附图简述
图1包括从欧洲油菜品种DMS100和Quantum克隆的fad2基因的部分基因组核苷酸序列。顶部显示了从DMS100克隆的fad2基因的部分基因组核苷酸序列(SEQ ID NO:7),底部显示了从Quantum克隆的fad2基因的部分基因组核苷酸序列(SEQ ID NO:9)。箭头标示“C”至“T”的单核苷酸突变,这产生终止密码子(“TAG”)(有阴影)。以粗体和下划线显示了突变体等位基因特异性正向(SEQ ID NO:5)和反向(SEQ ID NO:6)引物,用于突变体等位基因特异性标志物的基于PCR的鉴定。
图2包括与从DMS100(SEQ ID NO:8),Quantum(SEQ ID NO:10),及从发表的欧洲油菜fad2基因(BNfad2)(SEQ ID NO:11)克隆的基因组核苷酸序列简并的fad2基因的氨基酸序列。箭头标示源自DMS100中的单核苷酸突变(“C”至“T”)的终止密码子位置。
图3包括从DMS100和Quantum克隆的fad3c基因的基因组核苷酸序列。顶部显示了从DMS100克隆的fad3c基因(SEQ ID NO:12),而底部显示了从Quantum克隆的fad3c基因(SEQ ID NO:13)。与芜菁和拟南芥(Arabidopsis)中的fad3基因的外显子4、5、6和7对应的外显子是框示的,而与芜菁和拟南芥中的fad3基因的内显子4、5、和6对应的内含子是未框示的。箭头标示“G”至“A”的单核苷酸突变。以粗体和下划线显示了正向(SEQ ID NO:14)和突变体等位基因特异性反向(SEQ ID NO:15)引物,用于突变体等位基因特异性标志物的基于PCR的鉴定。
图4包括关联突变体等位基因特异性标志物和源自Quantum和DMS100杂交的184种双重单倍体(DH)品系的脂肪酸含量的表(顶部),及从fad2基因的突变体等位基因特异性标志物扩增的PCR产物的电泳结果(底部)。
图5包括数量性状基因座(QTL)图,其显示了通过本发明的标志物检出的一个主要(N5)和一个次要(N1)QTL区(对于高油酸(C18:1)),和三个QTL区(N4和N14)(对于低亚麻酸(C18:3))。
图6包括杂种种子生成方案中的细胞质雄性不育系统的一种用途的图示。
图7包括FAME图,其显示多种植物杂交的脂肪酸概貌的分布。
图8包括例示性的根肿病抗性、高油酸、和低亚麻酸芸苔植物中开花日期的分布的显示。
图9包括凝胶图像,其显示了与芸苔中根肿病抗性连锁的分子标志物的鉴定。与根肿病抗性连锁的鉴定的标志物条带以红色突出显示,并且在此情况中,扩增片段的大小是333bp(将总共33个额外的碱基对添加至SEQ ID NO:18和19的引物(将26个碱基添加至SEQ ID NO:18的5’端,并且将7个碱基添加至SEQ ID NO:19的5’端,如分别在SEQ ID NO:20和21中给出)以便于使用ABI 3130遗传分析仪的检测)。提供了测试的每个品系的根肿病反应。
序列表
使用如37 C.F.R.§1.822中限定的核苷酸碱基的标准字母缩写显示所附序列表中所列的核酸序列。仅显示每个核酸序列的一条链,但是应当理解通过任意参考展示链而包括互补链。
SEQ ID NO:1-2是用于从亲本系DMS100和Quantum的基因组欧洲油菜DNA扩增fad2基因的引物。
SEQ ID NO:3-4是用于从亲本系DMS100和Quantum的基因组欧洲油菜DNA扩增fad31基因的引物。
SEQ ID NO:5是突变体特异性正向引物,用于鉴定和/或测定促成芸苔中的高油酸和/或低亚油酸含量的fad2等位基因。
SEQ ID NO:6是反向引物,用于鉴定和/或测定促成芸苔中的高油酸和/或低亚油酸含量的fad2等位基因。
SEQ ID NO:7是从欧洲油菜品种DMS100克隆的fad2基因的部分基因组核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是与从欧洲油菜品种DMS100克隆的基因组核苷酸序列简并的fad2基因产物的氨基酸序列,该序列以如标示的“终止”密码子中断。
SEQ ID NO:9是从欧洲油菜品种Quantum克隆的fad2基因的部分基因组核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是与从欧洲油菜品种Quantum克隆的基因组核苷酸序列简并的fad2基因产物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11是与来自欧洲油菜品种BNfad2的基因组核苷酸序列简并的fad2基因产物的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是从欧洲油菜品种DMS100克隆的fad3c基因的基因组核苷酸序列。
SEQ ID NO:13是从欧洲油菜品种Quantum克隆的fad3c基因的基因组核苷酸序列。
SEQ ID NO:14是正向引物,用于鉴定和/或测定促成芸苔中的高油酸和/或低亚油酸含量的fad32等位基因。
SEQ ID NO:15是突变体特异性反向引物,用于鉴定和/或测定促成芸苔中的高油酸和/或低亚油酸含量的fad32等位基因。
SEQ ID NO:16和17是用于从亲本系DMS100和Quantum的基因组欧洲油菜DNA扩增fad32基因的引物。
SEQ ID NO:18-21是可用于鉴定和/或测定根肿病抗性标志物的例示性引物序列。
SEQ ID NO:22是在与SEQ ID NO:20和21一起使用时用于扩增经标记的DNA片段的经荧光标记的M13通用引物序列,用于检测。
发明详述
I.几个实施方案的概述
本文中描述了包含根肿病抗性表型的芸苔(例如欧洲油菜)植物及其后代。本文中还描述了从此类芸苔植物获得的植物部分,包括植物的种子和植物材料。在具体的实施方案中,对根肿病的抗性可以是单基因的和/或多基因的。在具体的实施方案中,对根肿病的抗性可以是显性的和/或隐性的。
使用包含根肿病抗性表型的欧洲油菜植物,已经鉴定出与根肿病抗性表型紧密连锁的分子标志物。特别地,鉴定出一个简单序列重复(SSR)标志物基因座,其与根肿病抗性表型紧密连锁。此SSR标志物特别可用于将此表型引入其它植物(例如其它欧洲油菜品种和其它芸苔物种)中,例如经由传统的植物育种进行,而且还可用于鉴定可能具有此表型的植物(例如在通过重组遗传工程产生的植物中)。在芸苔育种项目中利用至少一种与根肿病抗性表型紧密连锁的分子标志物可以大大降低对育种材料筛选根肿病抗性的时间和成本。例如,利用此类标志物可以降低对昂贵的根肿病抗性筛选的需要,由此显著有助于根肿病抗性芸苔品种的育种。
II.术语
回交:回交方法可以用于将核酸序列导入植物中。几十年以来已经广泛使用回交技术来将新性状导入植物中。Jensen,N.编Plant BreedingMethodology,John Wiley&Sons,Inc.,1988。在一个典型的回交方案中,将感兴趣的初始品种(回归亲本)与携带要转移的感兴趣基因的第二品种(非回归亲本)杂交。然后,将来自此杂交的所得后代与回归亲本再次杂交,并重复该过程,直到获得如下的植物,其中在来自非回归亲本的转移基因外,在转化植物中恢复回归植物的基本上所有期望的形态学和生理学特征。
