу імовірність косегрегації із бажаним фенотипом (наприклад, низький вміст пальмітинової кислоти), що виявляється як нерівновага по зчепленню. За допомогою ідентифікації молекулярного маркера або кластерів молекулярних маркерів, які косегрегують із кількісною ознакою, рослинник-селекціонер, таким чином, ідентифікує ОТ. За допомогою ідентифікації і селекції маркерного алеля (або бажаних алелів із множини маркерів), який асоціює із бажаним фенотипом, рослинник-селекціонер здатний швидко вибирати фенотип шляхом вибору належного молекулярного маркерного алеля (тобто МА5Б). Що більше молекулярних маркерів, які поміщені на генетичну карту, то більш потенційно придатною ця карта стає для проведення МА5.
Набір маркерів: як використовують у межах винаходу, "набір" маркерів або зондів стосується конкретної колекції маркерів або зондів (або даних, отриманих на її основі), яку можна використовувати для ідентифікації особин, які мають ознаку, яка становить інтерес. У деяких варіантах здійснення набір маркерів, зчеплених із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти, можна використовувати для ідентифікації рослин соняшнику, які мають низький вміст пальмітинової кислоти. Дані, які відповідають набору маркерів або набору зондів (або, дані, отримані за допомогою використання таких маркерів або зондів) можна зберігати на електронному носії. У той час як кожен маркер у наборі маркерів може бути застосовним відносно ідентифікації ознаки, індивідуальні маркери, вибрані із набору і піднаборів, які включають деякі, але не всі, маркери також можуть бути ефективними для ідентифікації особин, які містять ознаку, яка становить інтерес.
Алель: як використовують у межах винаходу, термін "алель" стосується однієї із двох або більше різних нуклеотидних послідовностей, які зустрічаються в конкретному локусі. Наприклад, перший алель може знаходитися на одній хромосомі, у той час як один алель може знаходитися на одній сгомологічній хромосомі; наприклад, як відбувається для різних хромосом гетерозиготної особини, або між різними гомозиготними або гетерозиготними особинами у популяції. У деяких варіантах здійснення конкретний алель у конкретному локусі може бути зчеплений із агрономічно бажаним фенотипом (наприклад, низький вміст пальмітинової кислоти). У деяких варіантах здійснення конкретний алель у локусі може забезпечити ідентифікацію рослин, які не містять агрономічно бажаний фенотип (наприклад, рослини із високим вмістом пальмітинової кислоти) так, що ці рослини можна усувати із програми
Зо розведення або посіву. Маркерний алель може сегрегувати із сприятливим фенотипом, таким чином, забезпечуючи користь ідентифікації рослин, які містять фенотип. "Алельна форма сегмента хромосоми" може стосуватися сегмента хромосоми, який містить нуклеотидну послідовність маркерного алеля, яка вносить вклад або зчеплена із конкретним фенотипом в одному або декількох генетичних локусах, фізично розташованих на сегменті хромосоми. "Алельна частота" може стосуватися частоти (яка виражається як частка або відсоток) у якій кожен алель є присутнім у локусі в рослині, у лінії або в популяції ліній. Таким чином, для алеля "А" диплоїдна особина із генотипом "АА", "Аа" або "аа" має алельну частоту 1,0, 0,5 або 0,0, відповідно. Алельну частоту в лінії можна оцінювати за допомогою усереднення алельних частот зразка особин цієї лінії. Аналогічно, алельну частоту в популяції ліній можна обчислювати за допомогою усереднення алельних частот ліній, які складають популяцію. Для популяції із кінцевим числом особин або ліній алельну частоту можна виражати як кількість особин або ліній (або будь-якої іншої визначеної групи), яка містить алель.
Маркерний алель "позитивно" корелює із ознакою, коли маркер зчеплений із ознакою і коли присутність маркерного алеля є показником того, що бажана ознака або форма ознаки з'являться в рослині, яка містить алель. Маркерний алель "негативно" корелює із ознакою, коли маркер зчеплений із ознакою і коли присутність маркерного алеля є показником того, що бажана ознака або форма ознаки не зустрінуться в рослині, яка містить алель. "Гомозиготна" особина має тільки одну форму алеля в даному локусі (наприклад, диплоїдна рослина має копію однієї і тієї ж форми алеля в конкретному локусі для кожної із двох гомологічних хромосом). Особина є "гетерозиготною", якщо більше однієї алельної форми присутні в даному локусі (наприклад, диплоїдна особина має одну копію першої форми алеля і одну копію другої форми алеля в даному локусі). Термін "гомогенність" стосується представників групи, які мають один і той же генотип (тобто одну і ту ж алельну частоту) в одному або декількох конкретних локусах, які становлять інтерес. Навпаки, термін "гетерогенність" стосується особин у групі, яка відрізняються по генотипі в одному або декількох локусах, які становлять інтерес.
Для ідентифікації маркерного алеля можна використовувати будь-який спосіб, який можна використовувати для характеризації нуклеотидної послідовності в даному локусі. Способи виявлення маркерного алеля включають, наприклад, але не обмежуються ними, способи бо молекулярної ідентифікації (наприклад, ампліфікація і виявлення амплікона маркера).
Наприклад, алельну форму маркера 5З5К або маркера 5МР можна виявляти за допомогою технології на основі ампліфікації. У типовому способі виявлення на основі ампліфікації маркерний локус або частину маркерного локусу ампліфікують (із використанням, наприклад,
ПЛР, ГСК ії транскрипції із використанням нуклеїнової кислоти, виділеної із рослини соняшнику, яка становить інтерес, як матрицю для ампліфікації) і отриманий ампліфікований амплікон маркера виявляють. У деяких варіантах здійснення РНК рослин можна використовувати як матрицю для реакції ампліфікації. У деяких варіантах здійснення геномну ДНК рослин можна використовувати як матрицю для реакції ампліфікації. У деяких прикладах маркер ОТІ. являє собою маркер 5МР, і виявлений алель являє собою маркерний алель 5МР, і спосіб виявлення являє собою алелеспецифічну гібридизацію (АЗН). У деяких прикладах маркер ОТІ являє собою маркер 55БК, і виявлений алель являє собою маркерний алель 55К.
Технологія АБН основана она стабільному відпалі короткого одноланцюгового олігонуклеотидного зонда із повністю комплементарною одноланцюговою нуклеїновою кислотою-мішенню. Виявлення можна проводити за допомогою виявлення ізотопної або неізотопної мітки, зв'язаної із зондом. Для кожного поліморфізму можна конструювати два або більше різних зондів А5Н, щоб вони мали ідентичні послідовності ДНК, за винятком ділянки поліморфізму. Кожен зонд може бути абсолютно гомологічний послідовності одного алеля так, що набір зондів може розрізняти усі відомі альтернативні алельні послідовності. Коли кожен зонд гібридизується із ДНК-мішенню у відповідних умовах конструювання і гібридизації зонда, невідповідність в одну основу між зондом і ДНК-мішенню перешкоджає гібридизації. Таким чином, із заданим зразком, який гомозиготний по алелю, гібридизується тільки один із альтернативних зондів. Зразки, які є гетерозиготними або гетерогенними за двома алелями, гібридизуються із обома із альтернативних зондів.
Маркери А5Н можна використовувати як домінантні маркери, де присутність або відсутність тільки одного алеля визначають по гібридизації або відсутності гібридизації тільки одного зонда.
Альтернативний алель можна встановлювати по відсутності гібридизації. У прикладах зонд АЗН і молекули-мішені можуть являти собою молекули РНК або ДНК; молекула-мішень може мати послідовність нуклеотидів будь-якої довжини, крім послідовності, яка комплементарна зонду; зонд може бути сконструйований так, щоб він гібридизувався із будь-яким ланцюгом ДНК-
Зо мішені; і розмір зонда можна варіювати, щоб він задовольняв вимогам різних умовах гібридизації.
Ампліфіковані варіабельні послідовності стосуються ампліфікованих послідовностей геному рослин, які виявляють високу варіабельність залишків нуклеїнової кислоти між представниками того самого виду. Всі організми мають варіабельні геномні послідовності і кожен організм (за винятком клону) має набір варіабельних послідовностей, який відрізняється. Після ідентифікації присутність конкретної варіабельної послідовності можна використовувати для прогнозування фенотипічних ознак. У деяких прикладах ДНК із рослини можна використовувати як матрицю для ампліфікації із праймерами, які фланкують варіабельну послідовність ДНК. Варіабельну послідовність можна ампліфікувати, а потім секвенувати.
Також і альтернативно для ідентифікації генетичних маркерів можна використовувати реплікацію послідовностей, яка самопідтримується. Реплікація послідовностей, яка самопідтримується, стосується способу ампліфікації нуклеїнових кислот із використанням послідовностей нуклеїнових кислот-мішеней, які реплікуються експоненціально іп міїго, по суті, в ізотермічних умовах, із використанням трьох ферментативних активних агентів, залучених у реплікацію ретровірусів: зворотна транскриптаза; РНК-аза Н; і ДНК-залежна РНК-полімераза. спаїгеїїї еї аїІ. (1990) Ргос. Маї). Асай. Зсі. ОБА 87: 1874. За допомогою імітації ретровірусної стратегії реплікації РНК за допомогою проміжних кКДНК, ця реакція забезпечує нагромадження копій КДНК і РНК вихідної мішені.
Дані, які відповідають виявленому маркерному алелю(ям) можуть передаватися (наприклад, електронним шляхом; і за допомогою інфрачервоної, безпровідної і оптичної передачі) на комп'ютер або носій, який зчитується комп'ютером, для аналізу або збереження.
Наприклад, праймер для ампліфікації або пара праймерів для ампліфікації можна змішувати із геномною нуклеїновою кислотою, виділеною із першої рослини або генетичного матеріалу соняшнику, де праймер або пара праймерів комплементарні або частково комплементарні щонайменше частині маркерного локусу, і праймер або пара праймерів здатні ініціювати полімеризацію ДНК ДНК-полімеразою із використанням геномної нуклеїнової кислоти соняшнику як матриці. Праймер або пара праймерів (наприклад, пара праймерів, представлена в таблиці 6) подовжуються в реакції полімеризації ДНК із використанням ДНК-полімерази і матричної геномної нуклеїнової кислоти із утворенням щонайменше одного амплікона.
"Позиційне клонування" стосується конкретної методики клонування, у якій нуклеїнову кислоту-мішень ідентифікують і виділяють по її геномній близькості до маркера. Наприклад, клон геномної нуклеїнової кислоти може включати всю або частину двох або більше хромосомних областей, які розташовані поблизу одна від одної. Якщо маркер можна використовувати для ідентифікації клону геномної нуклеїнової кислоти із геномної бібліотеки, стандартні способи, такі як субклонування і/або секвенування, можна використовувати для ідентифікації і/або виділення підпослідовностей клона, які розташовані поблизу маркера.
Локус: як використовують у межах винаходу, термін "локус" стосується положення в геномі, який відповідає характеристиці, яка піддається вимірюванню, (наприклад, ознаці) або поліморфізму. Локус ЗМР визначають за допомогою зонда, який гібридизується із ДНК, яка міститься в локусі.
Розведення за допомогою маркера: як використовують у межах винаходу, термін "розведення за допомогою маркера" може стосуватися підходу для розведення, прямо використовуваному МАБ для одного або декількох ознак (наприклад, знижений вміст пальмітинової кислоти). У сучасній практиці рослинники-селекціонери починають спроби ідентифікувати ознаки, які легко виявляються, такі як колір квіток, зовнішній вигляд оболонки насіння і варіанти ізоферментів, які зчеплені із агрономічно бажаною ознакою. Потім рослинники-селекціонери спостерігають за агрономічною ознакою в сегрегуючих популяціях для розведення шляхом спостереження за сегрегацією ознаки, яка легко виявляється. Однак для застосування у виведенні рослин доступно дуже мало цих взаємозв'язків зчеплення.
Розведення за допомогою маркера забезпечує ефективний із точки зору часу і витрат процес для удосконалення сортів рослин. Декілька прикладів застосування розведення за допомогою маркерів залучають використання ізоферментних маркерів. Див., наприклад,
Тапквівеєу апа Опоп, єдз. (1983) Іволутез іп Ріапі Вгеєдіпуд апа Сепеїїс5, Атвівегдат: ЕІвемівг.
Одним прикладом є ізоферментний маркер, асоційований із геном стійкості до паразитичних круглих черв'яків у томаті. Ген, який контролює стійкість, що позначається як Мі, локалізований на хромосомі б томата і дуже міцно зчеплений із Арзі, ізоферментів кислою фосфатазою.
Застосування ізоферментного маркера Арб5хі для непрямої селекції гена Мі забезпечує переваги, які полягають у тому, що сегрегацію в популяції можна визначати однозначно за допомогою
Зо стандартних електрофоретичних способів; ізоферментний маркер можна оцінювати в тканині проростків, що усуває необхідність у підтримці рослин до дозрівання; і кодомінантність ізоферментних маркерних алелів дозволяє розрізнити гомозиготи і гетерозиготи. Див. Кіск (1983), ТапкоіІєу апа Огпіоп, вище.
Зонд: у деяких варіантах здійснення присутність маркера в рослині можна виявляти із використанням зонда нуклеїнової кислоти. Зонд може являти собою молекулу ДНК або молекулу РНК. РНК-зонди можна синтезувати способами, відомими в даній галузі, наприклад, із використанням молекули ДНК-матриці. Зонд може містити всю або частину нуклеотидної послідовності маркера і додаткову суміжну нуклеотидну послідовність із геному рослин. Це позначається в даному описі як "суміжний зонд". Додаткова суміжна нуклеотидна послідовність позначається як "вищерозташована" або "нижчерозташована" щодо вихідного маркера, залежно від суміжної нуклеотидної послідовності із хромосоми рослин, і знаходиться із 5'- сторони із 3'-сторони вихідного маркера, як добре зрозуміло. Як зрозуміло фахівцю в даній галузі, процес отримання додаткової суміжної нуклеотидної послідовності для включення в маркер можна повторювати практично до нескінченності (обмежуючись тільки довжиною хромосоми), тим самим, ідентифікуючи додаткові маркери уздовж хромосоми.
Послідовність олігонуклеотидного зонда можна отримувати способами синтезу або за допомогою клонування. Придатні вектори для клонування добре відомі фахівцям у даній галузі.
Олігонуклеотидний зонд може бути міченим або неміченим. Існує широка множина способів мічення молекул нуклеїнової кислоти, включаючи, наприклад, але не обмежуючись ними: радіоактивне мічення за допомогою нік-трансляції; використання випадкових праймерів; добудовування термінальної дезокситрансферази і т. п., де використовувані нуклеотиди є міченими, наприклад, радіоактивним ЗР. Інші мітки, які можна використовувати, включають, наприклад, але не обмежуючись ними: флуорофори (наприклад, ГАМ і МІС); ферменти; субстрати ферментів; кофактори ферментів; інгібітори ферментів; і т. п. Альтернативно використання мітки, яка забезпечує сигнал, який піддається виявленню, сама по собі або разом із іншими реакційноздатними агентами, можна заміняти лігандами, із якими зв'язуються рецептори, де рецептори є міченими (наприклад, зазначеними вище мітками), щоб забезпечити сигнали, які піддаються виявленню, або самостійно, або разом із іншими реагентами. Див., наприклад, Г еагу єї аї. (1983) Ргос. Маїй!. Асад. сі. ОБА 80:4045-9.
Зонд може містити нуклеотидну послідовність, яка не є суміжною із послідовністю вихідного маркера; цей зонд позначають у даному описі як "несуміжний зонд". Послідовність несуміжного зонда розташована досить близько до послідовності вихідного маркера на геномі так, що несуміжний зонд генетично зчеплений із тим же геном або ознакою (наприклад, низький вміст пальмітинової кислоти). Наприклад, у деяких варіантах здійснення, несуміжний зонд розташований у межах приблизно 10 СМ; 9 СМ; 8 СМ; 7 СМ; 6 см; 5 сМ;4 СМ; З СМ; 2 СМ; 1 см; 0,75 СМ; 0,5 сМ; 0,25 СМ або менше від маркера ОТГ, проілюстрованого на фіг. 4.
Зонд може являти собою точну копію маркера, який підлягає виявленню. Зонд також може являти собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка містить або складається із нуклеотидної послідовності, яка, по суті, ідентична клонованому сегменту хромосомної ДНК розглянутого організму (наприклад, соняшнику). Як використовують у межах винаходу, термін "по суті, ідентичний" може стосуватися нуклеотидних послідовностей, які є більше ніж на 8595 ідентичними. Наприклад, по суті, ідентична нуклеотидна послідовність може бути на 85,5 95; 86 бо; 87 бо; 88 бо; 89 бо; 90 бо; 91 бо; 92 бо; 93 бо; 94 бо; 95 бо; 96 бо; 97 бо; 98 бо; 99 95 або 99,5 о ідентичною еталонній послідовності.
Зонд також може являти собою молекулу нуклеїнової кислоти, яка "специфічно гібридизується" або "специфічно комплементарна" точній копії маркера, який підлягає виявленню ("ДНК-мішень"). "Специфічно гібридизуючий" і "специфічно комплементарний" являють собою терміни, які вказують на достатній ступінь комплементарності, щоб між молекулою нуклеїнової кислоти і ДНК-мішенню відбувалося стабільне і специфічне зв'язування.
Молекула нуклеїнової кислоти не повинна бути на 100 95 комплементарною її послідовності- мішені, щоб бути специфічно гібридизованою. Молекула нуклеїнової кислоти є специфічно гібридизованою, коли існує достатній ступінь комплементарності, щоб уникнути неспецифічного зв'язування нуклеїнової кислоти із послідовностями, які не є мішенню в умовах, коли є бажаним специфічне зв'язування, наприклад, у жорстких умовах гібридизації.
Умови гібридизації, які забезпечують конкретні ступені жорсткості, варіюють, залежно від типу вибраного способу гібридизації і композиції і довжини гібридизованих послідовностей нуклеїнових кислот. Як правило, жорсткість гібридизації визначається температурою гібридизації і іонною силою (особливо концентрацією Ма" і/або Мод") буфера для гібридизації,
Зо хоча також на жорсткість впливає кількість разів промивання. Обчислення, які стосуються умов гібридизації, необхідних для досягнення конкретних ступенів жорсткості, відомі середнім фахівцям у даній галузі, і розглянуті, наприклад, у Затбгоок еї аї. (еа.) МоїІесшаг Сіопіпд: А
І арогаїогу Мапиаї, 2па ед., мої. 1-3, Соїд 5ргіпд Набог І арогаюгу Ргез5, Соїд бргіпу Нагбог, МУ, 1989, спаріег5 9 апа 11; ії Натез апа Ніддіп5 (еаз.) Мисієїс Асіа Нубгіаігацоп, ІК! Ргез55, Охіога, 1985. Подальша детальна інструкція і керівництво стосовно гібридизації нуклеїнових кислот можуть бути знайдені, наприклад, у Тіі55еп, "Омегмієму ої ргіпсіріез ої пубгіадіганоп апа пе 5ігаїеду ої писівїс асій ргобе аззаув", І арогаїогу Тесппідоез іп Віоспетівігу апа МоїІесшіаг Віоіоду-
Нубгіаігайоп м/їй Мисієїс Асій Ргобрев, Раїі І, Спаріег 2, ЕІбеміег, МУ, 1993; ії А!Ммзибеї еї аї., Еав.,
Ситепі Ргоїосоіїв іп МоїІєсшіаг Віоіоду, Спарієї 2, Стеєпе Рибріїзпіпуд апа УмМіеу-Іпівгвсієпсе, МУ, 1995.
Як використовують у межах винаходу, "жорсткі умови" охоплюють умови, при яких гібридизація відбувається, тільки, якщо існує менше 50 95 невідповідностей гібридизованих молекулою і ДНК-мішенню. "Жорсткі умови" включають інші конкретні рівні жорсткості. Таким чином, як використовують у межах винаходу, умови "помірної жорсткості" являють собою умови, у яких молекули із більше ніж 50 95 невідповідністю послідовностей не гібридизуються; умови "високої жорсткості" являють собою умови, у яких послідовності із більше ніж 20 95 невідповідностей не гібридизуються; і умови "дуже високої жорсткості" являють собою умови, при яких послідовності із більше ніж 10 95 невідповідностей не гібридизуються.
Нижче представлені типові необмежуючі умови гібридизації.
Умови дуже високої жорсткості (виявляють послідовності, які мають щонайменше 90 95 ідентичності послідовностей): гібридизація в 5х буфері 55С при 65 "С протягом 16 годин; промивання два рази в 2х буфері 55С при кімнатній температурі протягом 15 хвилин щораз; і промивання два рази в 0,5х буфері 55 при 65 "С протягом 20 хвилин щораз.
Умови високої жорсткості (виявляють послідовності, які мають щонайменше 80 95 ідентичності послідовностей): гібридизація в 5х-бх буфері 55С при 65-70 "С протягом 16-20 годин; промивання два рази в 2х буфері 55С при кімнатній температурі протягом 5-20 хвилин щораз; і промивання два рази в їх буфері 55С при 55-70 "С протягом 30 хвилин щораз.
Умови помірної жорсткості (виявляють послідовності, які мають щонайменше 50 95 ідентичності послідовностей): гібридизація в бх буфері 55С при температурі від кімнатної температури до 55 "С протягом 16-20 годин; промивання щонайменше два рази в 2х-3х буфері
ЗЗС при температурі від кімнатної температури до 55 "С протягом 20-30 хвилин щораз.
Що стосується всіх розглянутих вище зондів, зонд може містити додаткові послідовності нуклеїнової кислоти, наприклад, промотори; сигнали транскрипції і/або векторні послідовності.
