CN104736721A - 向日葵(Helianthus annuus)低棕榈酸含量的分子标记及其使用方法 - Google Patents

向日葵(Helianthus annuus)低棕榈酸含量的分子标记及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及用于鉴定具有低棕榈酸含量表型的向日葵植物的方法和组合物。一些实施方案涉及用于鉴定、选择、和/或构建低棕榈酸含量的植物和种质(germplasm)的分子标记，或者用于鉴定和反选择(counter-select)相对高棕榈酸含量的植物的分子标记。本公开还涉及通过利用至少一种本文所述标记的方法产生的具有低棕榈酸含量表型的向日葵植物。

Description

向日葵(Helianthus annuus)低棕榈酸含量的分子标记及其使用方法
优先权声明 
本专利申请要求获得美国临时专利申请系列号61/613,383的利益，其于2012年3月20日提出申请。
技术领域
本公开涉及用于鉴定具有低棕榈酸含量的向日葵植物的组合物和方法，其中该方法是用分子遗传标记鉴定、选择和/或构建低棕榈酸含量植物。本公开还涉及通过本发明方法产生的显示低棕榈酸含量的向日葵植物。
背景
栽培向日葵(Helianthus annuus L.)是全世界植物油的一个主要来源。在美国，每年种植大约400万英亩向日葵，主要位于达科他州(Dakotas)和明尼苏达州(Minnesota)。
在过去十年里，美国种植的向日葵英亩数非常快速地扩大，这部分地是由于向日葵育种和品种改良领域中的数项重要进展，包括细胞质雄性不育和育性恢复基因的发现。这一发现允许产生杂交向日葵。如此产生的杂交体在20世纪70年代早期被引入。关于向日葵细胞质雄性不育(CMS)和遗传育性恢复的描述见Fick,“Breeding and Genetics”，《向日葵科学与技术》(Sunflower Science and Technology)第279-338页(J.F.Carter编辑.1978)。
葵花籽油主要包含棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)等脂肪酸。尽管植物中还存在其它的不常见脂肪酸，但是棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸占世界植物油产量中存在的脂肪酸的大约88％。J.L.Harwood,“Plant Acyl Lipids:Structure,Distribution and Analysis,”4Lipids:Structure and Function,P.K.Stumpf和E.E.Conn编辑(1988)。棕榈酸和硬脂酸是饱和脂肪酸，在某些研究中已经证明了它们促成血浆胆固醇水平的增加，这种增加导致冠状动脉心脏病发展的一个因素。根据最近的研究，不饱和脂肪酸(如油酸和亚油酸)含量高的植物油可能具有降 低血浆胆固醇的能力。
一般而言，饱和脂肪酸还具有比相同碳数目的不饱和脂肪酸更高的熔点，这促成食物的耐冷性(cold tolerance)问题，并会进一步促成摄入过程中食物在口中的蜡质感(waxy)或油腻感。也已经知道，用饱和脂肪酸低于大约3％的脂肪和油制成的食品通常每人份(serving)含有少于0.5克的饱和脂肪，因此在目前的标记监管制度(labeling regulation)下可以被标记为含有“零饱和脂肪”。
任何新的、理想的植物种质的开发都包含许多步骤。植物育种程序将来自两个或多个栽培种或来自广泛多样来源的期望性状组合成育种池(breeding pool)，通过自交和选择期望的表型从育种池开发栽培种。对新的栽培种进行评估，以确定哪些具有商业潜力。植物育种首先是分析和确定现存种质的问题和缺点，建立项目目标，和定义具体地育种目的。下一步是选择具有满足项目目标的性状的种质。目标是在单一品种中组成来自亲本种质的期望性状的改良组合。这些重要的性状可以包括更高的种子产量、对疾病和昆虫的抗性、更好的茎和根、对干旱和热的耐受性，和更好的农艺学品质。
育种或选择方法的选择取决于植物繁殖的模式、被改良性状的遗传性、和商业上使用的栽培种的类型(例如F1杂交栽培种、纯系栽培种等)。对于高度可遗传的性状，选择在单一地点评估的优越植物个体可能是有效的，而对于遗传性低的性状，应当基于对近缘植物的家族的重复评估所得的平均值进行选择。流行的选择方法通常包括种系谱选择、改良系谱选择、混合选择(mass selection)和轮回选择(recurrent selection)。
遗传的复杂性影响育种方法的选择。回交育种用于将一个或少数几个对高度可遗传的性状有利的基因转移到理想的栽培种中。这种方法已被广泛地用于选育疾病抗性栽培种。多种轮回选择技术已用于改良由多个基因控制的数量遗传性状。轮回选择在自花受粉作物中的使用取决于授粉的容易度、每次授粉成功杂交的频率、和来自每次成功杂交的杂交后代的数目。
每个育种项目应当包括对选育方法效率的周期性客观评估。评估标准随着目标和目的而变化，但是应该包括每年的来自选择的增益(gain from selection)(基于与合适标准的比较)，高级育种系(advanced breeding line)的总价值，和每单位投入(例如每年、花费的每一美元(每一磅)等)产生的成功栽培种的数目。然后，对有前景的高级育种系进行彻底的测试，并与代表商业 目标区的环境中的合适标准品进行比较三年以上。从最佳的系中选出新的商业栽培种的候选者；那些在少数几个性状上仍有不足的系可以作为亲本用以产生供进一步选择用的新群体。这些过程，最终通向上市(marketing)和销售(distribution)的步骤，从进行第一次杂交的时间算起通常花费8-12年。因此，新栽培种的开发是耗时的过程，需要精确的预先计划、资源的高效使用、和最低限度的方向变化。
植物育种中最困难的任务是鉴定遗传上优越的个体。鉴定优越植物的一种方法是观察其相对于其它实验植物和广泛种植的标准栽培种的性能(performance)。如果单次观察没有结论，则重复观察可提供对其遗传价值的更好评估。这个任务非常困难，因为(对于大多数性状而言)真实基因型价值被其它混杂的植物性状或环境因素掩盖。
向日葵植物育种的目的是开发新的、独特的、并且优越的向日葵栽培种和杂交体。育种者最初选择并杂交两种或更多种亲本系，接着进行重复的自交和选择，产生许多新的遗传组合。理论上，育种者能够通过杂交、自交和诱变产生数十亿种不同的遗传组合。这样的育种者对该过程没有细胞水平上的直接控制。因此，两个育种者绝不会开发出具有相同向日葵性状的相同系，或者甚至非常类似的系。
每年，植物育种者选择种质来推进到下一世代。在独特且不同的地理、气候和土壤条件下种植该种质。然后，在生长期期间和结束时进行进一步的选择。发展出的栽培种是不可预测的。这种不可预测性是由于育种者的选择所致，该选择发生在独特的环境中，且无法在DNA水平上进行控制(使用常规的育种方法)，并且会产生数百万种不同的可能的遗传组合。具有本领域普通技术的育种者无法预测他所开发的最终所得品系，至多可能以非常粗略且概括的方式进行预测。类似地，同一育种者无法使用完全相同的初始亲本和相同的选择技术产生相同的栽培种两次。这种不可预测性导致优越的新型向日葵栽培种的开发要花费大量的资源、金钱等。
新的向日葵栽培种的开发要求开发和选择向日葵品种、杂交这些品种、和选择优越的杂交体杂交。通过在选定的雄性能育亲本之间的人工杂交或者通过使用雄性不育系统来产生杂交种子。对这些杂交体选择可表明种子确为杂交体的某些单基因性状(例如荚果颜色、花的颜色、短柔毛(pubescence)的颜色、和除草剂抗性)。关于亲本品系，以及杂交体表型的数据影响育种者 决定是否继续特定的杂交体杂交。
谱系育种通常用于改良自花授粉的作物。在谱系育种中，将两种具有有利的、互补性状的亲本杂交以产生F1后代。通过使一个或数个来自F1后代的植物自交产生F2群体。对最佳个体的选择可以从F2群体中开始；然后，从F3中开始，选择最佳家族中的最佳个体。为了提高对具有低遗传性的性状的选择有效性，可以在F4代中开始对家族进行重复测试。在育种的后期(例如F6和F7)，对最佳的系或具有相似表型的系的混合物进行测试，考察作为新栽培种的推出潜力。可以使用混合和轮回选择来改善自花授粉或异花授粉作物的群体。通过使数种不同亲本互交来鉴定或创建遗传可变的杂合个体群体。基于个体优越性、突出的后代、或优越的组合能力来选择最佳的植物。使选出的植物互交以产生新的群体，在其中可以继续进一步的选择循环。
回交育种已经被用于将简单并且高度可遗传的性状的基因转移到期望的纯合栽培种或近交系中，这样的纯合栽培种或近交系是轮回亲本。要转移的性状来源称作“供体亲本”。所得的植物预期具有轮回亲本(例如栽培种)的属性和从供体亲本转移的期望性状。初始杂交后，选择具有供体亲本表型的个体，并与轮回亲本重复杂交(回交)。所得的植物预期具有轮回亲本(例如栽培种)的属性和从供体亲本转移的期望性状。
在向日葵育种中，“单粒传方法”(single-seed descent procedure)是指种植分离群，随后从每株所得植物收获一粒种子样品，并使用所收获这一粒种子样品种植下一世代。当群体已经从F2代推进至期望的近交水平时，品系所来源的植物会各自回溯至不同的F2个体。群体中植物的数目每代都下降，这是由于一些种子不能萌发或者一些植物不能产生哪怕一粒种子。结果，当完成世代进度时，并不是所有最初在群体中取样的F2植物都会由后代代表。
在多种子方法(multiple-seed procedure)中，向日葵育种者通常从群体中的每株植物收获种子，并使它们脱粒在一起以形成一大批(bulk)。使用该大批的一部分来种植下一世代，而一部分进行保存。该方法被称为改良的单粒传方法。多种子方法被用来节约收获时的劳动力。用机器取下种子比单粒传方法中用手从每株取下一粒种子快得多。多种子方法还使得人们有可能为每个近交世代种植相同数目的群体种子。收获足够的种子来补偿那些不萌发或不产生种子的植物。
合适的测试应当检测任何严重的错误，并建立新栽培种相比于现有栽培 种的优越或改良水平。除显示优越的性能之外，应当需要符合产业标准相容或者开拓新市场的新栽培种。推出新栽培种前的测试应当考虑研究和开发成本以及最终栽培种的技术优越性。由于专门需要的广告和营销、种子和商业生产实践的改变、和新产品的利用，新栽培种的引入可能而使种子生产者、种植者、加工者和消费者承受额外的成本。对于种子繁殖的栽培种，容易且经济地产生种子必须是可行的。
植物育种者的目标是选择植物和富集具有期望性状，例如降低的棕榈酸含量，的个体的植物群体，最终导致农业生产率的提高。与前述一致，向日葵育种者的持续目标是开发稳定、高产率、农艺学上稳固的栽培种。当前的目标包括使所用土地上生产的谷粒量、以及对动物和人类的食物供应最大化。为了实现这些目的，向日葵育种者必须选择和开发具有可产生优越栽培种的性状的向日葵植物，并以成本效率最高的方式实现它。分子标记可以标记辅助选择(MAS)过程中使用，帮助鉴定和选择具有与标记连锁的遗传属性的个体或个体的家族。
公开
与低棕榈酸含量连锁的分子标记可用来易化向日葵中低棕榈酸含量性状的标记辅助选择。与棕榈酸含量分型(phenotyping)相比，标记辅助选择在时间、成本和劳动力方面可提供显著的优势。本文公开了经鉴定位于向日葵基因组的低棕榈酸含量QTL区域内或其附近的特定标记，这些标记在亲本基因型中是多态性的，并与低棕榈酸含量表型连锁(例如紧密连锁)。这些标记在具有低棕榈酸含量的向日葵植物和栽培种的标记辅助选择中提供了优越的效用。
本文描述了鉴定显示低棕榈酸含量的第一向日葵植物或包含在这种向日葵植物内的种质的方法。在一些实例中，显示低棕榈酸含量的第一向日葵植物或种质可以是所含棕榈酸含量比该第一植物或种质的亲本植物或种质内所观察到的低(即降低)的植物或种质。在一些实例中，显示低棕榈酸含量的第一向日葵植物或种质可以是所含棕榈酸含量比和该第一植物或种质同属于相同物种(例如向日葵)的特定常规植物或种质内所观察到的低(即降低)的植物或种质。这些方法的一些实施方案可以包括检测该第一向日葵植物或种质内的至少一个与低棕榈酸含量连锁的标记，其中该至少一种标记选自下 组：HA0031B；HA0908；HA1665；HA0304A；HA0850；HA0743；HA0870；HA0907；HA0612A；以及与HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,和HA0612A中的至少一个连锁(例如紧密连锁)的标记。
还描述了产生具有低棕榈酸含量的向日葵植物或种质的方法。这些方法的一些实施方案可以包括将至少一个与低棕榈酸含量连锁的标记从第一向日葵植物或种质基因渗入到第二向日葵植物或种质中，以产生很可能具有低棕榈酸含量的向日葵植物或种质。在这些实例中，该至少一个标记选自下组：HA0031B；HA0908；HA1665；HA0304A；HA0850；HA0743；HA0870；HA0907；HA0612A；以及与HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,和HA0612A中的任一个连锁的标记。在一些具体的实施方案中，还包含通过前述方法产生的向日葵植物或种质。
一些实施方案包括用于产生转基因向日葵植物的方法。这些方法的实例可以包括将一个或多个外源核酸分子引入到目标向日葵植物或其后代中，其中该一个或多个外源核酸分子中的至少一个包含与至少一个标记连锁的向日葵基因组核苷酸序列，所述至少一个标记与低棕榈酸含量连锁；或者其中该一个或多个外源核酸分子中的至少一个包含能够与如下所述的核苷酸序列特异性杂交的核苷酸序列：该核苷酸序列与至少一个标记连锁，该至少一个标记与低棕榈酸含量连锁。与低棕榈酸含量连锁的标记可以选自下组：HA0031B；HA0908；HA1665；HA0304A；HA0850；HA0743；HA0870；HA0907；HA0612A，以及与HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,和HA0612A中的任一个连锁的标记。在某些实例中，前述方法用于产生转基因向日葵植物，所得转基因向日葵植物可以包含低棕榈酸含量。
一些实施方案包括用于鉴定可能包含低棕榈酸含量的向日葵植物的系统和试剂盒。这些系统和试剂盒的具体实例可以包括一系列核酸探针，它们各自包含能够与如下所述的核苷酸序列特异性杂交的核苷酸序列：该核苷酸序列在向日葵中与至少一个标记连锁，所述标记与低棕榈酸含量连锁。在向日葵中与低棕榈酸含量连锁的标记可以选自下组：HA0031B；HA0908；HA1665；HA0304A；HA0850；HA0743；HA0870；HA0907；HA0612A，以及与HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870, HA0907,和HA0612A中的任一个连锁的标记。用于鉴定可能包含低棕榈酸含量的向日葵植物的系统和试剂盒的具体实例还可以包括检测器，其配置为检测一个或多个来自该系列核酸探针或其扩增子的信号输出，藉此鉴定该至少一个与低棕榈酸含量连锁的标记的存在或不存在。具体的实例包括将该至少一个标记的存在或不存在与棕榈酸含量降低关联的指令。
附图简述
图1包括一幅GC-FID FAME色谱图，显示通过与甲基酯参考标准的保留时间进行比较而鉴定的棕榈酸甲基酯峰。基于总积分峰面积，为参考标准中的所有分析物计算了单独的百分比面积。还注射了一个庚烷空白样，用于鉴定GC上的任何污染。
图2包括一幅图形显示，展示23,040个样品的棕榈酸含量的分布。描述该分布的值在下面的表1-2中给出。
图3包括由一个优良向日葵品系与一个具有低棕榈酸含量的品系杂交获得的384个个体的F2群体的棕榈酸含量的柱状图。
图4包括向日葵中连锁群5(LG5)上的一个低棕榈酸含量主要基因座的示意图。已经鉴定了数个SSR标记与所描述的基因座紧密连锁或者在其侧翼。
图5包括低棕榈酸含量基因座与数个SSR标记之间的连锁情况的示意性表示，显示了LG5上的主要低棕榈酸QTL的位置。Y-轴上显示LDO得分，x-轴上以cM为单位显示标记与基因座的距离。LOD得分是通过使用Map QTL软件程序(J.W.Van Ooijen,M.P.Boer,R.C.Jansen,C.Maliepaard(2002)Map QTL 4.0:software for the calculation of QTL positions on genetic maps,Plant Research International,Wageningen,The Netherlands)实现的多区间协议(multiple interval protocol)确定的。
实施本发明的模式
I.数个实施方案概览
有许多理由期望产生具有低棕榈酸和硬脂酸水平，以及高油酸和亚油酸水平的葵花籽油。本发明的实施方案包括，例如，用于鉴定含有低棕榈酸含量的向日葵植物和/或携带可预测和确定低棕榈酸表型的基因型的种质的组 合物和方法。在一些实施方案中，包含制作这些向日葵植物和种质的方法。这些方法可以包括，例如但不仅限于，期望的低棕榈酸含量标记等位基因的基因渗入和/或遗传转化方法。具体的实施方案中包括通过这些方法制作的向日葵植物和/或种质，例如前文所述的。用于选择含有低棕榈酸含量的向日葵植物和/或携带可预测和确定低棕榈酸表型的基因型的种质的系统和试剂盒也是某些实施方案的特征。
使用MAS鉴定和选择含有低棕榈酸含量的向日葵植物能够提供高效且环境友好的产生具有期望油含量的植物的方法。本发明的实施方案提供了若干向日葵标记基因座和QTL染色体区间(QTL chromosome interval)，它们与低棕榈酸含量展现统计学上显著的共分离(因此可以预测和确定低棕榈酸含量)。对这些标记，或者与这些标记连锁因此与之等价的额外基因座的检测可用于标记辅助向日葵育种程序，以产生低棕榈酸含量植物和种质。
一些实施方案提供了用于鉴定显示低棕榈酸含量的第一向日葵植物或种质(例如品系或品种)的方法。在一些实施例中，在第一向日葵植物或种质中检测一个或多个与低棕榈酸性状连锁的(例如紧密连锁的)的标记基因座(例如多个标记基因座)的至少一个等位基因。标记基因座可以从图4的基因座中选出，包括：HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,HA0612A，和与至少一个前述QTL标记连锁的其它标记。