根肿病抗性:植物对根肿病的抗性或耐受性指在包含芸苔根肿菌的田间种植时与相同植物的非抗性和/或非耐受性品系相比升高的生长、生产力、和/或植物中根小结大小和/或数目的降低。如本文中使用的,根肿病抗性还包括对根肿病抗性的耐受性。根肿病抗性可以由一种或多种基因、等位基因、或事件赋予。
遗传基因座:如本文中使用的,术语“遗传基因座”指染色体上的位置。
基因组基因座:如本文中使用的,术语“基因组基因座”指生物体的整组染色体内的位置。
连锁不平衡:如本文中使用的,术语“连锁不平衡”指两个基因座之间或性状与标志物之间的统计学关联。
连锁的、紧密连锁的、和极端紧密连锁的:如本文中所使用的,基因或标志物间的连锁指染色体上的基因或标志物显示一起传递到下一代个体的可测量概率的现象。两种基因或标志物彼此越接近,此概率变得越接近(1)。如此,术语“连锁的”可以指以大于0.5的概率(其从独立分类预期,其中标志物/基因位于不同染色体上)与某个基因一起传递的一种或多种基因或标志物。由于染色体上两个基因或标志物的接近性与基因或标志物会一起传递到下一代个体的概率直接相关,术语“连锁的”在本文中也可以指在同一芸苔染色体上彼此位于约2.0Mb内的一种或多种基因或标志物。因此,两种“连锁的”基因或标志物可以相隔约2.1Mb;2.00Mb;约1.95Mb;约1.90Mb;约1.85Mb;约1.80Mb;约1.75Mb;约1.70Mb;约1.65Mb;约1.60Mb;约1.55Mb;约1.50Mb;约1.45Mb;约1.40Mb;约1.35Mb;约1.30Mb;约1.25Mb;约1.20Mb;约1.15Mb;约1.10Mb;约1.05Mb;约1.00Mb;约0.95Mb;约0.90Mb;约0.85Mb;约0.80Mb;约0.75Mb;约0.70Mb;约0.65Mb;约0.60Mb;约0.55Mb;约0.50Mb;约0.45Mb;约0.40Mb;约0.35Mb;约0.30Mb;约0.25Mb;约0.20Mb;约0.15Mb;约0.10Mb;约0.05Mb;约0.025Mb;约0.012Mb;和约0.01Mb。基因可以与驻留于基因外显子或内含子内的标志物“连锁”。在此情况中,连锁的基因和标志物之间的相隔0.00Mb。
与fad2“连锁的”标志物的具体例子包括欧洲油菜基因组的连锁群N5和N1中的核苷酸序列,例如欧洲油菜fad2基因中第411位的“C”至“T”突变。与fad3“连锁的”标志物的具体例子包括欧洲油菜基因组的连锁群N14和N4中的核苷酸序列,例如欧洲油菜fad32基因中的第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“G”至“A”突变。
标志物和/或基因也可以与表型(例如牵涉连锁基因或与连锁标志物连锁的基因的表型)“连锁”。一些实施方案包括与HO、LL、咪唑啉酮抗性、和/或根肿病抗性表型连锁的标志物。与HO/LL表型“连锁的”标志物的具体例子包括与fad2和fad3连锁的标志物。与根肿病抗性表型“连锁的”标志物的具体例子包括长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:16和17扩增的基因组DNA的连续区段。如本领域技术人员应当理解,若添加或从位于退火时使用的特定引物的远端末端间的基因组DNA跨距扣除核苷酸,则此SSR的长度会有所变化。
如本文中使用的,术语“紧密连锁的”可以指在同一染色体上彼此位于约0.5Mb内的一种或多种基因或标志物。因此,两种“紧密连锁的”基因或标志物可以相隔约0.6Mb;约0.55Mb;0.5Mb;约0.45Mb;约0.4Mb;约0.35Mb;约0.3Mb;约0.25Mb;约0.2Mb;约0.15Mb;约0.12Mb;约0.1Mb;约0.05Mb;和约0.00Mb。与fad2“紧密连锁的”标志物的具体例子包括欧洲油菜基因组的连锁群N5和N1中的某些核苷酸序列,例如欧洲油菜fad2基因中第411位的“C”至“T”突变。与fad3“紧密连锁的”标志物的具体例子包括欧洲油菜基因组的连锁群N14和N4中的某些核苷酸序列,例如欧洲油菜fad32基因中第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“G”至“A”突变。与根肿病抗性表型“紧密连锁的”标志物的具体例子包括长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:16和17扩增的基因组DNA的连续区段。
如本文中使用的,术语“极端紧密连锁的”可以指在同一染色体上彼此位于约100kb内的一种或多种基因或标志物。因此,两种“极端紧密连锁的”基因或标志物可以相隔约125kb;约120kb;约115kb;约110kb;约105kb;100kb;约95kb;约90kb;约85kb;约80kb;约75kb;约70kb;约65kb;约60kb;约55kb;约50kb;约45kb;约40kb;约35kb;约30kb;约25kb;约20kb;约15kb;约12kb;约10kb;约5kb;约1kb;和约0kb。与fad2“极端紧密连锁的”标志物的具体例子包括欧洲油菜基因组的连锁群N5和N1中的某些核苷酸序列,例如欧洲油菜fad2基因中第411位的“C”至“T”突变。与fad3“极端紧密连锁的”标志物的具体例子包括欧洲油菜基因组的连锁群N14和N4中的某些核苷酸序列,例如欧洲油菜fad32基因中第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“G”至“A”突变。与根肿病抗性表型“极端紧密连锁的”标志物的具体例子包括长度为300bp并且通过例示性引物SEQID NO:16和17扩增的基因组DNA的连续区段。
连锁的,紧密连锁的,和极端紧密连锁的遗传标志物可以用于标志物辅助育种项目来鉴定包含连锁表型和/或基因类型的个体,以及将这些性状和/或基因育种到芸苔品种中。
基因座:如本文中使用的,术语“基因座”指基因组上与可测量的特征(例如,性状)对应的位置。SNP基因座通过与基因座内含有的DNA杂交的探针限定。
标志物:如本文中使用的,标志物指可以用于鉴定具有特定等位基因(例如fad2、fad32和长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:16和17扩增的基因组DNA的连续区段)的植物的基因或核苷酸序列。标志物可以描述为给定基因组基因座处的变异。遗传标志物可以是短的DNA序列,诸如单碱基对变化(单核苷酸多态性,或“SNP”)周围的序列,或长的DNA序列,例如小卫星/简单序列重复(“SSR”)。“标志物等位基因”指特定植物中存在的标志物型式。如本文中使用的,“标志物”包括指染色体上用来鉴定染色体上独特位置的基因座。基因型可以通过使用一种或多种标志物限定。因此,“标志物”包括指位于基因组的染色体上的基因中的一个或多个核苷酸位置。