Будь-який із зондів, розглянутих вище, можна використовувати для визначення додаткових маркерів, які зчеплені із геном, залученим у знижений вміст пальмітинової кислоти в соняшнику, і маркери, ідентифіковані таким чином, можуть бути еквівалентні ілюстративним маркерам, названим у даному описі, і таким чином, вони входять в обсяг винаходу.
Ідентичність послідовностей: термін "ідентичність послідовностей" або "ідентичність", як використовують у межах винаходу у контексті двох послідовностей нуклеїнових кислот або поліпептидів, може стосуватися залишків у двох послідовностях, які є однаковими при вирівнюванні на максимальну відповідність протягом зазначеного вікна порівняння.
Як використовують у межах винаходу, термін "відсоток ідентичності послідовностей" може стосуватися величини, обумовленої шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей (наприклад, послідовностей нуклеїнових кислот) протягом вікна порівняння, де частина послідовності у вікні порівняння може містити вставки або делеції (тобто пропуски) порівняно із еталонною послідовністю (яка не містить вставок або делецій) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Відсоток обчислюють шляхом визначення кількості положень, у яких ідентичний нуклеотидний або амінокислотний залишок зустрічається у обох послідовностях із отриманням кількості положень, які співпали, розподілу кількості положень, які співпали, на загальну кількість положень у вікні порівняння, і множення результату на 100 із отриманням відсотка ідентичності послідовностей.
Способи вирівнювання послідовностей для порівняння добре відомі в даній галузі. Різні програми і алгоритми вирівнювання описані, наприклад, у: 5тйй апа Улагегтап (1981) Аду. Аррі.
Май. 2:482; Мевдіеєтап апа М/ип5сп (1970) 9. Мої. Віої. 48:443; Реагзоп апа ІГіртап (1988) Ргос.
Май. Асай. сі. 0.5.А. 85:2444; Ніддіп5 апа ЗНнагр (1988) Сепе 73:237-44; Ніддіпв апа Зпагр (1989) САВІО5 5:151-3; Согреї єї а!. (1988) Мисієїс Асіаз Рез. 16:10881-90; Ниапо еї аї. (1992)
Сотр. Аррі. Віозсі. 8:155-65; Реагзоп сеї аї. (1994) Меїнподз» Мої. Віо!. 24:307-31; Тайапа еї аї. (1999) ЕЕМ5 Місгобіо!. І ей. 174:247-50. Докладний опис способів вирівнювання послідовностей і
Зо обчислення гомології може бути знайдено, наприклад, у Айб5спи! еї аЇ. (1990) 9. Мої. Віої. 215:403-10.
Вавіс І оса! Аїїдптепі беагсп Тоо! (ВГАБТ"М; Ай5спці еї аїЇ. (1990)) від Майопа! Сепіег ог
ВіотесппоЇоду Іптогтайоп (МСВІ) доступний із декількох джерел, у тому числі Маїопаї! Сепіег ог
Віотесппоіоду Іптоптацйоп (ВеШезаа, МО), і через інтернет, для застосування разом із декількома програмами аналізу послідовностей. Опис того, як визначати ідентичність послідовностей із використанням цієї програми, доступно через інтернет у розділі "пер" для ВГАБТ"М. Для порівнянь послідовностей нуклеїнових кислот можна використовувати функцію "Віабї 2 зедиєпсев" програми ВІ А5Т"М (Віазіп) із використанням матриці ВГ О5ИМб2 за замовчуванням із параметрами за замовчуванням. Послідовності нуклеїнових кислот із вищою подібністю із еталонними послідовностями будуть демонструвати збільшення процентної ідентичності при оцінці цим способом.
Молекула нуклеїнової кислоти: як використовують у межах винаходу, термін "молекула нуклеїнової кислоти" може стосуватися полімерної форми нуклеотидів, яка може включати як смисловий, так і антисмисловий ланцюги РНК, кДНК, геномної ДНК, і їх синтетичні форми і змішані полімери. Нуклеотид може стосуватися рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду або модифікованої форми будь-якого типу нуклеотиду. "Молекула нуклеїнової кислоти", як використовують у межах винаходу, є синонімом "нуклеїнової кислоти" і "полінуклеотиду". Термін включає одноланцюгові і дволанцюгові форми ДНК. Молекула нуклеїнової кислоти може включати нуклеотиди або які зустрічаються в природі, або які модифіковані, або і ті, і інші, зв'язані разом нуклеотидними зв'язками, які зустрічаються в природі і/або не зустрічаються в природі. "Екзогенна" молекула являє собою молекулу, яка не є нативною для визначеної системи (наприклад, генетичний матеріал, сорт, елітний сорт і/або рослина) відносно нуклеотидної послідовності і/або положення полінуклеотиду в геномі, і відносно амінокислотної послідовності іабо клітинної локалізації поліпептиду. У варіантах здійснення екзогенні або гетерологічні полінуклеотиди або поліпептиди можуть являти собою молекули, які штучним чином надані біологічній системі (наприклад, клітина рослини, ген рослини, конкретний вид або сорт рослин, іМабо хромосома рослини) і вони не є нативними для конкретної біологічної системи. Таким чином, позначення нуклеїнової кислоти як "екзогенна" може вказувати на те, що нуклеїнова 60 кислота походить із джерела, відмінного від природного джерела, або воно може вказувати на те, що нуклеїнова кислота має неприродну конфігурацію, генетичне положення або розташування елементів.
Навпаки, наприклад, "нативна" або "ендогенна" нуклеїнова кислота являє собою нуклеїнову кислоту (наприклад, ген), яка не містить елемент нуклеїнової кислоти, відмінний від елементів, у нормі присутніх у хромосомі або іншому генетичному матеріалі, у якому нуклеїнова кислота в нормі зустрічається в природі. Транскрипт ендогенного гена кодується нуклеотидною послідовністю в її природному хромосомному локусі і не надається штучним чином клітині.
Термін "рекомбінантний" стосується матеріалу (наприклад, рекомбінантна нуклеїнова кислота, рекомбінантний ген, рекомбінантний полінуклеотид і/або рекомбінантний поліпептид), який змінений за допомогою втручання людини Наприклад, розташування частин або елементів рекомбінантної молекули може не бути нативним розташуванням і/або первинна послідовність рекомбінантної молекули може бути зміненою відносно її нативної послідовності яким-небудь чином. Матеріал може бути змінений так, щоб отримати рекомбінантний матеріал, який знаходиться в його природному оточенні або стані, або витягнутий із його природного оточення або стану. Відкрита рамка зчитування нуклеїнової кислоти є рекомбінантною, якщо нуклеотидна послідовність відкритої рамки зчитування вилучена із її природного контексту і клонована в будь-який тип штучної нуклеїнової кислоти (наприклад, вектор). Протоколи і реагенти для отримання рекомбінантних молекул, особливо рекомбінантних нуклеїнових кислот, поширені і є стандартними в даній галузі. Термін "рекомбінантний" також у даному описі може стосуватися клітини або організму, які містять рекомбінантний матеріал (наприклад, рослина і/або клітина рослини, які містять рекомбінантну нуклеїнову кислоту). У деяких прикладах рекомбінантний організм являє собою трансгенний організм.
Як використовують у межах винаходу, термін "введений" при вказівці на переміщення гетерологічної або екзогенної нуклеїнової кислоти в клітину, стосується включення нуклеїнової кислоти в клітину із використанням будь-якої методології, доступної в даній галузі. Цей термін охоплює способи введення нуклеїнової кислоти, які включають, наприклад, але не обмежувані ними, трансфекцію; трансформацію і трансдукцію.
Вектор: як використовують у межах винаходу, термін "вектор" стосується полінуклеотиду або інших молекул, які здатні переносити щонайменше один сегмент(и) нуклеїнової кислоти в
Зо клітину. Вектор необов'язково може містити компоненти/елементи, які опосередковують підтримку вектора і забезпечують його передбачуване застосування (наприклад, послідовності, необхідні для реплікації, гени, які передають стійкість до лікарського засобу або антибіотика, ділянка множинного клонування і/або функціонально зв'язані промоторні/енхансерні елементи, які забезпечують експресію клонованого гена). Вектори можуть походити, наприклад, із плазмід, бактеріофагів або вірусів рослин або тварин. "Клонуючий вектор", "човниковий вектор" або "субклонуючий вектор", як правило, включає функціонально зв'язані елементи, які полегшують стадії клонування або субклонування (наприклад, ділянка множинного клонування, яка містить множину ділянок ендонуклеази рестрикції).
Термін "експресуючий вектор", як використовують у межах винаходу, стосується вектора, який містить функціонально зв'язані полінуклеотидні послідовності, які можуть сприяти експресії кодуючої послідовності у конкретному організмі-хазяїні. Наприклад, бактеріальний експресуючий вектор може сприяти експресії кодуючої послідовності у бактерії. Експресуючий вектор рослин може сприяти експресії кодуючої послідовності у клітині рослини.
Полінуклеотидні послідовності, які сприяють експресії в прокаріотах, можуть включати, наприклад, але не обмежуючись ними, промотор; оператор і ділянку зв'язування рибосом.
Еукаріотичні експресуючі вектори (наприклад, експресуючий вектор рослин) містять промотори, енхансери, сигнали термінації і поліаденілювання (і інші послідовності), які, як правило, відрізняються від послідовностей, які використовуються у прокаріотичних експресуючих векторах.
Однонуклеотидний поліморфізм: як використовують у межах винаходу, термін "однонуклеотидний поліморфізм" (ЗМР) може стосуватися варіювання послідовності ДНК, коли один нуклеотид у геномі (або іншій загальній послідовності) відрізняється між представниками виду або парними хромосомами в особини. У популяції «МР може бути привласнена частота мінорного алеля, яка являє собою найбільш низьку алельну частоту в локусі, яка спостерігається в конкретній популяції. Вона просто є меншою із двох алельних частот для однонуклеотидних поліморфизмів. Очікується, що різні популяції будуть виявляти щонайменше алельні частоти, які трохи відрізняються. Конкретні популяції можуть виявляти алельні частоти, які значно відрізняються. У деяких прикладах, маркерами 5МР є маркери, зчеплені із стійкістю до ЗСМ.
ЗМР можуть знаходитися в кодуючих послідовностях генів, некодуючих областях генів або у міжгенних областях між генами. ЗМР у кодуючій послідовності не обов'язково будуть змінювати амінокислотну послідовність отриманого білка унаслідок вироджуваності генетичного коду. ЗМР, обидві форми якого приведуть до однієї і тієї ж поліпептидної послідовності, називають "синонімічним" (іноді його називають мовчазною мутацією). Якщо продукується поліпептидна послідовність, яка відрізняється, його називають "несинонімічним". Несинонімічна зміна може являти собою місенсо-зміну або нонсенс-зміну, місенс-зміна приводить до амінокислоти, яка відрізняється, і нонсенсо-зміна приводить до передчасного стоп-кодону. ЗМР, які не є кодуючими білок областями, усе ще можуть впливати на сплайсинг генів, зв'язування факторів транскрипції або послідовність некодуючої РНК. ЗМР звичайно є біалельними і, таким чином, легко аналізованими в рослинах і тваринах. заспідапапаат (2001) Маїшге 409:928-33.
Рослина: як використовують у межах винаходу, термін "рослина" може стосуватися цілої рослини, культури клітин або тканин, отриманої із рослин, і/або будь-якої частини будь-якої із вищевказаних. Таким чином, термін "рослина" охоплює, наприклад, але не обмежуючись ними, цілі рослини; компоненти і/або органи рослин (наприклад, листки, стебла і корені); тканину рослин; насіння і клітину рослин. Клітина рослин може являти собою, наприклад, але не обмежуючись ними, клітину у рослині і/або клітину рослини, клітину, виділену із рослини і клітину, отриману за допомогою культивування клітини, виділеної із рослини. Таким чином, термін "рослина соняшнику" може стосуватися, наприклад, але не обмежуючись ними, до цілої рослини соняшнику; декількох рослин соняшнику; клітини(клітин) рослини соняшнику; протопласту рослини соняшнику; культури тканин соняшнику (наприклад, із якого можна регенерувати рослину соняшнику); калюсу рослини соняшнику; частини рослини соняшнику (наприклад, насіння соняшнику, квітки соняшнику, сім'ядоля соняшнику, листки соняшнику, стебла соняшнику, бруньки соняшнику, корені соняшнику і кінчики коренів соняшнику); і клітин рослин соняшнику, які є незміненими в рослинах соняшнику або в частинах рослин соняшнику. "Трансгенна рослина" являє собою рослину, яка містить щонайменше в одній із її клітин екзогенний полінуклеотид. Наприклад, екзогенний полінуклеотид стабільно вбудовується в геном клітини так, що полінуклеотид може успадковуватися в наступних поколіннях. У деяких прикладах гетерологічний полінуклеотид може вбудовуватися в геном як частину
Зо рекомбінантної експресуючої касети. Термін "трансгенний" використовують у даному описі для позначення будь-якої клітини, клітинної лінії, калюсу, тканини, частини рослини або рослини, генотип яких змінений присутністю екзогенної нуклеїнової кислоти. Таким чином, цей термін охоплює трансгенні організми і клітини, які спочатку змінені так, щоб вони містили екзогенний полінуклеотид, і організми і клітини, отримані за допомогою схрещувань і безстатевого розмноження вихідного трансгенного організму або клітини. Термін "трансгенний", як використовують у межах винаходу, не охоплює геномні (хромосомні або позахромосомні) зміни, внесені загальноприйнятими способами розведення рослин (наприклад, схрещування тільки нетрансгенних організмів) або за допомогою подій, які зустрічаються в природі, (наприклад, випадкове перехресне запліднення, нерекомбінантная вірусна інфекція, нерекомбінантна бактеріальна трансформація, нерекомбінантна транспозиція і спонтанна мутація). "Лінія", "сорт" або "штам" рослин являє собою групу окремих рослин, які мають те саме походження. Рослини лінії, як правило, є інбредними до деякого ступеня і, як правило, є гомозиготними і гомогенними в більшості генетичних локусів. "Підлінія" може стосуватися інбредної підгрупи нащадків загального попередника, які генетично відрізняються від інших аналогічно інбредних підгруп, які походять від того ж попередника. У деяких варіантах здійснення, "підлінію" можна отримувати за допомогою інбридингу насіння із окремої рослини соняшнику, вибраних із покоління Ез-Е5 доти, доки залишкові сегрегуючі локуси не будуть гомозиготними серед більшості або всіх локусів.
Комерційні сорти соняшнику, як правило, отримують за допомогою нагромадження самозапильних нащадків ("об'єднання") однієї рослини Ез3з-Е5 після контрольованого схрещування між двома батьками, які генетично відрізняються. Хоча такий сорт, як правило, виявляється однотипним, самозапильний сорт, який походить із вибраної рослини, у кінцевому підсумку (наприклад, до покоління Ев) стає сумішшю гомозиготних рослин, які можуть варіювати за генотипом у будь-якому локусі, який був гетерозиготним у спочатку вибраній рослині Ез-Е5. У варіантах здійснення, описаних у даному описі, підлінії на основі маркерів, які відрізняються один від одного поліморфізмом якісного маркера на рівні ДНК в одному або декількох конкретних локусах, отримують за допомогою генотипування зразка насіння, отриманого від індивідуального самозапильного нащадка, який походить із вибраної рослини Ез-Е5. Такий зразок насіння можна генотипувати прямо як насіння або тканини насіння, вирощеного із 60 насіння. У деяких прикладах насіння, яке має загальний генотип в одному або декількох конкретних маркерних локусах, поєднують із отриманням підлінії, яка є генетично гомогенною в одному або декількох локусах, які зчеплені із ознакою, яка становить інтерес (наприклад, низький вміст пальмітинової кислоти). "Анцестральна лінія" стосується батьківської лінії, яку використовують або використовували як джерело генетичного матеріалу, наприклад, для виведення елітних ліній. "Анцестральна популяція" стосується групи предків, які забезпечили сукупність генетичної мінливості, яку використовували для виведення елітної лінії. "Потомство" являє собою нащадків предків, і потомство може бути відділене від їх предків багатьма поколіннями розведення. Наприклад, елітні лінії є нащадками їх предків. Родовід можна використовувати для опису взаємозв'язку між потомством і будь-яким із його предків. Родовід може охоплювати одне або декілька поколінь і, таким чином, може описувати взаємозв'язки між нащадком і його предками, віддаленими на 1, 2, 3,4 і т. д. поколінь. "Елітна лінія" або "елітний штам" стосується агрономічно поліпшеної лінії, яка була виведена і відібрана (часто за допомогою множини циклів селекції) для поліпшення агрономічних характеристик. Численні елітні лінії соняшнику доступні і відомі фахівцям у даній галузі. Елітна популяція являє собою набір елітних ліній або особин із елітних ліній, які можна використовувати для відображення рівня техніки із точки зору доступних агрономічно поліпшених генотипів даного виду культури (наприклад, соняшнику). Аналогічно, елітний генетичний матеріал або елітний штам генетичного матеріалу являє собою агрономічно поліпшений генетичний матеріал. Елітний генетичний матеріал можна отримувати із рослини із поліпшеною агрономічною ефективністю, і його можна використовувати для отримання рослини із поліпшеними агрономічними характеристиками, такої як соняшник існуючої або знову виведеної елітної лінії.
На противагу елітним лініям, "екзотична лінія" або "екзотичний штам" (або "екзотичний генетичний матеріал") стосуються лінії або генетичного матеріалу, отриманих із соняшнику, який не належить елітній лінії або штаму зародкової лінії соняшнику. У контексті схрещування між двома рослинами соняшнику або генетичними матеріалами, екзотичний генетичний матеріал не є близькоспорідненим за походженням елітному генетичному матеріалу, з яким його схрещують. Найбільш часто екзотичний генетичний матеріал вибраний для включення
Зо нового генетичного елемента (наприклад, алельна форма, яка становить інтерес) у програму розведення. Ознака або фенотип: терміни "ознака" і "фенотип" використовують у даному описі взаємозамінно для позначення наслідуваної характеристики, яка піддається вимірюванню або спостереженню. У деяких прикладах фенотип може прямо контролюватися одиничним геном або генетичним локусом (тобто ознака одного гена). В інших прикладах фенотип може бути результатом взаємодії між декількома генами (комплексна ознака). Таким чином, ОТІ. може діяти за допомогою механізму одного гена або за допомогою полігенного механізму. У деяких прикладах ознаки або фенотипу можна привласнювати "фенотипічну величину", яка відповідає якісній величині, обмірюваної для фенотипічної ознаки. Термін "молекулярний фенотип" може стосуватися фенотипу, який піддається виявленню на рівні популяції (однієї або декількох) молекул. У деяких прикладах молекулярний фенотип може виявлятися на молекулярному рівні.
Молекули фенотипу, які піддаються виявленню, можуть являти собою нуклеїнові кислоти (наприклад, геномна ДНК або РНК); білки і/або метаболіти. Наприклад, молекулярний фенотип може являти собою профіль експресії одного або декількох продуктів генів (наприклад, на конкретній стадії розвитку рослини або у відповідь на умови або стресові впливи навколишнього середовища). Низький вміст пальмітинової кислоти: для цілей даного опису ознакою, яка представляє особливий інтерес, є "низький вміст пальмітинової кислоти". Хоча на сполуку жирних кислот у рослинах соняшнику можуть у деякому ступені впливати фактори навколишнього середовища, фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що вміст пальмітинової кислоти (а також інші ознаки олії) в основному визначаються наслідуваними генетичними факторами. Таким чином, наприклад, вибір конкретного сорту соняшнику для культивування може бути оснований щонайменше частково на характерному вмісті пальмітинової кислоти в цьому конкретному сорті у нормальних польових умовах вирощування (наприклад, умови без засухи, захворювань і із достатніми поживними речовинами в грунті). Наприклад, рослина соняшнику, яка має низький вміст пальмітинової кислоти, може мати вміст пальмітинової кислоти (16:0), який складає приблизно З 95 або менше від загального вмісту олії в насіннях рослини. У деяких прикладах така рослина соняшнику, яка має низький вміст пальмітинової кислоти, має вміст пальмітинової кислоти, яка складає приблизно 2,595 або менше від загального вмісту олії в насіннях рослини, наприклад, але не обмежуючись ними, вміст пальмітинової кислоти може складати 2,6 95; 2,590; 2,490; 2,390; 2,2 0; 2,1 90; 2,0 90; 1,9 Фо; 60 1,8 95; приблизно 1,7 95 і нижче.
У деяких варіантах здійснення "низький вміст пальмітинової кислоти" визначають за допомогою порівняння із характерним вмістом пальмітинової кислоти сорту дикого типу або батьківського сорту. Таким чином, перший соняшник, який має фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти, може мати "зменшені" або "знижені" рівні пальмітинової кислоти щодо соняшнику дикого типу або щодо батьківського сорту соняшнику, із якого походив перший соняшник. "Зменшений" і "знижений" є відносними термінами, які вказують на те, що рослина продукує або містить менше пальмітинової кислоти, ніж подібна рослина дикого типу.
Вміст пальмітинової кислоти в рослині соняшнику широко варіює, і характерний вміст пальмітинової кислоти, виміряний у конкретних сортах, відображує спектр фенотипів вищого і нижчого вмісту пальмітинової кислоти. Однак відносний вміст пальмітинової кислоти в різних рослинах, лініях рослин або родинах рослин, можна визначати шляхом простого спостереження. Більш того, сорти соняшнику являють собою генетично визначні фенотипічні ступені "вмісту пальмітинової кислоти". Фахівцю в даній галузі відомі аналізи для кількісного визначення і оцінки вмісту пальмітинової кислоти у соняшнику. Вміст пальмітинової кислоти у рослині можна кількісно визначати із використанням різних аналітичних способів, стандартних у даній галузі, включаючи, наприклад, але не обмежуючись ними, ЯМР; МІК і екстракцію Зохпіеї.