在一些实例中，可以在相同的植物或种质中选择或鉴定多个标记基因座。例如，要在植物或种质中选择或鉴定的多个标记基因座可以包括HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,HA0612A，和与至少一个前述QTL标记连锁的其它标记的所有组合。
在一些实施方案的方面中，向日葵植物的棕榈酸含量可以用本领域已知的任何合适的手段或方法加以定量。
II.缩写
AFLP                  扩增片段长度多态性
ASH                   等位基因特异性杂交
CCD                   电荷耦合装置
EST                   表达序列标签
FAME                  脂肪酸甲酯
FID                   火焰离子化检测器
GC                    气相色谱
LCR                   连接酶链式反应
LG                    连锁群
LNA                   锁定核酸
LOD                   对数几率(以10为底数)
MAS                   标记辅助选择
NASBA                 基于核酸序列的扩增
NIR                   近红外(谱)
NMR                   核磁共振(谱)
ORF                   开放阅读框
PCR                   聚合酶链式反应
PNA                   肽核酸
QTL                   数量性状基因座
RAPD                  随机扩增多态性DNA
RFLP                  限制酶片段长度多态性
RT-PCR                逆转录酶-PCR
SNP                   单核苷酸多态性
SSCP                  单链构象多态性
SSR                   简单序列重复
III.术语
如本申请书包括权利要求中所使用的，除非明确地另有定义，否则单数和单数形式的术语，例如“一”、“一个”和“该”包括多个指示物。因此，例如，对“植物”、“该植物”或“一种植物”的指示还包括多个植物。而且，根据上下文，术语“植物”的使用还指该植物在遗传上相似或相同的后代。类似地，术语“核酸”可以指核酸分子的许多拷贝。类似地，术语“探针”可以指许多相似或相同的探针分子。
数字范围包括界定该范围的数字，并且包括该界定范围内的每一整数和非整数分数。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员所普遍理解的相同的含义。
为了方便回顾在本公开中描述的各种实施方案，提供了特定术语的如下解释：
分离的：“分离的”生物组分(例如核酸或蛋白质)是与该组分天然存在的生物体细胞中的其它生物组分(即其它染色体或染色体外DNA和RNA，和蛋白质)基本上分离的、分离产生的、或纯化的，同时影响该组分的化学或功能变化(例如核酸可以通过断裂连接该核酸与染色体中其余DNA的化学键加以分离)。已经“分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞内重组表达制备的核酸分子和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。
定位群体：如本文所使用的，术语“定位群体”可以指用于基因定位的植物群体(例如向日葵植物群体)。定位群体通常从亲本基因型的受控杂交获得，例如可以由两个近交系提供。关于亲本选择、用于开发定位群体的交配设计(mating design)、和所用标记的类型的决定，取决于待定位的基因、标记的可得性和分子图谱。定位群体中的植物亲本应当在核酸序列和表型水平上对感兴趣的性状均具有足够的变异。亲本核酸序列的变异用于在定位群体的植物中跟踪重组事件。提供信息的多态性标记的可得性依赖于核酸序列的变异的量。因此，提供信息的标记不会在亲本基因型的特定杂交中被鉴定，尽管这样的标记可以存在。
“遗传图”是给定物种中一个或多个染色体上的基因座(或连锁群)之间的遗传连锁关系的描述，可以通过对定位群体的分析加以确定。在一些实例中，遗传图可以用图表或表格形式描绘。术语“基因定位”可以指通过使用遗传标记、标记分离的定位群体、和重组频率的标准遗传原则来定义基因座连锁关系的过程。“遗传图位置”是指遗传图上的位置(相对于相同连锁群或染色体上的周围遗传标记而言)，在给定的物种内在该位置上可以发现某一特定标记。相比之下，“基因组的物理图”是指给定物种内标记之间的绝对距离(例如，以碱基对或分离的和重叠的连续基因片段度量)。基因组的物理图不一定反映物理图上不同点之间在一个物种的测试杂交中观察到的实际重组频率。
杂交；如本文所使用的，术语“杂交”或“杂交的”是指经由授粉的配子融合以产生后代(例如细胞、种子和植物)。这一术语包括有性杂交(即一个植物被另一个授粉)和自交(即自花受粉，例如，使用来自相同植物的花粉和胚珠)。
回交：回交方法可用于将核酸序列引入到植物中。回交技术已经被广泛 使用了数十年，用于将新的性状引入到植物中。N.Jensen,Ed.Plant Breeding Methodology,John Wiley&Sons,Inc.,1988。在典型的回交方案中，原始的感兴趣品种(轮回亲本)与携带待转移的感兴趣基因的第二品种(非轮回亲本)杂交。然后，将该杂交所得的后代再次与轮回亲本杂交，并重复该过程直至获得如下的植物，其中除了来自非轮回亲本的转移基因之外，在转变植物中还恢复了轮回植物几乎全部的期望形态学和生理学特征。
(基因)渗入：如本文所使用的，术语“(基因)渗入”是指将某个基因座处的等位基因传递到某个遗传背景中。在一些实施方案中，基因座处特定等位基因形式的基因渗入可以通过相同物种的两个亲本之间的有性杂交将该等位基因形式传递到至少一个后代中而发生，其中至少一个亲本在其基因组中具有该特定的等位基因形式。含有该特定等位基因形式的后代可以和具有期望遗传背景的品系反复回交。可以选择具有该特定等位基因形式的回交后代，从而产生一个新的品种，其中该特定等位基因形式已经被固定在该遗传背景中。在一些实施方案中，特定等位基因形式的基因渗入可以通过两个供体基因组之间的重组发生(例如，在融合的原生质体中)，其中至少一个供体基因组在其基因组中具有该特定等位基因形式。基因渗入可以涉及特定等位基因形式的传递，该等位基因形式可以是，例如但不仅限于，标记等位基因的所选等位基因形式；QTL；和/或转基因。
种质：如本文所使用的，术语“种质”是指个体植物、植物群(植物品系、品种和家族)、从植物或植物群衍生的克隆所有的、或从之来源的遗传材料。种质可以是生物体或细胞的一部分，或者它可以是与生物体或细胞分开的(例如分离的)。一般地，种质提供了具有特定分子组成的遗传材料，其是植物遗传品质的基础。如本文所使用的，“种质”是指特定植物的细胞；种子；特定植物的组织(例如，可以长出新植物的组织)；和特定植物的非种子部分(例如叶、茎、花粉和细胞)。
如本文所使用的，术语“种质”与“遗传材料”同义，可用于指可繁殖出植物的种子(或其他植物材料)。“种质库”可以指可以栽培出已知栽培种并且可以产生新栽培种的不同种子或其他遗传材料(其中每种基因型被唯一地鉴定)的有组织的集合。在实施方案中，在如本文所述的方法或植物中利用的种质是来自向日葵品系或品种。在特定的实例中，种质是向日葵品系或栽培种的种子。在特定的实例中，种质是来自向日葵品系或品种的核酸样品。
基因：如本文所使用的，术语“基因”(或“遗传元件”)可以指具有功能上的重要性的可遗传的基因组DNA序列。术语“基因”还可用于指，例如但不仅限于，由可遗传的基因组DNA序列编码的cDNA和/或mRNA。
基因型：如本文所使用的，术语“基因型”指个体(或个体群)在一个或多个特定基因座处的遗传组成(genetic constitution)。个体或个体群的基因型由个体在一个或多个基因座处从其双亲遗传得到的等位基因形式所定义和描述。术语基因型还用于指个体在单个基因座、多个基因座或其基因组中全部基因座处的遗传组成。“单倍型”是个体在多个遗传基因座处的基因型。在一些实例中，单倍型所描述的遗传基因座可以是物理地和遗传地连锁的，即基因座可以位于同一染色体节段上。
数量性状基因座：具体的染色体基因座(或区间)可以被定位(map)在生物体的基因组中，与特定的数量表型相关联。这些基因座被称作数量性状基因座或QTL。如本文所使用的，术语“数量性状基因座”(QTL)可以指被鉴定为可能构成某种数量性状或表型的基础的DNA序列(例如基因、非编码序列、和/或基因间序列)的DNA段(stretches)，该数量性状或表型在程度上是可变的，并能够归因于两个或多个DNA序列(例如基因、非编码序列、和/或基因间序列)或其表达产物与其环境之间的相互作用。因此，术语“数量性状基因座”包括具有至少两个等位基因的多态性遗传基因座，所述至少两个等位基因在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种群体或后代中)会有差异地影响表型性状表达。在实践中，可以对QTL进行分子鉴定以帮助定位含有参与规定的数量性状(例如降低的棕榈酸含量)的序列的基因组区域。
如本文所使用的，术语“QTL区间”可以指与构成该QTL性状基础的基因连锁的DNA延伸。QTL区间通常，但不一定大于QTL自身。QTL区间可以含有相应于该QTL 5′和/或3′的DNA段。
已经开发出了多种用于鉴定和分析QTL的实验范式。见例如Jansen(1996)Trends Plant Sci.1:89。关于作物物种中QTL定位的公开报道大部分是基于二亲本杂交(bi-parental cross)的使用(Lynch and Walsh(1997)Genetics and Analysis of Quantitative Traits,Sinauer Associates,Sunderland)。典型地，这些范式包括使一对或多对亲本杂交，这些亲本对可以是，例如，来自两个近交株系的单一配对，或者不同近交品系或株系的多个亲缘或无亲缘亲本，其每一个显示关于感兴趣表型性状的不同特征。通常，这种实验方案涉及从 两个相异的近交系(例如，这些近交系被选择使各品系之间的表型和分子标记差异最大化)的单次杂交中获得100-300个分离后代。将亲本和分离后代针对多个标记基因座进行基因分型，并评估其一到数个数量遗传性状(例如疾病抗性)。然后，根据分离后代中基因型数值与表型变异性之间的统计学显著相关性作为QTL。这种实验方案的长处来自于近交的使用，因为所得的F1亲本全部具有相同的连锁相(linkage phase)(等位基因在亲本世代中的接合方式)。因此，在F1植物自交后，所有分离的F2后代均可提供信息，连锁不平衡(linkage disequilibrium)被最大化，连锁相是已知的，只有两个QTL等位基因，并且(除回交后代之外)，每个QTL等位基因的频率是0.5。
大量用于确定标记是否与QTL(或与另一标记)遗传连锁的统计学方法是本领域技术人员已知的，包括，例如但不仅限于，标准线性模型如ANOVA或回归作图(Haley and Knott(1992)Heredity 69:315)；和最大似然性方法，如最大期望算法(expectation-maximization algorithm)(例如，Lander and Botstein(1989)Genetics 121:185-99；Jansen(1992)Theor.Appl.Genet.85:252-60；Jansen(1993)Biometrics 49:227-31；Jansen(1994)“Mapping of quantitative trait loci by using genetic markers:an overview of biometrical models,”见J.W.van Ooijen and J.Jansen(编),Biometrics in Plant breeding:applications of molecular markers,第116-124页,CPRO-DLO Netherlands；Jansen(1996)Genetics 142:305-11；和Jansen and Stam(1994)Genetics 136:1447-55)。
示例统计学方法包括单点标记分析；区间定位(Lander and Botstein(1989)Genetics 121:185)；复合区间定位(composite interval mapping)；惩罚回归分析(penalized regression analysis)；复杂系谱分析(complex pedigree analysis)；MCMC分析；MQM分析(Jansen(1994)Genetics 138:871)；HAPLO-IM+分析，HAPLO-MQM分析，和HAPLO-MQM+分析；Bayesian MCMC；岭回归(ridge regression)；血缘同一性分析(identity-by-descent analysis)；和Haseman-Elston回归，它们的任一个均适合于本发明特定实施方案的语境。可用于在特定实施例中鉴定和定位QTL的复杂育种群体的替代统计学方法在美国专利6,399,855和PCT国际专利公开No.WO0149104A2中被描述。所有这些方法都需要大量的计算，并且通常在基于计算机的系统和专门软件的辅助下实施。合适的统计学软件包可以从多种公共和商业资源获得，并且是本领域技术人员已知的。
标记：尽管编码蛋白质的特定DNA序列一般在物种之间是很保守的，但是DNA的其它区域(例如非编码DNA和内含子)趋向于发展并积累多态性，因此在同一物种的个体之间可以有不同。基因组变异性可以是任何来源，例如，变异性可以是由于DNA插入、缺失、复制、重复DNA元件、点突变、重组事件，和可转座元件序列的存在。这些区域可能含有有用的分子遗传标记。一般地，在后代之间分离的任何差异遗传的多态性性状(包括核酸多态性)均是潜在的标记。
如本文所使用的，术语“标记”和“分子标记”指一段核苷酸序列或其编码的产物(例如蛋白质)，其在鉴定连锁基因座时用作参照点。因此，标记可以指能够用于鉴定具有特定等位基因的植物的基因或核苷酸序列。标记可以被描述为给定基因座处的变异。遗传标记可以是短DNA序列，例如单碱基对改变(单核苷酸多态性，或“SNP”)周围的序列，或者一个长序列，例如微卫星/简单序列重复(“SSR”)。“标记等位基因”或“标记等位基因形式”指存在于特定个体内的标记的版本。如本文所使用的，术语“标记”可以指染色体DNA的克隆片段，也可以或者替代地指与染色体DNA克隆片段互补的DNA分子。该术语还指与基因组标记序列互补的核酸序列，例如核酸引物和探针。
标记可以被描述为，例如，位于生物体遗传图的具体位置处的多态性遗传元件。遗传图谱可以是基因组(或基因组的一部分，例如单个染色体)的图形表示，其中染色体上界标(landmark)之间的距离用界标之间的重组频率来度量。遗传界标可以是各种已知的多态性标记的任何一种，例如但不仅限于：单序列重复(SSR)标记；限制片段长度多态性(RFLP)标记；和单核苷酸多态性(SNP)标记。作为一个实例，SSR标记可以来自基因组核酸或被表达的核酸(例如表达序列标签(EST))。
其它的标记包括，例如但不仅限于，ESTs；扩增片段长度多态性(AFLPs)(Vos et al.(1995)Nucl.Acids Res.23:4407；Becker et al.(1995)Mol.Gen.Genet.249:65；Meksem et al.(1995)Mol.Gen.Genet.249:74)；随机扩增多态性DNA(RAPD)和同工酶标记。同工酶标记可以用作遗传标记，例如，用于跟踪与特定的第一标记连锁的同工酶或其他类型的标记。同工酶是多种形式的酶，它们在氨基酸序列(因此在其编码核酸序列)上彼此不同。一些同工酶是含有略微不同亚基的多聚体酶。其它的同工酶可以是多聚体或单体，是从前体酶(pro-enzyme)上切割下来的，但在前体酶氨基酸序列上切割的位点不同。同 工酶可以在蛋白质水平或者在核酸水平上表征和分析。因此，本文所述的任何基于核酸的方法均可在特定实例中用于分析同工酶标记。
“遗传标记”包括在群体中具有多态性的等位基因，其中这些等位基因可以通过一种或多种分析方法(例如RFLP分析,AFLP分析,同工酶标记分析,SNP分析,和SSR分析)加以监测和区分。术语“遗传标记”也可以指遗传基因座(“标记基因座”)，其可以在鉴定遗传连锁基因座(例如QTL)时用作参照点。这种标记也可以称作“QTL标记”。
前述物理界标(以及用于检测它们的方法)的本质各异，但是所有这些标记可以根据多核苷酸长度和/或序列彼此之间(以及任何一个特定标记的多个等位基因之间)物理地加以区分。已经确立了多种用于检测分子标记和鉴定标记等位基因的方法。本领域技术人员已知有多种多样的方案可用于检测这种变异性，并且这些方案经常是针对所设计检测的多态性类型特异性的。这些方案包括，例如但不仅限于，PCR扩增；单链构象多态性(SSCP)，例如通过电泳；和自维持序列复制(self-sustained sequence replication)(3SR)(见Chan and Fox(1999)Reviews in Medical Microbiology 10:185-96)。
从植物育种者的视角来看，开发分子标记技术的主要动机是通过MAS提高育种效率。证明与期望表型性状连锁不平衡的分子标记等位基因(例如QTL)为在植物群体中选择期望的性状提供了有用的工具。执行MAS方法的关键部分是创建植物种质中分子标记的高密度(信息丰富的)遗传图；根据标记与表型变异性之间的统计学相关性检测至少一个QTL；根据QTL分析结果定义一系列特别有用的标记等位基因；和使用和/或将这些信息外推到当前系列的育种种质中，从而能够做出基于标记的选择决定。
遗传变异性，例如在定位群体中确定的，可以在同一物种(例如向日葵)的不同群体之间观察到。尽管遗传图中同一物种的两个群体之间可能出现变异性，但是出于鉴定和/或选择包含与标记连锁的性状的植物和/或种质以及反选择包含不良性状的植物和/或种质的目的，来自一个群体的遗传图谱和标记信息一般在多个群体之间仍然是有用的。