分子标志物特别可用于加速经由回交将基因或数量性状基因座(QTL)导入良种栽培种或育种系中的方法。可以使用与基因连锁的标志物来选择拥有期望性状的植物,并且可以使用遍及基因组的标志物来选择在遗传上与回归亲本相似的植物。Young和Tanksley(1989)Theor.Appl.Genet.77:95-101;Hospital等(1992)Genetics 132:1199-210。
如本文中使用的,术语“标志物”可以指芸苔染色体DNA的克隆区段(例如,SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12的核苷酸序列的区段),并且还可以或备选地指与芸苔染色体DNA的克隆区段互补的DNA分子。
一些实施方案包括标志物的“衍生物”。如本文中使用的,术语“衍生物”可以指特定标志物序列的修饰。就分子标志物而言的例示性此类修饰是与本文中公开的标志物的核酸序列相关的一个或多个碱基的取代、插入、和/或缺失,其保留,略微改变,或提高分子标志物在鉴定一种或多种性状(例如芸苔或其它含油种子作物物种中的根肿病抗性,和高油酸和/或低亚麻酸性状)中的功能。本领域技术人员可以例如通过使用用于预测和优化序列结构的计算机建模技术容易地确定此类衍生物。因此,术语“衍生物”包括与本文中公开的一种或多种标志物序列基本上相同,使得衍生物标志物能够拥有标志物辅助育种中使用的公开的功能性的核酸序列。
标志物辅助育种:如本文中使用的,术语“标志物辅助育种”可以指在一种或多种复杂性状(例如HO、LL、咪唑啉酮抗性、和/或根肿病抗性)方面直接育种的方法。在当前的实践中,植物育种人员尝试鉴定与农艺学期望的性状连锁的容易地可检出的性状,诸如花颜色、种皮外观、或同工酶变体。植物育种人员然后通过追踪容易地可检出的性状的分离来追踪分离的育种群体中的农艺学性状。然而,存在着可用于植物育种中使用的非常少的这些连锁关系。
标志物辅助育种提供了用于改善植物品种的时间和成本有效的方法。应用标志物辅助育种的几个例子牵涉使用同工酶标志物。参见例如Tanksley和Orton编(1983)Isozymes in Plant Breeding and Genetics,Amsterdam:Elsevier。一个例子是与对番茄中的线虫有害生物的抗性的基因关联的同工酶标志物。受到称作Mi的基因控制的抗性位于番茄的染色体6上,并且与Aps1(即一种酸性磷酸酶同工酶)非常紧密连锁。Aps1同工酶标志物间接选择Mi基因的用途提供如下的优点,即可以用标准的电泳技术明确测定群体中的分离;可以在幼苗组织中对同工酶标志物评分,消除对将植物维持至成熟的需要;以及同工酶标志物等位基因的共显性容许区别纯合子和杂合子。参见Rick(1983)于Tanksley和Orton,见上文。
在一些实施方案中,可以经由使用核酸探针检测植物中的标志物存在。探针可以是DNA分子或RNA分子。可以通过本领域中已知的手段,例如使用DNA分子模板合成RNA探针。探针可以含有标志物的整个或部分的核苷酸序列和来自芸苔基因组的额外的、连续的核苷酸序列。这在本文中称为“连续探针”。所述额外的、连续的核苷酸序列称为初始标志物的“上游”或“下游”,这取决于来自芸苔染色体的连续核苷酸序列是在初始标志物的5’还是3’侧,如按照惯例理解的。对于与HO性状连锁的标志物的例子,所述额外的、连续的核苷酸序列可以位于芸苔染色体上初始标志物与fad2基因的第411位之间。对于与LL性状连锁的标志物的例子,所述额外的、连续的核苷酸序列可以位于芸苔染色体上初始标志物与fad3基因的第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基之间。如本领域普通技术人员认可的,可以几乎无限重复获得标志物中纳入的额外的、连续的核苷酸序列的方法(仅受限于染色体的长度),由此沿着芸苔染色体鉴定额外的标志物。可以在本发明的一些实施方案中使用所有上文描述的标志物。
可以合成或通过克隆制备寡核苷酸探针序列。合适的克隆载体是本领域技术人员公知的。寡核苷酸探针可以是标记的或未标记的。存在用于标记核酸分子的极其多种技术,包括例如但不限于:通过缺口平移的放射性标记;随机引发;用末端脱氧转移酶(deoxytransferase)的加尾;等等,其中采用的核苷酸例如用放射性32P标记。可以使用的其它标记物包括例如但不限于:荧光团;酶;酶底物;酶辅因子;酶抑制剂;等等。或者,自身或与其它反应剂一起提供可检测信号的标记物的使用可以用受体结合的配体替换,其中受体是标记的(例如,通过上文指定的标记物进行),从而自身或与其它试剂一起提供可检测信号。参见例如Leary等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4045-9。
探针可以含有与初始标志物的核苷酸序列不连续的核苷酸序列;此探针在本文中称为“非连续探针”。非连续探针的序列与芸苔染色体上的初始标志物的序列足够接近地定位,从而非连续探针与相同基因(例如fad2或fad3)遗传连锁。例如,在一些实施方案中,非连续探针可以位于芸苔染色体上的初始标志物的500kb;450kb;400kb;350kb;300kb;250kb;200kb;150kb;125kb;120kb;100kb;0.9kb;0.8kb;0.7kb;0.6kb;0.5kb;0.4kb;0.3kb;0.2kb;或0.1kb内。
探针可以是要检测的标志物的精确拷贝。探针也可以是包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的核酸分子,所述核苷酸序列与芸苔染色体DNA的克隆区段(例如,如以SEQ ID NO:7中包含核苷酸位置411的区段和SEQ ID NO:12中包含基因的第三个内含子的5’剪接位点的第一个核苷酸位置的区段限定)是基本上相同的。如本文中使用的,术语“基本上相同的”可以指超过85%相同的核苷酸序列。例如,基本上相同的核苷酸序列与参照序列可以是85.5%;86%;87%;88%;89%;90%;91%;92%;93%;94%;95%;96%;97%;98%;99%或99.5%相同的。
探针也可以是与要检测的标志物的精确拷贝(“DNA靶物”)“特异性可杂交”或“特异性互补”的核酸分子。“特异性可杂交”和“特异性互补”是如下的术语,其指示足够的互补性程度,使得核酸分子和DNA靶物之间发生稳定的且特异性的结合。因此,在一些例子中,探针可以是DNA靶物的互补物。然而,核酸分子与要特异性可杂交的其靶序列不需要是100%互补的。在存在有足够的互补性程度以避免核酸在期望特异性结合的条件下,例如在严格杂交条件下对所有非靶序列的非特异性结合时,核酸分子是特异性可杂交的。因此,在一些例子中,探针与DNA靶物的互补物可以是基本上相同的。例如,探针与DNA靶物的互补物可以是85.5%;86%;87%;88%;89%;90%;91%;92%;93%;94%;95%;96%;97%;98%;99%或99.5%相同的。