Підтвердження низького вмісту пальмітинової кислоти можна проводити, використовуючи або модифікуючи доступні протоколи визначення вмісту пальмітинової кислоти. Наприклад,
ЯМР, МІК і/або екстракцію 5охпІеї можна використовувати для підтвердження того, що ознака низького вмісту пальмітинової кислоти усе ще сегрегує відносно конкретного маркера у будь- якій конкретній рослині або популяції. Ці і інші протоколи також можна використовувати у деяких варіантах здійснення для вимірювання ступеня зниження вмісту пальмітинової кислоти, який досягається за допомогою інтрогресії або рекомбінантного внесення маркера, зчепленого із низьким вмістом пальмітинової кислоти, у бажаний генетичний фон.
ІМ. Маркери для низького вмісту пальмітинової кислоти в соняшнику
Варіанти здійснення винаходу включають маркери, які зчеплені із низьким вмістом пальмітинової кислоти в соняшнику. Такі маркери можна використовувати, наприклад, але не обмежуючись ними, для ідентифікації рослин соняшнику і генетичного матеріалу, які мають збільшену імовірність наявності фенотипу низького вмісту пальмітинової кислоти; для селекції
Зо таких рослин соняшнику і генетичного матеріалу (наприклад, у програмі селекції за допомогою маркера); і для ідентифікації і селекції рослин і генетичного матеріалу соняшнику, які не мають збільшеної імовірності наявності фенотипу низького вмісту пальмітинової кислоти.
Використання одного або декількох маркерів, які описані у даному описі, може забезпечити переваги для рослинників-селекціонерів відносно часу, витрат і праці, залучених у розведення соняшнику, порівняно із доступними в даний час композиціями і способами рівня техніки.
У даному описі описані конкретні маркери, ідентифіковані як такі, що знаходяться в або поблизу області ОТ низького вмісту пальмітинової кислоти у групі зчеплення 5 (І 55) у геномі соняшнику, що є поліморфними в батьківських генотипах. Серед таких маркерів ОТІ. знаходяться конкретні маркерні алелі, які зчеплені із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти в соняшнику. У деяких варіантах здійснення маркер ОТГ, який зчеплений із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти в соняшнику, вибраний із підгрупи маркерів, яка представлена на фіг. 1. Наприклад, але не обмежуючись ними, маркер ОТІ,, який зчеплений із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти в соняшнику, може бути вибраний із
НА0ОЗІ1В; НАОЗ9ОВ8; НА1Т665; НАОЗО4А; НАОВ850; НАО743; НАОВ870; НАОЗ9О7 і НАОб12А.
Для визначення маркера, який зчеплений із низьким вмістом пальмітинової кислоти, можна використовувати популяції для картування. У деяких варіантах здійснення така популяція для картування може бути отримана за допомогою схрещування Н757В/Н28О, хоча також і альтернативно можна використовувати інші популяції. Для визначення зчепленого маркерного локусу можна використовувати будь-яку із множини придатних програмних платформ.
Наприклад, але не обмежуючись ними, у конкретних прикладах можна використовувати
ТАЗЗЕЇ Ф; СепегБіом«в і МарМападег-ОТХФ). У деяких варіантах здійснення, наприклад, коли в аналізі зчеплення використовують програмне забезпечення, дані, які відображують інформацію про виявлених алелів, можна передавати електронним шляхом або зберігати електронним чином під час застосування або перед застосуванням, наприклад, на зчитуваному комп'ютером носії. У деяких варіантах здійснення першу рослину або генетичний матеріал соняшнику, які, імовірно, мають фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти, ідентифікують за допомогою виявлення множини маркерних алелів у першій рослині або генетичному матеріалі соняшнику.
Наприклад, але не обмежуючись ними, конкретні варіанти здійснення включають способи ідентифікації рослин або генетичного матеріалу, які, імовірно, мають фенотип низького вмісту 60 пальмітинової кислоти, де маркерний алель, зчеплений із низьким вмістом пальмітинової кислоти, виявлений серед молекулярних маркерів НАООЗІВ; НАОЗО8; НА1Т665; НАОЗО4А;
НАОВ50; НАО743; НАОВ8г70; НАОЗО і НАОЄ1Т2А. Способи ідентифікації рослин або генетичного матеріалу, які, імовірно, мають фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти згідно із деякими варіантами здійснення, включають виявлення більше ніж одного маркерного алеля, зчепленого із низьким вмістом пальмітинової кислоти, із молекулярних маркерів НАООЗ1В; НАОЗО8; НА1665;
НАОЗО4А; НАОВб50О; НАО743; НАОбВ70О; НАООО і НАОбІ12А. Конкретні варіанти здійснення включають способи ідентифікації рослин або генетичного матеріалу, які, імовірно, мають фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти, де маркерний алель виявлений (із молекулярних маркерів, які зчеплені щонайменше з одним маркером, зчепленим із низьким вмістом пальмітинової кислоти, вибраним із НА0ОЗІВ; НАОЗУО8; НА1Т665; НАОЗО4А; НАОВ850;
НАО743; НАО870; НАОЗ9О7 і НАОбЄ12А.
У деяких варіантах здійснення виявлений алель являє собою форму алеля, яка позитивно корелює із низьким вмістом пальмітинової кислоти. Альтернативно алель, який виявлений, може являти собою форму алеля, яка негативно корелює із низьким вмістом пальмітинової кислоти, і в цьому випадку можна здійснювати негативну селекцію алеля. У випадку, коли більше одного маркерного алеля вибирають для виявлення, алель вибирають для кожного із маркерів; таким чином, виявляють два або більше алелів. У деяких прикладах маркер може містити більше однієї переважної (наприклад, яка позитивно корелює) форми алеля; у такому прикладі можна виявляти кожну із таких переважних форм алеля.
Таким чином, у одній рослині, генетичному матеріалі або популяції рослин можна одночасно виявляти множину маркерних алелів. У прикладах таких способів можна вибирати рослину або генетичний матеріал, які містять позитивно корелюючі алелі більше ніж одного маркера, зчепленого із низьким вмістом пальмітинової кислоти. У конкретних прикладах позитивно корелюючі алелі із більше ніж одного маркера, зчепленого із низьким вмістом пальмітинової кислоти, можна вносити за допомогою інтрогресії у цільовий (наприклад, реципієнтний) генетичний матеріал соняшнику. Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що одночасна селекція (і/або інтрогресія) позитивно корелюючих алелів із більше ніж одного маркера низького вмісту пальмітинової кислоти у одній і тій же рослині або генетичному матеріалі можуть приводити до адитивного (наприклад, синергічного) фенотипу у рослині або генетичному матеріалі.
Зо Хоча конкретні маркерні алелі можуть косегрегувати із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти, такі маркерні локуси не обов'язково є частиною локусу ОТІ, який забезпечує (наприклад, відповідального за) низький вміст пальмітинової кислоти. Наприклад, не вимагається, щоб косегрегуючий маркер містився в гені (наприклад, як частині відкритої рамки зчитування гена), який забезпечує або передає низький вміст пальмітинової кислоти. Асоціація між конкретним маркерним алелем із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти може бути наслідком початкової "з'єднуючої" фази зчеплення між косегрегуючим маркерним алелем і алелем ОТ. низького вмісту пальмітинової кислоти в анцестральній лінії соняшнику, із якої походить алель низького вмісту пальмітинової кислоти. В кінцевому підсумку, при повторюваній рекомбінації події кросинговера між косегрегуючим маркером і локусом ОТ. можуть змінювати цю орієнтацію. Таким чином, позитивно корелюючий маркерний алель може змінюватися в послідовних поколіннях залежно від фази зчеплення, яка існує в батьку із низьким вмістом пальмітинової кислоти, який використовують для отримання сегрегуючих популяцій. Цей факт не зменшує придатності маркера для моніторингу сегрегації фенотипу; він тільки змінює те, яка форма маркерного алеля позитивно (на противагу негативній кореляції) корелює в даній сегрегуючій популяції.
При вказуванні на взаємозв'язок між двома генетичними елементами (наприклад, генетичний елемент, який забезпечує низький вміст пальмітинової кислоти («Іі близькорозташований маркер), "з'єднуюча" фаза зчеплення стосується обставин, коли позитивно корелюючий алель у ОТ. низького вмісту пальмітинової кислоти фізично зв'язаний із тією же хромосомою, що і позитивно корелюючий алель відповідного зчепленого маркерного локусу. У "з'єднуючій фазі" обидва алелі успадковуються разом нащадками, які успадковують цю хромосомну нитку. У "відштовхуючій" фазі зчеплення, яка позитивно корелює алель у локусі, який становить інтерес, (наприклад, СТІ низького вмісту пальмітинової кислоти) фізично зчеплений із нормальним негативно корелюючим алелем у проксимальному маркерному локусі і, таким чином, два алелі, які звичайно позитивно корелюють, не успадковуються разом (тобто два локуси знаходяться "не у фазі" один відносно одного).
Як використовують у межах винаходу, "позитивно корелюючий" алель маркера, являє собою алель маркера, який косегрегує із бажаним фенотипом (наприклад, низький вміст пальмітинової кислоти) у популяціях для картування, описаних у даному описі. Однак за вищесказаним, буде бо зрозуміло, що внаслідок можливості відштовхуючої фази зчеплення, в інших варіантах здійснення, що залучають інші популяції можна еквівалентно використовувати інші алельні форми маркера.
Аналогічно, зчеплену форму маркерного алеля, яка не косегрегує із низьким вмістом пальмітинової кислоти, також і альтернативно можна використовувати у деяких варіантах здійснення, оскільки таку алельну форму можна використовувати для ідентифікації рослини, яка, імовірно, не має фенотипу низького вмісту пальмітинової кислоти. Наприклад, такий алель можна використовувати для цілей виключення (наприклад, негативна селекція) під час розведення для ідентифікації алелів, які негативно корелюють із низьким вмістом пальмітинової кислоти і/або для усунення рослин або генетичного матеріалу із збільшеним вмістом пальмітинової кислоти із наступних раундів розведення.
Маркер ОТ. має мінімум один позитивно корелюючий алель, хоча в деяких прикладах маркер ОТ може мати два або більше позитивно корелюючих алелів, які зустрічаються в популяції. Можна використовувати будь-який позитивно корелюючий алель такого маркера, наприклад, для ідентифікації і створення ліній соняшнику із низьким (наприклад, зниженим) вмістом пальмітинової кислоти. У деяких прикладах один, два, три або більше позитивно корелюючий(их) алель(ів) різних маркерів, зчеплених із низьким вмістом пальмітинової кислоти, ідентифікують у (або піддають інтрогресії в) рослині, і всі або підгрупу позитивно корелюючих маркерів можна вибирати або виключати під час МА5Б. У деяких варіантах здійснення ідентифікують щонайменше одну рослину або генетичний матеріал, які мають щонайменше один такий алель, який позитивно корелює із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти.
Маркерні локуси самі по собі є ознаками і, таким чином, їх можна аналізувати стандартним аналізом зчеплення, наприклад, за допомогою відстеження маркерних локусів у ході сегрегації.
Таким чином, у деяких варіантах здійснення визначають зчеплення між маркерами, наприклад, де один СМ дорівнює імовірності 195 того, що перший маркерний локус відділиться за допомогою кросинговера в одному поколінні від другого локусу (який може являти собою будь- яку іншу ознаку (наприклад, другий маркерний локус) або другий локус ознаки, який містить або міститься в ОТГ).
Генетичні маркери, зчеплені із маркерами ОТ. (наприклад, маркери ОТГ, представлені на фіг. 1 і їх еквіваленти) є особливо придатними, коли вони знаходяться досить близько (тобто
Зо досить міцно зчеплені) із даним маркером СТІ так, що генетичний маркер і маркер ОТ. виявляють низьку частоту рекомбінації. У деяких варіантах здійснення зчеплений маркер і маркер ОТІ. виявляють частоту рекомбінації приблизно 10 95 або менше (тобто даний маркер знаходиться в межах приблизно 10 СМ від ОТ). За визначенням ці зчеплені локуси косегрегують протягом щонайменше 90 95 часу. Дійсно, що ближче маркер знаходиться до маркера ОТГ, то більш ефективним і переважним стає цей маркер як індикатор бажаної ознаки.
Проте, можуть бути придатними маркери, які знаходяться на відстані, наприклад, більше ніж приблизно 10 СМ від ОСТІ, зокрема в комбінації із іншими зчепленими маркерами.
Таким чином, у деяких варіантах здійснення зчеплені локуси, такі як маркерний локус ОТІ і другий маркерний локус, виявляють частоту рекомбінацій у локусі приблизно 10 95 або менше; наприклад, але не обмежуючись ними, приблизно 9 95 або менше, приблизно 8 95 або менше, приблизно 7 95 або менше, приблизно 6 95 або менше, приблизно 5 95 або менше, приблизно 4 У або менше, приблизно З 95 або менше, і приблизно 2 956 або менше. У деяких прикладах відповідні локуси (наприклад, маркерний локус і локус-мішень, такий як ОТ) виявляють частоту рекомбінації приблизно 1 95 або менше; наприклад, але не обмежуючись ними, приблизно 0,75 95 або менше, приблизно 0,5 95 або менше, і приблизно 0,25 95 або менше. Таким чином, у конкретних варіантах здійснення локуси можуть бути розділені приблизно на 10 СМ; приблизно 9 СМ; приблизно 8 СМ; приблизно 7 СМ; приблизно 6 СМ; приблизно 5 СМ; приблизно 4 сМ; приблизно З СМ; приблизно 2 СМ; приблизно 1 СМ; приблизно 0,75 СМ; приблизно 0,5 СМ; приблизно 0,25 СМ або менше. У деяких прикладах конкретні зчеплені маркери можна визначати шляхом вивчення генетичної карти геному соняшнику, включаючи, наприклад, І 5.
У деяких аспектах зчеплення можна виражати як межу частоти рекомбінації, або як генетичний або фізичний діапазон. Наприклад, у деяких варіантах здійснення два зчеплених локуси являють собою два локуси, які розділені на кількість одиниць карти, яка складає менше 50 СМ. У деяких прикладах зчеплені локуси являють собою два локуси, які розділені менше ніж на 40 СМ. У деяких прикладах два зчеплених локуси являють собою два локуси, які розділені менше ніж на 30 СМ. У деяких прикладах два зчеплених локуси являють собою два локуси, які розділені менше ніж на 25 СМ. У деяких прикладах два зчеплених локуси являють собою два локуси, які розділені менше ніж на 20 СМ. У деяких прикладах два зчеплених локуси являють собою два локуси, які розділені менше ніж на 15 СМ. У деяких прикладах зчеплення може бути 60 виражено як діапазон із верхньою і нижньою межею; наприклад, але не обмежуючись ними,
приблизно від 10 до 20 СМ; приблизно від 10 до 30 СМ; приблизно від 10 до 40 сМ; від приблизно 0,5 до приблизно 10 сМ; від приблизно 0,1 до приблизно 9 сМ; від приблизно 0,1 до приблизно 8 СМ; від приблизно 0,1 до приблизно 7 СМ; від приблизно 0,1 до приблизно 6 сМ; від приблизно 0,1 до приблизно 5 СМ; від приблизно 0,1 до приблизно 4 СМ; від приблизно 0,1 до приблизно З СМ; від приблизно 0,1 до приблизно 2 СМ; від приблизно 0,1 до приблизно 1 сМ; і від приблизно 0,1 до приблизно 0,5 СМ.
Маркери, описані в даному описі (наприклад, маркери, представлені на фіг. 1: НАООЗ18В,
НАОЗ908, НА1665, НАОЗО4А, НАО8ф50, НАО743, НАО8Ф70, НАОЗ9О, НАОб12А, і маркери, зчеплені щонайменше із одним із зазначених вище маркерів) у деяких варіантах здійснення позитивно корелюють із низьким вмістом пальмітинової кислоти в соняшнику. Таким чином, ці маркери можуть знаходитися досить близько до ОСТІ. і/або ознаки низького вмісту пальмітинової кислоти так, що один або декілька маркерів можна використовувати як прогностичний фактор для ознаки низького вмісту пальмітинової кислоти. Ця прогностична здатність надзвичайно корисна у контексті МА5, як більш докладно розглянуто у даному описі.
Використання конкретних маркерів, описаних у даному описі, які зчеплені із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти і/або маркером ОТІ, не обмежується якою-небудь конкретною генетичною картою соняшнику або методологією. Слід зазначити, що перелік зчеплених маркерів може варіювати між картами і методологіями внаслідок різних факторів.
Наприклад, маркери, які знаходяться на будь-яких двох картах, можуть не бути ідентичними, і перша карта може мати вищу щільність маркерів, ніж інша, друга карта. Також популяції для картування, методології і алгоритми, які використовують для конструювання генетичних карт, можуть відрізнятися. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що одна генетична карта не обов'язково більш-менш точна, ніж друга, і, більше того, кваліфікованому фахівцю буде зрозуміло, що будь-яку генетичну карту соняшнику можна використовувати для визначення маркерів, які зчеплені із конкретним маркером. Наприклад, конкретні зчеплені маркери можна визначати із будь-якої генетичної карти, відомої в даній галузі (наприклад, експериментальна карта або інтегрована карта), і їх можна визначати із будь-якого нового набору даних про картування.
Варіанти здійснення даного винаходу не обмежуються якою-небудь конкретною популяцією
Зо соняшнику або застосуванням якої-небудь конкретної методології (наприклад, яким-небудь конкретним програмним забезпеченням або яким-небудь конкретним набором параметрів програмного забезпечення) для ідентифікації або визначення зчеплення конкретного маркера із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти. За даним винаходом фахівець у даній галузі здатний екстраполювати ознаки маркерів, які описані у даному описі, на будь-яку сукупність генів соняшнику або популяцію, яка становить інтерес, і застосовувати яке-небудь конкретне програмне забезпечення і параметри програмного забезпечення для цього.
М. Виявлення маркерів низького вмісту пальмітинової кислоти в соняшнику
Способи виявлення (ідентифікації) рослин або генетичного матеріалу соняшнику, які містять конкретні алелі маркерних локусів низького вмісту пальмітинової кислоти, є ознакою деяких варіантів здійснення. У деяких варіантах здійснення для виявлення маркерного алеля можна використовувати будь-який із різних протоколів виявлення маркерів, доступних у даній галузі, залежно від типу маркера, що виявляється. Наприклад, придатні способи виявлення маркерів можуть включати ампліфікацію і ідентифікацію отриманого ампліфікованого маркера за допомогою, наприклад, але не обмежуючись ними, ПЛР; І СК і способу ампліфікації на основі транскрипції (наприклад, АЗН, виявлення за допомогою 55Е, аналізу КРЇІ Р і багато інших).
Як правило, виявлення генетичного маркера основане на одній або декількох властивостях нуклеїнових кислот. Наприклад, у деяких способах виявлення генетичних маркерів використовується гібридизація нуклеїнової кислоти зонда із нуклеїнової кислотою, яка відповідає генетичному маркеру (наприклад, ампліфікована нуклеїнова кислота, отримана із використанням молекули геномної ДНК соняшнику як матриці) У конкретних варіантах здійснення для виявлення алеля можуть бути придатними формати гібридизації, які включають, наприклад, але не обмежувані ними, аналізи гібридизації в рідкій фазі; жорсткій фазі; змішаній фазі і аналізи гібридизації іп 5йи. Великий посібник із гібридизації нуклеїнових кислот може бути знайдено, наприклад, у Ті)ї55еп (1993) І арогаїогу Тесппідце5 іп Віоспетізігу апа МоїІесшаг
Віоїоду-Нубгіаігайоп мйй Мисівїс Асій Ргобез ЕІземієг, МУ.
Маркери, які відповідають генетичним поліморфізмам між представниками популяції, можна виявляти за допомогою численних способів, включаючи, наприклад, але не обмежуючись ними, способи на основі ампліфікації нуклеїнових кислот і секвенування нуклеотидів поліморфної маркерної області. У деяких прикладах множину способів виявлення (включаючи способи на бо основі ампліфікації і способи на основі секвенування) можна легко адаптувати до високопродуктивного аналізу, наприклад, із використанням доступних високопродуктивних способів секвенування, таких як секвенування гібридизацією.
У конкретні приклади деяких варіантів здійснення включені праймери для ампліфікації маркерних локусів 55К-типу. У таблиці 6 представлені конкретні праймери для ампліфікації конкретних маркерів, які описані у даному описі. Однак фахівцю в даній галузі буде добре зрозуміло, що замість даних праймерів можна використовувати інші послідовності із будь-якої сторони від даних праймерів, за умови, що праймери здатні ампліфікувати нуклеотидну послідовність, яка містить алель, який підлягає виявленню. Крім того, конкретний зонд, який використовують для виявлення алеля, може варіювати. Наприклад, будь-який зонд, здатний ідентифікувати область амплікона маркера, який підлягає виявленню, можна заміняти ілюстративними зондами, наведеними в даному описі. Крім того, також може варіювати конфігурація праймерів для ампліфікації і зондів для виявлення. Таким чином, варіанти здійснення не обмежуються праймерами і зондами, конкретно зазначеними в даному описі.