本文所述特定MAS方法中使用的两种类型的标记是SSR标记和SNP标记。SSR标记包括任何导致核酸序列长度变异性的分子异质性类型。SSR标记的实例是短DNA(最多达数百个碱基对)区段，其由两个或三个碱基对序列的多次串联重复构成。由于复制忠实性(replication fidelity)较差(例如由 于聚合酶滑脱)，这些重复序列导致不同长度的高多态性DNA区域。SSR在基因组中似乎是随机分散的，两侧一般是保守区。SSR标记也可以来自RNA序列(处于cDNA、部分cDNA、或EST的形式)以及基因组材料。
SSR标记的异质性使它们非常适合于用作分子遗传标记。例如，SSR基因组变异性是可遗传的，并且是多等位基因、共显性、和可重复检测的。更加精细的基于扩增的检测技术(例如基于PCR的技术)的推广为检测样品之间的核苷酸序列异质性提供了多种多样的灵敏的方法。探针(例如核酸引物)可以被设计成与SSR两侧的保守区域杂交，并可使用这些探针扩增可变的SSR区。从SSR区产生的不同大小的扩增子具有特征性的并且可重现的尺寸。从植物群体中某个个体的两个同源染色体，或者从不同个体观察到的不同大小的SSR扩增子定义了SSR标记等位基因。只要存在至少两个可产生不同大小的PCR产物的SSR标记等位基因，就可以使用该SSR作为标记。
连锁(不)平衡：如本文所使用的，术语“连锁平衡”是指两个标记独立分离的情况；即标记在后代中随机分配(sort)。显示连锁平衡的标记被认为是不连锁的(无论它们是否位于同一染色体上)。如本文所使用的，术语“连锁不平衡”是指两个标记以非随机的方式分离的情况；即标记的重组频率小于50％(因此根据定义，在同一连锁群上距离小于50cM)。在一些实施例中，显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。
连锁、紧密连锁、和极紧密连锁：如本文所使用的，基因和标记间的连锁可以指如下的现象，其中染色体上的基因或标记显示可测量的一起传递给下一代的个体的概率。因此，一个标记与另一个标记或基因的连锁可以用重组频率来度量和/或表示。两个基因或标记彼此越靠近，这个概率越接近于“1”。因此，术语“连锁的”可以指一个或多个基因或标记与某个基因一起传递的概率大于0.5(0.5是根据当标记/基因位于不同染色体上时自由组合而预期的值)。当存在某个基因促成个体中的某种表型时，与该基因连锁的标记可以被称作与该表型连锁。因此，术语“连锁的”可以指标记与基因之间的关系，或者标记与表型之间的关系。
相对遗传距离(通过互换频率确定，并用厘摩(cM)测量)一般与两个连锁标记或基因之间在染色体上的物理距离成比例。一厘摩定义为显示1％重组频率(即，两个标记之间在每100次细胞分裂中发生一次互换事件)的两个遗传标记之间的距离。一般地，一个标记与另一个标记或基因越接近(无论它 们之间的距离是以遗传距离测量还是以物理距离测量)，它们连锁得越紧密。因为染色体距离近似与性状之间的重组事件频率成比例，所以存在一个与重组频率相关联的近似物理距离。例如，在向日葵中，平均而言，1cM与大约400kb关联。
因此，术语“连锁的”在本文中可以指在同一向日葵染色体上彼此之间的物理位置在大约4.0Mb(即大约10cM)之内的一个或多个基因或标记。因此，两个“连锁的”基因或标记可以相距4.1Mb；大约4.0Mb；大约3.0Mb；大约2.5Mb；2.1Mb；2.00Mb；大约1.95Mb；大约1.90Mb；大约1.85Mb；大约1.80Mb；大约1.75Mb；大约1.70Mb；大约1.65Mb；大约1.60Mb；大约1.55Mb；大约1.50Mb；大约1.45Mb；大约1.40Mb；大约1.35Mb；大约1.30Mb；大约1.25Mb；大约1.20Mb；大约1.15Mb；大约1.10Mb；大约1.05Mb；大约1.00Mb；大约0.95Mb；大约0.90Mb；大约0.85Mb；大约0.80Mb；大约0.75Mb；大约0.70Mb；大约0.65Mb；大约0.60Mb；大约0.55Mb；大约0.50Mb；大约0.45Mb；大约0.40Mb；大约0.35Mb；大约0.30Mb；大约0.25Mb；大约0.20Mb；大约0.15Mb；大约0.10Mb；大约0.05Mb；大约0.025Mb；和大约0.01Mb。
如本文所使用的，术语“紧密连锁的”可以指在同一染色体上彼此之间相距在大约2.0Mb之内的一个或多个基因或标记。因此，两个“紧密连锁的”基因或标记可以相距2.1Mb；大约1.75Mb；大约1.5Mb；大约1.0Mb；大约0.9Mb；大约0.8Mb；大约0.7Mb；大约0.6Mb；大约0.55Mb；大约0.5Mb；大约0.45Mb；大约0.4Mb；大约0.35Mb；大约0.3Mb；大约0.25Mb；大约0.2Mb；大约0.15Mb；大约0.1Mb；和大约0.05Mb。
如本文所使用的，术语“极紧密连锁的”可以指在同一染色体上彼此之间相距在大约500kb之内的一个或多个基因或标记。因此，两个“极紧密连锁的”基因或标记可以相距600kb；大约450kb；大约400kb；大约350kb；大约300kb；大约250kb；大约200kb；大约175kb；大约150kb；大约125kb；大约120kb；大约115kb；大约110kb；大约105kb；100kb；大约95kb；大约90kb；大约85kb；大约80kb；大约75kb；大约70kb；大约65kb；大约60kb；大约55kb；大约50kb；大约45kb；大约40kb；大约35kb；大约30kb；大约25kb；大约20kb；大约15kb；大约10kb；大约5kb；和大约1kb。
一个特定标记与编码贡献于某个特定表型的多肽的基因的距离越近(无论是用遗传距离还是用物理距离测量)，该特定标记与该表型越紧密连锁。鉴于上述，可以意识到，与特定基因或表型连锁的标记包括与该基因或表型紧密连锁的标记，和与之极紧密连锁的标记。在一些实施方案中，特定标记与编码促成低棕榈酸含量表型的多肽的基因的距离越近(无论是用遗传距离还是用物理距离度量)，该特定标记与低棕榈酸含量表型越紧密连锁。因此，向日葵中与低棕榈酸含量表型连锁、紧密连锁和极紧密连锁的遗传标记可用在MAS程序中，用于鉴定含有降低的棕榈酸含量(与亲本品种和/或至少一个特定环境品种比较)的向日葵品种，鉴定含有降低的棕榈酸含量的单个向日葵植物，和将这种性状育种到其它向日葵品种中，以降低棕榈酸含量。
在一些实施方案中，分子标记与表型之间的连锁关系可以用“概率”或“调整概率”表示。在该语境中，概率值是“表型与特定标记等位基因形式的存在或不存在的特定组合是随机的”的统计学似然性。因此，概率得分越低，表型与特定标记等位基因形式共同分离的似然性越大。在一些实施例中，概率得分可以用“显著”或“不显著”描述。在特定的实例中，随机组合的概率得分为0.05(p＝0.05(5％概率))被认为是共同分离的“显著”指示。然而，在其它实施例中，显著概率可以是任何小于50％(p＝0.5)的概率。例如，显著概率可以小于0.25；小于0.20；小于0.15；或小于0.1。
在一些实施方案中，与低棕榈酸含量表型连锁的标记可以从图4所示的向日葵连锁群5的QTL标记中选出。在一些实施方案中，与低棕榈酸含量表型连锁的标记可以从与图4所示的QTL标记相距大约10cM之内的标记中选出。因此，与低棕榈酸含量表型连锁的标记可能与图4所示的QTL标记相距例如10cM；9cM；8cM；7cM；6cM；5cM；4cM；3cM；2cM；1cM；0.75cM；0.5cM；0.25cM；或更少的距离。
植物育种者可以有利地使用分子标记，通过鉴定与期望表型(例如低棕榈酸含量)显示统计学显著的共分离概率的标记等位基因，其表现为连锁不平衡，来鉴定期望的个体。通过鉴定与数量性状共分离的分子标记或分子标记群，育种者由此鉴定一个QTL。通过鉴定和选择与期望表型相关联的标记等位基因(或来自多个标记的期望等位基因)，植物育种者能够通过选择合适的分子标记等位基因快速地选择表型(即MAS)。被置于遗传图上的分子标记越多，该图用于指导MAS的潜在有用性越大。
标记组：如本文所使用的，一“组”标记或探针是指可用于鉴定包含感兴趣性状的个体的标记或探针的特定集合。在一些实施方案中，一组与低棕榈酸表型连锁的标记可用于鉴定包含低棕榈酸含量的向日葵植物。相应于标记组或探针组的数据(或者使用这些标记或探针得到的数据)可以存储在电子介质中。虽然标记组中的每一个标记均可用于性状鉴定，但是从标记组和包含一些但非全部标记的亚组中选出的个别标记也可有效地用于鉴定包含感兴趣性状的个体。
等位基因：如本文所使用的，术语“等位基因”是指出现在某个特定基因座处的两个或多个不同核苷酸序列中的一个。例如，第一等位基因可以出现在一个染色体上，而第二等位基因可以出现在第二同源染色体上；例如，出现在杂合子个体的不同染色体上，或者群体的不同纯合子或杂合子个体之间。在一些实施方案中，特定基因座处的特定等位基因可以和农艺学期望的表型(例如低棕榈酸含量)连锁。在一些实施方案中，基因座处的特定等位基因允许鉴定不包含农艺学期望表型的植物(例如高棕榈酸含量植物)，从而可以将那些植物从育种程序或种植中除去。标记等位基因可以和有益的表型一起分离，因此提供了鉴定包含该表型植物的收益。“染色体片段的等位基因形式”可以指包含这样的标记等位基因核苷酸序列的染色体片段，该标记等位基因核苷酸序列贡献于特定表型或与特定表型连锁，所述特定表型物理定位在染色体片段上的一个或多个遗传基因座处。
“等位基因频率”可以指等位基因在植物内、品系内、或品系群内位于某个基因座处的频率(用比例或百分比表示)。因此，对于等位基因“A”，基因型为“AA,”“Aa,”或“aa”的二倍体个体的等位基因频率分别为1.0、0.5或0.0。品系内的等位基因频率可以通过将来自该品系的个体样品的等位基因频率取平均值进行估算。类似地，品系群体内的等位基因频率可以通过将构成该群体的品系的等位基因频率取平均值进行计算。对于一个具有有限数目个体或品系的群体，等位基因频率可以用含有该等位基因的个体或品系(或任何其它规定的分组)的计数表示。
当标记等位基因与性状连锁，且该标记等位基因的存在指示包含该等位基因的植物中会出现该期望性状或性状形式时，标记等位基因与性状“正”相关。当标记与性状连锁，且该标记等位基因的存在指示包含该等位基因的植物中不会出现该期望性状或性状形式时，标记等位基因与性状“负”相关。
“纯合”个体在给定基因座处仅具有一种形式的等位基因(例如二倍体植物在两个同源染色体的每一个的特定基因座处具有相同等位基因形式的拷贝)。如果在基因座处存在超过一种等位基因形式，则个体是“杂合的”(例如二倍体个体在基因座处具有第一等位基因形式的一个拷贝和第二等位基因形式的一个拷贝)。术语“纯合性”是指群体的成员在一个或多个具体感兴趣基因座处具有相同的基因型(即相同等位基因频率)。相反，术语“杂合性”是指群体中的个体在一个或多个特定的感兴趣基因座处具有不同的基因型。
任何可用于表征某个基因座处的核苷酸序列的技术均可用于鉴定标记等位基因。用于标记等位基因检测的方法包括，例如但不仅限于，分子鉴定方法(例如，扩增和标记扩增子的检测)。例如，SSR标记或SNP标记的等位基因形式可以通过基于扩增的技术进行检测。在典型的基于扩增的检测方法中，标记基因座或标记基因座的一部分被扩增(使用例如PCR、LCR和转录，以从感兴趣的向日葵植物分离的核酸为扩增模板)，并检测所得的经扩增的标记扩增子。在一些实施方案中，可以使用植物RNA作为扩增反应的模板。在一些实施方案中，可以使用植物基因组DNA作为扩增反应的模板。在一些实例中，QTL标记是SNP标记，所检测的等位基因是SNP标记等位基因，并且检测方法是等位基因特异性杂交(ASH)。在一些实例中，QTL标记是SSR标记，并且所检测的等位基因是SSR标记等位基因。
ASH技术是基于短单链寡核苷酸探针与完全互补的单链靶核酸的稳定退火。检测可以通过检测附着在探针上的同位素或非同位素标记物实现。对于每种多态性，两个或多个不同的ASH探针可以设计成具有相同的DNA序列，除多态性位点处之外。每个探针可以与一个等位基因序列完全同源，从而探针的范围能够区分所有已知的可选择等位基因序列。当每个探针在合适的探针设计和杂交条件下与靶DNA杂交时，探针与靶DNA之间的单碱基错配会阻止杂交。通过这种方式，只有一个可选择探针会与对等位基因而言是纯合的靶样品杂交。对两个等位基因而言是杂合或异质的样品则会同时与两个可选择探针杂交。
ASH标记可以用作显性标记，其中从仅一个探针的杂交或不杂交来确定仅一个等位基因的存在或不存在。可选择的等位基因可以从杂交的缺失推断。在实例中，ASH探针和靶分子可以是RNA或DNA分子；靶分子在与探针互补的序列之外可以包含任何长度的核苷酸；探针可以设计成与DNA 靶的任一链杂交；并且探针的大小可以不同，以符合不同杂交条件的要求。
扩增的可变序列是指植物基因组的这样的扩增序列，它在同一物种的成员之间显示高度的核苷酸残基变异性。所有的生物体均具有可变的基因组序列，并且每一个生物体(除了克隆之外)都具有一组不同的可变序列。一旦鉴定特定可变序列的存在，其可用于预测表型性状。在一些实施例中，来自植物的DNA可用作模板，用位于DNA可变序列两侧的引物加以扩增。该可变序列可以被扩增然后测序。
自维持序列复制也可以替代地用于鉴定遗传标记。自维持序列复制是指使用在基本上等温的条件下在体外呈指数复制的靶核酸序列的核酸扩增方法，其使用三种参与逆转录病毒复制的酶活性：逆转录酶；RNA酶H；和DNA依赖的RNA聚合酶。Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874。通过利用cDNA中间产物模拟逆转录病毒的RNA复制策略，该反应积累原始靶的cDNA和RNA拷贝。
代表所检测标记等位基因的数据可以被传输(例如，电子传输；并通过红外、无线或光学输送)给计算机或计算机可读介质，供分析和储存。
例如，扩增引物或扩增引物对可以和从第一向日葵植物或种质分离的基因组核酸混合，其中引物或引物对与标记基因座的至少一部分互补或部分互补，并且引物或引物对能够使用向日葵基因组核酸作为模板通过DNA聚合酶引发DNA聚合。在DNA聚合反应中，引物或引物对(例如表6中提供的引物对)利用DNA聚合酶和模板基因组核酸延伸，产生至少一个扩增子。
“定位克隆”是指一种特殊的克隆程序，其中按照靶核酸与标记的基因组接近度(genomic proximity)鉴定和分离靶核酸。例如，基因组核酸克隆可以包括彼此接近的两个或多个染色体区的全部或部分。如果标记能够用于从基因组文库鉴定基因组核酸克隆，则可以使用标准方法，例如亚克隆和/或测序，鉴定和/或分离位于标记附近的克隆的亚序列。
基因座：如本文所使用的，术语“基因座”是指基因组上相应于可测量特征(例如性状)或多态性的位置。SNP基因座由可以和基因座内包含的DNA杂交的探针定义。
标记辅助育种：如本文所使用的，术语“标记辅助育种”可以指直接利用MAS对一个或多个性状(例如低棕榈酸含量)进行育种的方法。在当前的实践中，植物育种者试图鉴定易检测的、与农艺学期望性状连锁的性状，例如花 色、种皮外貌、或同工酶变体。植物育种者随后通过跟踪该易检测性状的分离在分离的育种群体中跟踪该农艺学性状。然而，这些连锁关系中只有极少数可用于植物育种。
标记辅助育种为改良植物品种提供了高时间效率和高成本效率的方法。应用标记辅助育种的一些实例涉及使用同工酶标记。见例如Tanksley and Orton,eds.(1983)Isozymes in Plant Breeding and Genetics,Amsterdam:Elsevier。一个实例是与番茄中抗线虫害的基因相关的同工酶标记。该抗性由定名为Mi的基因控制，位于番茄6号染色体上，与Aps1(一种酸性磷酸酶同工酶)极紧密连锁。使用Aps1同工酶标记间接选择Mi基因提供的优势在于：群体的分离可以用标准电泳技术明确地加以确定；可以在幼苗组织中给该同工酶标记打分，从而无需维持植物至成熟；并且该同工酶标记的共显性允许辨别纯合子和杂合子。见Tanksley and Orton中的Rick(1983)，同前文。
探针：在一些实施方案中，标记在植物中的存在可以通过使用核酸探针加以检测。探针可以是DNA分子或RNA分子。RNA探针可以通过本领域已知的方法合成，例如使用DNA分子模板。探针可以包含标记核苷酸序列的全部或一部分，以及额外的来自植物基因组的邻接核苷酸序列。这在本文中被称作“邻接探针(contiguous probe)”。额外的邻接核苷酸序列称作原探针的“上游”或“下游”，取决于按照常规理解，该来自植物染色体的邻接核苷酸序列位于原标记的5′侧还是3′侧。本领域技术人员会认识到，获得额外邻接核苷酸序列以包含在标记内的过程可以几乎无限次地重复(仅受染色体的长度限制)，借此沿着染色体鉴定额外的标记。
寡核苷酸探针序列可以合成制备或者通过克隆加以制备。合适的克隆载体是本领域技术人员众所周知的。寡核苷酸探针可以被标记或不标记。有多种用于标记核酸分子的技术，包括例如但不仅限于：切口平移放射性标记(radiolabeling by nick translation)；随机引物法；脱氧核苷酸转移酶加尾(tailing with terminal deoxytransferase)，等等，其中所用的核苷酸用例如放射性32P标记。其它可用的标记物包括，例如但不仅限于：荧光团(例如FAM和VIC)；酶；酶底物；酶辅助因子；酶抑制剂；等。或者，可以使用与报告子结合的配体来代替使用由自身提供或与其他反应剂一起提供可检测信号的标记物，其中报告子被标记(例如通过上述标记)以提供可检测信号(由自身提供或与其他反应剂一起提供)。见例如Leary et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4045-9。
探针可以含有不与原标记邻接的核苷酸序列；这种探针在本文中被称作“非邻接探针(noncontiguous probe)”。非邻接探针的序列在基因组中与原标记序列足够接近，从而使该非邻接探针与相同基因或性状(例如低棕榈酸含量)遗传连锁。例如，在一些实施方案中，非邻接探针与图4所示QTL标记的距离为大约10cM；9cM；8cM；7cM；6cM；5cM；4cM；3cM；2cM；1cM；0.75cM；0.5cM；0.25cM；或更小。
探针可以是要检测的标记的确切拷贝。探针也可以是包含下述核苷酸序列或者由下述核苷酸序列构成的核酸分子：与主题生物体(例如向日葵)染色体DNA的克隆片段基本上相同的核苷酸序列。如本文所使用的，术语“基本上相同”可以指高于85％相同的核苷酸序列。例如，基本上相同的核苷酸序列可以和参考序列85.5％；86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或99.5％相同。