探针可以包含在包含额外的核酸序列的核酸分子内;例如启动子;转录信号;和/或载体序列。可以使用探针限定与基因紧密连锁的别的标志物,所述基因牵涉HO、LL、咪唑啉酮抗性、和/或根肿病表型(例如fad2和fad3)。如此鉴定的标志物可以与本公开内容中命名的例示性标志物等同,并且因此在本发明的范围内。
产生特定严格性程度的杂交条件会随选择的杂交方法的性质及杂交核酸序列的组成和长度而有所变化。一般地,杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg++浓度)会决定杂交严格性,尽管清洗次数也影响严格性。关于获得特定严格性程度需要的杂交条件的计算是本领域普通技术人员已知的,并且例如在Sambrook等(编)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989,第9章和第11章;及Hames和Higgins(编)Nucleic Acid Hybridization,IRLPress,Oxford,1985中讨论。关于核酸杂交的更为详细的用法说明书和指导可以参见例如Tijssen,“Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assays,”于Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,第I部分,第2章,Elsevier,NY,1993;和Ausubel等编,Current Protocols in Molecular Biology,第2章,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995。
如本文中所使用的,“严格条件”涵盖仅在杂交分子与DNA靶物之间存在有小于25%错配时发生杂交的条件。“严格条件”包括其它特定的严格性水平。如此,如本文中使用的,“温和(moderate)严格性”条件是具有超过25%序列错配的分子不会杂交的那些条件;“中等(medium)严格性”条件是具有超过15%错配的分子不会杂交的那些条件;而“高严格性”条件是具有超过10%错配的分子不会杂交的那些条件。“非常高严格性”的条件是具有超过6%错配的分子不会杂交的那些条件。
在具体的实施方案中,严格条件是于65℃在6x盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液、5x登哈特(Denhardt)氏溶液、0.5%SDS、和100μg剪切的鲑鱼精巢DNA中杂交,接着于65℃在2x SSC缓冲液和0.5%SDS中,接着是1x SSC缓冲液和0.5%SDS中,最终0.2x SSC缓冲液和0.5%SDS中序贯清洗15-30分钟。
咪唑啉酮:如本文中使用的,术语“咪唑啉酮”指干扰植物中酶乙酰乳酸合酶(ALS)(又称为乙酰羟酸合酶(AHAS))的作用的除草剂,该干扰最终可以导致植物死亡。咪唑啉酮的例子包括但不限于:咪草酸(imazamethbenz);甲氧咪草烟(imazamox);甲咪唑烟酸(imazapic);灭草烟(imazapyr);灭草喹(imazaquin);和咪唑乙烟酸(imazethapyr)。
如本文中使用的,“咪唑啉酮抗性”指至少部分以在与同一物种的野生型植物相比时对抗性植物的健康和/或生活力的损伤降低、改善和/或消除为特征的表型。咪唑啉酮抗性包括对咪唑啉酮的耐受性。咪唑啉酮抗性可以由改变乙酰乳酸合酶(ALS),又称为乙酰羟酸合酶(AHAS),且容许该酶对抗或耐受咪唑啉酮作用的一种或多种基因、等位基因、或事件赋予。赋予咪唑啉酮抗性的例示性基因包括但不限于那些例如由Lee等(1988)EMBO J.7:1241,及Miki等(1990)Theor.Appl.Genet.80:449(两篇都通过提及完整并入本文)描述的基因。植物对咪唑啉酮的抗性或耐受性可以容许在栽培有植物的区域中为了控制杂草而需要时使用咪唑啉酮。
InDel:如本文中使用的,术语“InDel”一般用于描述基因中的插入或缺失。因此,“InDel”指可以作为插入、缺失、或其组合的特定突变。如本文中使用的,“插入”或“添加”指与天然存在的分子相比分别导致一个或多个氨基酸或核苷酸残基的添加的氨基酸或核苷酸序列变化。
油含量:如本文中使用的,“油含量”指植物或植物部分(例如种子)中的油表征。在一些实施方案中,油含量以全干燥种子的百分比表示。在一些实施方案中,特定的种子油含量是特定植物品种特征性的,并且可以用于区别所述特定品种的植物与同一物种的其它植物。可以经由使用多种分析技术,诸如例如但不限于NMR、NIR、FAME分析、和Soxhlet提取测量油含量。
在具体的实施方案中,特征性油含量可以包括“百分比油酸”和/或“百分比亚麻酸”的描述。如本文中使用的,“百分比油酸”指如通过FAME分析测量的油酸占总种子油的百分比。如本文中使用的,“百分比亚麻酸”指如通过FAME分析测量的亚麻酸占总种子油的百分比。
FAME分析可以用于测量样品中总脂肪酸中特定脂肪酸的百分比组成。就种子油而言,可以如下测定百分比,即从种子提取油样品,生成所述油样品中存在的脂肪酸的甲酯,并且使用气相层析分析样品中的各种脂肪酸的比例。如此测定的油含量可以是品种的区别性特征。
序列同一性:如本文中在两种核酸或多肽序列的背景中所使用的,术语“序列同一性”或“同一性”可以指两种序列中在规定的比较窗里为了实现最大对应性而比对时相同的残基。
在提及蛋白质使用序列同一性百分比时,认可的是,不相同的残基位置经常相差保守的氨基酸取代,其中氨基酸残基用具有类似化学特性(例如,电荷、疏水性或空间效应)的其它氨基酸残基取代,并且因此不改变分子的功能特性。
因此,在序列相差保守取代时,百分比序列同一性可以向上调节以校正不相同残基位点处取代的保守性质。相差此类保守取代的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行此调节的技术是本领域普通技术人员公知的。通常,此类技术牵涉将保守取代评分为部分的,而不是完全的错配,由此增加百分比序列同一性。例如,在对相同的氨基酸给予0-1的得分,而对非保守取代给予0得分的情况中,对保守取代给予0-1的得分。可以计算保守取代的得分,例如,如程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,CA)中执行的。
如本文中所使用的,术语“序列同一性百分比”可以指在比对窗里比较两个最佳比对序列时测定的数值,其中为了两个序列的最佳比对,比较窗中序列的部分与参照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即,缺口)。通过测定两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数目,将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数,并将结果乘以100以产生序列同一性百分比来计算百分比。可以用于测定两种序列间的同一性和相似性的计算机程序包括:GCG程序包(Devereux等(1984)Nucleic Acids Res.12(1):387);BLASTP;BLASTN;FASTA;和TFASTA(Atschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403)。