Хоча в даному описі описана множина конкретних праймерів (див. таблицю 6), придатні праймери, які підлягають застосуванню в межах винаходу, можна конструювати (із використанням будь-якого придатного способу. Наприклад, еквівалентні праймери можна конструювати із використанням будь-якого придатного програмного забезпечення, такого як, наприклад, але не обмежуючись ними, І АБЕКНСЕМЕФ)
Молекулярні маркери можна виявляти стандартними способами, доступними в даній галузі, наприклад, але не обмежуючись ними: А5Н або інші способи виявлення ЗМР; виявлення АРІ Р; виявлення ампліфікованої варіабельної послідовності; виявлення КАРОЮ; виявлення РР Р; виявлення за допомогою реплікації послідовностей, яка самопідтримується; виявлення 59К; виявлення 5ЗСР і виявлення ізоферментних маркерів. Хоча ілюстративні маркери, представлені на фіг. 1 і в таблиці 6, являють собою маркери 55К, будь-який із згаданих вище типів маркерів можна використовувати в конкретних варіантах здійснення для ідентифікації сегментів хромосоми, які охоплюють генетичний елемент, який забезпечує фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти в соняшнику.
Наприклад, маркери, які включають КЕР, можна виявляти, наприклад, за допомогою гібридизації зонда (який, як правило, являє собою підфрагмент або синтетичний олігонуклеотид, відповідний підфрагмент) нуклеїнової кислоти, який підлягає виявленню, із рестрикційно розщепленої геномної ДНК. Фермент рестрикції вибирають так, щоб отримати фрагменти рестрикції щонайменше двох альтернативних (або поліморфних) довжин у різних особин або популяцій. Визначення одного або декількох ферменту(ів) рестрикції, які продукують інформативні фрагменти для кожного схрещування, є простою методикою, яку легко виконують фахівці в даній галузі після встановлення послідовності ДНК-мішені. Після поділу по довжині в придатному матриксі (наприклад, агароза або поліакриламід) і перенесення на мембрану (наприклад, нітроцелюлоза або нейлон), мічений зонд може гібридизуватися в умовах, які приводять до рівноважного зв'язування зонда із мішенню, із наступним видаленням надлишку зонда за допомогою промивання, і виявлення міченого зонда.
У деяких варіантах здійснення стадію ампліфікації використовують як частину способу виявлення/генотипування маркерного локусу. Однак стадія ампліфікації не у всіх випадках потрібна для виявлення маркера. Наприклад, неампліфіковану геномну ДНК можна виявляти просто за допомогою проведення саузерн-блотинга на зразку геномної ДНК. Відокремлені зонди для виявлення також можуть бути відсутніми у способах ампліфікації/виявлення, наприклад, але не обмежуючись цим, унаслідок проведення реакції ампліфікації у реальному часі, яка виявляє утворення продукту по модифікації праймера для ампліфікації при включенні в продукт; включення мічених нуклеотидів в амплікон; і моніторингу змін властивостей обертання молекул ампліконів порівняно із неампліфікованими попередниками (наприклад, за допомогою флуоресцентної поляризації).
ПЛР, ЗТ-ПЛР, ПЛР у реальному часі і | СЕ мають особливо широке застосування як способи ампліфікації і ампліфікації-виявлення для ампліфікації і виявлення нуклеїнових кислот (наприклад, нуклеїнових кислот, які містять маркерні локуси). Деталі, які стосуються застосування цих і інших способів ампліфікації можуть бути знайдені у кожному із різних стандартних довідників, які включають, наприклад, затюбгоокК еї аїЇ., МоїІесшаг Сіопіпд: А
І арогаїогу Мапиаї (2000) За Еа., Мої. 1-3, Соїд 5ргіпд Натотг І арогаюгу, Соїд брііпа Натбог, МУ;
Ситепі Ргоїосої5 іп МоїІесшаг Віоіоду (доповнений по 2002 рік) Е. М. А!,зхирбеї еї аї., ед5., Сцтепі
Ргогосо!5, а |оіпі мепіиге реїееп Сгеепе Рибіїзпіпд Абзосіагев, Іпс. і допйп УМіеу 5 5опв5, Іпс.; і
ПЛР Ргоосоїв5 А Сиціде о Мейоз апа Арріісайопз (1990) Іппів вї а. ед5) Асадетіс Ргез5 Іпс., Зап
Оієдо, СА. Додаткові деталі, які стосуються виявлення нуклеїнових кислот у рослинах, також можуть бути знайдені, наприклад, 4 Ріапі МоїІесшіаг Віоосду (1993) Стау (єда.) ВІО5 5сієпійіс
РибіївНегв, Іпс.
Додаткові деталі, які стосуються способів, достатніх для вказування фахівцям у даній галузі на конкретні способи ампліфікації і виявлення іп мійго, включаючи способи полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), лігазної ланцюгової реакції (І СК), ампліфікації із ОР-репліказою і інші опосередковувані РНК-полімеразою способи (наприклад, МАЗВА) і їх приклади, також можуть бути знайдені, наприклад: у патенті США 4683202; АтПеїт апа І еміпзоп (1991) У МІН Кезв. 3:81- 94; Кугоп еї аї. (1989) Ргос. Май. Асайд. Зсі. ОБА 86:1173; смагеїЇїї єї аї. (1990), вище; ГопеїїЇ єї аї. (1989) У. Сіп. Спет. 35:1826; І апдедгеп єї аї. (1988) Зсієпсе 241:1077-80; Мап Вгипі (1990)
ВіоїесппоЇоду 8:291-4; Ми апа У/аІасе (1989) Сепе 42560; Вагтіпдег еї а). (1990) Сепе 89:117; і
ЗооКпапап апа Маїек (1995) Віотесппоіоду 13:563-4. Удосконалені способи ампліфікації великих нуклеїнових кислот способом ПЛР, які можуть бути придатними в деяких застосуваннях позиційного клонування, додатково описані в Спепо еї а!. (1994) Маїшге 369:684, і в посиланнях, які цитовані у ній, згідно яким отримували амплікони ПЛР розміром аж до 40 т. п. н.
Множину доступних біологічних довідників також розширили обговорення ПЛР і споріднених способів ампліфікації. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що, по суті, будь-яку РНК можна конвертувати у дволанцюгову ДНК, яка придатна для рестрикційного розщеплення, ампліфікації способом ПЛР і секвенування із використанням зворотної транскриптази і полімерази (наприклад, способом ЗТ-ПЛР).
У деяких варіантах здійснення зонд нуклеїнової кислоти можна використовувати для виявлення нуклеїнової кислоти, яка містить нуклеотидну послідовність маркерного алеля. Такі зонди можна використовувати, наприклад, для позиційного клонування для виділення нуклеотидних послідовностей, які зчеплені із послідовністю маркерного алеля. Зонди нуклеїнової кислоти, які придатні у конкретних варіантах здійснення, не обмежуються ніяким конкретним розміром. У деяких варіантах здійснення зонд нуклеїнової кислоти може мати довжину, наприклад, але не обмежуючись цим, щонайменше 20 нуклеотидів; щонайменше 50 нуклеотидів; щонайменше 100 нуклеотидів і щонайменше 200 нуклеотидів. Зонди нуклеїнової кислоти для маркерного локусу можуть бути клонованими і/або синтезованими.
У конкретних прикладах із зондом можна використовувати будь-яку мітку. Мітки, які піддаються виявленню, придатні для застосування із зондами нуклеїнової кислоти, включають будь-яку композицію, яка виявляється за допомогою спектроскопічних, радіоізотопних, фотохімічних, біохімічних, імунохімічних, електричних, оптичних або хімічних засобів. Таким чином, гібридизований зонд можна виявляти із використанням, наприклад, радіоавтографії, флуорографії і інших подібних способів виявлення залежно від конкретної мітки, яка підлягає виявленню. Придатні мітки включають біотин (для забарвлювання міченого стрептавідином кон'югата), магнітні гранули, флуоресцентні барвники, радіоактивні мітки, ферменти і колориметричні мітки. Інші мітки включають ліганди, які зв'язуються із антитілами або визначеними зв'язувальними мішенями, міченими флуорофорами, хемілюмінесцентними агентами і ферментами. Зонд також може містити радіоактивно мічені праймери для ПЛР, які використовують для отримання радіоактивно міченого амплікона. Додаткова інформація, яка стосується стратегій мічення нуклеїнових кислот і відповідних стратегій виявлення, може бути знайдена, наприклад, у Наийдіапа (1996) Напароок ої РіІйогезсепі Ргоре5 апа Кезеагсп
Спетіса!5, Біхіпй Еайіоп, Моїесшціаг Ргорев5, Іпс., Еидепе ОК; і Нацйдіапа (2001) Напароок ої
Ріногезсепі Ргобез апа Везеагсп Спетісаї!в5, Бідній Еайіоп, МоїІесшаг Ргобевз, Іпс., Еидепе ОВ (Амайаріе оп СО КОМ). У конкретних прикладах виявлення і кількісне визначення за допомогою
ПЛР проводять із використанням флуорогенних олігонуклеотидних зондів із подвійним міченням, наприклад, зондів ТадМапФф (Арріїеа Віозувзіетв).
У деяких варіантах здійснення праймери не є міченими і маркерні амплікони ПЛР можна візуалізувати, наприклад, після їх поділу за розміром (наприклад, після агарозного гель- електрофорезу). У конкретних прикладах забарвлювання бромідом етидію ампліконів ПЛР після поділу за розміром дозволяє візуалізацію ампліконів із різним розміром, який відповідає різним маркерним алелям.
Праймери для застосування у варіантах здійснення не обмежуються праймерами, здатними утворювати амплікон будь-якого конкретного розміру. Наприклад, праймери, які використовують для ампліфікації конкретних маркерних локусів і алелів, не обмежуються праймерами, які ампліфікують всю область відповідного локусу. Праймери можуть утворювати амплікон будь- якої придатної довжини, яка є більшою або меншою, ніж довжина, наведена в характеристиках алеля. Наприклад, ампліфікація маркера може продукувати амплікон, який має довжину, наприклад, але не обмежуючись цим, щонайменше 20 нуклеотидів; щонайменше 50 бо нуклеотидів; щонайменше 100 нуклеотидів і щонайменше 200 нуклеотидів.
Синтетичні способи отримання олігонуклеотидів і придатних композицій, які містять олігонуклеотиди (наприклад, зондів, праймерів, молекулярних маяків, РМА і І МА), як правило, добре відомі фахівцям у даній галузі. Наприклад, олігонуклеотиди можна синтезувати хімічно згідно із твердофазним способом із складними триефірами фосфорамідитів, описаних, наприклад, у Веаисаде апа Сагиїпег: (1981) Теїгапеагоп І ейв. 22(20): 1859-62. У таких способах може використовуватися автоматичний пристрій для синтезу, наприклад, але не обмежуючись цим, як описано в Мееапат-МапОемапієї еї аї. (1984) Мисівїс Асійб5 Нев5. 12:6159-68.
Олігонуклеотиди (включаючи модифіковані олігонуклеотиди) також можна замовляти із різних комерційних джерел, включаючи, але не обмежуючись цим, Те Мідіапа Сегійе!й Кеадепі
Сотрапу; Те Огеаї Атегісап Сепе Сотрапу; Ехргез5ОСеп Іпс.; і Орегоп Тесппоїодіев Іпс.
Аналогічно, РМА можуть виготовлятися на замовлення різними джерелами, включаючи, наприклад, але не обмежуючись цим, РеріідосСепіс; НТІ Віо-Ргодисів, Іпс.; ВМА Віотедісаїв (а (О.К.) і Віо.Зупіпевів, Іпс.
У деяких варіантах здійснення для виявлення маркерного алеля можна використовувати спосіб іп 5йЙйсо. Наприклад, послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить маркерну послідовність, можна зберігати в комп'ютері. Бажану послідовність маркерного локусу (або її гомолог) можна ідентифікувати із використанням придатного алгоритма для пошуку нуклеїнових кислот, наданого, наприклад, але не обмежуючись цим, у ВІ А5Т"М або навіть у простих текстових редакторах.
У деяких варіантах здійснення маркерний алель виявляють із використанням способу виявлення на основі ПЛР, де розмір або послідовність амплікона ПЛР, який містить маркер, указують на відсутність або присутність конкретного маркерного алеля. У деяких прикладах, праймери для ПЛР гібридизуються із консервативними областями, які фланкують поліморфну маркерну область. Праймери для ПЛР, які використовують таким чином для ампліфікації молекулярного маркера, іноді називають у даній галузі "маркерами для ПЛР" або просто "маркерами".
Головним стимулом для виявлення молекулярних маркерів у сільськогосподарських культурах є можливість збільшення ефективності розведення рослин за допомогою селекції за допомогою маркерів (МА5). Генетичні маркери, які зчеплені із ознакою, яка становить інтерес,
Зо або геном, можна використовувати для ідентифікації рослин, які містять бажаний маркерний алель в одному або декількох локусах, і, таким чином, очікується, що ці рослини перенесуть бажаний маркерний алель разом з ознакою, яка становить інтерес, або геном їх потомству.
Генетичні маркери можна використовувати для ідентифікації рослин, які мають конкретний генотип в одному локусі або в декількох незчеплених або зчеплених локусах (наприклад, гаплотип). Аналогічно, маркерні алелі, які описані в даному описі, можна вносити за допомогою інтрогресії в будь-який бажаний генетичний фон, генетичний матеріал, рослину, лінію, сорт і т. д. соняшнику, як частині загальної програми розведення МА5, призначеної для підвищення виходу соняшнику.
Відповідно до деяких варіантів здійснення маркери, описані в даному описі, забезпечують засіб для ідентифікації рослин і генетичного матеріалу соняшнику, які мають низький або знижений вміст пальмітинової кислоти (або високий або збільшений вміст пальмітинової кислоти) за допомогою ідентифікації рослин і генетичного матеріалу, які містять конкретний алель у локусі, такому як НА0ОЗІВ, НАОЗО8, НА1665, НАОЗО4А, НАО850, НАО743, НАОВ870,
НАОЗ907, НАОб12А і маркерний локус, зчеплений щонайменше із одним із вищевказаних локусів.
За допомогою ідентифікації рослин, які не мають маркерного алеля, який косегрегує із низьким вмістом пальмітинової кислоти, можна ідентифікувати рослини і генетичний матеріал із високим вмістом пальмітинової кислоти (або рослини із меншим зниженням вмісту пальмітинової кислоти), наприклад, для усунення із наступного схрещування і розведення.
Згідно із вищевказаним, варіанти здійснення винаходу включають молекулярні маркери, які мають значну імовірність косегрегації із ОТ, який забезпечує або передає фенотип із низьким (наприклад, зниженим) вмістом пальмітинової кислоти. Ці СТІ застосовні в селекції за допомогою маркера бажаних ознак (знижений вміст пальмітинової кислоти) і також мають інші застосування. Варіанти здійснення винаходу не обмежуються яким-небудь конкретним способом виявлення або аналізу цих маркерів.
МІ. Інтрогресія маркерів низького вмісту пальмітинової кислоти в лінії соняшнику
Як зазначено вище, ідентифікація рослин або генетичного матеріалу соняшнику, який включає маркерний алель або алелі, які зчеплені із фенотипом низького (наприклад, зниженого) вмісту пальмітинової кислоти, забезпечує основу для проведення селекції соняшнику за допомогою маркерів. У деяких варіантах здійснення вибирають щонайменше одну рослину бо соняшнику, яка містить щонайменше один маркерний алель, який позитивно корелює із низьким вмістом пальмітинової кислоти, у той час як рослини соняшнику, які містять маркерні алелі, які негативно корелюють із низьким вмістом пальмітинової кислоти можна піддавати негативній селекції.
Бажані маркерні алелі, які позитивно корелюють із низьким вмістом пальмітинової кислоти, можна піддавати інтрогресії в соняшник, який має конкретний (наприклад, елітний або екзотичний) генетичний фон так, щоб отримати рослину або генетичний матеріал соняшнику із інтрогресією низького вмісту пальмітинової кислоти. У деяких варіантах здійснення множину маркерів низького вмісту пальмітинової кислоти можна послідовно або одночасно відбирати іМабо вводити шляхом інтрогресії в соняшник. Конкретні комбінації маркерів низького вмісту пальмітинової кислоти, по яких можна проводити селекцію в одиничній рослині або генетичному матеріалі, не обмежені, і вони включають комбінацію маркерів, таких як маркери, зазначені на фіг. 1, будь-які маркери, зчеплені із маркерами, наведеними на фіг. 1, або будь-які маркери, розташовані в інтервалах ОТ, визначених у даному описі. У деяких варіантах здійснення здатність ідентифікувати маркерні алелі ОТ, які позитивно корелюють із низьким вмістом пальмітинової кислоти в рослині соняшнику, забезпечує спосіб селекції рослин, які також мають сприятливі маркерні локуси. Наприклад, можна проводити селекцію будь-якої рослини, яку ідентифікують як таку, що містить маркерний алель (наприклад, маркерний алель, який позитивно корелює із низьким вмістом пальмітинової кислоти), у той час як рослини, які позбавлені алеля (або які містять алель, який негативно корелює із низьким вмістом пальмітинової кислоти), можна піддавати негативній селекції. Таким чином, у конкретних варіантах здійснення після ідентифікації маркерного алеля в першій рослині або генетичному матеріалі, спосіб інтрогресії включає селекцію першої рослини або генетичного матеріалу соняшнику або селекцію потомства першої рослини або генетичного матеріалу. У деяких прикладах отримані шляхом селекції рослину або генетичний матеріал соняшнику можна схрещувати із другою рослиною або генетичним матеріалом соняшнику (наприклад, елітний соняшник або екзотичний соняшник), щоб отримати потомство, яке містить маркерний алель і має бажані характеристики і/або алелі другої рослини або генетичного матеріалу. У деяких варіантах здійснення спосіб інтрогресії ОТ низького вмісту пальмітинової кислоти може включати, наприклад, надання щонайменше одного маркера, зчепленого із низьким вмістом
Зо пальмітинової кислоти (наприклад, маркер, який косегрегує із низьким вмістом пальмітинової кислоти); визначення маркерного алеля в першій рослині або генетичному матеріалі, які містять
ОТІ. низького вмісту пальмітинової кислоти; і інтрогресію маркерного алеля у другу рослину або генетичний матеріал соняшнику, щоб отримати рослину або генетичний матеріал соняшнику із інтрогресією. У конкретних варіантах здійснення друга рослина або генетичний матеріал соняшнику можуть мати збільшений вміст пальмітинової кислоти порівняно із першою рослиною соняшнику або генетичним матеріалом, у той час як рослина або генетичний матеріал соняшнику із інтрогресією мають знижений вміст пальмітинової кислоти порівняно із другою рослиною або генетичним матеріалом. Як більш докладно розглянуто нижче, рослина або генетичний матеріал соняшнику із інтрогресією, отримані за допомогою цих і інших варіантів здійснення, також включені у варіанти здійснення винаходу. У деяких варіантах здійснення, коли рослину або генетичний матеріал соняшнику із інтрогресією отримують будь-яким із способів, представлених у даному описі, рослина або генетичний матеріал соняшнику із інтрогресією можуть бути охарактеризовані сполукою жирних кислот в олії насіння рослини.
Рослина або генетичний матеріал із інтрогресією можуть містити, наприклад, але не обмежуючись ними, приблизно З 95 або менше пальмітинової кислоти в олії насіння із рослини.
У деяких прикладах, така рослина або генетичний матеріал соняшнику із інтрогресією містять приблизно 2,5 95 або менше пальмітинової кислоти в олії насіння рослини, наприклад, але не обмежуючись цим, 2,6 95; 2,5 905 2,4 90:52,3 90522 965 2,1 90; 2,0 Фо; 1,9 90; 1,8 95; приблизно 1,7 95 і нижче.
На додаток до інтрогресії вибраних маркерних алелів (наприклад, за допомогою стандартних способом розведення) у бажаний генетичний фон, щоб здійснити інтрогресію ОТ. низького вмісту пальмітинової кислоти в генетичний фон, у деяких варіантах здійснення можна використовувати трансгенні підходи для отримання рослин і/або генетичного матеріалу соняшнику із низьким вмістом пальмітинової кислоти. У деяких варіантах здійснення екзогенну нуклеїнову кислоту (наприклад, ген або відкриту рамку зчитування), яка зчеплена щонайменше із одним маркером у соняшнику, описаним у даному описі, можна вводити в цільову рослину або генетичний матеріал. Наприклад, нуклеїнову кислоту, кодуючу послідовність, зчеплену щонайменше із одним маркером, описаним у даному описі, можна клонувати із геномної ДНК соняшнику (наприклад, за допомогою позиційного клонування) і вводити в цільову рослину або бо генетичний матеріал.
Таким чином, конкретні варіанти здійснення включають способи отримання рослини або генетичного матеріалу соняшнику, які мають фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти, де спосіб включає введення екзогенної нуклеїнової кислоти в цільову рослину соняшнику або його потомство, де екзогенна нуклеїнова кислота, по суті, ідентична нуклеотидній послідовності, яка зчеплена щонайменше із одним позитивно корелюючим маркерним алелем в одному або декількох маркерних локусах, які зчеплені із низьким вмістом пальмітинової кислоти. У деяких прикладах маркерний локус може бути вибраний із: НА0ООЗ1В; НАОЗО8; НА1Т665; НАОЗО4А;
НАОВ850; НАО743; НАОВ870; НАОЗО7; НАОбЄ12А і маркера, який зчеплений (наприклад, демонструє частоту рекомбінації не більше 1095) щонайменше із одним із вищевказаних. У деяких варіантах здійснення множину зчеплених маркерів можна використовувати для конструювання трансгенної рослини. Те, який із маркерів, описаних у даному описі, із такої множини використовувати, визначає практикуючий фахівець.