探针还可以是能够与要检测的标记(“DNA靶”)的确切拷贝“特异性杂交”或“特异性互补”的核酸分子。术语“能够(与……)特异性杂交”和“(与……)特异性互补”是指充分程度的互补性，从而在核酸分子与DNA靶之间发生稳定而特异的结合。能够特异性杂交的核酸分子不必与其能够特异性与之杂交的靶序列100％互补。当存在充分程度的互补性以避免核酸分子与非靶序列在期望特异结合的条件下，例如在严格杂交条件下，发生非特异性结合时，核酸分子即可特异性杂交。
导致特定程度严格性的杂交条件会随着所选杂交方法的本质和杂交核酸序列的组成和长度而变化。一般地，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(特别是Na+和/或Mg++浓度)会确定杂交的严格性，尽管清洗时间也会影响严格性。关于实现特定程度严格性所需的杂交条件的计算是本领域技术人员已知的，并且在例如下列文献中有讨论：Sambrook等(编)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989,第9和11章；和Hames and Higgins(编)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985。关于核酸杂交的更详细的说明和指导可以参见，例如Tijssen,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,”参见Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, 第I部分,第2章,Elsevier,NY,1993；和Ausubel等编,Current Protocols in Molecular Biology,第2章,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995。
如本文所使用的，“严格条件”包括如下的条件，在该条件下，只有杂交分子与DNA靶之间的错配少于50％时才会发生杂交。“严格条件”包括更具体水平的严格性。因此，如本文所使用的，“中等严格”条件是指如下的条件，其中超过50％错配的分子不会杂交；“高严格”条件是指如下的条件，其中超过20％错配的分子不会杂交；“极高严格”条件是指如下的条件，其中超过10％错配的分子不会杂交。
下面是代表性的非限制性杂交条件。
极高严格性(检测具有至少90％序列同一性的序列)：在65℃ 5x SSC缓冲液中杂交16小时；在室温2x SSC缓冲液中清洗2次，每次15分钟；和在65℃ 0.5x SSC缓冲液中清洗2次，每次20分钟。
高严格性(检测具有至少80％序列同一性的序列)：在65-70℃ 5x-6x SSC缓冲液中杂交16-20小时；在室温2x SSC缓冲液中清洗2次，每次5-20分钟；和在55-70℃ 1x SSC缓冲液中清洗2次，每次30分钟。
中等严格性(检测具有至少50％序列同一性的序列)：在室温-55℃ 6x SSC缓冲液中杂交16-20小时；在室温-55℃ 2x-3x SSC缓冲液中清洗2次，每次20-30分钟。
关于前文所讨论的所有探针，探针可以包括额外的核酸序列，例如启动子；转录信号；和/或载体序列。前文所讨论的任何探针均可用于界定与参与向日葵中低棕榈酸含量的基因相连锁的额外标记，如此鉴定的标记可以与本公开中命名的示例标记等价，因此在本发明的范围之内。
序列同一性：如本文所使用的，在两个核酸或多肽序列的上下文中，术语“序列同一性”或“同一性”可以指当两个序列按照在特定比较窗口上具有最大相应度的方式被对齐时，两个序列中相同的残基。
如本文所使用的，术语“百分比序列同一性”可以指通过在比较窗口上比较两个最佳对齐的序列(例如核苷酸序列)确定的数值，其中在比较窗口中，序列的一部分与参考序列相比(其不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即空位(gap))以实现两个序列的最佳对齐。百分比的计算是通过确定在两个序列中出现相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目， 将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数，再将结果乘以100，得到百分比序列同一性。
用于对齐序列以供比较的方法是本领域众所周知的。各种程序和比对算法在例如下列文献中有描述：Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins and Sharp(1988)Gene73:237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang et al.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson et al.(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。序列比对方法和同源性计算的详细描述可以在例如Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10中找到。
美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM；Altschul et al.(1990))可以从数个资源获得，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)和在互联网上，用于和多种序列分析程序一起使用。关于如何使用该程序确定序列同一性的描述可以在互联网上在BLASTTM的“帮助”部分获得。为了比较核酸序列，可以采用BLASTTM(Blastn)程序的“Blast 2sequences”功能，使用设定为缺省参数的缺省BLOSUM62矩阵系列。当用本方法进行估算时，与参考序列具有更大相似性的核酸序列将显示更大的百分比同一性。
核酸分子：如本文所使用的，术语“核酸分子”可以指核苷酸的多聚体形式，其可以同时包括RNA、cDNA、基因组DNA、和上述的合成形式和混合多聚体的有义和反义链。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸，或两种任意类型核苷酸的修饰形式。如本文所使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”同义。该术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括通过天然发生和/或非天然发生的核苷酸连接键连接在一起的天然发生和经过修饰的核苷酸的任一种或两种。
“外源”分子是指不是特定系统(例如种质、品种、优良品种、和/或植物)固有的分子，对于多核苷酸而言是指其核苷酸序列和/或基因组定位，对于多肽而言是指其氨基酸序列和/或细胞定位。在实施方案中，外源或异源多核苷酸或多肽可以是人为添加给生物系统(例如植物细胞、植物基因、特定植物物种或栽培种，和/或植物染色体)、并非该特定生物系统固有的分子。因此， 将一个核酸指定为“外源”可以指示该核酸来自天然发生来源之外的来源，或者可以指示核酸具有非天然的构型、遗传定位和元件排列。
相反，例如，“天然”或“内源”核酸是指除了在该核酸自然正常出现的染色体或其他遗传材料上正常存在的核酸元件之外，不含有其它核酸元件的核酸(例如基因)。内源基因转录本由天然染色体基因座处的核苷酸序列编码，而不是人为添加给细胞的。
术语“重组”是指已通过人为干预而被改变的材料(例如重组核酸，重组基因，重组多核苷酸，和/或重组多肽)。例如，重组分子的部分或元件的排列可以不是天然排列，和/或重组分子的一级序列可以在某种方式上与其天然序列不同。可以改变材料从而在其自然环境或状态中产生或从中移除重组材料。如果开放阅读框的核苷酸序列已经被从其天然语境中移出并被克隆到任何类型的人工核酸(例如载体)中，则核酸的开放阅读框是重组的。产生重组分子特别是重组核酸的方案和试剂，是本领域常见和常规的。在本文中，术语“重组”还可以指包含重组材料的细胞或生物体(例如包含重组核酸的植物和/或植物细胞)。在一些实例中，重组生物体是转基因生物体。
如本文所使用的，术语“引入”在指示将异源或外源核酸转位到细胞内时，是指使用任何本领域可以获得的方法学将核酸导入到细胞内。该术语包括核酸引入方法，包括例如但不仅限于，转染；转化；和转导。
如本文所使用的，术语“载体”是指能够将至少一个核酸片段转移到细胞内的多核苷酸或其他分子。载体可以任选地包括介导载体保持并使其能够实现预期用途的组分/元件(例如复制必需的序列，赋予药物或抗生素抗性的基因，多克隆位点，和/或使被克隆基因能够表达的可操作连接的启动子/增强子元件)。载体可以来自，例如，质粒、噬菌体、或植物或动物病毒。“克隆载体”、“穿梭载体”或“亚克隆载体”一般包括可操作连接的元件，以易化克隆或亚克隆步骤(例如，含有多个限制性内切酶位点的多克隆位点)。
如本文所使用的，术语“表达载体”是指包含可易化编码序列在特定宿主生物体内表达的可操作连接的多核苷酸序列的载体。例如，细菌表达载体可以易化编码序列在细菌内的表达。植物表达载体可以易化编码序列在植物细胞内的表达。易化在原核生物内的表达的多核苷酸序列可以包括，例如但不仅限于，启动子；操纵基因；和核糖体结合位点。真核生物表达载体(例如植物表达载体)包含的启动子、增强子、终止子和多腺苷酸化信号(和其他序 列)一般与原核生物表达载体中所使用的不同。
单核苷酸多态性：如本文所使用的，术语“单核苷酸多态性”(SNP)可以指当某个物种的成员之间或某个个体的配对染色体之间在基因组(或其他分享序列)上具有单个核苷酸差异时出现的DNA序列变异。在群体内，SNP可以被分配(assigned)一个较小的等位基因频率，其是在特定群体中观察到的某个基因座处的最低等位基因频率。这就是单核苷酸多态性的两个等位基因频率中较小那个。预期不同的群体显示至少有微小不同的等位基因频率。特定的群体可以显示显著不同的等位基因频率。在一些实施例中，与SCN抗性连锁的标记是SNP标记。
SNP可以位于基因的编码序列、基因的非编码区、或基因之间的基因间区域内。由于遗传密码子的简并性，编码序列中的SNP不一定改变所产生的蛋白质的氨基酸序列。两种形式均导致相同多肽序列的SNP被称作“同义的”(有时被称作沉默突变)。如果产生不同的多肽序列，则它们被称作“非同义的”。非同义的改变可以是错义的或无义的，其中错义改变导致产生不同的氨基酸，而无义改变导致提早的终止密码子。不在蛋白质编码区内的SNP对基因剪接、转录因子结合或非编码RNA的序列也仍然有影响。SNP通常是双等位基因的，因此容易在植物和动物中测定。Sachidanandam(2001)Nature 409:928-33。
植物：如本文所使用的，术语“植物”可以指整个植物，衍生自植物的细胞或组织培养物，和/或前述任一个的任何部分。因此，术语“植物”包括，例如但不仅限于，整个植物；植物组分和/或器官(例如叶、茎和根)；植物组织；种子；和植物细胞。植物细胞可以是，例如但不仅限于，植物体内和/或植物的细胞，从植物分离的细胞，和通过培养从植物分离的细胞获得的细胞。因此，术语“向日葵植物”可以指，例如但不仅限于，整个向日葵植物；多个向日葵植物；向日葵植物细胞；向日葵植物原生质体；向日葵组织培养物(例如可以再生向日葵植物者)；向日葵植物愈伤组织；向日葵植物部分(例如向日葵种子，向日葵花，向日葵子叶，向日葵叶，向日葵茎，向日葵芽，向日葵根，和向日葵根尖)；和在向日葵植物中或者在向日葵植物的部分中是完整的向日葵植物细胞。
“转基因植物”是在其至少一个细胞内含有外源多核苷酸的植物。在实例中，外源多核苷酸被稳定整合在细胞的基因组中，从而使该多核苷酸可以在 连续的世代中遗传。在一些实例中，异源多核苷酸可以作为重组表达盒的一部分被整合在基因组中。在本文中，术语“转基因”用于指任何其基因型已由于外源核酸的存在而被改变的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物。因此，该术语包括初始被改变而包含外源多核苷酸的转基因生物体和细胞，和那些通过初始转基因生物体或细胞的杂交或无性繁殖而产生的生物体和细胞。如本文所使用的，术语“转基因”不包括通过传统植物育种方法(例如，仅非转基因生物体的杂交)或通过自然发生事件(例如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座，和自发突变)而引入的基因组(染色体或染色体外)变异。
植物“品系”、“品种”或“株(系)”是具有相同亲本的个体植物的群体。品系中的植物一般有一定程度的近交，并且一般在大多数遗传基因座处是纯合和均质的。“亚系”可以指来自共同祖先的某个近交后代亚组，其与从相同祖先繁衍的其他相似的近交亚组在遗传上可区别。在一些实施方案中，“亚系”可以通过下述手段产生：用来自在F3-F5代选出的个体向日葵植物的种子近交，直至大多数或全部的基因座中残余的分离基因座均是纯合的为止。
商业向日葵品种一般是通过使两个遗传上不同的亲本之间受控杂交，并归集单个F3-F5代植物的自花授粉后代(“归拢(bulking)”)。尽管这样的品种通常似乎是均一的，但是来自所选植物的自花授粉品种最终(例如，在F8代以前)会变成纯合植物的混合物，这些纯合植物在最初所选F3-F5植物中为杂合的任何基因座处的基因型不同。在本文所述的实施方案中，通过对选定的F3-F5植物的自花授粉后代个体的种子样品进行基因分型产生了基于标记的亚系，这些亚系基于一个或多个特定基因座处的DNA水平上的数量标记多态性而彼此不同。这样的种子样品可以直接作为种子进行基因分型，或者作为从种子生长的植物组织进行基因分型。在一些实例中，将在一个或多个特定标记基因座处具有共同基因型的种子归拢在一起而产生亚系，该亚系在与感兴趣性状(例如低棕榈酸含量)连锁的一个或多个基因座处是遗传纯合的。
“祖系”是指被用作或者已经被用作遗传材料源(例如用于开发优良品系)的亲本系。“祖先群体”是指已经为用于开发优良品系的遗传变异的主体做出过贡献的祖先的群体。“后代”是祖先的子孙，后代可以通过许多代的育种与其祖先分开。例如，优良品系是其祖先的后代。“系谱”可用于描述后代与其每个祖先之间的关系。系谱可以跨越一代或多代，因此可以描述后代与其 祖先之间相隔在1,2,3,4等代数的关系。
“优良品系”或“优良株系”是指经过育种和选择优越农艺学性能(经常通过多轮选择)的农艺学优越的品系。有许多优良向日葵品系可用，并且是本领域技术人员已知的。优良群体是一群优良品系或来自优良品系的个体，它们可用于代表给定作物物种(例如向日葵)的在可用的农艺学优越基因型方面的技术发展水平。类似地，优良种质或种质的优良株系是农艺学优越的种质。优良种质可以从具有优越农艺学性能的植物获得，并且能够用于产生具有优越农艺学性能的植物，例如现有的或新近开发的向日葵优良品系。
与优良品系相对，“外来品系”或“外来株系”(或“外来种质”)是指从不属于可用的优良向日葵品系或种质株系的向日葵获得的品系或种质。在两个向日葵植物或种质之间杂交的语境中，外来种质与其所杂交的优良种质在世系上并不密切近缘。最常见的是，外来种质是为了将新颖的遗传元件(例如感兴趣的等位基因形式)引入到育种程序中而选择的。
性状或表型：术语“性状”和“表型”在本文中可互换使用，是指可测量的或可观察的可遗传特征。在一些实例中，表型可以直接由单个基因或遗传基因座控制(即，单基因性状)。在其他实例中，表型可以是数个基因相互作用的结果(复杂性状)。因此，QTL可以通过单基因机制或者通过多基因机制发挥作用。在一些实例中，性状或表型可以被指定一个“表型值”，其对应于为该表型性状测得的定量值。
术语“分子表型”可以指能够在(一个或多个)分子的群体的水平上检测到的表型。在一些实例中，分子表型可以仅能够在分子水平上检测到。表型的可检测分子可以是核酸(例如基因组DNA或RNA)；蛋白质；和/或代谢物。例如，分子表型可以是一个或多个基因产物的表达概貌(profile)(例如在植物发育的特定阶段的表达概貌，或响应环境条件或胁迫的表达概貌)。
低棕榈酸含量：出于本公开的目的，特别感兴趣的性状是“低棕榈酸含量”。尽管向日葵植物的脂肪酸组成在一定程度上会受到环境因素的影响，但是本领域技术人员会理解，棕榈酸含量(以及其他油性状)主要是由可遗传的遗传因素决定的。因此，例如，特定向日葵品种的选择可以至少部分地基于该特定品种在正常田间生长条件(例如无干旱、疾病和适当土壤营养素的条件)下的特征棕榈酸含量。在实例中，具有低棕榈酸含量的向日葵植物所包含的棕榈酸(16:0)含量可以占该植物的种子中总油含量的大约3％或者更 低。在一些实例中，这种具有低棕榈酸含量的向日葵植物所包含的棕榈酸含量可以占该植物的种子中总油含量的大约2.5％或者更低，例如但不仅限于，棕榈酸含量可以是2.6％；2.5％；2.4％；2.3％；2.2％；2.1％；2.0％；1.9％；1.8％；大约1.7％；和更低。
在一些实施方案中，“低棕榈酸含量”通过与野生型亲本品种的特征棕榈酸含量进行比较加以确定。因此，包含低棕榈酸含量表型的第一向日葵与野生型向日葵相比，或者与产生该第一向日葵的亲本向日葵品种相比，可以具有“减少”或“降低”水平的棕榈酸。减少和降低是相对的术语，表明植物产生或含有比类似的野生型植物更少的棕榈酸。
向日葵植物棕榈酸含量变化较大，并且在特定品种中测得的特征棕榈酸含量表现为一系列高和低棕榈酸含量表型。然而，通过简单观察，可以确定不同植物、植物品系或植物家族的相对棕榈酸含量。而且，向日葵品种表现出“棕榈酸含量”的在遗传上可以确定的表型等级。本领域的技术人员熟悉用于定量和评分向日葵植物棕榈酸含量的测定法。植物的棕榈酸含量可以使用本领域的各种常规分析技术进行定量，例如但不仅限于，NMR；NIR；和索式萃取。
低棕榈酸含量的核实可以通过使用或适用已有的棕榈酸含量方法实现。例如，NMR,NIR,和/或索式萃取可用于验证低棕榈酸含量性状在任何特定植物或群体中仍然与特定标记一起分离。在一些实施方案中，也可以使用这些和其他方法来测量通过将与低棕榈酸含量连锁的标记渗入或重组引入到期望遗传背景中而实现的棕榈酸含量降低的程度。
IV.向日葵中的低棕榈酸含量标记