统计学关联的:如本文中使用的,术语“统计学关联的”指两种事件以比可归于偶然性的频率大的频率一起发生的趋势,其中可归于偶然性的频率以预先确定的显著性水平表示。可以通过本领域技术人员公知的许多显著性检验中的任一种,例如ANOVA或t检验测定统计学关联。参见例如StatisticalMethods,G.W.Snedecor和W.G.Cochran,Iowa State University Press,Ames,Iowa(1985)。优选地,alpha的显著性水平小于0.01。例如,本发明的显著性水平范围可以为0-约0.250,例如小于约0.0001,0.00050,0.0010,0.0050,0.010,0.025,0.050,0.100或0.250,包括其间的任何水平。
性状或表型:术语“性状”和“表型”在本文中可互换使用。出于本公开内容的目的,特别感兴趣的性状包括例如但不限于:高油酸含量;低亚麻酸含量;咪唑啉酮抗性;根肿病抗性;和细胞质雄性不育的能育性恢复。
III.fad2和fad3基因中的HO/LL突变
一些实施方案包括fad2和fad3基因中赋予芸苔属植物中的HO/LL(高油酸(fad2)和低亚麻酸(fad3))表型的突变。本发明的一些实施方案利用包含核酸序列的分离的核酸分子,所述核酸序列包含这些突变之一或两者以对接受分离的核酸分子导入的植物赋予HO/LL性状之任一或两者。另外,此类分离的核酸分子可以包含与芸苔中的HO和/或LL表型紧密连锁的标志物。
欧洲油菜品种DMS100(突变体类型)和Quantum(野生型)在fad2(脂肪酸去饱和酶-2)和fad3(脂肪酸去饱和酶-3)等位基因的克隆中使用。突变体DMS100品种从源自Global X AG019姐妹系杂交的单一F3植物选择的F4批量衍生。DMS100是一种具有约77%的油酸含量和约3%的亚麻酸含量的HO/LL系。Quantum是一种含有相当低的油酸(~66%)含量和高亚麻酸(~7%)含量的商业野生型品种。如本文中详细讨论的,涉及脂肪酸合成途径的酶fad2和fad3去饱和酶的DMS100基因组克隆的测序揭示了每个基因中的单核苷酸突变。其它序列分析显示了突变是DMS100中改变的脂肪酸含量的原因。这两个突变与先前发表的突变(等(1998)Mol.Breeding4:543-50;Jourdren等(1996)Theor.Appl.Genet.93:512-8)截然不同。
一些实施方案利用fad2基因中与特定油含量有关的单核苷酸多态性(SNP)的鉴定,所述特定油含量在一些应用中可以是期望的。芸苔中的油酸(C18:1)含量受到fad2基因影响,所述fad2基因编码负责将油酸去饱和成亚油酸(C18:2)的酶(内质delta 12油酸去饱和酶)。具体的实施方案包括单核苷酸取代突变,其在fad2可读框中引入过早的“终止”密码子,生成截短的表达产物。在某些实施方案中,单核苷酸取代突变位于fad2基因的第411位(参见图1)。例如,突变可以是第411位的“C”至“T”突变,其产生终止密码子“TAG”,并且生成长度仅为185个氨基酸的fad2表达产物。在一些实施方案中,fad2基因中的单核苷酸取代突变生成截短的表达多肽,其作为将油酸去饱和成亚油酸的活性去饱和酶具有降低的功能(例如无功能或基本上无功能)。
fad2基因的失活突变体等位基因通过降低油酸去饱和成亚油酸来促成芸苔中油酸含量的控制。在实施方案中,fad2突变体等位基因包含在包含第411位核苷酸的区域中与SEQ ID NO:7的互补物特异性可杂交的核苷酸序列,如通过与SEQ ID NO:7比对确定的。在具体的实施方案中,fad2突变体等位基因是SEQ ID NO:7。在一些实施方案中,本发明还包括那些与SEQ ID NO:7的突变体fad2等位基因基本上相同的核苷酸序列。例如在一些实施方案中,核酸分子是fad2同系物(例如直向同系物),其与SEQ ID NO:7的突变体fad2等位基因是至少约85%相同的。fad2同系物与SEQ ID NO:7的突变体fad2等位基因可以是86%;87%;88%;89%;90%;91%;92%;93%;94%;95%;96%;97%;98%;99%;99.5%;或99.8%相同的。此类fad2同系物可以从多种生物体(例如芸苔)的对于本领域技术人员容易得到的任何完整或部分基因组容易地鉴定并分离。
一些实施方案还包括SEQ ID NO:7的突变体fad2等位基因的功能性变体。fad2的功能性变体包括例如SEQ ID NO:7的fad2序列、包含一处或多处核苷酸取代、缺失或插入的序列,其中功能性变体降低芸苔细胞中油酸去饱和成亚油酸,其可以通过本领域普通技术人员公知的常规技术测量。例如,可以通过将突变或片段同源重组到在功能性Fad2等位基因方面纯合的植物中,接着从植物常规分离并表征种子油来测定fad2基因的特定变体在芸苔细胞中降低将油酸去饱和成亚油酸的能力。fad2基因的功能性变体可以通过定点诱变,诱导突变创建,或者它们可以以等位变体(多态性,例如SNP)存在。具体的实施方案包括在fad2可读框中引入过早的“终止”密码子,生成截短且无活性的表达产物的突变。
一些实施方案利用fad32基因中与特定油含量有关的单核苷酸多态性(SNP)的鉴定,所述特定油含量在一些应用中可以是期望的。fad3基因编码内质delta-15亚油酸去饱和酶,即一种负责亚油酸(C18:2)去饱和成亚麻酸(C18:3)的酶。具体地,fad32基因促成亚麻酸含量的控制。具体的实施方案包括单核苷酸取代突变,其干扰fad32基因的正确剪接,由此生成不完全翻译的表达产物。在某些实施方案中,单核苷酸取代突变位于fad32基因中内含子的5’剪接位点的第一个碱基。例如,内含子可以是欧洲油菜的fad32基因中的第三个内含子、芜菁的fad32基因中的第六个内含子、或别的植物物种的fad32基因中的同源内含子。例如,突变可以是欧洲油菜fad32基因中第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“G”至“A”突变,其干扰基因的正确剪接(参见图3)。在一些实施方案中,干扰fad32基因的正确剪接,由此生成不完全翻译的表达产物的单核苷酸取代突变可以导致无活性的酶,并且阻断亚油酸(C18:2)去饱和成亚麻酸(C18:3),最终导致芸苔种子中C18:3积累的降低。