Для введення екзогенної нуклеїнової кислоти в рослину або генетичний матеріал соняшнику можна використовувати будь-який із множини способів. У деяких варіантах здійснення нуклеотидну послідовність виділяють за допомогою позиційного клонування і ідентифікують по зчепленню із маркерним алелем, який позитивно корелює із низьким вмістом пальмітинової кислоти. Наприклад, нуклеотидна послідовність може відповідати відкритій рамці зчитування (ОКР), яка кодує поліпептид, який при експресії в рослині соняшнику приводить до або забезпечує рослину соняшнику, яка має низький вміст пальмітинової кислоти. Потім нуклеотидну послідовність можна вбудовувати в екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти.
Точний склад екзогенної нуклеїнової кислоти може варіювати. Наприклад, екзогенна нуклеїнова кислота може містити експресуючий вектор для забезпечення експресії нуклеотидної послідовності у рослині, у яку вводять екзогенну нуклеїнову кислоту. Маркери, зчеплені із низьким вмістом пальмітинової кислоти, можна вводити шляхом інтрогресії (наприклад, тим самим, здійснюючи інтрогресію фенотипу низького вмісту пальмітинової кислоти) у рослину або генетичний матеріал соняшнику із використанням способу, який включає селекцію за допомогою маркера. У варіантах здійснення МА5 проводять із використанням поліморфних маркерів, які ідентифіковані як такі що мають значну імовірність косегрегації із ознакою низького вмісту пальмітинової кислоти. Такі маркери (наприклад, маркери, зазначені на фіг. 1)
Зо приблизно картуються в гені або генах або поблизу них, які забезпечують знижений вміст пальмітинової кислоти в рослині (порівняно із рослиною, яка містить ген або гени дикого типу).
Такі маркери можна вважати індикаторами ознаки, і вони можуть бути позначені як маркери
ОТ. У деяких варіантах здійснення рослину або генетичний матеріал досліджують стосовно присутності позитивно корелюючого алеля щонайменше в одному маркері ОТІ.
У деяких варіантах здійснення аналіз зчеплення використовують для визначення того, який поліморфний алель демонструє статистичну імовірність косегрегації із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти. Після ідентифікації такого позитивно корелюючого маркерного алеля для фенотипу низького вмісту пальмітинової кислоти, маркер можна використовувати для швидкого точного скринінгу ліній рослин стосовно алеля низького вмісту пальмітинової кислоти без необхідності у вирощуванні рослин протягом їх життєвого циклу і очікуванні фенотипічної оцінки. Більш того, ідентифікація маркера дозволяє генетичну селекцію конкретного алеля із низьким вмістом пальмітинової кислоти, навіть коли молекулярна структура справжнього ОТГ. низького вмісту пальмітинової кислоти невідома. Невеликий зразок тканини (наприклад, із першого листка рослин) можна брати від рослини соняшнику, яка є нащадком, отриманого схрещуванням і підданого скринінгу за допомогою відповідного молекулярного маркера. Таким чином, можна швидко визначити, чи варто використовувати потомство для подальшого розведення. Зчеплені маркери також усувають вплив факторів навколишнього середовища, які можуть впливати на прояв фенотипу, тим самим дозволяючи селекцію соняшнику із низьким вмістом пальмітинової кислоти незалежно від умов навколишнього середовища. Таким чином, у той час як внесок різних факторів зовнішнього середовища в ознаки олії рослин може, на перший погляд, заважати використанню маркерів, описаних у даному описі, у дійсності конкретна перевага цих маркерів полягає в тому, що їх застосовність не залежить від навколишнього середовища.
У деяких варіантах здійснення, які включають МАЄ, локус поліморфного маркера ОТГ. можна використовувати для селекції рослини, яка містить маркерний алель (або алелі), які позитивно корелюють із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти. Наприклад, нуклеїнову кислоту, яка відповідає маркерному алелю нуклеїнової кислоти, можна виявляти в біологічному зразку із рослини, яка підлягає селекції. Це виявлення може приймати форму гібридизації зонда нуклеїнової кислоти із маркерним алелем або його ампліконом (наприклад, із використанням 60 алелеспецифічної гібридизації, саузерн-аналізу, нозерн-аналізу, гібридизації іп 5йи і гібридизації праймерів із наступною ампліфікацією способом ПЛР області маркера). Після підтвердження присутності (або відсутності) конкретного маркерного алеля у біологічному зразку, рослину відбирають, і в деяких випадках його можна використовувати для отримання рослин-нащадків за допомогою селекційного розведення.
Для рослинників-селекціонерів соняшнику є бажаними комбінації маркерних локусів низького вмісту пальмітинової кислоти із маркерами/генами інших бажаних ознак (наприклад, високий вихід), щоб вивести поліпшені сорти соняшнику. Скринінг великих кількостей зразків немолекулярними способами (наприклад, оцінка ознаки в рослинах соняшнику) звичайно є дорогим, таким, що потребує багато часу, і ненадійним. Використання поліморфних маркерів, описаних у даному описі, які зчеплені із ОТІ. низького вмісту пальмітинової кислоти, забезпечує ефективний спосіб селекції бажаних сортів у програмах розведення. Переваги селекції за допомогою маркерів над оцінкою в польових умовах низького вмісту пальмітинової кислоти включають, наприклад, те що МАб можна проводити в будь-який час року, незалежно від сезону вирощування. Більше того, як зазначено вище, ефекти факторів навколишнього середовища частіше не мають значення для селекції за допомогою маркерів.
Коли популяція є сегрегуючою за множиною маркерних локусів, зчеплених із одним або декількома ознаками (наприклад, множину маркерів, зчеплених із низьким вмістом пальмітинової кислоти), ефективність МА порівняно із фенотипічним скринінгом стає ще вищою, оскільки всі маркерні локуси можна оцінювати в лабораторії разом в одному зразку ДНК.
У конкретних варіантах здійснення винаходу маркери НА0ООЗІВ, НАОЗО8, НА1665, НАОЗО4А,
НАО850, НАО743, НАО870, НАОЗ9О7 і НАОБЄ12А, а також маркери, зчеплені щонайменше із одним із зазначених вище маркерів, можна аналізувати одночасно або послідовно в одному зразку або в декількох паралельних зразках.
Іншим застосуванням МАБЗ у розведенні рослини є сприяння відновленню генотипу рекурентного батька за допомогою розведення способом зворотного схрещування. Зворотне схрещування звичайно проводять для інтрогресії одного або декількох маркерів або локусів ОТ. із донорного батька (наприклад, батько, який має бажані маркерні локуси низького вмісту пальмітинової кислоти) загалом бажаний генетичний фон із рекурентного батька (наприклад, лінія соняшнику із високим виходом). Що більше циклів зворотного схрещування проводять, то
Зо вищим є генетичний внесок рекурентного батька у кінцевий сорт із інтрогресією. У деяких прикладах можна проводити множину циклів зворотного схрещування, наприклад, оскільки рослини із низьким вмістом пальмітинової кислоти можуть бути загалом небажаними, наприклад, внаслідок низького виходу, низької родючості і т. д. Навпаки, штами, які є результатом інтенсивних програм розведення, можуть мати чудовий вихід, родючість і т. д., 35 будучи дефіцитними тільки в одному бажаному аспекті, такому як вміст пальмітинової кислоти.
У схрещуванні за допомогою маркерів конкретних маркерів із донорного джерела, яке може складати або може не складати елітний генетичний фон для елітного сорту, який буде служити як рекурентна лінія, практикуючий фахівець може проводити селекцію серед нащадків зворотного схрещування за донорним маркером, а потім використовувати повторюване 40 зворотне схрещування із рекурентною лінією для максимального відновлення геному рекурентної лінії.
Відповідно до вищевказаного, маркери і способи, описані в даному описі, можна використовувати для здійснення селекції за допомогою маркерів або розведення сортів соняшнику із бажаним комплектом (набором) алельних форм сегментів хромосоми, 45 асоційованих із поліпшеними агрономічними характеристиками (наприклад, низький вміст пальмітинової кислоти разом із будь-якими іншими доступними маркерами виходу, стійкості до захворювань і т. д.). Будь-який із описаних маркерних алелів можна вводити в лінію соняшнику за допомогою інтрогресії (наприклад, шляхом традиційного розведення, за допомогою трансформації, або обох із них) із отриманням рослини соняшнику із поліпшеними 50 агрономічними характеристиками. Якщо нуклеїнові кислоти із рослини є позитивними за бажаним генетичним маркерним алелем, у деяких варіантах здійснення рослину можна піддавати самозапиленню із отриманням чистої лінії із одним і тим же генотипом, або його можна схрещувати із рослиною, яка містить той же маркерний алель або інші бажані маркери іМабо характеристики, із отриманням гібридного покоління, яке є результатом статевого 55 схрещування.
Часто спосіб за даним винаходом використовують щонайменше для однієї родинної рослини соняшнику, такої як із ліній нащадків або спадних родичів у розглянутому родоводі рослин соняшнику так, щоб можна було відстежити спадкування бажаного алеля зниженого вмісту пальмітинової кислоти. Кількість поколінь рослин, які використовують у способах за 60 даним винаходом, як правило, складає від 1 до 20, звичайно від 1 до 5, і, як правило, 1, 2 або З покоління, і особливо часто спосіб здійснюють на прямих нащадках або батьках рослини соняшнику (тобто поділ в одне покоління).
Генетична розмаїтість є важливим для програм розведення. При обмеженій різноманітності генетична вигода, яка досягається в програмі по розведенню, в кінцевому підсумку досягне плато, коли усі із сприятливих алелів будуть фіксовані в елітній популяції. Таким чином, однією задачею розведення рослин є включення різноманітності в елітний набір без втрати генетичної вигоди, яка вже досягнута, і із мінімальними можливими інвестиціями. МА5 забезпечує вказування на те, які геномні області і які сприятливі алелі із початкових предків, були відібрані і збережені із часом, полегшуючи спроби включення сприятливого варіювання із екзотичних джерел генетичного матеріалу (батьківські рослини, які є неспорідненими із набором елітних генів) надіючись знайти сприятливі алелі, які у даний час відсутні в елітному наборі генів. Таким чином, у деяких варіантах здійснення маркери, описані в даному описі, можна використовувати для МА5 при схрещуваннях, які залучають (елітні і екзотичні) лінії соняшнику, здійснюючи МА5 для сегрегуючого потомства із метою збереження основних алелів, які забезпечують вихід, разом із маркерними алелями зниженого вмісту пальмітинової кислоти, описаних у даному описі.
Локуси молекулярних маркерів і алелі, описані в даному описі (наприклад, НАО0ОЗ18,
НАОЗ908, НА1665, НАОЗО4А, НАОВ50, НАО743, НАО8ф70, НАОЗО7, НАОб612А і маркери, зчеплені щонайменше із одним із вищевказаних маркерів) у деяких варіантах здійснення можна використовувати, як і зазначено раніше, для ідентифікації ОТ. низького вмісту пальмітинової кислоти, який потім можна клонувати за допомогою відомих методик. Такі клони із зниженим вмістом пальмітинової кислоти можна спочатку ідентифікувати за їх генетичним зчепленням із маркерами, описаними в даному описі. Наприклад, у "позиційному клонуванні генів" використовується фізична близькість маркера низького вмісту пальмітинової кислоти для визначення виділеного хромосомного фрагмента, який містить ген ОТЇ низького вмісту пальмітинової кислоти. Виділений хромосомний фрагмент можна отримувати такими добре відомими способами, як, наприклад, але не обмежуючись ними, розщеплення хромосомної ДНК одним або декількома ферментами рестрикції, ампліфікацію хромосомної області із використанням ПЛР, і будь-яка придатна альтернативна реакція ампліфікації. Потім
Зо розщеплений і ампліфікований фрагмент можна лігувати у вектор, придатний для реплікації іабо експресії вбудованого фрагмента. Маркери, які є сусідніми із ОРЕ, асоційованої із фенотипічною ознакою, можна специфічно гібридизувати із клоном ДНК (наприклад, клон із бібліотеки геномної ДНК), тим самим, ідентифікуючи клон, на якому розташована ОРЕ (або фрагмент ОКЕ). Якщо маркер розташований далі від гена ОТ. низького вмісту пальмітинової кислоти, фрагмент, який містить ОКЕ, можна ідентифікувати за допомогою послідовних раундів скринінгу і виділення клонів, які також містять суміжну послідовність ДНК. Цей процес звичайно називають "прогулянкою по хромосомі", і його можна використовувати для отримання "контига" або "карти контигів".
Протоколи, достатні для інформації для фахівця в даній галузі про виділення клонів, асоційованих із зчепленими маркерами, можуть бути знайдені, наприклад, у Затрьгоок еї аї. (єд.) МоїІесшаг Сіопіпд: А І арогаюгу Мапиаї, 2па єд., мої. 1-3, Соїд бргіпа Натог І арогаюгу Ргезв,
Со 5ргіпд Нагбог, МУ, 1989; і Аизибеї еї аї., Еа5., Сиепі Ргоїосої5 іп МоїІесціаг Віоіоду, Спарієг 2, агеепе Рибріїзпіпд апа МіІеу-Іпіег5сіепсе, МУ, 1995.
МІ. Рослини, які містять маркери низького вмісту пальмітинової кислоти
Деякі варіанти здійснення включають способи отримання рослини соняшнику і, крім того, включають самі ці рослини соняшнику. У конкретних варіантах здійснення такий спосіб може включати схрещування першої батьківської рослини соняшнику, яка містить щонайменше один маркерний алель, який позитивно корелює із низьким вмістом пальмітинової кислоти, із другою рослиною соняшнику із маркером, зчепленим із низьким вмістом пальмітинової кислоти, описаним у даному описі, і вирощування жіночої рослини соняшнику в умовах вирощування рослин, які забезпечують потомство рослин соняшнику. Таке потомство рослин соняшнику можна аналізувати відносно маркерних алелів, зчеплених із низьким вмістом пальмітинової кислоти, і можна вибирати бажаних нащадків. Такі нащадки-потомки або їх насіння можна використовувати різним чином, включаючи, наприклад, але не обмежуючись цим, те, що їх можна продавати комерційно для виробництва соняшнику; використовувати для продуктів харчування; обробляти для отримання бажаного продукту соняшнику, (наприклад, соняшникова олія) і/або далі використовувати у наступних раундах розведення. Рослини соняшнику згідно із деякими варіантами здійснення включають рослини-нащадки, які містять щонайменше одну із алельних форм маркерів, описаних у даному описі так, щоб наступне потомство був здатним 60 успадковувати маркерний алель.
Деякі варіанти здійснення включають способи отримання рослини соняшнику, яка має низький вміст пальмітинової кислоти (наприклад, знижений вміст пальмітинової кислоти). У конкретних варіантах здійснення такі способи можуть включати отримання такої рослини загальноприйнятим розведенням рослин або введенням екзогенної ДНК (наприклад, трансгена) у сорт або рослину соняшнику.
Таким чином, деякі варіанти здійснення включають клітини-хазяїни і організми-хазяїни, які трансформовані нуклеїновими кислотами, які відповідають ОТ. низького вмісту пальмітинової кислоти, ідентифікованими із використанням щонайменше одного маркера, зчепленого із низьким вмістом пальмітинової кислоти, описаного в даному описі. У деяких прикладах, такі нуклеїнові кислоти можуть включати хромосомні інтервали (наприклад, геномні фрагменти),
ОРЕ і/або кДНК, які кодують продукти експресії, які роблять внесок у фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти.
Клітини-хазяїни можна отримувати способами генної інженерії (наприклад, трансдукувати, трансфікувати, трансформувати і т. д.) вектором (наприклад, клонуючий вектор, човниковий вектор або експрессируючий вектор), який містить ОКЕ, зчеплену із маркером низького вмісту пальмітинової кислоти. Вектори включають, наприклад, але не обмежуючись ними, плазміди; фагміди; агробактерії; віруси; "голі" полінуклеотиди (лінійні або замкнуті) і кон'юговані полінуклеотиди. Множину векторів можна вводити в бактерії, особливо для збільшення в кількості і поширення.
Вектори можна вводити в тканині рослин, культивовані клітини рослин і протопласти рослин будь-яких із множини стандартних способів, відомих у даній галузі, включаючи, наприклад, але не обмежуючись ними: електропорацію (Егот еї аї. (1985) Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА 82:5824); інфікування вірусними векторами, такими як вірус мозаїки цвітної капусти (Саму) (див., наприклад, патент США 4407956); балістичне проникнення дрібних частинок, які містять нуклеїнову кислоту (Кієїп еї а). (1987) Маїшге 327:70); використання пилку як вектора (міжнародна публікація патенту РСТ Мо МО 85/01856); і використання Адгобасіегішт їштегїасіеп5 або А. гпігодепе5, що містять Т-ДНК-плазміду, у якій клоновані фрагменти ДНК (Егаїеу еї аї. (1983) Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 80:4803). У визначених варіантах здійснення винаходу можна використовувати будь-який придатний спосіб, включаючи, але не обмежуючись ними, конкретні
Зо способи, прямо зазначені в даному описі, які забезпечують ефективне введення нуклеїнової кислоти в клітину або протопласт.
Модифіковані способами інженерії клітини-хазяїни можна культивувати в звичайних поживних середовищах або середовищах, модифікованих, наприклад, для активації промоторів або селекції трансформантів. У деяких варіантах здійснення хазяйські клітин-рослин можна культивувати в трансгенні рослини. Регенерація рослин із культивованих протопластів описана, наприклад, у Емап5 еї аї. (1983) "Ргогоріаві ІзоЇайоп апа Сийиге", Напабоок ої Ріапі СеїЇ Сийитев 1, Масміїап Рибіївєпіпа Со., ММ, рр. 124-176; Оамеу (1983) "Несепі Оеєемеіортепів іп Ше Сипиге апа Недепегайоп ої Ріапі Ргоїоріавів", Ргоїоріавзіб5, ВіїкНпа!йзег, Вазеї, рр. 12-29; ЮОаїе (1983) "Ргогоріазі Сийите апа Ріапі НРедепегаїййоп ої Сегеаі5 апа ОїйНег Весаїсітапі Сторв", Ргоїоріавів, вище, рр. 31-41; і Віпаіпд (1985) "Кедепегайоп ої Ріапів", Ріапі Ргоїоріазі5, СКС Ргез5, Воса
Ваюп, РІ, рр. 21-73. Додаткові ресурси, які забезпечують придатні деталі, які стосуються культивування і регенерації клітин рослин включають Раупе еї аї. (1992) Ріапі СеїІ апа Тізвце
Сийиге іп Гідцідй Зубвівтв, Уопп УМіеу б Бопв, Іпс., ММ; Сатброгу апа РНйірз (едв5.) (1995) Ріапі
Сеїї, Тіввиє апа Огдап Сийиге; Еипдатепіа! Меїподіз, Зргіпдег Габ Мапиаї, Зргіпде!-Мепая (Вепіп
НеїдеІрегд МУ); і Кк. К. О. Сгоу (Ед.) Ріапі Моїесшіаг Віооду (1993) Віо5 Зсієепійіс Рибіїзпегв,
Охгога, ШК (ІЗВМ 0 12 198370 6).
Трансформовані клітини рослин, отримані із використанням кожного із описаних вище способів трансформації, можна культивувати для регенерації цілої рослини, яка має трансформований генотип і, таким чином, бажаним фенотипом. Такі способи регенерації, як правило, основані на маніпулюванні визначеними фітогормонами в середовищі для вирощування культури тканини, як правило, основаному на біоцидному і/або гербіцидному маркері, введеному в клітину разом із бажаними нуклеотидними послідовностями. Процеси регенерації і вирощування, які використовуються для отримання цілої рослини, як правило, включають стадії селекції трансформованих клітин і пагонів; укорінення трансформованих пагонів і вирощування паростків у грунті.
Трансформацію рослин нуклеїновими кислотами, які знижують вміст пальмітинової кислоти (наприклад, які містять маркери, описані в даному описі) можна використовувати для трансформації виду, відмінного від соняшнику. Наприклад, передбачається, що продукти експресії із ОТІ,, які роблять внесок у або забезпечують фенотип низького вмісту пальмітинової бо кислоти в соняшнику, також можуть знижувати вміст пальмітинової кислоти при трансформації і експресії в інших важливим із агрономічної точки зору і із точки зору садівництва видах рослин.
Такі види включають дводольні рослини, наприклад, але не обмежуючись ними, сімейств:
І едитіпозає (включаючи горох, боби, квасолю, арахіс, пахіризус, коров'ячий горох, боби оксамитні, сою, конюшину, люцерну, люпин, вику, лотос, буркун білий, гліцинію і запашний горошок) і Сотро5йаеє (найбільшу родину судинних рослин, які включає щонайменше 1000 родів, які включають важливі комерційні культури, такі як соняшник). Додаткові рослини, які містять нуклеїнові кислоти, які знижують вміст пальмітинової кислоти (наприклад, які містять маркери, описані в даному описі) можуть являти собою рослини родів: Аїшт, Арішт, Агаспів,
Вгаззіса, Сарзісит, Сісег, биситів, Ситсиріїа, Оайсив, РГадоругит, Стпусіпе, Неїїапіпив, І асіиса,
Геп5, Гусорегвзісоп, Медісадо, Різит, Рпазеоїни5, Зоіагішт, Тгйойшт, Мідпа і багато інших.
Розповсюджені сількогосподарські культури, які можна використовувати у конкретних прикладах, включають, наприклад, але не обмежуючись ними: сою, соняшник, канолу, горох, боби, квасолю, арахіс, пахіризус, коров'ячий горох, боби оксамитні, конюшину, люцерну, люпин, вику, буркун білий, запашний горошок, горох польовий, стручкову квасолю, броколі, брюссельську капусту, качанну капусту, цвітну капусту, капусту кормову, кольрабі, селеру, салат-латук, моркву, цибулю, перець, картоплю, баклажан і томат.