本发明的实施方案包括与向日葵中低棕榈酸含量连锁的标记。这些标记可以用于，例如但不仅限于，鉴定有更高的可能包含低棕榈酸表型的向日葵植物或种质；选择这类向日葵植物和种质(例如，在标记辅助选择程序中)；和鉴定和选择不具有更高可能性包含低棕榈酸表型的向日葵植物和种质。与本领域当前已有的组合物和方法相比，使用本文所述的一种或多种标记可以在向日葵育种中的时间、成本和劳动力方面为植物育种者提供优势。
本文公开了被鉴定为位于向日葵基因组连锁群5(LG5)中的低棕榈酸含量QTL区域内或附近的特定标记，它们在亲本基因型中是多态性的。在这 些QTL标记中，有特定的标记等位基因与向日葵低棕榈酸含量表型连锁。在一些实施方案中，与向日葵低棕榈酸含量表型连锁的QTL标记选自从图1中提供的标记亚组。例如但不仅限于，与向日葵低棕榈酸含量表型连锁的QTL标记选自HA0031B；HA0908；HA1665；HA0304A；HA0850；HA0743；HA0870；HA0907；和HA0612A。
可利用定位群体确定与低棕榈酸含量连锁的标记。在一些实施方案中，这样的定位群体可以来自杂交H757B/H280R，尽管其他群体也可以替代性地使用。许多合适软件平台的任一种可用于确定连锁的标记基因座。例如但不仅限于，；；和可以在特定的实例中使用。在一些实施方案中，例如当在连锁分析中使用软件时，反映所检测的等位基因信息的数据可以在使用期间或者在使用前被电子传输或电子存储，例如存储在计算机可读介质中。
在一些实施方案中，可能包含低棕榈酸含量表型的第一向日葵植物或种质是通过检测该第一向日葵植物或种质内的多个标记等位基因鉴定的。例如但不仅限于，特定的实施方案包括用于鉴定可能包含低棕榈酸含量表型的植物或种质的方法，其中从分子标记HA0031B；HA0908；HA1665；HA0304A；HA0850；HA0743；HA0870；HA0907；和HA0612A中检测与低棕榈酸连锁的标记等位基因。根据一些实施方案，用于鉴定可能包含低棕榈酸含量表型的植物或种质的方法包括从分子标记HA0031B；HA0908；HA1665；HA0304A；HA0850；HA0743；HA0870；HA0907；和HA0612A中检测超过一个与低棕榈酸连锁的标记等位基因。特定的实施方案包括用于检测可能包含低棕榈酸含量表型的植物或种质的方法，其中从与选自HA0031B；HA0908；HA1665；HA0304A；HA0850；HA0743；HA0870；HA0907；和HA0612A的至少一个低棕榈酸连锁标记连锁的分子标记中检测标记等位基因。
在一些实施方案中，被检测的等位基因是与低棕榈酸含量正相关的等位基因形式。替代地，被检测的等位基因可以是与低棕榈酸含量负相关的等位基因形式，在这种情况下，等位基因可以被反选择。在选择超过一个标记等位基因用于检测的情况下，为每个标记选择等位基因；因此，检测两个或多个等位基因。在一些实例中，标记可以包括多于一个有利的(例如正相关的)等位基因形式；在此类实例中，可以检测这些有利的等位基因形式的任一个。
因此，在单个植物、种质或植物群体中可以同时检测多个标记等位基因。 在这种方法的实例中，可以选择这样的植物或种质，其含有来自多于一个与低棕榈酸含量连锁的标记的正相关等位基因。在特定的实例中，可以将来自多于一个与低棕榈酸含量连锁的标记的正相关等位基因渗入到目标(例如受体)向日葵种质中。本领域的技术人员会意识到，在相同植物或种质中从多于一个低棕榈酸含量标记中同时选择(和/或基因渗入)正相关的等位基因可能在植物或种质中产生加性(例如协同)表型。
尽管特定的标记等位基因可能与低棕榈酸含量表型共分离，但是这些标记基因座不一定是贡献于(例如造成)低棕榈酸含量的QTL基因座的一部分。例如，不要求共分离标记包含在贡献于或赋予低棕榈酸含量的基因内(例如作为该基因开放阅读框的一部分)。特定标记等位基因与低棕榈酸含量表型之间的关联可能是由于在该低棕榈酸含量等位基因所起源的祖先向日葵品系中共分离的标记等位基因与QTL低棕榈酸含量等位基因之间的原始“相引”(coupling)连锁相所致。最终，通过反复重组，共分离标记与QTL基因座之间的互换事件可能会改变这一定向。由此，正相关的标记等位基因可能在连续世代中发生变化，这取决于在用于创建分离群体的低棕榈酸含量亲本中存在的连锁相。这个事实不会减少该标记监视表型分离的用处；它仅会改变哪个标记等位基因形式在给定的分离群体中是正相关的(相对地，负相关的)。
当指示两个遗传元件(例如一个贡献于低棕榈酸含量的遗传元件与最接近的标记)之间的关系时，“相引”连锁相是指低棕榈酸含量QTL处的正相关等位基因与各自连锁的标记基因座的正相关等位基因物理关联在相同染色体链上的情况。在相引相”中，两个等位基因一起被继承该染色体链的后代所继承。在“相斥(repulsion)”相连锁中，感兴趣基因座(例如低棕榈酸含量的QTL)处的正相关等位基因与附近标记基因座处的通常负相关的等位基因物理连锁，因此两个通常正相关的等位基因不会一起被继承(即，这两个基因座彼此“不同相(out of phase)”)。
如本文所使用的，标记的“正相关”等位基因是该标记的等位基因在本文所述定位群体中与期望表型(例如，低棕榈酸含量)共分离者。然而，考虑前文应当理解，由于排斥相连锁的可能性，在其他涉及不同群体的实施方案中可能可以等价地使用标记的其它等位基因形式。
类似地，不与低棕榈酸含量共分离的连锁标记等位基因形式也可以替代地在一些实施方案中使用，因为这种等位基因形式可用于鉴定不可能具有低 棕榈酸表型的植物。例如，在育种中这种等位基因可以用于排除的目的(例如反选择)，以鉴定与低棕榈酸含量负相关的等位基因，和/或将高棕榈酸含量植物或种质淘汰出后续的育种轮次。
一个QTL标记最少具有一个正相关的等位基因，尽管在一些实例中在群体中可以发现QTL标记有两个或更多个正相关等位基因。这种标记的任何正相关等位基因可用于，例如，鉴定和构建低(例如降低的)棕榈酸含量向日葵品系。在一些实例中，在植物中鉴定(或向植物中渗入)了与低棕榈酸含量连锁的不同标记的1、2、3或更多个正相关的等位基因，并且在MAS过程中可以对所有这些正相关标记或其子集进行正选择或反选择。在一些实施方案中，鉴定了至少一个植物或种质，其具有至少一个这样的与低棕榈酸含量表型正相关的等位基因。
标记基因座自身就是性状，因此可以根据常规连锁分析对其进行分析，例如通过在分离期间对标记基因座进行跟踪。因此，在一些实施方案中，测定标记之间的连锁，例如，1cM相当于第一标记基因座在单独一代中通过互换与第二基因座(其可以是任何其它性状(例如，第二标记基因座)，或另一个包含或者包含在QTL中的性状基因座)分开的机会为1％。
当与QTL标记(例如图1中提供的QTL标记及其等价物)连锁的遗传标记与给定的QTL标记充分接近(即，充分紧密连锁)，使得该遗传标记与QTL标记显示低重组频率时，这些遗传标记是特别有用的。在一些实施方案中，连锁标记和QTL标记显示大约10％或更低的重组频率(即，给定标记在QTL的大约10cM之内)。根据定义，这些连锁基因座在至少90％的情形下会共分离。确实，标记与QTL标记越接近，标记作为期望性状的指示物越有效和有利。然而，与QTL的距离超过例如10cM的标记也可能是有用的，特别是当与其它连锁标记组合时。
因此，在一些实施方案中，连锁的基因座，例如QTL标记基因座与第二标记基因座显示大约10％或更低的基因座间重组频率；例如但不仅限于，大约9％或更低，大约8％或更低，大约7％或更低，大约6％或更低，大约5％或更低，大约4％或更低，大约3％或更低，和大约2％或更低。在一些实例中，相关基因座(例如标记基因座和靶基因座，例如QTL)显示大约1％或更低的重组频率；例如但不仅限于，大约0.75％或更低，大约0.5％或更低，和大约0.25％或更低。因此，在特定实施方案中，各基因座可以相隔大约10 cM；大约9cM；大约8cM；大约7cM；大约6cM；大约5cM；大约4cM；大约3cM；大约2cM；大约1cM；大约0.75cM；大约0.5cM；大约0.25cM；或更少。在一些实例中，具体的连锁标记可以通过审阅向日葵基因组的遗传图(例如包含LG5者)加以确定。
在一些方面中，连锁可以表示为重组频率极限，或表示为遗传或物理距离范围。例如，在一些实施方案中，两个连锁的基因座是两个相隔小于50cM图谱单位的基因座。在一些实例中，连锁的基因座是两个相隔小于40cM的基因座。在一些实例中，两个连锁基因座是两个相隔小于30cM的基因座。在一些实例中，两个连锁基因座是两个相隔小于25cM的基因座。在一些实例中，两个连锁基因座是两个相隔小于20cM的基因座。在一些实例中，两个连锁基因座是两个相隔小于15cM的基因座。在一些实例中，连锁可以表示为有上限和下限的范围；例如但不仅限于，大约10-20cM；大约10-30cM；大约10-40cM；大约0.5-大约10cM；大约0.1-大约9cM；大约0.1-大约8cM；大约0.1-大约7cM；大约0.1-大约6cM；大约0.1-大约5cM；大约0.1-大约4cM；大约0.1-大约3cM；大约0.1-大约2cM；大约0.1-大约1cM；和大约0.1-大约0.5cM。
在一些实施方案中，本文所述的标记(例如，在图1中示出的那些标记，HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,HA0612A,和与前述的至少一个连锁的标记)与低向日葵棕榈酸含量正相关。因此，这些标记可能与低棕榈酸含量QTL和/或性状充分接近，从而这些标记中的一个或多个可用作低棕榈酸含量性状的预测子。这种预测能力在MAS环境中极其有用，如在本文中将更详细讨论的。
本文所述的与低棕榈酸含量表型和/或QTL标记连锁的标记的使用并不限制于任何特定的向日葵遗传图或方法学。应当注意，由于各种因素，连锁标记的列表在图与图和方法学与方法学之间可以不同。例如，位于任何两个图上的标记可能不会相同，且一个图可能比另一个图具有更大的标记密度。同样，用于构建遗传图的定位群体、方法学和算法可以不同。本领域的技术人员会认识到，一个遗传图不一定比另一个更精确或更不精确，并且技术人员还会认识到，任何向日葵遗传图均可用于确定与特定标记连锁的标记。例如，特定连锁标记可以从任何本领域已知的遗传图(例如实验图或整合图)加以确定，并可以从任何新的定位数据集加以确定。
本发明的实施方案不仅限于任何特定向日葵群体或使用任何特定方法学的(例如，任何特定的软件或任何特定的软件参数组)来鉴定或确定特定标记与低棕榈酸含量表型的连锁。根据本公开，本领域的技术人员将能够将本文所述的标记的特征外推到任何感兴趣的向日葵基因池或群体，并且在这样做时可使用任何特定的软件和软件参数。
V.向日葵中的低棕榈酸含量标记的检测
用于检测(鉴定)携带低棕榈酸含量标记基因座的特定等位基因的向日葵植物或种质的方法是一些实施方案的特征。在一些实施方案中，本领域中可用的多种标记检测方法中的任一种都可以用于检测标记等位基因，这取决于被检测标记的类型。在实例中，用于标记检测的合适方法可以包括扩增和鉴定所得的扩增标记，通过，例如但不仅限于，PCR；LCR；和基于转录的扩增方法(例如ASH、SSR检测、RFLP分析和许多其它方法)。
一般地，遗传标记的检测依赖核酸的一种或多种性质。例如，一些用于检测遗传标记的技术利用探针核酸与遗传标记的相应核酸(例如使用向日葵基因组DNA分子作为模板产生的扩增核酸)的杂交。在特定的实施方案中，可以使用包括，例如但不仅限于，溶液相、固相、混合相的杂交格式和原位杂交测定进行等位基因检测。关于核酸杂交的详细指导可以在例如下列文献中找到：Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes Elsevier,NY。
对应于群体成员之间的遗传多态性的标记可以用多种方法中的任一种检测，这些方法例如但不仅限于，基于核酸扩增的方法；和多态性标记区的核苷酸测序。许多检测方法(包括基于扩增的和基于测序的方法)在一些实例中可以容易地被修改以适应高通量分析，例如通过使用可用的高通量测序方法，如杂交测序。
用于扩增SSR-型标记基因座的扩增引物包含在一些实施方案的特定实例中。表6提供了用于扩增本文所述的特定标记的特异性引物。然而，技术人员可以立即认识到，给定引物任一侧的其他序列可以代替给定的引物，只要该引物能够扩增包含要检测的等位基因的核苷酸序列即可。而且，用于等位基因检测的具体探针可以改变。例如，任何能够鉴定要检测的标记扩增子的区域的探针都可以代替本文列出的示例探针。而且，扩增引物和检测探针 的构型也可以改变。因此，实施方案并不仅限于本文具体列出的引物和探针。尽管本文提供了许多具体的引物实例(见表6)，但是可以使用任何合适的方法设计出本发明可以使用的合适探针。例如，可以用任何合适的软件程序，例如但不仅限于，设计等价的引物。
分子标记可以用本领域可用的确立方法进行检测，此类方法包括例如但不仅限于：ASH或其他用于检测SNP的方法；AFLP检测；扩增的可变序列检测；RAPD检测；RFLP检测；自维持序列复制检测；SSR检测；SSCP检测；和同工酶标记检测。尽管图1和表6中提供的示例标记是SSR标记，但是前述标记类型中的任一种均可用在特定的实施方案中来鉴定包含贡献于向日葵低棕榈酸含量表型的遗传元件的染色体片段。
例如，包含RFLP的标记可以通过，例如，使要检测的核酸的探针(其通常是亚片段或对应于亚片段的合成寡核苷酸)与待检测的限制酶消化的基因组DNA杂交来进行检测。选择限制酶以在不同个体或群体中提供有至少两个可选择(或多态性)长度的限制性片段。确定一种或多种可以为每个杂交产生提供信息的片段的限制酶是一个简单的过程，在提供了靶DNA序列后，可以由本领域的技术人员容易地实现。在合适的基质(例如琼脂糖或聚丙烯酰胺)中基于长度进行分离并转移到膜(例如硝酸纤维素或尼龙)上之后，可以在导致探针与靶平衡结合的条件下使被标记的探针杂交，随后通过清洗除去多余的探针，并检测被标记的探针。
在一些实施方案中，使用扩增步骤作为检测标记基因座/对标记基因座进行基因分型的方法的一部分。然而，扩增步骤不是在所有情况下都是标记检测所必需的。例如，未扩增的基因组DNA可以通过对基因组DNA样品进行Southern印迹而简单地检测到。在扩增/检测方法中也可以省略单独的检测探针，这可以通过例如但不仅限于下列方式来实现：实施实时扩增反应，实时扩增反应借助掺入产物时扩增引物的修饰来检测产物的形成；将被标记的核苷酸掺入到扩增子中；和通过监视扩增子与未扩增的前体相比分子旋光性质的变化(例如借助荧光偏振)。
PCR、RT-PCR、实时PCR和LCR被特别广泛地用作扩增和扩增检测方法，用于扩增和检测核酸(例如包含标记基因座的核酸)。关于使用这些和其它扩增方法的细节可以在大量标准教科书中的任一种中找到，包括例如：Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2000)第三版,第1-3 章,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY；Current Protocols in Molecular Biology(从2002年版增补)F.M.Ausubel等编,Current Protocols,Greene Publishing Associates公司和John Wiley&Sons公司合资；和PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(1990)Innis等编，Academic Press Inc.,San Diego,CA。关于植物中核酸检测的额外细节还可见例如Plant Molecular Biology(1993)Croy(编)BIOS Scientific Publishers,Inc。
在例如下列文献中也可以找到关于足以指导技术人员执行体外扩增和检测方法，包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其他RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA)及其实例的技术的额外细节：美国专利4,683,202；Arnheim and Levinson(1991)J.NIH Res.3:81-94；Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173；Guatelli et al.(1990),supra；Lomell et al.(1989)J.Clin.Chem.35:1826；Landegren et al.(1988)Science 241:1077-80；Van Brunt(1990)Biotechnology 8:291-4；Wu and Wallace(1989)Gene 4:560；Barringer et al.(1990)Gene 89:117；和Sooknanan and Malek(1995)Biotechnology 13:563-4。通过PCR扩增大核酸的改良方法，其可以在定位克隆的一些应用中使用，在Cheng et al.(1994)Nature 369:684及其引用的参考文献中有进一步的描述，其中可以产生长达40kb的PCR扩增子。
许多可用的生物教科书也有关于PCR和相关扩增方法的进一步讨论。技术人员会意识到，基本上任何RNA均可被转变成适合于限制性消化、PCR扩增和用逆转录酶和聚合酶测序(例如通过RT-PCR)的双链DNA。
在一些实施方案中，核酸探针可用于检测包含标记等位基因核苷酸序列的核酸。这些探针可以在，例如，定位克隆中用于分离与标记等位基因序列连锁的核苷酸序列。在特定实施方案中有用的核酸探针不受任何特定尺寸约束的限制。在一些实施方案中，核酸探针的长度可以是，例如但不仅限于，至少20个核苷酸；至少50个核苷酸；至少100个核苷酸；和至少200个核苷酸。针对标记基因座的核酸探针可以是克隆的和/或合成的。