fad3基因的失活突变体等位基因通过降低亚油酸去饱和成亚麻酸来促成芸苔中亚麻酸含量的控制。在实施方案中,fad3突变体等位基因包含在包含fad32基因中内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的核苷酸的区域中与SEQID NO:12的互补物特异性可杂交的核苷酸序列,如通过与SEQ ID NO:12比对测定的。在具体的实施方案中,fad3突变体等位基因是SEQ ID NO:12。在一些实施方案中,本发明还包括那些与SEQ ID NO:12的突变体fad3等位基因基本上相同的核苷酸序列。例如,在一些实施方案中,核酸分子是fad3同系物(例如直向同系物),其与SEQ ID NO:12的突变体fad3等位基因是至少约85%相同的。fad3同系物与SEQ ID NO:12的突变体fad3等位基因可以是86%;87%;88%;89%;90%;91%;92%;93%;94%;95%;96%;97%;98%;99%;99.5%;或99.8%相同的。此类fad3同系物可以从多种生物体(例如芸苔)的对于本领域技术人员容易得到的任何完整或部分基因组容易地鉴定并分离。
一些实施方案还包括SEQ ID NO:12的突变体fad3等位基因的功能性变体。fad3的功能性变体包括例如SEQ ID NO:12的fad3序列、包含一处或多处核苷酸取代、缺失或插入的序列,其中功能性变体降低芸苔细胞中亚油酸去饱和成亚麻酸,其可以通过本领域普通技术人员公知的常规技术测量。例如,可以通过将突变或片段同源重组到在功能性Fad3等位基因方面纯合的植物中,接着从植物常规分离并表征种子油来测定Fad3基因的特定变体在芸苔细胞中降低将亚油酸去饱和成亚麻酸的能力。Fad3基因的功能性变体可以通过定点诱变,诱导突变创建,或者它们可以以等位变体(多态性,例如SNP)存在。具体的实施方案包括在fad2可读框中引入过早的“终止”密码子,生成截短且无活性的表达产物的突变。
IV.分子标志物及其应用
本发明的实施方案包括与感兴趣基因(例如fad2或fad3)连锁(例如连锁;紧密连锁;或极端紧密连锁)的分子标志物(即核酸标志物)。例如,在一些实施方案中的感兴趣基因可以是促成芸苔中选自下组的表型或性状的基因:高油酸,低亚麻酸,除草剂抗性(例如草甘膦抗性和咪唑啉酮抗性),和根肿病抗性。具体的实施方案包括使用此类标志物,例如以转移感兴趣的基因(例如其包含在DNA区段中),以将感兴趣的基因导入宿主中,以及鉴定生物体或来自生物体的DNA样品中的感兴趣基因的方法。在具体的实施方案中,可以使用SSR标志物转移DNA区段,其包含促成根肿病抗性欧洲油菜品种的根肿病抗性的基因。此类SSR标志物可以包含基因组DNA的连续区段,其长度为300 bp,并且通过例示性引物SEQ ID NO:18和19扩增。
在一些实施方案中,在感兴趣基因侧翼的标志物可以用于转移供体亲本DNA的区段,其明确含有感兴趣的基因。在具体的实施方案中,欧洲油菜连锁群N5和N1中的标志物,或与此类标志物等同的标志物可以用于转移包含来自欧洲油菜品种DMS100的fad2的DNA区段。在这些和其它实施方案中,欧洲油菜连锁群N14和N4中标志物,或与此类标志物等同的标志物可以用于转移包含欧洲油菜品种DMS100的fad32的DNA区段。
在一些实施方案中,使用在感兴趣基因侧翼的标志物以转移明确含有感兴趣基因的供体亲本DNA区段的方法可以包括用与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交的探针分析两个亲本植物的基因组DNA;有性杂交两个亲本植物基因型以获得后代群体,并且对那些后代分析与感兴趣的基因连锁的标志物的存在,将含有与感兴趣基因连锁的标志物的后代与接受体基因型回交以生成第一回交群体,然后,继续进行回交程序,直到获得包含由亲本基因型和感兴趣基因展现的任何期望性状的最终后代。在具体的实施方案中,通过在每个世代的标志物分析选择在每个杂交和回交步骤中获得的个体后代。在一些实施方案中,用与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交的探针分析两个亲本植物的基因组DNA揭示亲本植物之一包括与探针特异性杂交的较少连锁标志物,或与探针特异性杂交的无一连锁标志物。
在一些实施方案中,可以使用与感兴趣基因连锁的标志物通过遗传转化将感兴趣的基因导入芸苔属的植物中。在具体的实施方案中,欧洲油菜连锁群N5或N1中的标志物,或与此类标志物等同的标志物可以用于将fad2基因转移到芸苔属的植物中。在这些和其它实施方案中,欧洲油菜连锁群N14或N4中的标志物,或与此类标志物等同的标志物可以用于将fad32基因转移到芸苔属的植物中。在这些和其它实施方案中,可以使用SSR标志物来将促成根肿病抗性的基因转移到芸苔属的植物中。此类SSR标志物可包括基因组DNA的连续区段,其长度为300bp,并且通过例示性引物SEQ ID NO:18和19扩增。
在一些实施方案中,通过遗传重组将感兴趣的基因导入芸苔属植物中的方法可以包括用与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交的探针分析植物(例如欧洲油菜品种DMS100)的基因组DNA以鉴定植物中的感兴趣基因;例如通过提取基因组DNA,并用一种或多种酶限制性内切核酸酶消化基因组DNA,来分离植物基因组DNA中包含感兴趣基因的区段;任选地,扩增分离的DNA区段;将分离的DNA区段导入芸苔属宿主植物的细胞或组织中,并用探针分析宿主植物的DNA以鉴定宿主植物中的感兴趣基因,所述探针与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交。在具体的实施方案中,可以将分离的DNA区段导入宿主植物中,使得其稳定整合入宿主植物的基因组中。
在一些实施方案中,可以使用与感兴趣基因连锁的标志物将感兴趣的基因导入与芸苔属植物不同的生物体(例如植物)中。在具体的实施方案中,感兴趣基因是fad2,并且标志物在欧洲油菜连锁群N5或N1中,或者是等同的标志物。在具体的实施方案中,感兴趣的基因是fad3,并且标志物在欧洲油菜连锁群N14或N4中,或者是等同的标志物。在具体的实施方案中,感兴趣的基因是促成根肿病抗性的基因,并且标志物是SSR标志物或等同标志物,所述SSR标志物包含基因组DNA中长度为300 bp并且通过例示性引物SEQ IDNO:18和19扩增的连续区段。
在一些实施方案中,将感兴趣的基因导入与芸苔属植物不同的生物体(例如植物)中的方法可以包括用与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交的探针分析芸苔植物(例如欧洲油菜品种DMS100的植物)的基因组DNA以鉴定植物中的感兴趣基因;例如通过提取基因组DNA,并用一种或多种酶限制性内切核酸酶消化基因组DNA,来分离植物基因组DNA中包含感兴趣基因的区段;任选地,扩增分离的DNA区段;将分离的DNA区段导入与芸苔属植物不同的生物体中,并用探针分析生物体的DNA以鉴定生物体中的感兴趣基因,所述探针与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交。在具体的实施方案中,可以将分离的DNA区段导入生物体中,使得其稳定整合入生物体的基因组中。