МІ. Системи для виявлення і/або встановлення співвідношення маркерів низького вмісту пальмітинової кислоти
Системи, включаючи автоматичні системи, для ідентифікації рослин, які містять щонайменше один маркер, зчеплений із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти в соняшнику і/або встановлення співвідношення присутності конкретного зчепленого маркера із низьким вмістом пальмітинової кислоти, також включені у деякі варіанти здійснення.
Ілюстративні системи можуть включати зонди, придатні для виявлення алелів у маркерному локусі, описаному в даному описі; детектор для виявлення міток на зондах; відповідні елементи для обробки рідин і контролери температури, наприклад, які змішують зонди і матриці і/або ампліфікують матриці; і/або системні інструкції, які встановлюють співвідношення між виявленням мітки і присутністю конкретного маркерного локусу або алеля.
У конкретних варіантах здійснення передбачається система для ідентифікації рослини соняшнику, який переважно має низький вміст пальмітинової кислоти. Така система може
Зо включати, наприклад, але не обмежуючись ними: набір маркерних праймерів і/або зондів, сконструйованих так, щоб вони виявляли щонайменше один алель щонайменше одного маркера, зчепленого із низьким вмістом пальмітинової кислоти (наприклад, НАООЗ1В, НАОЗО8,
НА1Т665, НАОЗО4А, НАОбф50, НАО743, НАОбВ7О, НАООО, НАОбІ2А і маркер, зчеплений із щонайменше одним із зазначених вище маркерів); детектор, який налаштований так, щоб виявляти один або декілька вихідних сигналів від набору маркерних зондів або праймерів, або їх амплікона, тим самим ідентифікуючи присутність або відсутність алеля; і системні інструкції, які встановлюють співвідношення між присутністю або відсутністю алеля і низьким (наприклад, зниженим) або підвищеним вмістом пальмітинової кислоти.
Система, яка проводить виявлення маркера і/або встановлення співвідношення, може включати детектор, який налаштований так, щоб виявляти один або декілька вихідних сигналів із набору маркерних зондів або праймерів, або їх амплікона. Точна конфігурація детектора може залежати від типу мітки, яку використовують для виявлення маркерного алеля. Конкретні приклади можуть включати детектори світла і/або детектори радіоактивності. Наприклад, виявлення емісії світла або іншої властивості міченого зонда може вказувати на присутність або відсутність маркерного алеля, який взаємодіє із зондом (наприклад, за допомогою специфічної гібридизації). Детектор(и) необов'язково здійснює моніторинг одного або декількох сигналів реакції ампліфікації. Наприклад, детектор може здійснювати моніторинг оптичних сигналів, які відповідають результатам аналізу ампліфікації в "реальному часі".
Є доступним широка множина пристроїв для виявлення сигналу, наприклад, але не обмежуючись ними, трубки фотопомножувачів; спектрофотометри; чипи ССО; чипи і сканери чипів; скануючі детектори; фотоелементи і фотодіоди; мікроскопи; гальванометричні сканери і мікрорідинні пристрої для виявлення ампліфікації нуклеїнових кислот. На додаток до типу мітки, яка використовується для виявлення маркерного алеля, точна конфігурація детектора може залежати, частково, від устаткування, найбільш зручного для користувача. У деяких прикладах можна використовувати детектори, які виявляють флуоресценцію, фосфоресценцію, радіоактивність, рН, заряд, поглинання, люмінесценцію, температуру або магнетизм.
Точна форма інструкцій, наданих системі згідно із деякими варіантами здійснення, може варіювати подібним чином, залежно від компонентів системи. Наприклад, інструкції можуть бути присутнім як програмним забезпеченням системи в одному або декількох убудованому бо елементі(ах) системи, або вони можуть бути присутніми в одному або декількох комп'ютерах або носіях, які зчитуються комп'ютером, функціонально з'єднаних із детектором. У деяких прикладах системні інструкції включають щонайменше одну еталонну таблицю, що включає кореляцію між присутністю або відсутністю конкретного маркерного алеля в рослині або генетичному матеріалі і передбаченому вмісті пальмітинової кислоти. Інструкції також можуть включати вказівки по створенню користувальницького інтерфейсу системою; наприклад, щоб дозволити користувачу бачити результати аналізу зразка і вводити параметри в систему.
У конкретних варіантах здійснення система може включати компоненти для збереження або передачі зчитуваних комп'ютером даних, відповідних або позначаючих виявлені маркерні алелі, наприклад, у автоматизованій (наприклад, повністю автоматизованій) системі. Наприклад, може бути наданий зчитуваний комп'ютером носій, який включає кеш-пам'ять, оперативну пам'ять і запам'ятовуючий пристрій, і/або інші компоненти для електронного збереження даних (наприклад, дисковод жорстких дисків, дисковод м'яких дисків і запам'ятовуючий пристрій) для збереження комп'ютерного коду. Дані, відповідні алелям, виявленим способом за даним винаходом, також можуть переводитися електронним, оптичним або магнітним шляхом у сигнал даних комп'ютера, який передається по мережі, такий як внутрішня мережа, або інтернет, або їх комбінації. Також або альтернативно система може передавати дані за допомогою безпровідного, інфрачервоного або іншого доступного альтернативного способу передачі.
Під час роботи система, як правило, містить зразок, який підлягає аналізу, такий як тканина рослини або матеріал, виділений із тканини, такої як геномна ДНК, ампліфікована геномна ДНК,
КДНК, ампліфікована кДНК, РНК, ампліфікована РНК або подібні із ними.
У деяких варіантах здійснення система може складатися із окремих елементів, або альтернативно вона може бути інтегрована в одну установку для зручного виявлення маркерних алелів, і необов'язково для додаткового проведення встановлення співвідношень маркер-фенотип. У конкретних варіантах здійснення система також включає зразок, наприклад, але не обмежуючись ними, геномну ДНК; ампліфіковану геномну ДНК; кДНК; ампліфіковану
КДНК; РНК; і ампліфіковану РНК, із соняшнику або з вибраної тканини рослини соняшнику.
Автоматизовані системи, які передбачаються в деяких варіантах здійснення, необов'язково включають компоненти для маніпулювання зразком; наприклад, роботизовані пристрої.
Наприклад, автоматизована система може включати роботизований маніпулятор для керування
Зо рідинами для перенесення розчинів (наприклад, екстрактів клітин рослин) від джерела в місце призначення (наприклад, із мікропланшета для титрування на підкладку чипа), який може бути функціонально з'єднаний із цифровим обчислювальним пристроєм (наприклад, в інтегрованій комп'ютерній системі). Пристрій для введення даних у цифровий обчислювальний пристрій для контролю високопродуктивного перенесення рідин роботизованим маніпулятором для керування рідинами (і, необов'язково, для контролю перенесення маніпулятором на тверду підкладку) також може бути ознакою автоматизованої системи. Множину автоматизованих роботизованих систем для обробки рідин є комерційно доступними. Наприклад, різні автоматизовані системи, у яких використовуються різні системи 7утаїе М, і які, як правило, включають робототехнічний модуль і модуль обробки рідин, доступні від Саїїрег Тесппоіодіе5
Согр. (НорКіпіоп, МА). Аналогічно, розповсюджений робот ОКСАФ, який використовують у різних лабораторних системах (наприклад, для маніпулювання лотком для мікротитрування) також є комерційно доступним, наприклад, від ВесКтап СоиМег, Іпс. (РшШегіоп, СА). Як альтернативу загальноприйнятій робототехніці у даний час широко доступні мікрорідинні системи для проведення обробки рідин і детекції від Саїїрег Тесппоіодіеє апа Адіепі
ІТесппоіодієз (Раю АМО, СА).
У конкретних варіантах здійснення система для молекулярного аналізу маркерів може включати, наприклад, але не обмежуючись ними, цифровий обчислювальний пристрій, який містить програмне забезпечення для високопродуктивного контролю рідин; цифровий обчислювальний пристрій, який містить програмне забезпечення для аналізу зображень для аналізу даних від міток маркерів; цифровий обчислювальний пристрій, який містить програмне забезпечення для інтерпретації даних; роботизований маніпулятор для керування рідинами для перенесення розчинів із джерела в місце призначення; пристрій введення (наприклад, клавіатура комп'ютера) для введення даних у систему (наприклад, для контролю високопродуктивного перенесення рідин за допомогою роботизованого стрижня контролю рідин); і сканер зображень для оцифровування сигналів мітки від мічених зондів.
Оптичні зображення (наприклад, профілі гібридизації), візуалізовані і/або записані за допомогою камери або іншого пристрою (наприклад, фотодіодний пристрій і пристрій для збереження даних) можна далі обробляти у будь-якому із варіантів здійснення, описаних у даному описі. Наприклад, але не обмежуючись цим, такі зображення можна обробляти шляхом 60 оцифровування зображення і/або збереження і аналізу зображення на комп'ютері. Для оцифровування, збереження або аналізу оцифрованого відеозапису або оцифрованного оптичного зображення доступно різне комерційно доступне периферійне устаткування і програмне забезпечення, наприклад, із використанням різних комп'ютерних і програмних платформ.
Деякі варіанти здійснення також включають набори, придатні для ідентифікації рослин, які містять щонайменше один маркер, зчеплений із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти в соняшнику, і/або для встановлення співвідношення між присутністю конкретного зчепленого маркерного алеля із низьким вмістом пальмітинової кислоти. У деяких прикладах такий набір може включати відповідні праймери або зонди для виявлення щонайменше одного маркера, зчепленого із низьким вмістом пальмітинової кислоти, і конкретних маркерних алелів; і інструкції із застосування праймерів або зондів для виявлення щонайменше одного маркера і встановлення співвідношення маркерного алеля із прогнозованим вмістом пальмітинової кислоти. У деяких прикладах набір може включати матеріали для впаковування зондів, праймерів і/або інструкцій; і контролі (наприклад, контрольні реакційні суміші для ампліфікації, які включають зонди, праймери або матричні нуклеїнові кислоти для ампліфікацій і маркери розміру молекул).
У деяких варіантах здійснення набір або система для ідентифікації рослин, які містять щонайменше один маркер, зчеплений із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти в соняшнику, і/або для встановлення співвідношення між присутністю конкретного зчепленого маркерного алеля і низьким вмістом пальмітинової кислоти, можуть включати нуклеїнові кислоти, які виявляють конкретні маркери 55К ОТ, описані в даному описі. Наприклад, система або набір можуть містити пару праймерів для ампліфікації, здатних ініціювати полімеризацію ДНК ДНК-полімеразою на матричній нуклеїновій кислоті соняшнику, для отримання амплікона маркера соняшнику, де амплікон маркера відповідає маркеру соняшнику, вибраному із НА0ООЗІВ, НАООО8Ї, НА1Т665, НАОЗО4А, НАОВб5О0, НАО743, НАО8В70, НАО9ОТ,
НАОб12А і маркера, зчепленого щонайменше із одним із зазначених вище маркерів. Наприклад, пара праймерів, яка є специфічною до маркера, може бути вибрана із пар праймерів, зазначених у таблиці 6, або їх еквівалентів.
Приклади
Представлені нижче приклади надані для ілюстрації, але не для обмеження, визначених варіантів здійснення винаходу. Зрозуміло, що приклади і варіанти здійснення, описані в даному описі, призначені тільки для цілей ілюстрації, і фахівцям у даній галузі відомі різні реагенти, технології, системи і параметри, які можна змінювати без відхилення від суті або обсягу винаходу.
Приклад 1: Природне варіювання вмісту пальмітинової кислоти в соняшнику
Природне варіювання вмісту пальмітинової кислоти в соняшнику вимірювали, виходячи із способу ЛОС5М Се 2-66(97) (код продукту ЛОС5"М МО-СЕ266).
П'ять насінин соняшнику із кожного зразка, який підлягає дослідженню, поміщали в позначений 96-ямковий планшет для екстракції (Согпіпу Іпс., каталоговий номер Мо 4411), який містить одну сталеву кулю розміром 1/8 дюйма (0,2825-см) (З таї! Рагів5 Іпс. каталоговий номер
Мо 85-0125-С). У кожну ямку додавали 200 мкл гептану, а потім їх накривали. Накриті зразки поміщали в Сепостіпаег"М на 2,0 хвилини при 1300 ударів/хвилина. Зразки витягали і будь-які нерозмелені зразки дробили вручну за допомогою шпателя і повторно перемелювали.
Після першого подрібнювання в кожну ямку додавали 400 мкл гептану, і матеріал повторно подрібнювали при 1300 ударів/хвилина. Потім зразки центрифугували протягом 10 хвилин при 3700 об./хв. при 6 "С. Потім, із використанням робота ВесКктап СошМег МС, супернатант переносили в 9б-ямковий планшет із скляними вставками (Місгоїйег Апаїуїса! Зирріїе5 Іпс., каталоговий номер Ме 07-8045МВ-1200), який містив 400 мкл гептану. Потім у кожну ямку додавали 40 мкл 1 95 метоксиду натрію. Метоксид натрію розбавляли їх вихідного 30 95 розчину із метанолом (Зідта-Аїагіспй БіІиКа, каталоговий номер Мо 71748). Планшети накривали тефлоновою плоскою кришкою і інкубували при кімнатній температурі протягом 60 хвилин перед аналізом.
Зразки аналізували для визначення їх складу жирних кислот на Адііепі 6890 ОС-РІО (Адіїепі
ТесппоЇодієзх), обладнаному колонкою ІЮ ОЗМ/ Зсіепіййс ОВ-23, 15 х 0,25 мм, і плівкою товщиною 0,25 мкм (Адіїепі ТесппоЇІодіе5, каталоговий номер Мо 122-2312). Початкова температура печі становила 200 "С, цю температуру підтримували протягом всього аналізу. Вхідний отвір був встановлений на відношення ділення потоку 1:50 і температуру 280 "С. Протягом перших двох хвилин підтримували швидкість похилого потоку гелію 0,8 мл/хвилина. Потім потік збільшували до швидкості від 1,0 мл/хвилина до 2,5 мл/хвилина, і на цій швидкості тримали протягом 1,5 бо хвилин. Детектор був установлений на 300 "С із постійним складом газу-носія і швидкістю стовпчика 30 мл/хвилина, швидкістю потоку паливного водню 30 мл/хвилина, і швидкістю потоку окислювача 400 мл/хвилина. Для всіх зразків використовували об'єм ін'єкції 2 мкл.
Піки метилового складного ефіру пальмітинової кислоти ідентифікували за допомогою порівняння із часом утримання еталонних стандартів метилового складного ефіру (Ми-СНек-
Ргер, Іпс., СІ СжЖ428). Фіг. 1 і таблиця 1. Індивідуальні процентні площі обчислювали для всіх аналізованих сполук в еталонному стандарті на основі загальних інтегрованих площ хроматографічних піків. Також інжектували порожній зразок гептану для ідентифікації яких- небудь домішок на СС.
Таблиця 1
Статистика розподілу вмісту пальмітинової кислоти г 8в61111111111111111111111158711СсС2С 81111115 пит: ПО ПО зх ЗО пи ГИ: Я ПО КО: У оо нини ши в 1111111 осИсЙйЙ2 11171700077777777111111711111111мінмальнийї////// | 77777777 000777СсС2С
Із використанням цього способу вміст пальмітинової кислоти у вирощених на полі зразках оцінювали на сортах соняшнику, які були виведені як частина програми розведення соняшнику протягом семи років. Вимірюваний розподіл вмісту пальмітинової кислоти представлено на фіг. 2 і в таблиці 2. Як правило, величини, які спостерігаються для пальмітинової кислоти в звичайному генетичному матеріалі соняшнику знаходилися у діапазоні приблизно від 2,5 95 до 6 95 від загального вмісту жирних кислот із середнім значенням 3,75 95.
Таблиця 2
Статистика розподілу вмісту пальмітинової кислоти
Приклад 2: Ідентифікація генетичного матеріалу із низьким вмістом пальмітинової кислоти
Профіль низького вмісту пальмітинової кислоти був виявлений під час програми, призначеної для удосконалення елітної лінії соняшнику із чорною оболонкою і високим вмістом лінолеїнової кислоти (687К) за допомогою схрещування її із лінією, яка має профіль збільшеного вмісту олеїнової кислоти. Це здійснювали шляхом розведення способом зворотного схрещування із використанням як донора із високим вмістом олеїнової кислоти кондитерської батьківської рослини із смугастою оболонкою і високим вмістом олеїнової кислоти (Н28ОК). Н28ОК, як правило, має нижчий вміст пальмітинової кислоти, однак рівень, який спостерігається, звичайно становить не нижче ніж приблизно 2,595. Для досягнення заданих рівнів олеїнової кислоти проводили аналіз ЕАМЕ, як описано в прикладі 1, у кожному поколінні під час програми по розведенню способом зворотного схрещування. Під час
Зо стандартного скринінгу рівнів жирних кислот спостерігали сегрегуючу особину, яка мала істотно знижені рівні пальмітинової кислоти. У таблиці З представлені величини вмісту пальмітинової кислоти для чотирьох особин із першого покоління зворотного схрещування програми розведення способом зворотного схрещування 687 із Н28ОК.
Таблиця З
Рівні пальмітинової кислоти, визначені із використанням протоколу, описаного в прикладі 1, для об'єднаного зразка із 8-10 насінин із чотирьох голівок, вибраних із першого покоління розведення шляхом зворотного схрещування 687Р/Н2вОКк
Приклад 3: Варіювання вмісту пальмітинової кислоти в популяції соняшнику, отриманої із батьківської рослини із низьким вмістом пальмітинової кислоти і звичайної елітної батьківської рослини соняшнику
Варіювання вмісту пальмітинової кислоти, коли елітну інбредну рослину соняшнику схрещують із джерелом зниженого вмісту пальмітинової кислоти, було продемонстровано за допомогою схрещування рослини, яка відновлює високий вміст олеїнової кислоти (лінія К), із джерелом низького вмісту пальмітинової кислоти, отриманим у результаті відкриття, описаного в прикладі 2. Джерело із низьким вмістом пальмітинової кислоти конвертували в генетичний фон із цитоплазматичною чоловічою стерильністю (лінія А). Отримували популяцію Ег від схрещування лінії А із лінією К і збирали 384 насінини. Насіння розрізали навпіл, причому половину насіння аналізували відповідно до протоколу, описаного у прикладі 1. Іншу половину насіння сіяли для наступного аналізу. Сумарна статистика для вмісту пальмітинової кислоти в популяції Ег лінія А/лінія ЕК (М-384) представлені в таблицях 4-5.
Таблиця 4
Статистика розподілу вмісту пальмітинової кислоти в поколінні ЕР» між елітною інбредною рослиною, яка має типовий вміст пальмітинової кислоти, і лінією, яка має низький вміст пальмітинової кислоти нини нини шини пиши 29751116 96011118 пи ГІ Я ПОЯ ПОООООО о нини нини з о б611111111111111111111111116481 7711110171007777777771110 | 0 мінмальний// | 77777777 716481
Таблиця 5
Статистика розподілу вмісту пальмітинової кислоти в популяції Ег між елітною інбредною рослиною, яка має типовий вміст пальмітинової кислоти і лінією, яка має низький вміст пальмітинової кислоти
Приклад 4: Демонстрація бімодального розподілу вмісту пальмітинової кислоти
Розподіл вмісту пальмітинової кислоти в популяції, описаної в прикладі 3, представлено на фіг. 3. Розподіл є бімодальним: частина популяції має центр на рівні приблизно 3,15 95 пальмітинової кислоти, причому нижня кінцева частина закінчується на рівні приблизно 2,5 95 і верхня кінцева частина продовжується до приблизно 4 95; і друга частина популяції має центр на рівні приблизно 2,195 пальмітинової кислоти, причому нижня кінцева частина досягає приблизно 1,75 95 і верхня кінцева частина продовжується до приблизно 2,5 95. Із квантилів, представлених у прикладі 3, було виявлено, що 25 95 популяції має вміст пальмітинової кислоти нижче 2,6 95, причому інша частина популяції має вищий вміст пальмітинової кислоти. Величина першого квартиля (2,6 95) розташовується близько до точки перегину, де бімодальний розподіл переходить із нижнього кластера у верхній кластер. Відзначивши, що існує співвідношення 3:1 між особинами із високим вмістом пальмітинової кислоти і особинами із нищою величиною, було зроблено висновок, що існує один головним генетичний елемент, який відповідальний за низький вміст пальмітинової кислоти у цій популяції, причому рецесивний алель передає фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти.
Приклад 5: Картування ОТ. генетичної детермінанти вмісту пальмітинової кислоти
Головний локус для вмісту пальмітинової кислоти був картований на групі зчеплення соняшнику 5 (05) із використанням мікросателітних маркерів або маркерів 55БК і дані про вміст пальмітинової кислоти представлені в прикладах З і 4.
Карти соняшнику звичайно надають за групами зчеплення. Доступні карти групи зчеплення 5. Див. Ми еї аїЇ. (2003) Стор 5сі. 43:367-87; також див. Тапд еї аї. (2002) Тпеог. Аррі. Сепеї. 105:1124-36. Слід зазначити, що номера груп зчеплення соняшнику на картах, розроблених європейськими вченими, відрізняються, наприклад, від номерів, зазначених у цитованих вище джерелах. Номера хромосом, які відповідають групам зчеплення в соняшнику, ще не були визначені.