任何合适的标记物均可在具体实例中与探针一起使用。适合于和核酸探针一起使用的可检测标记物包括任何可以通过分光、放射性同位素、光化学、生物化学、免疫化学、电、光或化学手段检测的组分。因此，杂交探针可以用，例如，放射自显影、荧光显影或其它类似的检测技术检测，这取决于所 检测的特定标记物。有用的标记物包括生物素(用于用带标记物的链霉亲和素偶联物染色)、磁珠、荧光染料、放射性标记物、酶、和比色标记物。其他标记物包括与用荧光团、化学发光剂和酶标记的抗体或特异性结合靶结合的配体。探针还可包括带放射性标记的PCR引物，其用于产生带放射性标记的扩增子。关于用于标记核酸的标记策略的额外信息和相应的检测策略可以在例如下列文献中找到：Haugland(1996)Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,Sixth Edition,Molecular Probes,Inc.,Eugene OR；和Haugland(2001)Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,Eighth Edition,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR(有CD ROM可用)。在特定实例中，PCR检测和定量使用带双标记物的荧光寡核苷酸探针，例如 探针(Applied Biosystems)来实施。
在一些实施方案中，引物不带标记物，而标记PCR扩增子可以在例如，尺寸解析(size resolution)后(例如在琼脂糖凝胶电泳后)加以可视化。在特定实例中，在尺寸解析后对PCR扩增子的溴化乙锭染色允许将对应于不同标记等位基因的不同尺寸的扩增子可视化。
实施方案中使用的引物不仅限于能够产生特定尺寸的扩增子的引物。例如，用于扩增特定标记基因座和等位基因的引物不仅限于扩增相关基因座整个区域的引物。引物可以产生任何合适长度的扩增子，其长度比等位基因定义中给出的更长或更短。在实例中，标记扩增可以产生的扩增子的长度是，例如但不仅限于，至少20个核苷酸；至少50个核苷酸；至少100个核苷酸；和至少200个核苷酸。
用于制作寡核苷酸和包含寡核苷酸的有用组合物(例如，探针、引物、分子信标、PNA和LNA)的合成方法是本领域技术人员众所周知的。例如，寡核苷酸可以根据在例如Beaucage and Caruthers(1981)Tetrahedron Letts.22(20):1859-62中描述的固相亚磷酰胺三酯法化学地合成。这些方法可以采用自动化的合成仪，例如但不仅限于，Needham-VanDevanter et al.(1984)Nucleic Acids Res.12:6159-68中所描述的。寡核苷酸(包括经过修饰的寡核苷酸)还可以从许多商业来源订购，包括例如但不仅限于，The Midland Certified Reagent Company；The Great American Gene Company；ExpressGen Inc.；和Operon Technologies Inc。类似地，PNA可以从许多来源中的任何来源定制，包括例如但不仅限于，PeptidoGenic；HTI Bio-Products,Inc.；BMA Biomedicals  Ltd(U.K.)；和Bio.Synthesis,Inc。
在一些实施方案中，可以使用计算上模拟的方法(in silico method)检测标记等位基因。例如，包含标记序列的核酸序列可以存储在计算机中。期望的标记基因座序列(或其同源物)可以用合适的核酸搜索算法加以鉴定，例如，由例如但不仅限于，提供的算法，或者更简单的文字处理器。
在一些实施方案中，标记等位基因使用基于PCR的检测方法加以检测，其中包含标记的PCR扩增子的大小或序列可以指示特定标记等位基因的存在或不存在。在一些实例中，PCR引物与多态性标记区两侧的保守区杂交。用于如此扩增分子标记的PCR引物在本领域中有时被称作“PCR标记”(PCR markers)或简称为“标记”。
在作物中开发分子标记的一个主要动机是通过标记辅助选择(MAS)提高植物育种效率的潜力。与感兴趣性状或基因连锁的遗传标记可用于鉴定在一个或多个基因座处含有期望标记等位基因的植物，因此预期这些植物可以将该期望标记等位基因与该感兴趣的性状或基因一起转移给它们的后代。遗传标记可用于鉴定在一个基因座或者在数个非连锁或连锁的基因座(例如，单倍型)处含有特定基因型的植物。类似地，作为旨在提高向日葵产量的整体MAS育种程序的一部分，可以将本文所述的标记等位基因渗入到任何期望的向日葵遗传背景、种质、植物、品系、品种等中。
根据一些实施方案，本文所述的标记提供了鉴定包含低或减少的棕榈酸含量(或高或增大的棕榈酸含量)的向日葵植物和种质的手段，它是通过鉴定包含某个基因座处例如HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,HA0612A的特定等位基因，和与前述的至少一者连锁的标记的植物和种质来实现的。通过鉴定缺少与低棕榈酸含量共分离的标记等位基因的植物，可以鉴定高棕榈酸植物和种质(或者棕榈酸含量降低得较少的植物)，例如以便将其从后续的杂交和育种中淘汰。
根据前文，本发明的实施方案包括具有与贡献于或赋予低(例如降低的)棕榈酸含量表型的QTL共分离的显著盖然性的分子标记。这些QTL标记可以在期望性状(降低的棕榈酸含量)的标记辅助选择中得到应用，并具有其它的用途。本发明的实施方案并不仅限于任何用于检测或分析这些标记的特定方法。
VI.将低棕榈酸含量标记基因渗入到向日葵品种中
如前文提到的，鉴定包含与低(例如降低的)棕榈酸含量表型连锁的标记等位基因的向日葵植物或种质，为实施向日葵的标记辅助选择提供了基础。在一些实施方案中，选择至少一个含有至少一个与低棕榈酸正相关的标记等位基因的向日葵植物，同时可以反选择包含与低棕榈酸含量负相关的标记等位基因的向日葵植物。
与低棕榈酸正相关的期望标记等位基因可以基因渗入到具有特定(例如优良或外来)遗传背景的向日葵中，从而产生基因渗入的低棕榈酸含量向日葵植物或种质。在一些实施方案中，多个低棕榈酸含量标记可以被顺次或同时选择和/或基因渗入到向日葵中。可以在单个植物或种质中选择的低棕榈酸含量标记的特定组合没有限制，并且能够包括标记，例如图1中提出的那些，任何与图1中所列标记连锁的标记，或任何位于本文所定义的QTL区间内的标记的组合。
在实施方案中，鉴定与向日葵植物的低棕榈酸含量正相关的QTL标记等位基因的能力也为选择具有有利的标记基因座的植物提供了方法。例如，可以选择任何被鉴定为包含期望标记基因座(例如与低棕榈酸含量正相关的标记等位基因)的植物，而反选择缺乏该等位基因的植物(或者包含与低棕榈酸含量负相关的等位基因的植物)。因此，在特定实施方案中，在第一植物或种质中鉴定标记等位基因之后，基因渗入方法包括选择第一向日葵植物或种质，或者选择第一植物或种质的后代。在一些实例中，可以将所得的被选出的向日葵植物或种质和第二向日葵植物或种质(例如良种向日葵或外来向日葵)杂交，从而产生包含该标记等位基因和期望特性和/或第二植物或种质等位基因的后代。
在一些实施方案中，基因渗入低棕榈酸QTL的方法可包括，例如，提供至少一个与低棕榈酸连锁的标记(例如，与低棕榈酸共分离的标记)；在包含低棕榈酸QTL的第一植物或种质中确定标记等位基因；和将标记等位基因基因渗入到第二向日葵植物或种质中，从而产生基因渗入的向日葵植物或种质。在特定的实施方案中，第二向日葵植物或种质可以包含与第一向日葵植物或种子相比增加的棕榈酸含量，而基因渗入的向日葵植物或种质将包含与第二植物或种质相比降低的棕榈酸含量。如在下文中将更详细讨论的，通过这些实施方案和其它实施方案产生的基因渗入的向日葵植物或种质也包 含在本发明的实施方案内。
在一些实施方案中，其中基因渗入的向日葵植物或种质通过本文所提供的任何方法产生，基因渗入的向日葵植物或种质可以用来自该植物的种子中的油的脂肪酸组成来表征。基因渗入的植物或种质在来自该植物的种子油中可以包含，例如但不仅限于，大约3％或更少的棕榈酸。在一些实施例中，这种基因渗入的向日葵植物或种质在来自植物的种子油中包含大约2.5％或更少的棕榈酸，例如但不仅限于，2.6％；2.5％；2.4％；2.3％；2.2％；2.1％；2.0％；1.9％；1.8％；大约1.7％；和更低。
除了将选定的标记等位基因渗入(例如通过常规育种方法)到期望的遗传背景中从而将低棕榈酸QTL基因渗入到该背景中之外，在一些实施方案中还可以使用转基因方法产生低棕榈酸含量的向日葵植物和/或种质。在一些实施方案中，可以将与向日葵中至少一个本文所述的标记连锁的外源核酸(例如基因或开放阅读框)引入到靶植物或种质中。例如，可以从向日葵基因组DNA中克隆与本文所述的至少一个标记连锁的核酸编码序列(例如通过定位克隆)，并引入到靶植物或种质中。
因此，特定的实施方案包括产生包含低棕榈酸含量表型的向日葵植物或种质的方法，其中该方法包括将外源核酸引入到靶向日葵植物或其后代中，其中该外源核酸与如下的核苷酸序列基本上相同，所述核苷酸序列与一个或多个与低棕榈酸含量连锁的标记基因座处的至少一个正相关的标记等位基因连锁。在一些实例中，标记基因座可选自：HA0031B；HA0908；HA1665；HA0304A；HA0850；HA0743；HA0870；HA0907；HA0612A；和与前述的至少一个连锁(例如，展现不超过10％重组频率)的标记。在一些实施方案中，可以使用多个连锁标记构建转基因植物。这多个标记中使用本文所述标记的哪一个由从业者自由裁量。
多种方法的任一种均可用于为向日葵植物或种质提供外源核酸。在一些实施方案中，通过定位克隆分离核苷酸序列，并通过与和低棕榈酸含量正相关的标记等位基因的连锁加以鉴定。例如，所述核苷酸序列可以对应于编码如下多肽的开放阅读框(ORF)，该多肽在向日葵植物中表达时会导致或促成向日葵植物具有低棕榈酸含量。该核苷酸序列可以随后组入到外源核酸分子中。外源核酸的确切组成可以变化。例如，外源核酸可以包括表达载体，以便在该外源核酸所导入的植物体内表达所述核苷酸序列。
与低棕榈酸含量连锁的标记可以利用包含标记辅助选择的方法渗入(例如，藉此渗入低棕榈酸含量表型)到向日葵植物或种质中。在实施方案中，使用已被鉴定为具有与低棕榈酸含量性状共分离的显著盖然性的多态性标记来实施MAS。这些标记(例如，图1中列出的那些)被推定为定位在贡献于植物低棕榈酸含量(与包含野生型基因的植物相比)的基因内部或附近。这些标记可以被看作是性状的指示子，并可以称作QTL标记。在实施方案中，植物或种质进行测试在至少一个QTL标记中正相关等位基因的存在。
在实施方案中，使用连锁分析来确定哪个多态性标记等位基因展现统计学显著的与低棕榈酸含量表型共分离的似然性。在鉴定了这样的与低棕榈酸含量表型正相关的标记等位基因之后，可以使用该标记快速而准确地在植物品系中筛选低棕榈酸含量等位基因，而无需种植植物经过其生命周期并等待表型评估。而且，标记的鉴定允许对特定的低棕榈酸含量等位基因进行遗传选择，即使是在该实际低棕榈酸含量QTL的分子身份未知的情况下。可以从通过杂交产生的后代向日葵植物获取一个小组织样品(例如，从植物的第一片叶)并用合适的分子标记进行筛选。借此，可以快速地确定后代是否应该被继续进一步的育种。连锁标记还排除了可能影响表型表达的环境因素的影响，从而允许以环境中性的方式选择低棕榈酸含量的向日葵。因此，尽管各种环境因素对植物油性状的贡献可能似乎表面上会困扰本文所述标记的使用，但实际上这些标记的一个特殊优势就是它们的可用性不依赖于环境。
在一些包含MAS的实施方案中，可使用多态性QTL标记基因座来选择含有与低棕榈酸含量表型正相关的标记等位基因的植物。例如，可以在来自要选择的植物的生物样品中检测标记核酸等位基因的相应核酸。该检测可以采用探针核酸与标记等位基因或其扩增子杂交的形式(例如，使用等位基因特异性杂交，Southern分析，Northern分析，原位杂交，和引物杂交随后对标记的区域进行PCR扩增)。在验证生物样品中存在(或不存在)特定标记等位基因之后，选择植物，并且在一些实例中可将其用于通过选择育种来制造后代植物。
向日葵植物育种者期望低棕榈酸含量标记基因座位与其它期望性状(例如高产率)的标记/基因的组合，以开发改良的向日葵品种。通过非分子方法(例如向日葵植物的性状评估)筛选大量样品一般是昂贵、耗时和不可靠的。使用本文所述的与低棕榈酸含量QTL连锁的多态性标记，提供了一种有效 的方法来在育种程序中选择期望的品种。低棕榈酸含量的标记辅助选择与田间评估相比的优势包括，例如，MAS可以在一年的任何时间进行，而不必考虑生长季节。而且，如前面提出的，环境影响与标记辅助选择基本上无关。
当一个群体相对于与一个或多个性状连锁的多个标记基因座(例如与低棕榈酸含量连锁的多个标记)分离时，MAS的效率与表型筛选相比会更大，因为所有的标记基因座可以在实验室中从单个DNA样品一起被评估。在本发明的具体实施方案中，可以从单个样品或从多个平行样品同时或顺次地测定HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,和HA0612A标记，以及与前述至少一个连锁的标记。
MAS在植物育种中的另一个用途是帮助通过回交育种回收轮回亲本基因型。进行回交的目的通常是将一个或少数几个标记或QTL基因座从供体亲本(例如包含期望的低棕榈酸含量标记基因座的亲本)渗入到来自轮回亲本(例如，其他的高产向日葵品系)的其他期望的遗传背景中。所进行的回交的轮数越多，轮回亲本对所得的基因渗入品种的遗传贡献越大。在一些实例中，可能进行许多轮的回交，这是因为，例如，低棕榈酸含量植物可能由于其他原因(例如低产率、低育性等)是不理想的。相对地，强化育种程序中产生的株系可能具有优良的产率、育性等，而仅仅在一个期望的方面，例如在棕榈酸含量上有缺陷。在来自供体源(其可能是也可能不是要用作轮回品系的优良品种的优良遗传背景)的特定标记的标记辅助回交中，从业者可以在回交后代中选择供体标记，然后利用与轮回品系的反复回交来尽可能多地重建轮回品系的基因组。
根据前述，可以利用本文所述的标记和方法来指导人们进行具有与优越农艺学性能(例如，低棕榈酸含量，以及与任何其它可用的关于产率、疾病抗性等的标记)相关的染色体片段等位基因形式的期望互补物(组)的向日葵品种的标记辅助选择或育种。可以将任何所述的标记等位基因通过基因渗入(例如通过传统育种和/或转化)引入到向日葵品系中，以产生具有优越农艺学性能的向日葵植物。在一些实施方案中，如果来自植物的核酸对期望的遗传标记等位基因是阳性的，则植物可以自花授粉以创建具有相同基因型的纯系，或者可以将它们与包含相同标记等位基因或其它期望标记和/或特征的植物杂交以创建有性杂交的杂种世代。
很多时候，将本发明的方法应用于至少一个亲缘的向日葵植物，例如来 自主题向日葵植物系谱中的祖先品系或后代品系，从而能够跟踪期望的低棕榈酸含量等位基因的遗传情况。用于本发明方法的各向日葵植物相隔的代数一般为1-20代，通常1-5代，典型的是相隔1，2或3代，非常经常的是，向日葵植物的直接子代或亲代用于该方法(即，隔1代)。
遗传多样性在育种项目中是重要的。在多样性有限的情况下，当所有有利的等位基因均被固定在优良群体内时，育种程序中获得的遗传增益最终将达到平台。因此，植物育种的一个目的是在优良池中引入多样性而不丧失已经取得的遗传增益，并使用最少的可能投资。MAS提供了哪个基因组区域和哪些来自原始祖先的有利等位基因已经过选择并且随时间推移保守的指示，从而有助于从外来种质资源(与优良基因池无亲缘的亲本)引入有利变异以期发现目前不存在于优良基因池内的有利等位基因的努力。因此，在一些实施方案中，本文所述的标记可用于涉及(优良x外来)向日葵品系的杂交中的MAS，通过对分离后代进行MAS，来维持主要的产率等位基因，以及本文的低棕榈酸含量标记等位基因。
在一些实施方案中可以使用本文所述的分子标记基因座和等位基因(例如HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,HA0612A,和与前述的至少一个连锁的标记)，如前所述，来鉴定低棕榈酸含量QTL，其然后可以通过熟知的方法将该QTL克隆。这些低棕榈酸含量克隆可以首先通过其与本文所述的标记的遗传连锁来加以鉴定。例如，“定位基因克隆”利用低棕榈酸含量标记的物理邻近性来界定含有低棕榈酸含量QTL基因的分离染色体片段。分离的染色体片段可以通过众所周知的方法产生，例如但不仅限于，用一种或多种限制酶消化染色体DNA，用PCR扩增染色体区域，和任何合适的备选扩增反应。可以随后将经过消化或扩增的片段连接到适合于复制和/或表达所插入片段的载体中。与和表型性状相关的ORF邻接的标记可以和DNA克隆(例如，来自基因组DNA文库的克隆)特异性杂交，由此鉴定其上带有该ORF(或ORF的片段)的克隆。如果标记与低棕榈酸含量QTL基因的距离较远，则含有该ORF的片段可以通过对克隆的多轮筛选和分离加以鉴定，这些克隆合起来组成一段连续的DNA序列。这个过程通常被称作“染色体步移”，并且它可以用于产生“重叠群(contig)”或“重叠群图谱”。
在下列文献中可以找到足以指导技术人员分离与连锁标记相关的克隆 的方法：例如，Sambrook等(编)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989；和Ausubel等编,Current Protocols in Molecular Biology,第2章,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995。
VII.包含低棕榈酸含量标记的植物
一些实施方案包括用于制作向日葵植物的方法，并进一步包括这些向日葵植物自身。在特定的实施方案中，这种方法可以包括在本文所述的与低棕榈酸连锁的标记处使第一亲本向日葵植物与第二向日葵植物杂交，其中第一向日葵植物包含至少一个与低棕榈酸正相关的标记等位基因；和在植物生长条件下培育雌性向日葵植物，从而产生向日葵植物后代。可以对这些向日葵植物后代分析与低棕榈酸含量连锁的标记等位基因，并可选择期望的后代。这些后代植物或其种子可以用于各种用途，包括但不仅限于，可以商业销售它们用于向日葵生产；用于食品；加工获得期望的向日葵产品(例如，葵花籽油)；和/或在后续轮次的育种中进一步使用。根据一些实施方案的向日葵植物包括含有本文所述标记的至少一个等位基因形式的后代植物，从而使进一步的后代能够继承该标记等位基因。
一些实施方案包括用于产生包含低棕榈酸含量(例如，降低的棕榈酸含量)的向日葵植物的方法。在特定的实施方案中，这些方法可以包括通过常规植物育种或通过将外源DNA(例如转基因)引入到向日葵栽培种或植物中产生这种植物。
因此，一些实施方案包括用对应于低棕榈酸含量QTL的核酸转化的宿主细胞和生物体，其中QTL是使用本文所述的至少一个与低棕榈酸含量连锁的标记鉴定的。在一些实例中，这些核酸可以包括编码贡献于低棕榈酸含量表型的表达产物的染色体区间(例如基因组片段)、ORF、和/或cDNA。