在一些实施方案中,可以使用与感兴趣基因连锁的标志物来鉴定包含感兴趣基因的植物。在具体的实施方案中,植物可以是芸苔。在一些实施方案中,可以从植物提取核酸分子(例如基因组DNA或mRNA)。然后,可以使提取的核酸分子与探针接触,所述探针与同感兴趣基因连锁的标志物特异性可杂交。探针与提取的核酸分子的特异性杂交指示植物中感兴趣基因的存在。
关于分子标志物及其使用方法的一般信息可以参见例如Andrew H.Paterson,“The DNA Revolution”(第2章)于:Genome Mapping in Plants,Andrew H.Paterson编,1996,Academic Press/R.G.Landis Company,Austin,Tex.,pp.7-21。
V.fad2和fad3基因的分子标志物
提供了与芸苔中突变体等位基因fad2和fad3中每种连锁(例如紧密连锁)的分子标志物。鉴定了含有HO性状(fad2)和LL性状(fad3)中牵涉的序列的DNA区段。这些区段位于标志物周围及之间,所述标志物与基因组连锁群中的突变体等位基因连锁(例如紧密连锁)。因此,还提供了包含具有失活突变的突变体fad2或fad3基因的核酸分子。鉴定的区段及其标志物在本文中部分以其在欧洲油菜基因组中连锁群中的位置描述。例如,fad2和与其连锁的分子标志物可以位于连锁群N5和N1中。还在例子中,fad3和与其连锁的分子标志物可以位于连锁群N14和N4中。
鉴定的区段的位置及其标志物可以以重组频率或图距单位表示。在欧洲油菜群体DMS100 x Quantum中实施本文中描述的实施方案。然而,以图距单位计的特定区段和标志物的位置可以参照芸苔近交基因组序列表示。预期的是,以图距单位计对特定区段和标志物给予的数字可以在栽培种间有所变化,并且不是DNA区段和标志物的必要限定的一部分,所述DNA区段和标志物在其它情况中例如以核苷酸序列描述。
芸苔系DMS100种质中存在的fad2和fad32基因中的特定例示性失活单核苷酸突变是造成此品系中观察到的升高的油酸(HO)和降低的亚麻酸(LL)含量的因素。使用与这些中任一处或两处突变连锁的分子标志物,可以使用标志物辅助渐渗来将DMS100及其后代或衍生物的HO/LL性状,和/或DMS100及其后代或衍生物的突变fad2和fad32基因(分别为SEQ ID NO:7(参见图1)和SEQ ID NO:12(参加图3))引入芸苔系中。
使用与突变体fad2或fad3等位基因连锁或驻留于突变体fad2或fad3等位基因内的核酸分子标志物将HO/LL性状引入新植物和种质中以及鉴定具有HO/LL性状的植物的方法可以导致植物发育者节约成本,因为此类方法可以降低或消除对意图引入HO/LL性状的杂交的后代测定表型的需要。
在实施方案中,与HO性状极端紧密连锁的标志物是欧洲油菜fad2基因的第411位(或来自例如芸苔的比对序列的相同位置)的“T”核苷酸,如在图1中描绘并在SEQ ID NO:7中表示的。在实施方案中,与LL性状极端紧密连锁的标志物是欧洲油菜fad32基因中的第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基(或来自例如芸苔的比对序列的相同位置)处的“A”核苷酸,如在图3中描绘并在SEQ ID NO:12中表示的。别的标志物可以鉴定为等同于这些例示性标志物之任一种,例如通过测定别的标志物与例示性标志物之间的重组频率进行。此类测定可以利用基于Mather(1931),The Measurement of Linkage inHeredity,Methuen&Co.,London的方法的改良正交比较(orthogonal contrast)方法,接着是最大似然检验以测定重组频率。Allard(1956)Hilgardia24:235-78。为了在目前公开的方法中使用,若重组频率的数值在任何栽培种中小于或等于0.10(即10%),则认为别的标志物等同于具体的参照标志物。
与高油酸(HO)性状极端紧密连锁的标志物包括用于将HO表型引入芸苔属植物中的手段。用于将HO表型引入芸苔属植物中的手段可以包括来自植物的核酸序列,该核酸序列的检出至少提供强烈的指示,即植物包含核酸序列,该核酸序列包含促成HO性状的突变体fad2等位基因。用于将HO表型引入芸苔属植物中的手段的例子是欧洲油菜fad2基因的第411位的“T”核苷酸,如在图1中描绘并在SEQ ID NO:7中表示的。与低亚麻酸(LL)性状极端紧密连锁的标志物包括用于将LL表型引入芸苔属植物中的手段。用于将LL表型引入芸苔属植物中的手段可以包括来自植物的核酸序列,所述核酸的检出至少提供强烈的指示,即植物包含核酸序列,该核酸序列包含促成LL性状的突变体fad32等位基因。用于将LL表型引入芸苔属植物中的手段的例子是欧洲油菜fad32基因中第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“A”核苷酸,如在图3中描绘并在SEQ ID NO:12中表示的。
涉及与高油酸(HO)性状极端紧密连锁的标志物的是用于鉴定携带促成芸苔属植物中HO表型的基因的植物的手段。此类手段包括在添加至自植物获得的样品时呈现可检测信号的分子,所述植物携带促成芸苔属植物中HO表型的基因。核酸的特异性杂交是可检测信号,因此,与促成HO表型的基因特异性杂交的核酸探针可以是用于鉴定植物的手段,所述植物携带促成芸苔属植物中HO表型的基因。在一些例子中,用于鉴定携带促成芸苔属植物中HO表型的基因的植物的手段是探针,其与欧洲油菜fad2基因中包含第411位“C”至“T”突变的区段特异性杂交,但是不与野生型欧洲油菜fad2基因(例如SEQ ID NO:5)的相同区段杂交。
涉及与低亚麻酸(LL)性状极端紧密连锁的标志物的是用于鉴定携带促成芸苔属植物中LL表型的基因的植物的手段。此类手段包括在添加至自植物获得的样品时呈现可检测信号的分子,所述植物携带促成芸苔属植物中LL表型的基因。核酸的特异性杂交是可检测信号,因此,与促成LL表型的基因特异性杂交的核酸探针可以是用于鉴定植物的手段,所述植物携带促成芸苔属植物中LL表型的基因。在一些例子中,用于鉴定携带促成芸苔属植物中LL表型的基因的植物的手段是探针,其与欧洲油菜fad32基因中包含第三个内含子的5’剪接位点的第一个碱基处的“G”至“A”突变的区段特异性杂交,但是不与野生型欧洲油菜fad32基因(例如SEQ ID NO:15)的相同区段杂交。
VI.根肿病抗性的标志物
提供了与芸苔中的根肿病抗性连锁(例如紧密连锁)的分子标志物。含有根肿病抗性中涉及的基因的DNA区段与这些标志物连锁。因此,能够使用提供的标志物,利用并操作包含根肿病抗性中涉及的基因的核酸分子。鉴定的标志物及与其连锁的序列可以部分以其在欧洲油菜基因组中连锁群中的位置描述。在一些例子中,与芸苔中的根肿病抗性连锁的标志物是SSR标志物。