Таблиця 6
Послідовності праймери і положення на картах маркерів З5К, картованих на І. 5, для ідентифікації локусу пальмітинової кислоти же КД печютьтнюютньни | пелююнтьтеютеютньн»
Маркер на карті Послідовність прямого праймера Послідовність зворотного праймера (см) сттостатосааатТААСТатАОаС САТТОАТОСАСАТОССТОС (5ЕО Ю
БсЕовс МИССИ ЧТО пінні Енн
Й ЗЕО ІЮ МО:5 ЗЕО ІЮ МО:б ' ЗЕО ІЮ МО:7 І МО:8
СТТАТТССААДИСАСОаСАТАСТСО СаАТаСТАТОАТТСТОСАССОТТА " ІО МО:11 І МоОл2
Й ЗЕО ІЮ МО:13 ЗЕО ІЮ МО:14 ' ЗЕО ІЮ МО:15 МО:16 ттт?атТаАТОаСаТОАТТОАТОАТТ САВСААСТСТаАССОаТТТСАТТА
СТСАСОСАААСТСТТСАТаСТта (5ЕО | СТСТСАСАСТТАСТОААС ' ІО МО:21 МО:22
Й ЗЕО ІЮ МО:23 ЗЕО ІЮ МО:24
ІО МО:25 МО:26
Таблиця 6
Послідовності праймери і положення на картах маркерів З5К, картованих на І 5, для ідентифікації локусу пальмітинової кислоти
Положення
Маркер на карті Послідовність прямого праймера Послідовність зворотного праймера
СМ
НАОВБО Н7БТВ состобАОТОТАТОТОСОТТА (ЗЕО АгосетотастесстААТос (ЗЕОІЮ
НАОТАЗ Н7БТВ АсовАаАОСТоТтОАААОСА (ЗЕО ооОбСАТТОСААСТАВТАХ (БЕОІЮ
НАОВТО стТасаттаастстТтТАТОСАТ (5ЕО. | АОТаАТОаССАТТСССААТТТ (5ЕО І ' ІО МО:31 МО:32
НАО9ОЇ 246 САТОААСАТСИаССААТТСАС (5ЕО | ТаСААДасСААССАТСАСААТС (5ЕО 10 ' ІО МО:З3З3 МО:34
НАОВІгА Н7Б7В СО аОТТСТТСАТААСТО (БЕО ІЮ САТОТААТСАССТТТОААО (БЕОІЮ
НАТ923 ААССАДАСАТТСААССОСААТСА САСАСАТТАСАСОССААССАС (5ЕО ' ЗЕО ОО МО:37 І МО:З38
НА1З357А 282 САСААААСААТСОИСТААААСААСА | ААТаОАТОАТаСТСАСИ,ААСААСА ' ЗЕО ІЮ МО:39 ЗЕО ІЮ МО:40
САСААААСААТСОИСТААААСААСА | ААТаОАТОАТаСТСАСИ,ААСААСА
НАТ3578. Н7УЗ7В ЗЕО ІО МО:39 ЗЕО ІЮ МО40 сттсосоставаООАТТАСОоС АТОСТСОАСААСААДИСОаСАААС
НАТВ19. Навов ЗЕО ІО МО: ЗЕОО МО42
НАОВО4 332 теаставпАсатТсСАСТАТТОаСА (5ЕО | АОСАААСААСаААласстяАаА (5ЕО ' ІО МО:43 І МО:44
НА1790 37 6 ТОСССАААСТТаСаИататАсат (ЗЕО|Ї САТТАСАААССАСАССТОСТТОС " ІО МО:45 ЗЕО ІЮ МО:46
НАООЧІ СТАЙСААССААССТСАТТО (5ЕО І | СТСТОСТТоТСТТТСТСОаС (ЗЕО ' МО:47 МО:48
НА1313 52 З СаАСССАССТАСТААААССАдДАС тТасСссСсАТААДАДААСаАТТТОатстос ' ЗЕО ІЮ МО:49 ЗЕО ІЮ МО:50
ТСАСАСОАСААТаСАААаАатТа ССАТААТАСаИаАСТААСТаСсСААААС
НАТ776. НВ ЗЕОО МО:51 ЗЕО Ю МО2
Методики ПЛР для маркерів 55Б. Реакції ПЛР проводили на системі Сепе2йтр"М РСВ
Зузіет 9700 (Арріїей Віозуєіет5) із двома 384-ямковими блоками. Кожну реакцію ПЛР проводили в об'ємі 8 мкл, який містить 10 нг геномної ДНК із 1х кінцевою концентрацією буфера для ПЛР Оіадеп'М (Оіадеп, МаїІепсіа, Саїйогпіа), 0,25 мкМ кожного праймера (прямий і зворотний), 1 мМ Масіг, 0,1 мМ кожного амМтТР, 0,4 95 РМР і 0,04 одиниці ДНК-полімерази Тад
Ноїсїан М (Оіадеп, Маіепсіа, Саїогпіа).
Умови ПЛР були наступними: 12 хвилин при 95 "С для денатурації матричної ДНК; 40 циклів для ампліфікації ДНК (кожен цикл: 5 секунд при 94 "С для денатурації, 15 секунд при 55 "С для відпалу і 30 секунд при 72 "С для подовження); і 30 хвилин при 72 "С для кінцевого подовження.
Аналіз фрагментів. Продукти ПЛР різних пар праймерів піддавали мультиплексному аналізу в кінцевому об'ємі 100 мкл (із використанням автоклавованої води для доведення об'єму до 100 мкл). 0,5 мкл продуктів мультиплексної ПЛР змішували 5 мкл буфера для нанесення. Гелі розділяли на АВЗ37ЗОХІ. ОМА Апаїулег (Арріїєа Віозузіетв) із спектральною матрицею 55-КСТ із використанням стандартних умов. Потім дані імпортували в сСепеМаррегФ версії 4.0 (Арріїєй
Віозузіет5). Імпортували всі кольори барвників і 2 найбільш високі піки із мінімальною інтенсивністю 100 відносних одиниць флуоресценції (пи) позначали. Алелям привласнювали числову величину відповідно до розміру фрагмента ПЛР. Числові показники алелів імпортували в ЕхсеІ"М (Місгозой), де їх конвертували у формати, придатні для доіпМар М 3.0 і Мароті тм 4.0.
Статистичний аналіз
Картування зчеплення. ЧдоіїпМар'М 3.0 використовували для створення карти генетичного зчеплення для популяції Рг лінія А/лінія В. Для доіїпМар'"М 3.0 потрібно один вхідний файл, який позначається як файл генотипу локусу. У файлі генотипу локусу алелі елітної батьківської рослини позначали як "А", алелі донорної рослини позначали як "В", у той час як гетерозиготні алелі позначали як "Н". Відсутні дані відображали тире у файлі генотипу локусу. Результати обчислювали в сантиморганах Козатрі. Карту, отриману в цьому аналізі, порівнювали із загальнодоступною картою (див. 5. Тапд, У. К. Ми, М. В. 5іабацчой, 0. К. 5Впіпіапі, 5. У. Кпарр (2002) бітріє зедпепсе гереаї тар ої Пе зипіомег депоте. ТНеог. Аррі. Сепеї. 105:1124-1136) для кінцевої інтерпретації даних.
Аналіз ОТ. Картування інтервалів для вмісту пальмітинової кислоти проводили із використанням Мароті "М 4,0 для визначення положення потенційного ОТ. Для Марот/ "М 4.0 потрібно три вхідні файли, включаючи файл генотипу локусу, файл карти і файл кількісних даних. Файл генотипу локусу містив коди генотипу для всіх локусів сегрегуючої популяції, як описано вище. Файл карти, отриманий за допомогою доіпМар'мМ 3.0, містив оцінені положення на карті 55 для 27 локусів, наведених у прикладі 5. Файл кількісних даних включав вміст пальмітинової кислоти, визначений із використанням способів аналітичної хімії, які описані у прикладі 1.
Аналіз для картування інтервалів оцінює імовірність розташування ОТ в інтервалі між двома маркерами. Учапзеп (1993) Сепеїйс5 135:205-11. Проводили аналіз для картування інтервалів і обчислювали імовірність того, що СТІ! знаходиться в межах інтервалу. Коли показник ОО перевищував заздалегідь заданий поріг значущості Р«0,05 або Реб,01, обчислений із дослідження із перестановкою із 1000 повторень експерименту (СпигепіїЇ апа
Боегде (1994) Сепеїїсв 138(3):963-71) проводили визначення ОТ. Положення із найбільшим
ГОО на групі зчеплення використовували як оцінене положення ОТІ на карті. Оскільки ця популяція являла собою популяцію Рг було можливим проведення картування інтервалів із використанням статистичної моделі для виявлення ОТЇ, асоційованого із адитивною генетичною мінливістю, окремо, і із використанням статистичної моделі, яка враховувала (ії, таким чином, виявляла) ОТІ, асоційований як із адитивною, так і із домінантною генетичною мінливістю. Раніше визначені дані аналізували із використанням обох моделей.
Приклад 6: Селекція потомства зворотного схрещування за вмістом пальмітинової кислоти
Маркери, описані в даному описі, використовували для селекції потомства, отриманого шляхом розведення способом зворотного схрещування із використанням донорної лінії, яка має алель, асоційований із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти. Елітну лінію із низьким вмістом пальмітинової кислоти, яка становить приблизно 3,595, схрещували із донорною лінією, яка має алелі, асоційовані із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти в локусах НА0О9О7, НАОО41, НА1790, НА1Т665, НАОЗ08 і НА1620. Відібраних отриманих нащадків схрещували із елітною лінією із отриманням першого покоління зворотного схрещування. Відібраних нащадків першого покоління зворотного схрещування знову піддавали зворотному схрещуванню із елітною лінією із отриманням другого покоління зворотного схрещування. Генотип особин другого покоління зворотного схрещування представлений у таблиці 7.
Таблиця 7
Генотипи елітної лінії, яка має фенотип збільшеного вмісту пальмітинової кислоти, і донора із алелями, асоційованими із фенотипом зниженого вмісту пальмітинової кислоти, і селекція у другому поколінні зворотного схрещування цих двох ліній як рекурентної батьківської рослини і донора, відповідно 11111111 Хромосома5д////////ССССсС 11111111 |НАОЗОЯЇ НАОМІ | НАТТООЇ НАТвЕБ| НАОЗ9ОВ | НАТб2О Кінець 17111111 118 | 20 | 25 | зі | з5 | з9 | 55
Зразок 17771 Ї1111Ї111111111Г11111Г11111г111 оМмб725в 17777777 | АА | АА | АА| АЛЛА | АА | АА м51982Ж08..юИЙ/....ю.юЮМ | В.В | В.В | вв| вв'/| вв '|вв| / піна Аа леї ле| ле лені
М51982,841-1-3 та
Оскільки фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти є рецесивним, особина із другого покоління зворотного схрещування, представлена в таблиці 7, сама по собі не має фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти. Для підтвердження того, що алелі, асоційовані із зниженим вмістом пальмітинової кислоти, передають фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти в елітному генетичному фоні, проводили дослідження із якості потомства. Особину, представлену в таблиці 7, піддавали самозапиленню і вісім насінин, які відповідають потомству самозапилення, піддавали аналізу БАМЕ для визначення вмісту пальмітинової кислоти.
Результати, представлені в таблиці 8, демонструють, що три із восьми нащадків мають фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти, що узгоджується із очікуваним співвідношенням один до трьох для рецесивної ознаки, контрольованої одним локусом. Цей результат демонструє, що фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти успадковується потомством.
Таблиця 8
Фенотипи пальмітинової кислоти для восьми особин, отриманих у результаті самозапилення рослини номер 19 із другого покоління зворотного схрещування ОМ6725К|2/М51982.841-1-3 61111128 шипшини
Приклад 7: Селекція лінії нащадків, яка зберігає цитоплазматичну чоловічу стерильність, із підвищеним вмістом пальмітинової кислоти
При комерційному виробництві гібридних насінин соняшнику використовують систему із цитоплазматичною чоловічою стерильністю для отримання необхідних кількостей насінин. Лінія соняшнику в прикладі 6 являла собою лінію-відновника, яка відновлює нормальну фертильність при використанні як запильника із жіночою рослиною, яка має цитоплазму із чоловічою стерильністю. Гібриди, які мають фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти, можна отримувати із чоловічих і жіночих інбредних рослин, які містять алель(ї) ОТ низького вмісту пальмітинової кислоти, зчеплений із маркерами, описаними в даному описі, оскільки фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти є рецесивним. У системі отримання гібриду із цитоплазматичною чоловічою стерильністю інбредні жіночі рослини складаються із двох практично ізогенних ліній: лінія А, яка містить цитоплазму, яка передає чоловічу стерильність; і лінія В, яка має нормальну цитоплазму, але не містить ген-відновник. Лінія В має чоловічу фертильність і її можна використовувати для запилення лінії А, причому отримане потомство має чоловічу стерильність, оскільки вони успадковують цитоплазму із жіночої лінії А. Ці нащадки також, по суті, ідентичні батьківській лінії А, оскільки лінії А і В є практично ізогенними. Таким чином, лінія В відома як підтримуюча лінія. Лінія А походить із лінії В внаслідок використання лінії із цитоплазматичною чоловічою стерильністю як донора і лінії В як рекурентного батька.
Після повторюваного зворотного схрещування із лінією В як рекурентного (чоловічого) батька, генотип лінії В можна відновлювати при збереженні чоловічої стерильної цитоплазми донора.
Отримана лінія відома як лінія А. Першою стадією для створення нової пари лінія А-лінія В є створення нової лінії В. Потім лінію А отримують із лінії В.
Щоб продемонструвати застосовність маркерів, описаних у даному описі, для створення
Зо підтримуючих ліній із цитоплазматичною чоловічою стерильністю, що мають фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти, елітну лінію В із вмістом пальмітинової кислоти приблизно 3,5 95 схрещували із донорною лінією, що має алелі, асоційовані із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти в локусах НАО8Ф5О, НАОЗО7 і НАОЗО8. Інші локуси були мономорфними між донорною і рекурентною батьківською рослиною. Відібраних отриманих нащадків піддавали зворотному схрещуванню із елітною лінією із отриманням першого покоління зворотного схрещування. Генотип особи із першого покоління зворотного схрещування представлений у таблиці 9.
Таблиця 9
Генотипи елітної лінії В, яка має фенотип збільшеного вмісту пальмітинової кислоти, донора з алелями, асоційованими із фенотипом зниженого вмісту пальмітинової кислоти, і відібраних особин першого покоління зворотного схрещування із цими двома лініями як рекурентного батька і донора, відповідно 11111111 Хромосомаб////////СЗО 11111111 1 нловбо | НАОоЮ/ |НАОВОВІ Кінець
Зразок ЇЇ Ї111113 1118 | 35 | 59
ОМм19198 нн и и а т п
Ме1982,8 77иии 1788 | вв '|88| |).
ОМм1919811/СМ19198/
Мет1982,853-1- 17-5 Рослина Я 11 А, А А, В А, В
Для підтвердження того, що алелі низького вмісту пальмітинової кислоти, які є у особини, представлені в таблиці 9, передають фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти в гомозиготному стані, проводили дослідження з якості потомства. Особини у таблиці 9 піддавали самозапиленню і вісім насінин, які відповідають потомству самозапилення, піддавали аналізу
ЕАМЕ для визначення фенотипу вмісту пальмітинової кислоти. Результати, представлені в таблиці 10, демонструють, що два із восьми нащадків мали фенотип низького вмісту пальмітинової кислоти, який узгоджується із очікуваним співвідношенням один до трьох для рецесивної ознаки, яка контролюється одним локусом. Цей результат демонструє, що фенотип із низьким вмістом пальмітинової кислоти можна піддавати інтрогресії в лінію В із використанням розведення способом зворотного схрещування.
Таблиця 10
Фенотипи вмісту пальмітинової кислоти у восьми особин, отриманих шляхом самозапилення рослини номер 11 із першого покоління зворотного схрещування ОМ19198|11)/СМ19198/М451982,843-1-17-5 6111 нини
Приклад 8: Виведення остаточних елітної підтримуючої лінії із цитоплазматичною чоловічою стерильністю і лінії-відновника із підвищеним вмістом пальмітинової кислоти
Після двох поколінь зворотного схрещування відібраних особин піддавали самозапиленню протягом З поколінь і відібрані особини із бажаними агрономічними ознаками піддавали аналізу
ЕАМЕ. Результати, представлені в таблиці 11, демонструють, що остаточні елітні лінії В із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти можуть бути виведені із використанням способу зворотного схрещування.
Таблиця 11
Вміст пальмітинової кислоти в елітних лініях В, виведених із використанням способу розведення за допомогою зворотного схрещування нгБ5івіІзуме1982,12-20-1-4-1-20-07 ом74798І2уМ51982- Вя2-1-5- 12- 10- 01
Після двох поколінь зворотного схрещування відібрані особини піддавали самозапиленню протягом трьох поколінь, і відібрані бажані агрономічні ознаки піддавали аналізу РАМЕ.
Результати, представлені в таблиці 12, демонструють, що остаточні елітні лінії-відновники із фенотипом низького вмісту пальмітинової кислоти можуть бути виведені із використанням способу виведення із зворотним схрещуванням.
Таблиця 12
Вміст пальмітинової кислоти в елітних лініях-відновниках, виведених із використанням способу виведення із зворотним схрещуванням
Назва Вміст пальмітинової кислоти (95 омот6знІдум51982-16-20-2-3-13-7-2-2
ОМм7З85НІЗУМ51982,8-7-2-5-4-2-01
Хоча представлені вище варіанти здійснення докладно описані для чіткості і розуміння, фахівцю в даній галузі із даного опису буде зрозуміло, що можна вносити різні зміни у формі і деталях без відхилення від даного обсягу винаходу. Наприклад, усі технології і пристрої, описані вище, можна використовувати в різних комбінаціях.
СУТ ПЛ ІШИВНОКЕ КИ сх прац чи ня ча» МК беру всвемсевВ., ШеО 40 міні пи, АНеУХ хх шиї є жк пи КЯ У
ЗВізхізанйоціівакх, Малу аск. сах Б
Тек куки т 22. Я іхжксш, ТММ Ж. т мусимо міт МІ укии оцдидехворучт МД Мі кт пити «їійс»У МОлЕКУЦДЯКЕНІ МАРККСИ НИЗЬКОГО ВМІЦІТХ ПоЛЬМІТИНИВИОЇ ББОЛОТИ
НОСИН ЕУ ІБЖЬІАМУВИХ ВЕМОВІО ОСИКА ТУ спАСТСТЕВАНИХ еі5Зз дае 6 «ів бе ок У НН із зер іц екв З. сх з ж УМ я пух - тах сеї З
Ко Тр че ОМ «Ж Ж 0 фШомсмих
Ж Ух жтУчна щи. «НИ «ке пЕфяМмаМ пеамме - марке ЯвоЗзБ БУМ
ШИ 4 уд А
Зкжесозес сива щи жк кт я
АХ 2 «ж ча кА хх Ал сту мих ккжі«ка ДИМ жк м пилу че. хи «ЕХ мОини "еру хктй уко х м зує діжа из щеоУ «шк ВОДО тниЙ мІМаюМеє - маже НАЗЯВ ВОЛІВ
КУ НКЕчни х патрон такту МУ ах г з.