宿主细胞可以用包含与低棕榈酸含量标记连锁的ORF的载体(例如克隆载体、穿梭载体或表达载体)基因工程改造(例如，转导、转染、转化等)。载体包括，例如但不仅限于，质粒；噬菌体；土壤杆菌；病毒；裸多核苷酸(线性或环状)；和缀合(conjugated)多核苷酸。许多载体可以被引入到细菌中，特别是用于繁殖和扩增的目的。
载体可以通过本领域已知的多种标准方法中任一种引入到植物组织、培 养的植物细胞和植物原生质体中，包括例如但不仅限于：电穿孔(From et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5824)；病毒载体感染，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)(见例如美国专利号4,407,956)；含有核酸的小颗粒飞弹渗入(ballistic penetration)(Klein et al.(1987)Nature 327:70)；使用花粉作为载体(PCT国际专利公开No.WO 85/01856)；和使用携带T-DNA质粒的根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌，其中克隆有DNA片段(Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803)。在本发明的某些实施方案中可以采用任何合适的可以高效地将核酸引入到细胞或原生质体内的方法，包括但不仅限于本文明确鉴定的具体方法。
经工程改造的宿主细胞可以培养在常规的营养培养基中，或者经过改良的培养基，例如为了激活启动子或选择转化子而改良的培养基中。在一些实施方案中，宿主植物细胞可以培养成转基因植物。从培养的原生质体进行植物再生在例如下列的文献中有描述：Evans et al.(1983)“Protoplast Isolation and Culture,”包含在Handbook of Plant Cell Cultures 1,MacMillan Publishing Co.,NY,第124-176页；Davey(1983)“Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts,”包含在Protoplasts,Birkhauser,Basel,第12-29页；Dale(1983)“Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops,”包含在Protoplasts,同上,第31-41页；和Binding(1985)“Regeneration of Plants,”包含在Plant Protoplasts,CRC Press,Boca Raton,FL,第21-73页。提供关于植物细胞培养和再生的有用细节的其他资源包括Payne et al.(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems,John Wiley&Sons,Inc.,NY；Gamborg and Phillips(编)(1995)Plant Cell,Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods,Springer Lab Manual,Springer-Verlag(Berlin Heidelberg NY)；和R.R.D.Croy(编)Plant Molecular Biology(1993)Bios Scientific Publishers,Oxford,UK(ISBN 0121983706)。
使用上述任何转化技术产生的转化植物细胞可以被培养从而再生出具有转化基因型以及因此具有期望表型的完整植物。这些再生技术一般依赖于组织培养生长培养基中某些植物激素的操作，典型地依赖于已经与期望的核苷酸序列一起被引入到细胞内的杀生物剂和/或除草剂标记。用于产生完整植物的再生和培育过程包括如下步骤：选择转化细胞和苗；使转化苗生根；和在土壤中培育小植物。
用降低棕榈酸含量的核酸(例如包含本文所述的标记者)进行的植物转化可用于转化除向日葵之外的物种。例如，可以想到，贡献于或提供向日葵中的低棕榈酸含量表型的QTL的表达产物当被转化到其它农艺学和园艺学重要的植物物种中并在其中表达时，也能够降低棕榈酸含量。这些物种包括双子叶植物，例如但不仅限于，来自下列科的双子叶植物：豆科(包括豌豆，豆类(beans)，小扁豆，花生，豆薯(yam bean)，豇豆，藜豆，大豆，三叶草，紫花苜蓿，羽扇豆，野豌豆，莲花，草木樨，紫藤，和香豌豆)和菊科(维管植物中最大的科，包括至少1000个属，包括重要的商业作物如向日葵)。其他包含可降低棕榈酸含量的核酸的植物(例如，包含本文所述标记者)可以是来自如下属的植物：葱属、芹属、落花生属、芸苔属、辣椒属、鹰嘴豆属、黄瓜属、南瓜属、胡萝卜属、荞麦属、大豆属、向日葵属、莴苣属、兵豆属、番茄属、苜蓿属、豌豆属、菜豆属、茄属、车轴草属、豇豆属，和许多其他的属。可用于特定实例的常见作物包括，例如但不仅限于：大豆，向日葵，加拿大油菜，豌豆，豆类(beans)，小扁豆，花生，豆薯，豇豆，藜豆，三叶草，紫花苜蓿，羽扇豆，野豌豆，甜三叶草，香豌豆，紫花豌豆，蚕豆，西兰花(broccoli)，抱子甘蓝，甘蓝，花椰菜(cauliflower)，羽衣甘蓝(kale)，大头菜(kohlrabi)，芹菜，莴苣，胡萝卜，洋葱，辣椒，马铃薯，茄子(eggplant)和番茄。
VIII.用于检测和/或关联低棕榈酸含量标记的系统
在一些实施方案中，还包括用于鉴定含有至少一个与向日葵中低棕榈酸性状连锁的标记的植物，和/或用于将特定连锁标记等位基因的存在与低棕榈酸含量相关联的系统，包括自动化系统。示例系统可以包括用于检测如本文所述的标记基因座处等位基因的探针；用于检测探针上标记的检测器；合适的液体处理元件和温度控制器，例如混合探针和模板和/或扩增模板者；和/或将标记检出与特定标记基因座或等位基因的存在相关联的系统指令。
在特定的实施方案中，提供了用于鉴定预测具有低棕榈酸含量的向日葵植物的系统。这种系统可以包括，例如但不仅限于：一组标记引物和/或探针，其配置成检测与低棕榈酸含量连锁的至少一个标记的至少一个等位基因(例如HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,HA0612A,和与前述的至少一个连锁的标记)；检测器，其配置成检 测一个或多个来自该组标记探针或引物或其扩增子的信号输出，借此鉴定等位基因存在与否；和将该等位基因的存在与否与低(例如降低)或高棕榈酸含量相关联的系统指令。
执行标记检测和/或关联的系统可以包括检测器，其配置成检测一个或多个来自该组标记探针或引物或其扩增子的信号输出。检测器的具体配置可以取决于用于检测标记等位基因的标记物的类型。特定的实例可以包括光学检测器和/或放射性检测器。例如，带标记探针的光发射或其他性质的检出可以指示与探针相互作用(例如通过特异性杂交)的标记等位基因的存在与否。检测器任选地监视一个或多个来自扩增反应的信号。例如，检测器可以监视相应于“实时”扩增测定结果的光信号。
可用的信号检测设备多种多样，包括例如但不仅限于，光电倍增管；分光光度计；CCD阵列；阵列和阵列扫描仪；扫描检测器；光电管和发光二极管；显微镜；高速扫描振镜(galvo-scanns)；和微流体核酸扩增检测装置。除了用于检测标记等位基因的标记物类型之外，检测器的具体配置还部分地依赖于用户最方便获得的仪器。在一些实例中，可以使用检测荧光、磷光、放射性、pH、电荷、吸光度、冷光、温度、或磁性的检测器。
在根据一些实施方案的系统中提供的指令的确切形式可以类似地变化，这取决于系统的组件。例如，指令可以作为系统的一个或多个集成单元中的系统软件存在，或者它们可以存在于与检测器操作耦合的一个或多个计算机中或计算机可读介质中。在一些实例中，系统指令包括至少一个参照表，其包括植物或种质中特定标记等位基因的存在与否与预测的棕榈酸含量之间的关联。指令还可以包括建立用户与系统的界面的指导；例如，为了允许用户观察样品分析结果和向系统中输入参数。
在特定的实施方案中，系统可以包括用于例如在自动化(例如完全自动化)系统中储存或传输描述或指派所检测到的标记等位基因的计算机可读数据的组件。例如，可以提供计算可读介质，其包括用于存储计算机编码的缓存、主存和存储器，和/或其它电子数据存储组件(例如硬盘驱动器、软盘驱动器和存储设备驱动器)。描述通过本发明方法检测的等位基因的数据还可以作为体现(embody)在传输介质中的计算机数据信号以电子、光、或磁形式在网络上传输，例如内联网或互联网或其组合。系统还可以或者替代地通过无线、红外或其他可用的替代传输方式传输数据。
在操作期间，系统通常包括待分析的样品，例如植物组织或从组织分离的材料，例如基因组DNA、扩增的基因组DNA、cDNA、扩增的cDNA、RNA、扩增的RNA等。
在一些实施方案中，系统可以由分离的元件构成，或者集成为单一单元，以方便检测标记等位基因，任选地，用于进一步执行标记-表型关联。在特定的实施方案中，系统还可以包括样品，例如但不仅限于，来自向日葵或者来自选定的向日葵植物组织的基因组DNA、扩增的基因组DNA、cDNA、扩增的cDNA、RNA、扩增的RNA。
在一些实施方案中提供的自动化系统可任选地包括用于样品操作的组件；例如机器人设备。例如，自动化系统可以包括用于将溶液(例如植物细胞提取物)从源头转移到目的地(例如从微孔板转移到阵列基质)的机器人液体控制支架(armature)，目的地可以与数字计算机(例如集成计算机系统中的)操作连接。用于将数据输入到数字计算机中以便控制机器人液体控制支架的高通量液体转移(和任意地，控制通过支架转移到固体支持物上)的输入设备也可以是自动化系统的一个特征。可商购的自动化机器人液体处理系统很多。例如，Caliper Technologies公司(Hopkinton,MA)可以提供多种自动化系统，它们使用各种ZymateTM系统并且通常包括机器人和液体处理模块。类似地，常见的机器人，其用在多种实验室系统中(例如用于微滴定盘操作)，也可以从例如Beckman Coulter公司(Fullerton,CA)购买。作为常规机器人的一种替代品，Caliper Technologies和Agilent technologies(Palo Alto,CA)出产的用于实施液体处理和检测的微流体系统目前普及很广。
在特定的实施方案中，用于分子标记分析的系统可包括，例如但不限于，包括高通量液体控制软件的数字计算机；包括用于分析来自标记标记物的数据的图像分析软件的数字计算机；包括数据解析软件的数字计算机；用于将溶液从源头转移到目的地的机器人液体控制支架；用于将输入输入到系统内(例如，控制机器人液体控制支架的高通量液体转移)的输入设备(例如，电脑键盘)；和用于将来自被标记探针的标记物信号数字化的图像扫描器。
由照相机或其他设备(例如，光电二极管和数据存储设备)观察和/或记录的光学图像(例如杂交图谱)可以在本文的任何实施方案中被进一步处理。例如但不仅限于，这些图像的处理可以是将图像数字化和/或在计算机上对图像进行存储和分析。有许可商购的多外周设备和软件可供使用例如各种计算机 和程序平台进行数字化，并对数字化的视频或数字化的光学图像进行存储和分析。
一些实施方案还包括可用于鉴定包含至少一个与向日葵中低棕榈酸表型连锁的标记的植物，和/或用于将特定连锁标记等位基因的存在与低棕榈酸含量相关联的试剂盒。在一些实例中，这种试剂盒可以包括用于检测至少一个与低棕榈酸含量连锁的标记的合适引物或探针；和使用这些引物和探针检测至少一个标记并将标记等位基因与预测的棕榈酸含量相关联的使用说明书。在一些实例中，试剂盒可以包括用于包装探针、引物和/或使用说明书的包装材料；和对照品(例如，包括探针、引物或用于扩增的模板核酸的对照扩增反应，和分子大小标志物)。
在一些实施方案中，用于鉴定含有至少一个与向日葵中低棕榈酸表型相连锁的标记的植物、和/或用于将特定连锁标记等位基因的存在与低棕榈酸含量相关联的试剂盒或系统可以包括能够检测本文所述的特定SSR QTL标记的核酸。例如，系统或试剂盒可以包括扩增引物对，其能够在向日葵核酸模板上通过DNA聚合酶引发DNA聚合从而产生向日葵标记扩增子，其中该标记扩增子相应于选自HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,HA0612A的向日葵标记，以及与上述至少一个相连锁的标记。例如，标记特异性的引物对可以选自表6中提供的引物对或其等价物。
实施例
如下的实施例被提供用于例证，但不仅限于，本发明的某些实施方案。应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅是出于举例说明的目的，在不背离本发明精神或范围的前提下，本领域的技术人员可识别各种能够被改变的试剂、技术、系统和参数。
实施例1：向日葵棕榈酸含量的自然变异
根据AOCSTM方法Ce 2–66(97)(AOCSTM产品代码MC-CE266)测量了向日葵中棕榈酸含量的自然变异。
将每个测试样品的5粒向日葵种子置于含有一个1/8英寸(0.2825-cm)钢球(Small Parts Inc.目录号no.BS-0125-C)的带标记的96孔提取盘(Corning Inc.目录号no.4411)中。向每孔添加200μL庚烷，然后盖上盖子。将封盖 的样品置于GenoGrinderTM中，以1300震/分钟震荡2.0分钟。移出样品，用铲子徒手压碎任何未被研磨的样品，并再次研磨。
第一次研磨后，向每孔添加400μL庚烷，并以1300震/分钟对材料再次研磨。随后，在6℃以3700rpm将样品离心10分钟。然后，使用Beckman Coulter MC机器人，将上清液转移到带有玻璃插片(glass insert)(MicroLiter Analytical Supplies Inc.目录号no.07-8045MB-1200)并含有400μL庚烷的96孔板中。向每孔添加40μL 1％甲醇钠。甲醇钠由30％储液用甲醇(Sigma-Aldrich Fluka目录号no.71748)稀释。用Teflon垫盖(mat cap)封盖，并在分析之前在室温下温育60分钟。
用装备有J&W Scientific DB-2315m x 0.25mm ID柱和0.25μm膜厚(Agilent Technologies,catalog no.122-2312)的Agilent 6890GC-FID(Agilent Technologies)对样品进行分析，确定其脂肪酸组成。初始炉温是200℃，并在运行期间保持该温度。入口设定为1:50的分流比(split ratio)和温度280℃。最初2分钟保持0.8mL/分钟氦气的斜坡流速(ramped flow rate)。然后，流速从1.0mL/分钟增加至2.5mL/分钟，并保持1.5分钟。检测器设定为300℃，具有恒定的载气补充(carrier gas make up)和30mL/分钟的柱流速，燃料氢流速为30mL/分钟，氧化剂流速为400mL/分钟。对所有样品使用2μL的注射体积。
棕榈酸甲酯的鉴定是通过与甲基酯参考标准(Nu-Chek-Prep,Inc.,GLC#428)的保留时间进行比较。图1和表1。根据总积分色谱峰面积和参考标准为所有分析物计算个体百分比面积。还注射了庚烷空白，用以鉴定GC上的任何污染。
表1.棕榈酸含量分布的统计
分布 分位数 ％棕榈酸
100.0％ 最大值 15.05
99.5   5.87
97.5   5.23
90.0   4.63
75.0 四分位数 4.20
50.0 中位数 3.72
25.0 四分位数 3.21
10.0   2.92
2.5   2.66
0.5   2.41
0.0 最小值 0.00
使用本方法，对作为一项7年向日葵育种程序的一部分而被开发的向日葵品种评估了田间生长样品的棕榈酸含量。图2和表2提供了所测得的棕榈酸含量的分布。常规向日葵种质中棕榈酸的典型观察值的范围是总脂肪酸的大约2.5％-6％，平均值是3.75％。
表2.棕榈酸含量分布的统计
平均值 3.74945
标准差 0.70766
标准误 0.00466
平均值95％置信区间上限 3.75858
平均值95％置信区间下限 3.74031
实施例2：具有低棕榈酸含量的种质的鉴定
在一项旨在通过与具有高油酸谱(profile)的品系育种来改良一个优良黑壳、高亚油酸向日葵品系(687R)的程序中，发现了低棕榈酸谱。这是通过使用有条纹壳(striped-hull)、高油酸的甜点(confection)亲本(H280R)作为高油酸供体通过回交育种的方法实现的。H280R一般具有较低的棕榈酸含量，但是所观察到的水平通常并不低于大约2.5％。为了实现目标油酸水平，在本回交育种程序期间，在每一个世代均执行如实施例1所描述的FAME分析。在脂肪酸水平的常规筛选过程中，观察到了棕榈酸水平大大降低的分离子(segregant)。在表3中，显示了来自687R与H280R回交育种项目第一回交世代的4个个体的棕榈酸含量值。
表3.使用实施例1所述方案确定的来自从687R/H280R第一回交育种世代中选出的4个花盘(head)的8-10粒种子的成批样本的棕榈酸值
花盘 棕榈酸含量(％)
1 2.18
2 2.13
3 2.06
4 2.04
H280R 3.18
实施例3：在低棕榈酸亲本和常规向日葵优良亲本之间制成的向日葵群体中的棕榈酸含量变异
通过将高油酸恢复系(R系)与来自实施例2所述发现的低棕榈酸来源杂交，证明了当优良向日葵近交系与低棕榈酸含量来源杂交时棕榈酸含量会发生变异。该低棕榈酸来源已经被转变成细胞质雄性不育的背景(A系)。A系与R系杂交产生了F2群体，并收集了384粒种子。将种子切成两半，根据实施例1所述的方案对种子的一半进行分析。将种子的另一半种植用于随后的分析。表4-5提供了A系/R系F2群体(N＝384)中棕榈酸含量的概要统计。
表4.具有典型棕榈酸含量的优良近交系与具有低棕榈酸含量的品系之间F2群体中的棕榈酸含量分布的统计
分布 分位数 ％棕榈酸
100.0％ 最大值 4.216
99.5   4.216
97.5   3.612
90.0   3.342
75.0 四分位数 3.1995
50.0 中位数 2.989
25.0 四分位数 2.5995
10.0   1.976
2.5   1.734
0.5   1.648
0.0 最小值 1.648
表5.具有典型棕榈酸含量的优良近交系与具有低棕榈酸含量的品系之间F2群体中的棕榈酸含量分布的统计
平均值 2.83964
标准差 0.51878
均值标准误 0.02647
平均值95％置信区间上限 2.89169
平均值95％置信区间下限 2.78759
实施例4：棕榈酸含量双峰式分布的证明
图3提供了在实施例3所述的群体中棕榈酸含量的分布。分布是双峰的：群体的一部分集中在大约3.15％棕榈酸，低尾(lower tail)结束于大约2.5％，高尾延伸至大约4％；群体的第二部分集中在大约2.1％棕榈酸，低尾达到大约1.75％，高尾延伸至大约2.5％。从实施例3中提供的四分位数可以观察到，群体的25％的棕榈酸含量低于2.6％，群体的其余部分具有较高的棕榈酸含量。第一四分位数的数值(2.6％)紧密切合双峰式分布从下集群向上集群转换的拐点(inflection point)。注意，高棕榈酸含量个体与低棕榈酸含量个体之间有3:1比值，因此得出结论，在该群体中有一个单一、主效的遗传元件负责低棕榈酸含量，其中隐性的等位基因赋予低棕榈酸表型。
实施例5：棕榈酸含量遗传决定子的QTL定位
使用微卫星或SSR标记以及实施例3和4提供的棕榈酸含量数据，将棕榈酸含量的主效基因座定位在向日葵连锁群5(LG5)上。
向日葵中的定位通常用连锁群指称。连锁群5的图是现有的。见Yu et al.(2003)Crop Sci.43:367-87；另见Tang et al.(2002)Theor.Appl.Genet.105:1124-36。应当注意，由欧洲科学家开发的图谱中向日葵连锁群的编号与，例如，上面所引参考文献中所提出的不同。与向日葵连锁群相应的染色体编 号尚未定义。
表6.在LG5上定位的用于鉴定棕榈酸基因座的SSR标记的引物序列和定位位置
用于SSR标记的PCR程序在GeneAmpTMPCR System 9700(Applied Biosystems)中用双384孔模块(block)进行PCR反应。每个PCR反应在8μL体积中实施，其中含有10ng基因组DNA，终浓度为1x的QiagenTMPCR缓冲液(Qiagen,Valencia,California),0.25μM每种引物(正向和反向),1mM MgCl2,0.1mM每种dNTP,0.4％PVP,和0.04单位HotStartTMTaq DNA聚合酶(Qiagen,Valencia,California)。
PCR条件设置如下：95℃ 12分钟，用于模板DNA变性；40个循环的DNA扩增(每个循环：94℃ 5秒变性，55℃ 15秒退火，和72℃ 30秒延伸)；和72℃ 30分钟的最终延伸。
片段分析将不同引物对的PCR产物多重混合在100μL的终体积中(使用高压灭菌水补充至100μL的终体积)。将0.5μL多重混合PCR产物与5μL上样缓冲液混合。在备有G5-RCT频谱矩阵(spectral matrix)的AB3730XL DNA分析仪(Applied Biosystems)上使用标准条件跑胶。然后，将数据导入到 version 4.0(Applied Biosystems)中。导入全部的染料颜色，并标记2个最高的峰，最小强度为100相对荧光单位(rfu)。根据PCR片段大小给等位基因指定数值。将数字化的等位基因值导入到ExcelTM(Microsoft)中，在那里将它们转变成适合于JoinMapTM3.0和MapQTLTM4.0的格式。
统计学分析 
连锁定位使用JoinMapTM3.0生成A系/R系F2群体的遗传连锁图谱。JoinMapTM3.0要求一个输入文件，称作基因座基因型文件。在基因座基因型 文件中，优良亲本等位基因被称作“A”，供体亲本等位基因被称作“B”，而杂合子的等位基因称作“H”。在基因座基因型文件中，缺失的数据用虚线表示。结果被计算成Kosambi厘摩。将由该分析生成的图谱与公共图谱(见，S.Tang,J.K.Yu,M.B.Slabaugh,D.K.Shintani,S.J.Knapp(2002)Simple sequence repeat map of the sunflower genome.Theor.Appl.Genet.105:1124–1136)进行比较，用于最终的数据解释。
QTL分析使用MapQTLTM4.0为棕榈酸含量进行区间定位，以定位潜在的QTL。MapQTLTM4.0要求3个输入文件，包括一个基因座基因型文件、一个图文件和一个定量数据文件。基因座基因型文件含有如上所述的分离群体的全部基因座的基因型编码。地图文件由JoinMapTM3.0生成，含有实施例5中列出的LG5上27个基因座的估算的图位置。定量数据文件含有使用实施例1所述的分析化学方法确定的棕榈酸含量。
区间定位分析评估QTL沿着两个标记之间的区间定位的盖然性。Jansen(1993)Genetics 135:205-11。执行了区间定位分析，并计算了QTL定位在某一区间内的盖然性。当LOD得分超过预定的P<0.05或P<0.01显著性阈值时，可以做出一个QTL确定，其中LOD得分是从1000次迭代实验间排列检验(1,000iteration experiment-wise permutation test)(Churchill and Doerge(1994)Genetics 138(3):963-71)计算而得的。以在连锁群上具有最大LOD的位置作为QTL在图上的估算位置。由于这是一个F2群体，因此有可能使用统计学模型进行区间定位，以检测仅与加性遗传变异(additive genetic variance)相关的QTL，并使用统计学模型解释(因此检出)同时与加性和显性遗传变异(dominant genetic variation)相关的QTL。先前定义的数据同时使用这两个模型进行分析。
实施例6：根据棕榈酸含量选择回交后代
使用本文所述的标记，对通过使用具有与低棕榈酸表型相关的等位基因的供体系进行回交育种获得的后代进行选择。一个棕榈酸含量为大约3.5％的优良品系与一个具有与在基因座HA0907,HA0041,HA1790,HA1665,HA0908,和HA1620处的低棕榈酸表型相关的等位基因的供体系杂交。从所得后代中选择一部分与所述优良品系回交，从而产生第一回交世代。从第一回交世代选择一部分再次与该优良品系回交，从而产生第二回交世代。表7 显示了来自第二回交世代的个体的基因型。
表7.一个具有高棕榈酸表型的优良品系，一个具有与低棕榈酸表型相关的等位基因的供体，和从以这两个品系分别作为亲本和受体的第二回交世代中选出的一株的基因型
因为低棕榈酸含量表型是隐性的，所以表7所示第二回交世代的个体自身不会显示低棕榈酸表型。为了核实与低棕榈酸相关的等位基因可以在优良背景下提供低棕榈酸表型，进行了后代测试。将表7中的个体自花授粉，对代表自花授粉后代的8粒种子进行FAME分析，以确定棕榈酸含量。表8中提供的结果显示，8个后代中的3个具有低棕榈酸含量表型，与由单一基因座控制的隐性性状1:3的期望比值一致。该结果证明，低棕榈酸含量表型被后代继承。
表8.来自ON6725R[2]/NS1982.8#1＝1＝3第二回交世代的19号植物自花授粉的8个单株的棕榈酸表型
个体 棕榈酸含量(％)
1 2.68
2 2.73
3 1.71
4 2.23
5 1.98
6 2.85
7 3.31
8 1.92
实施例7：选择具有高棕榈酸含量的细胞质雄性不育维持系后代
在商业向日葵杂交种子生产中，细胞质雄性不育系统被用于产生需要量的种子。实施例6中的向日葵系是一个恢复系，当用作具有雄性不育细胞质的雌性的授粉者时，它可以恢复正常的育性。从携带与本文所述标记连锁的低棕榈酸QTL等位基因的雄性和雌性近交系可以产生具有低棕榈酸含量表型的杂交体，因为低棕榈酸含量表型是隐性的。在细胞质雄性不育杂交体产生系统中，雌性近交系包含两个近等基因系：携带赋予雄性不育性的细胞质的A系；和具有正常细胞质但不携带恢复基因的B系。B系是雄性可育的，它能够用于给A系授粉，所得后代是雄性不育的，因为它们继承了来自雌性A系的细胞质。这些后代也与A系亲本基本上相同，因为A和B系是近等基因的。因此B系称作保持系。A系是从B系使用细胞质雄性不育系作为供体，B系作为轮回亲本而衍生的。在与作为轮回(雄性)亲本的B系反复回交之后，B系基因型可以被恢复，同时保持供体的雄性不育细胞质。所得的系被称作A系。创建一个新的A系-B系对的第一步是创建一个新的B系。然后，从B系衍生A系。
为了证明本文所述标记对于创建具有低棕榈酸含量表型的细胞质雄性不育保持系目的的效用，将棕榈酸含量为大约3.5％的优良B系与在基因座HA0850,HA0907,和HA0908处具有和低棕榈酸表型相关的等位基因的供体系杂交。其余基因座在供体和轮回亲本之间是单态的。选择所得的后代与该优良系回交，产生第一回交世代。表9显示了来自第一回交世代的个体的基因型。
表9.一个具有高棕榈酸表型的优良品系B，一个具有与低棕榈酸表型相关的等位基因的供体，和从以这两个品系分别作为轮回亲本和受体的第一回交世代中选出的一株的基因型
为了核实表9中的个体所携带的低棕榈酸等位基因在杂合状态下可以赋予低棕榈酸表型，进行了后代测试。将表9中的个体自花授粉，对代表自花授粉后代的8粒种子进行FAME分析，以确定棕榈酸含量。表10中提供的结果显示，8个后代中的2个具有低棕榈酸含量表型，与由单一基因座控制的隐性性状1:3的期望比值一致。该结果证明，低棕榈酸含量表型可以使用回交育种基因渗入到B系中。
表10.来自ON1919B[1]//CN1919B/NS1982.8#3＝1-17＝5第一回交世代的11号植物自花授粉的8个个体的棕榈酸表型
个体 棕榈酸含量(％)
1 2.74
2 3.16
3 3.01
4 1.77
5 2.97
6 3.47
7 2.73
8 1.87
实施例8：开发最终的具有高棕榈酸含量的细胞质雄性不育优良保持系和恢 复系
回交两代之后，将选定的个体自花授粉3代，选取具有期望农艺学性状者进行FAME分析。表11所示的结果证明，使用回交育种方法能够开发具有低棕榈酸含量表型的最终优良B系。
表11.使用回交育种方法开发的优良B品系的棕榈酸含量
名称 棕榈酸含量(％)
H251B[3]/NS1982.12-20＝1＝4-1-20-07 1.93
ON7479B[2]/NS1982-8#2＝1＝5-12-10-01 1.96
回交两代之后，将所选个体自花授粉3代，选择具有期望农艺学性状者进行FAME分析。表12所示的结果证明，使用回交育种方法能够开发具有低棕榈酸含量表型的最终优良恢复系。
表12.使用回交育种方法开发的优良恢复系的棕榈酸含量
名称 棕榈酸含量(％)
OND163R[4]/NS1982-16＝20＝2＝3＝13-7-2-2 1.79
ON7385R[3]/NS1982.8＝7＝2＝5-4-2-01 1.79
尽管出于阐明和理解的目的已经对前述实施方案进行了详细的描述，但是本领域的技术人员通过阅读本公开可以显见在不背离本发明真实范围的前提下在形式和细节上的各种改变。例如，上述的所有技术和装置可以按照各种组合加以使用。

Claims (37)

1.一种用于鉴定包含低棕榈酸含量的第一向日葵植物或种质的方法，该方法包括：
检测第一向日葵植物或种质中的至少一种与低棕榈酸含量连锁的标记，其中该至少一种标记选自下组：HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,HA0612A，以及与HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,和HA0612A中的至少一个连锁的标记。
2.根据权利要求1的方法，其中该方法包括检测所述第一向日葵植物或种质中的与HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,和HA0612A中的至少一个连锁的标记。
3.根据权利要求2的方法，其中所述被检测的标记展现与HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907和HA0612A中的至少一个标记的少于大约10％的遗传重组频率。
4.根据权利要求1的方法，其中所述被检测的标记选自下组：HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,和HA0612A。
5.根据权利要求1的方法，其中所述种质是向日葵品系或向日葵品种。
6.根据权利要求1的方法，其中所述检测包括检测多态性简单序列重复标记(SSR)的至少一个等位基因形式。
7.根据权利要求1的方法，其中所述检测包括扩增所述标记或所述标记的一部分而产生经扩增的标记扩增子，和检测所得的经扩增的标记扩增子。
8.根据权利要求7的方法，其中该扩增包括：
将扩增引物或扩增引物对与从所述第一向日葵植物或种质分离的核酸混合，其中该引物或引物对与所述标记的至少一部分互补或部分互补，并能够使用该向日葵核酸作为模板引发DNA聚合酶所致的DNA聚合；和
在包含DNA聚合酶和模板核酸的DNA聚合反应中延长所述引物或引物对，从而产生至少一个扩增子。
9.根据权利要求8的方法，其中所述核酸是DNA分子或RNA分子。
10.根据权利要求7的方法，其中所述扩增包括利用聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR)，在PCR或LCR中使用从所述第一向日葵植物或种质分离的核酸作为模板。
11.一种用于产生基因渗入的向日葵植物或种质的方法，该方法包括：
将至少一个与低棕榈酸含量正相关的标记等位基因从第一向日葵植物或种质基因渗入到第二向日葵植物或种质中，产生基因渗入的向日葵植物或种质，
其中该至少一个标记选自下组：HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,HA0612A，以及与HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,和HA0612A中的至少一个连锁的标记。
12.根据权利要求11的方法，其中所述第二向日葵植物或种质与所述第一向日葵植物或种质相比显示更高的棕榈酸含量，并且其中所述基因渗入的向日葵植物或种质与所述第二植物或种质相比显示降低的棕榈酸含量。
13.一种通过根据权利要求11的方法产生的基因渗入的向日葵植物或种质。
14.权利要求13的基因渗入的向日葵植物或种质，其中所述基因渗入的向日葵植物或种质包含大约3.3％或更少的棕榈酸(16:0)与硬脂酸(18:0)的合并总含量。
15.权利要求13的基因渗入的向日葵植物或种质，其中所述基因渗入的向日葵植物或种质含有少于大约2.5％的总棕榈酸含量。
16.权利要求15的基因渗入的向日葵植物或种质，其中所述基因渗入的向日葵植物或种质含有少于大约2.5％的总棕榈酸含量。
17.权利要求16的基因渗入的向日葵植物或种质，其中所述基因渗入的向日葵植物或种质含有少于大约2.2％的总棕榈酸含量。
18.权利要求17的基因渗入的向日葵植物或种质，其中所述基因渗入的向日葵植物或种质含有少于大约2.1％的总棕榈酸含量。
19.权利要求18的基因渗入的向日葵植物或种质，其中所述基因渗入的向日葵植物或种质含有少于大约2.0％的总棕榈酸含量。
20.根据权利要求11的方法，其中所述第二向日葵植物或种质是来自优良向日葵品种或外来向日葵品种的植物或种质。
21.根据权利要求2的方法，其中所述被检测的标记是利用定位群体H757B/H280R确定的。
22.根据权利要求21的方法，其中所述被检测的标记是用选自下组的软件确定的：TASSELTM,GeneFlowTM,和MapManager-QTXTM。
23.根据权利要求1的方法，其中该方法包括将代表被检测的标记的数据电子传输或电子存储在计算机可读介质内。
24.根据权利要求1的方法，其中该方法包括选择所述第一向日葵植物或种质。
25.根据权利要求1的方法，其中该方法包括选择所述第一向日葵植物或种质的后代。
26.根据权利要求24的方法，包括将选定的第一向日葵植物或种质与第二向日葵植物或种质杂交。
27.根据权利要求26的方法，其中所述第二向日葵植物或种质是来自优良向日葵品种或外来向日葵品种的植物或种质。
28.一种用于产生具有低棕榈酸含量表型的转基因植物的方法，该方法包括：
将一个或多个外源核酸导入目标植物中从而产生转基因植物，其中该一个或多个外源核酸中的至少一个包含来自向日葵植物的内源核苷酸序列，其在该向日葵植物中与至少一个选择下组的标记连锁：HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,HA0612A，
其中，所得的转基因植物显示降低的棕榈酸含量。
29.根据权利要求28的方法，其中所述目标植物是向日葵植物。
30.根据权利要求28的方法，其中所述来自向日葵植物的内源核苷酸序列在该向日葵植物中与所述至少一个标记连锁，使得该内源核苷酸序列展现与所述至少一个标记的不超过大约10％的遗传重组频率。
31.根据权利要求28的方法，其中所述核苷酸序列通过定位克隆而被分离，并通过与所述至少一个标记的连锁而被鉴定。
32.根据权利要求28的方法，其中所述外源核酸序列对应于编码多肽的开放阅读框(ORF)，所述多肽当在向日葵植物中表达时导致该向日葵植物具有降低的棕榈酸含量。
33.根据权利要求28的方法，其中所述外源核酸包括表达载体。
34.一种用于鉴定被预测具有低棕榈酸含量表型的向日葵植物的系统，该系统包括：
一组标记探针或引物，配置为检测至少一个与低棕榈酸含量连锁的标记，其中所述标记选自下组：HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,HA0612A，以及与HA0031B,HA0908,HA1665,HA0304A,HA0850,HA0743,HA0870,HA0907,和HA0612A中的至少一个连锁的标记；
检测器，配置为检测来自该标记探针或引物组或其扩增子的一个或多个信号输出，藉此鉴定所述标记的存在或不存在；和
将所述标记的存在或不存在与低棕榈酸含量表型关联的系统指令。
35.权利要求34的系统，其中所述检测器检测一个或多个光发射，其中该光发射指示标记等位基因的存在或不存在。
36.权利要求34的系统，其中所述指令包括至少一个参照表，所述参照表包括所述至少一个被检测的标记处的标记等位基因的存在或不存在与低棕榈酸含量表型之间的关联。
37.权利要求34的系统，其中该系统包括来自植物或种质的核酸样品。
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