ЖЕКи їх «Ме шо «Вій» ДИК кі» жид ах пЕаМх «кий» Прямий преймер - мариФр НепЕвам МиБОМ «зп ос васа атака за зай я «КАП я «1 ХО о пи «аїія» ДЕК жи печуєакх: «Юа штучна
Оля ем є. ен здичасимеі їй ккд г З
ШОВКУ неозфнУВвМиК преаемьмн) - мМарких неленьв Кищик
«я є яЖж т МУ у пак бек Я зале чехЕз ку же хжЖаА й хжіїйх Й «хм СІК «кійм ЦрУЧчЧНВ ха
За
СИ НКо ітучіужамийу суєта мУржсю ЩА М «ай» Призи піааме У мзеЕее НАХаВЕ «ам ох смена ев у пика ва Зх
Ка ВК Еко Бак р ккАйм В «Міїм й «кіз ВК кій штучна
ТП х. кам хивох ЗБВОоМОосМиий поаиМмев о мМареже МБлЛІЗаЕ «ВМ З завсасвсоста автсасмкак дах ЗХ ха У ве НС ср «ж МА ся сЗіЗ МЕ чаш МИХ «ху дугнчетігі
Ка чекя жтЕЗна «МЕ» и Мігхарнкайі сом: бе ашк доски ТА «ДІ цияшим прашешр У капеею назвав «п 3 «МОУ 7 скоро мя у емЕ ев пах вина запи а кох км В «Ії ХХ «Мій ДИК ур пат ях хе хм шуми «ЖІ «вий х ОББОЮОТМИМ Пра є мМаркше НАХ сх : «кн В чив посвозсавтов о о т
АЕН ВАХ СК ААКАК дх
АЛЬ с хі я кт Бош «ек М я ел ММ се ДЕ «Ай шу чиА при ж вою ух «шах пЕримай пра мер - ШВариви: НАЗаах НВК лот а «З» Ж меми рчиої мулу шк пс скхвссссза сазволиасво сс да «В» 18 «іх 3 ша КИ пам хну жах 0 ТІМ «віх штТУЧчМАа «де кла прсчемтх дм мус свій МОЗОК «ша» ШВОоВОотнийЙй рама «з мзрижи ПЛАЗА МОВОК зом 1 ха» А тав сякта зЕхсксчнстя Ка 3 маь о хз «В» 13 оц у «ій» ЖИ сі тий чхакМа т М
Мене піл: така штузниа тв «жа т тк стххевочи і касі Ко я сукзжеихух МАТЧ «кю таж ия Ше ями З маркер ВУЖ «дл. з «а» 1 асасксчкасма фак «М «Ма У сх чут «жк ллх жи
Зі пик бгаодкш ЗАМ «ЯМ» ШтеЕчна вч «ХЕ ха Вон уМий прайме є вари АЗІЯ «ам Я зЗзгссаввоває звадвадчае ки «Вій У стр -х ях АТ ся сажа ВИК
МНК пес че дух щЩушчна «ВИЙ» пи иея Ттезледатейя УМ хи У дек ге УУчечНни «на» ПшдМмиМй праМмею мавжев МІХ ще хз «і 13 ук имеви Ком гуми жа ззасакзччасс зсласкУвка ас а дО ча «Віа 14 «кА ха шия сту зу АКА КК їх а. проксі
М Ах штучна хх хх ЕНН МиМ прраймет - мережею МАЄТКУ? «В ги з «ЗК 4 сивкоснЬспс вата ії «вій» ІВ «кії» хі «жів НЕ кій щЩкУчНна отут ож де те" Жіердкмать іч о аж спожи, БМК «ай» Прямих працшеро- вах нАЧЬЕа «ЯК і нсвсвеакся свое є щі же 15 кхійж А си с. М кій» й «вій ЛИК ух ніх каїЗв ШшШручна сту «ж «кайЗ» Звовотний праймеюш ос марки; НАБОБа ши їх «Зб Ії зе еехх максяде зд аз«сстЕссвИис слава еац я «Из А
У як ож же В за зт тре жо пиг ле КК еєиа» Штучна
СКЛ о М лют Зеник о сік есе, ех ій з «КЗ» Пюрхщий празйжео - маркер НАзЗшИЄ БОВОХ калом 7
З фо хвіх уж Кам ке и щу ср жу у ткксЗетчавт чезаккоснаке ЗЕ З хкійв ТЕ кадіх ТІ «ій ДНК «ійх ЖуУчЧМ а хх, жк «жі» МЕєжкУтний праймер о маркоо НВіБиО НеичОК хаоп 18 пацевзссост чавосзсксв ста ха «ЖЕ» їЗ сЕМіз щі «Хійт ОПН КЕ «ЕВ теж Нна «МВ ким Прямим преанкечг ее млружим БАЛУ хіЗйх 15
СУ схеми сх ик шк пика тх мЕісвочаайас кс оаютск з ях нот Ех БК як АХ вом «ім ІК я пам и КУ лен Как р М м ЕУ «У чт та НН дотику: ЩЕ Зх чик ЗМІНИ М лрамееюр я макет жна лк а «я серетю уяви прик уже яв
Есе Зашещаи ї18 пут я тех АХА Я
ТК за кА ам
Он піших «КАК АЖ «Кіа ШеУцчна «А са гребні ехо . схо ж тт еаї3- пПримиО премнеею - маска ОВ «ВИ ОД ше Ме км ие КМ штЕсюлтЕшаВо соку кома іх «АХ КЗ «как Я учи ек «кА ДМЕ
Б піхоту ця «ків Штучна
У
«их
НВ ее Ки НАННЯ ую 0 ЕН ЕНКМИУ МО ПММ маркер МОНЕ хімім Ж сжЕ РАВ ою фор точи ші За кЕщеЕцеКе ак РІВ ее ях ви че КО по ча че ІК «33 пе «Же ДЕК «Жах Ще НА
Ту. хо я склиту, с ках сем Мел спрезхесхех ММА ти» ПЕлмнМ драйвер о - мавжеюв КАБ «ЗО иа «са каз КЕ кА «я Ох кад Сх дк Ух КУ «ша пи «кіш ЛКК
Тл ж зу пкАЙХ УЖ ни ше хом чия Ге г. ЧО - вх г- пи зима мах. кВЕ3» Зворотмий праймер ос мМмаркею Мі «ВИ» Я а НН о Я т засмесствас спо посащи са РУ я п «УМ ж «хів хи «хіх» МНЕ ей Вушна ех кинь таза сайт сах кірка Ко ик, ЖИМ ЗЕ Ко ев «із ПИЯМиМ пеайМмеє є Ммавкежш ВМС ЯМ чі ож
Бк У І шКмлюак Кс Кп мМ жа В
ЕМ 15 ен пи «ешїшЖ КАХ ее емо сЕхІа ян пф ухех мл чех Мах я зжмСга щук «Ж» сема жВиМХ кКечамеею х машкхев НЕ цав взЕТЕ «аа Же азсззазиа стае ІЗ кю тк чт «ха ЕІ я я п 1 ха ежшійз МКК кі» штучна пачку кни хх ІрУцеій студради але м мк «МИ3»х Прамих праймер - марево ОБО БТ «ах ХУ у их и; ху вк Ки УК ому те тк сстткоматим БИ сКК т
ХМК х ЖЕ «м зл
СК Е Ми «М засо вище «МІйз М «ші» штТуУучКВ, чт чок ІЛ сит безе кі жезл йди сом слекіі ВЖК б чий» Вони ИЙй ГІБаЙМОг о маркев НАСВКа НІВ г. -д «ОПО да - силь хни В шх, хо - Ме вісстуюсиаст кслескавксє хи «Ей З «із ох «МіХа ДНК «ака ОВУ чКа «Ти В яю х
У ТЕЖ Я гхжа му Щ ша ххх, дими ТЕ мед чиїх драм праймем с шмаркжр МАпІТЯЗ НТК
ЧЕННЯ 5 «Ой» З зсззфавацех сказом ща
«Віз ЛЕ «трата зи хо их «М тити Ні
М Кк чле чих штучна
В
«Ваш
КУТ дулю ми Фея дегукека хо вище «Ж» ЗВІД МРВНиМ Бар з майпкеюв МАО 243 Мм'УБУВ «а ж «За хе
Фон ос базвосзеояа Ко
Ох ж тк М ах «М З «хз ДМК «Ве ШМузна «ах ту Шірчкгахевух сим тв когу -к кока тежав ПЮчМИМ цеайМмеО З маже) НАС «аа ХУ гру же екю Кв в вуж т зичозокащеи век Ке МУ «МА Я кл х З пк ек ЗУ у и я АХ Ка доли Спок «ха» штучна «вах
А доки мк еУ др оно дл тонку дж Вих хажлх ЗЕЦЮСЕМИМ пу Е мате НЕТ хамох ЗЕ ацетат Ес ЕК м «ЗВійх 3
ОТ Ж зх «ЖАХ хи сру. тлівх «ет 0 СМАК «ЯМ е щЩилечна еВшйо оо пек Гітара ста йкеюто Е сук ІДИ ВИЙ «Ех прямний преакем З марні ВеЧЧСТ «Ве 33
Ус и ато тку ЗІ савещавсавс осоавевсеку Е хи» 34 ха ЕЙ хаїйх ДЖ еру Ав «ку штучна пос не жом я клен чи У то жумоск КЕ чек ситний рраймаю оз масксюЕ БАХ ЗИ еайлз За і ум, яжчх ние ча у й
Касвеацуваєс саксаоуая с до «г да
КАМ ил аку НЕК
Кен зу кліше кій ДЕК ее пегУс вх хвіЗз» ШрУчмВ «Ем «хм ПрамиМм повимеє - мошкещже МаоБісв ЯТаВ ї Ї Ї Е як й ! «аз 35 ссекозакстх ссакавосо хв чай ЖЕ кі І ср сце км ВБИА сх Мах сівім «ій» кучна «ВМО «ЕК» ЗаегУжМмниИ пИрдамею є Марка МАСІ ЗБ
В Е ї СУ РЕ «ай» ДЕ сахумеана сосна хх каїйх 8
Попа «шіїх ик «вах ДЕК «вій шРуЧчнВ стук, «хх кашах пПІИДЕМа праквт - мМашкею МАЕЗаЗ «со р «Зб 7 аззссавзазає Коза са Ку «71 м. сяк «10 МВ ож «Кі Кі уч уп «ках ДИКЕ ча штучна «Ва «ВЕ дворами чзрайеее є вавкши ВУЗИ З «ам ЖЕ сазасаскжиа доопаав хі «Мі їх 7 о СЕ. кож 1 ж КЗ
Не ДН евіха ДИ Е -МАЗе Штучна «ВИ са У я Ткужст кое укла КЛ СС та хлор «ект «їз Прямим сраймек о - маркерн АТЗ З МЖІЗаТтВ ТЕ В «лм ЗЕ сапазазнсва КлудствавО зала хо «іти дк «вай» ТИ ж ск хЖ же
АЖ МУ ДН ча плач езксї чі щеІжчна гола
Кая ха смс ха Еелу справі МІЙ СК ЩОСЬ зх МТ АС зт ц «жів» Мворттний лрайеер - мавжхоери НдАІЗЕЗА м нНАЇЗАТВ ВТІК «ал» 55 ожихщ самок жу І и «ж ту
Ваша Клея я хі ст Ще «мя ОКХ «МЕ М «їй» лик ша проку «ХУ» ще жиНа ель
Б я яра тТлохушо Фо сего плитки Щі пак екс МИямий прави З майкЕею НЬВіВ НВО «аж 4 панам чн чим т щих осшашо скат я «1» 45 кеьши кл
ФІ АК сюч охо зн «кіз КК еЕаз пре шчна майя до лЕмак мі зах ст че свемтомеу ВИ шум «шеааз В прижня й опюеИиВшЕ - маше лів х МеВ
УЧ З
ОКХ Же р в и ЧТ ку иа сет іве ах ру сша п що
С НЕ ЗКІ сх -кх
АХ «М «Кі ЯКЕ
Са 00 Моекорух мкА УЧ. ще хх г тією Уха ех смш'єтеух ВТ КВ ее ПИяКИМХ МЕМ МеНе майки Пе «Шрю» 3 м и нн Я кокс е саневкевща з «ХУ» аа чі» Ж «ій ДЕК сао ь Я ліжка а не
ЕН ках дужки вві ВЕ му вХ о блоюрчітєчть ВІЙОК ЗА «ке» ЗвоювихаВИи прайимеюв є варксев ЯВИ За и ЕАЧ «ЗИ ж ще тд
ДМ ВК КИ КВ. У запи тк а ва с х «аз ї хі
НА пІКІА сій» ДЕК зх чи «М33з Штучна зей
КМ
«аа Прямих праймер с мар» НАХІВИ «ЗП» 55
КхоессзавиЕ сдецкчкамо ХХ май дк кий ВЕ 3 ку кА и «війм МАК «вай ШУ чНМІ «Ел» зу деуюютвмЕ пеакмат з мадтиком МА: «ха» ЗворсетнММ праймер з маркер НАТО
ОК, хх «жо» а паскасаваик со ВЕВІМІМК КлиХ х «ій» 87
ОК З 5 «ЖУК А з ще «їх» ДК заз. масі м «жів Щтучна 7 кре «ам
Ед 1. Хо та ек и. кі «из паичшУМ порами Кох Маре кАОСЯХ че - «з 47 очи и М іх нихазосазвиса зако ух ножі «й
ФМ Ж
Тл жи ж ще «Вій» ЛКК
СЬО пабу с ж 0 ши ких киіх даюрехмиМ прзамем с марке НАПІВ і «Об» З ач за еле со ссече З «хі 8 ве 4
ЖАВ КО
«те пе ше хх МАЛ
ЕМ» тУчна «ХІІ сЕшіз Прямим праймер ее арквю МАЗІ «зпоз 45 пптдствчощучю діт ча реч зшх ях
Ума М шу сьВВваиа МК Ко «іп хх
НЯ Я кві х й хій ДИЖК у, плозхит мо киш Штучна
«Зд3» зворотний прейвер ос майкев НІМ «ше НЕ хеслазсназа везе кощкс бою и «МО» щі «хз» Де ЩщНа их «пд» ЗУ ссасасатя зЗбосвасча У В «Вій» З «рій» ДМК «й мужа «иа ЗвОрОЖниМ превмар о мареею НМТ ЗУ хай» 5 зчсасжакжа зем вааяе ж

Claims (10)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб ідентифікації рослини або генетичного матеріалу соняшнику, що має низький вміст пальмітинової кислоти, причому спосіб включає: ампліфікацію з геномної ДНК рослини або генетичного матеріалу соняшнику щонайменше одного маркера, зчепленого з низьким вмістом пальмітинової кислоти, де щонайменше один маркер вибраний з групи, що складається з НАОЗО4А, який має нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 25, НАО743, який має нуклеотидну послідовність 560 ІЮ МО: 29, і НАОбІ12А, який має нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 35, для отримання амплікону маркера, де ампліфікація включає: змішування праймера для ампліфікації або пари праймерів для ампліфікації з нуклеїновою кислотою, виділеною з рослини або генетичного матеріалу соняшнику, де праймер або пара праймерів комплементарні або частково комплементарні щонайменше частині маркера і здатні ініціювати полімеризацію ДНК ДНК-полімеразою з використанням нуклеїнової кислоти соняшнику як матриці; і виявлення щонайменше одного амплікону маркера.
2. Спосіб за п.1, де виявлений маркер має частоту генетичної рекомбінації менше ніж приблизно 1095 щонайменше з одним маркером з НАООЗІВ, який має нуклеотидну послідовність ЗЕОО ІЮ МО: 19, НАОЗ9О8, який має нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21, НА1665, який має нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 23, НАОЗО4А, який має нуклеотидну послідовність ЗЕ ІЮ МО: 25, НАО8Ф50, який має нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 27, НАО743, який має нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 29, НАО870, який має нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 31, НАОЗ9УО7, який має нуклеотидну послідовність ЗЕО ІО МО: 33 і НАОб12А, який має нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО: 35.
3. Спосіб за п. 1, де генетичний матеріал являє собою лінію соняшнику або сорт соняшнику.
4. Спосіб за п.1, де виявлення включає виявлення щонайменше однієї алельної форми поліморфного простого повтору послідовності (55). Зо
5. Спосіб за п. 1, де ампліфікація включає використання полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або лігазної ланцюгової реакції (І СК) із використанням нуклеїнової кислоти, виділеної із першої рослини або генетичного матеріалу соняшнику, як матриці в ПЛР або І СК.
6. Спосіб за п. 1, де виявлений маркер визначають із використанням популяції для картування н757в/Н2гВоВ.
7. Спосіб за п. 6, де виявлений маркер визначають із використанням програмного забезпечення, вибраного із ТА55ЕЇ М, СепеБРіом/"М ії Мармападег-ОТХ М,
8. Спосіб за п. 1, де спосіб включає електронну передачу або електронне збереження даних, які відповідають виявленому маркеру, на зчитуваному комп'ютером носії.
9. Спосіб за п. 1, де екзогенна нуклеїнова кислота відповідає відкритій рамці зчитування (ОКР), яка кодує поліпептид, який при експресії в рослині соняшнику приводить до рослини соняшнику, яка має знижений вміст пальмітинової кислоти.
10. Спосіб за п. 1, де екзогенна нуклеїнова кислота містить експресуючий вектор. іх ! ек кма ФЕОЕ- Б й 5 ; 1їзї КЗ їй се ваз ! й : ЗАБЕЗ : С Я пец : й Е Ж: Ж РО» КАВА ши ! яке у і сх і ЖІ : ЩІ : фюЕеівиНЯ ; ЗВ щ : ВІ ЖК Од не.
UAA201411351A 2012-03-20 2013-03-15 Спосіб ідентифікації рослини соняшнику, яка має низький вміст пальмітинової кислоти UA118173C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261613383P 2012-03-20 2012-03-20
PCT/US2013/032217 WO2013142348A1 (en) 2012-03-20 2013-03-15 Molecular markers for low palmitic acid content in sunflower (helianthus annus), and methods of using the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA118173C2 true UA118173C2 (uk) 2018-12-10

Family

ID=49213625

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201411351A UA118173C2 (uk) 2012-03-20 2013-03-15 Спосіб ідентифікації рослини соняшнику, яка має низький вміст пальмітинової кислоти

Country Status (12)

Country Link
US (2) US10036029B2 (uk)
EP (1) EP2828406A4 (uk)
CN (2) CN104736721B (uk)
AR (1) AR090446A1 (uk)
AU (1) AU2013235401A1 (uk)
CA (1) CA2867535A1 (uk)
CL (1) CL2014002470A1 (uk)
HK (1) HK1209794A1 (uk)
RU (1) RU2670517C2 (uk)
UA (1) UA118173C2 (uk)
WO (1) WO2013142348A1 (uk)
ZA (1) ZA201407257B (uk)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108103156A (zh) * 2018-02-08 2018-06-01 苏州百源基因技术有限公司 用于检测葵花dna的特异性引物和探针及实时荧光定量pcr试剂盒
CN108396074B (zh) * 2018-05-10 2019-04-02 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 基于白三叶转录组序列开发的est-ssr引物组及其应用
CN109868330B (zh) * 2019-04-22 2022-03-11 山东省农作物种质资源中心 一种基于RNA-Seq开发的小扁豆EST-SSR标记及应用
CN112626257B (zh) * 2020-12-29 2022-04-22 华智生物技术有限公司 一套检测向日葵品种纯度的snp分子标记及其应用
CN113584201B (zh) * 2021-07-09 2023-05-16 中国农业科学院油料作物研究所 与花生棕榈酸、油酸、亚油酸含量关联的分子标记ahgs2050及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4407956A (en) 1981-03-13 1983-10-04 The Regents Of The University Of California Cloned cauliflower mosaic virus DNA as a plant vehicle
WO1985001856A1 (en) 1983-11-03 1985-05-09 Johannes Martenis Jacob De Wet Method for the transfer of exogenous genes in plants using pollen as a vector
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5276264A (en) 1991-01-09 1994-01-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sunflower products having lower levels of saturated fatty acids
EP1042507B1 (en) 1997-12-22 2008-04-09 Pioneer-Hi-Bred International, Inc. Qtl mapping in plant breeding populations
WO2001049104A2 (en) 1999-12-30 2001-07-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Mqm mapping using haplotyped putative qtl-alleles: a simple approach for mapping qtl's in plant breeding populations
RU2265668C1 (ru) * 2004-09-15 2005-12-10 Общество с ограниченной ответственностью Инновационная Корпорация "БИОЗАЩИТА" Набор праймеров для детекции и/или идентификации трансгенных последовательностей днк в растительном материале и его содержащих продуктах (варианты), праймер (варианты), пара праймеров (варианты), способ детекции и/или идентификации с их использованием (варианты) и устройство для осуществления способа
RU2489849C2 (ru) * 2007-12-20 2013-08-20 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Подсолнечник с низким содержанием насыщенных жиров и соответствующие способы
BRPI0908510A2 (pt) 2008-02-12 2015-08-18 Dow Agrosciences Llc Mutação de prematuridade dominante e gene em girassol (helianthus annuus)
US8710295B2 (en) 2010-05-10 2014-04-29 Pioneer Hi-Bred International Inc Soybean sequences associated with the FAP3 locus

Also Published As

Publication number Publication date
HK1209794A1 (en) 2016-04-08
RU2014142022A (ru) 2016-05-10
RU2670517C2 (ru) 2018-10-23
AR090446A1 (es) 2014-11-12
AU2013235401A1 (en) 2014-10-16
WO2013142348A1 (en) 2013-09-26
CL2014002470A1 (es) 2015-01-16
EP2828406A1 (en) 2015-01-28
US20180371483A1 (en) 2018-12-27
ZA201407257B (en) 2016-08-31
CN104736721A (zh) 2015-06-24
US10036029B2 (en) 2018-07-31
US20130254927A1 (en) 2013-09-26
CA2867535A1 (en) 2013-09-29
CN104736721B (zh) 2019-02-01
EP2828406A4 (en) 2016-02-10
CN107502670A (zh) 2017-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10472684B2 (en) Methods and compositions for producing brachytic corn plants
US10577623B2 (en) Quantitative trait loci (QTL) associated with shatter resistant capsules in sesame and uses thereof
US11445692B2 (en) Quantitative trait loci (QTL) associated with shatter resistant capsules in sesame and uses thereof
CN105256031B (zh) 利用高通量分子标记转育甜瓜雌性系的方法及其专用引物
US20180371483A1 (en) Molecular markers for low palmitic acid content in sunflower (helianthus annus), and methods of using the same
WO2020036950A1 (en) Molecular markers for blackleg resistance gene rlm1 in brassica napus, and methods of using the same
CN107099588B (zh) 用于鉴定陆地棉早熟性的ssr标记的开发及其应用
BRPI0916265B1 (pt) Método de selecionar uma planta de soja ou germoplasma com tolerância ou tolerância melhorada a herbicidas que inibem a função de protoporfirinogênio oxidase, método de rastrear soja para determinar a presença ou ausência de um lócus de traço quantitativo associado com tolerância a herbicidas que inibem a função de protoporfirinogênio oxidase
US10561084B2 (en) Molecular markers for blackleg resistance gene rlm2 in brassica napus and methods of using the same
CN113736910A (zh) 花生单株荚果数主效QTL位点qPN7的连锁分子标记及其应用
US9161501B2 (en) Genetic markers for Orobanche resistance in sunflower
CN113278723B (zh) 合成芥菜中导入的白菜基因组片段或遗传多样性分析的组合物及应用
US10793918B2 (en) Molecular markers for blackleg resistance in canola and methods of using the same
US20210315177A1 (en) Molecular markers for blackleg resistance gene rlm7 in brassica napus, and methods of using the same
CN117887885B (zh) 大豆油分含量相关主效单核苷酸多态性位点及其应用
Tian et al. Genetic analysis methods of quantitative traits in wheat