在欧洲油菜群体中实施本文中描述的实施方案,所述欧洲油菜群体通过杂交根肿病抗性品种Mendel与含有能育性恢复基因(restr)和草甘膦抗性(gly)的HO/LL欧洲油菜近交物获得。鉴定的标志物的位置及与其连锁的DNA序列(例如基因)可以以重组频率或图距单位表示。以图距单位计的特定序列和标志物的位置可以参照芸苔近交物基因组序列表示。预期的是,以图距单位计对特定区段和标志物给予的数字可以在栽培种间有所变化,并且不是任何DNA序列或标志物的必要限定的一部分,所述DNA序列和标志物在其它情况中例如可以以核苷酸序列描述。
芸苔系Mendel种质中存在的标志物可以与造成此根肿病抗性来源品系中观察到的根肿病抗性的因素连锁。例如,通过使用这些标志物或其等同物,可以使用标志物辅助渐渗将Mendel及其后代或衍生物的根肿病抗性引入芸苔系中。
可以将与芸苔中的根肿病抗性连锁的标志物整合到标志物辅助选择项目中,用于开发新的根肿病抗性基因型和种质。此类项目容许筛选数千个芸苔后代,该芸苔后代例如源自杂交具有一种或多种期望的性状的芸苔近交物和Mendel(或其后代或衍生物)。此类标志物还容许根肿病抗性品系的相当快速且便宜的鉴定,之后在根肿病感染测定法中的生物学筛选期间利用资源,诸如温室,田地,等等。目前,通常在以相当大的费用进行的约束性室内温室试验中实施疾病抗性筛选。
在实施方案中,与根肿病抗性表型连锁的标志物是SSR标志物,其包含基因组欧洲油菜DNA中长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:18和19扩增的连续区段,所述标志物与欧洲油菜植物中的根肿病抗性连锁。本领域技术人员应当认可,同一基因座的等同标志物可以通过改变引物的长度或位置限定,所述引物用于改变基因组欧洲油菜DNA中通过引物扩增的连续区段的长度。
别的标志物可以鉴定为等同于此例示性标志物,例如通过测定别的标志物与例示性SSR标志物之间的重组频率进行。此类测定可以利用基于Mather(1931),The Measurement of Linkage in Heredity,Methuen&Co.,London的方法的改良正交比较方法,接着是最大似然检验以测定重组频率。Allard(1956)Hilgardia 24:235-78。为了在目前公开的方法中使用,若重组频率的数值在任何栽培种中小于或等于0.10(即10%),则认为别的标志物等同于具体的参照标志物。
与根肿病抗性连锁的标志物包括用于将根肿病抗性引入芸苔属植物中的手段。用于将根肿病抗性引入芸苔属植物中的手段可以包括来自植物的核酸序列,该核酸序列的检出至少提供强烈的指示,即植物包含核酸序列,该核酸序列包含促成根肿病抗性表型的DNA序列。用于将根肿病抗性引入芸苔属植物中的手段的例子是基因组DNA中长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:18和19扩增的连续区段,所述标志物与欧洲油菜植物中的根肿病抗性连锁。
涉及与根肿病抗性连锁的标志物的是用于鉴定携带促成芸苔属植物中根肿病抗性的基因的植物的手段。此类手段包括在添加至自植物获得的样品时呈现可检测信号的分子,所述植物携带促成芸苔属植物中根肿病抗性的基因。核酸的特异性杂交是可检测信号,因此,与促成根肿病抗性的DNA序列特异性杂交的核酸探针可以是用于鉴定植物的手段,所述植物携带促成芸苔属植物中根肿病抗性的基因。在一些例子中,用于鉴定携带促成芸苔属植物中根肿病抗性的基因的植物的手段是探针,其与基因组DNA中长度为300bp并且通过例示性引物SEQ ID NO:18和19扩增的连续区段特异性杂交,但是不与通过相同引物从野生型基因组DNA扩增的任何区段杂交。
在上述内容外,可以在实施方案中使用以SEQ ID NO:18-22列出的引物组或其等同物,以筛选根肿病抗性中涉及的基因的存在。在使用这些引物或其等同物从基因组芸苔DNA样品扩增居间DNA序列时,可以显现扩增的DNA片段(例如通过凝胶电泳)。300bp片段(或使用与SEQ ID NO:18-22功能等同的引物预期的大小的片段)的存在指示获得基因组DNA样品的植物包含根肿病抗性中涉及的基因。
VII.除草剂和根肿病抗性HO/LL芸苔植物
本发明的一些实施方案提供或在其它方面包括芸苔植物(例如欧洲油菜植物),其在与同一物种的野生型芸苔植物(例如欧洲油菜品种Quantum)比较时具有高油酸和/或低亚麻酸(HO/LL)。在这些和其它实施方案中,芸苔植物可以包含对咪唑啉酮除草剂的抗性的性状。在这些和其它实施方案中,芸苔植物可以包含对根肿病的抗性的性状。因此,本发明的一些实施方案提供或在其它方面包括芸苔植物,其包含高油酸、低亚麻酸、咪唑啉酮抗性、和根肿病抗性的所有性状。
因此,对根肿病有抗性的芸苔植物可以包含与根肿病抗性表型连锁的标志物,而且还包含与HO性状连锁的标志物。在这些和其它实施方案中,芸苔植物还可以包含与LL性状连锁的遗传标志物。例如,对根肿病有抗性的芸苔植物还可以包含一种或多种与突变fad2和/或fad3基因对应的核酸序列。可以通过本领域中的多种已知方法之任一种将这些基因导入芸苔或其它含油种子植物中。另外,可以通过已知的体内或体外方法改变野生型fad2和/或fad3基因以提供例示性的突变fad2和/或fad3基因,或其等同物。此类基因、标志物和突变的例子可以参见但不限于那些披露的美国专利公开文本No.2006/0248611(其全部内容通过提及并入本文)。
在具体的实施方案中,芸苔植物的种子可以包含有利的油概貌。例如,种子可以包含至少63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71%,72%,73%,74%,75%,76%或77%油酸(C18:1)。在这些和其它例子中,芸苔植物的种子可以包含不超过6%,5%,4%,3%,2%或1.5%亚油酸(C18:3)。
在本发明的实施方案中,对根肿病有抗性的欧洲油菜植物也可以对咪唑啉酮有抗性或耐受性。
在一些实施方案中,根肿病抗性芸苔植物还可以包含细胞质雄性不育系统恢复系。细胞质雄性不育(CMS)是一种分布广泛且典型的非孟德尔性状。CMS植物不能自花传粉。因此,在雄性能育系旁边种植CMS系时,在不育植物上形成的所有种子会是两个亲本的杂种。与大多数性状不同,CMS是母本传播的(即,它仅经由种子亲本传递至后代)。此特性源自如下的事实,即决定CMS的一种或多种基因位于线粒体DNA(mtDNA)上。与大多数基因(其驻留于核DNA中)不同,mtDNA中的基因在大多数植物物种中仅经由雌性传播。由于母本传播的此特性,有可能容易繁殖雌性CMS系,其通过用雄性能育“维持者”系传粉进行,所述雄性能育“维持者”系在其核基因上与CMS系相同,但是其由于缺乏引起CMS的mtDNA而是雄性能育的。然而,由于CMS的母本传播,使用雌性CMS系生成的杂种植物也是雄性不育的;它们携带赋予雄性不育性的mtDNA。这对于种子作物(例如玉米和芸苔)是成问题的,所述种子作物需要花粉生成以形成收获的产物种子。
幸运的是,在许多作物物种中,已经鉴定出称作能育性恢复系(Rf)的特定显性核基因,其可以抑制雄性不育表型,并且对F1杂种“恢复”能育性。因此,CMS系统的组分包含:(1)CMS系(其含有雄性不育(S)胞质(或mtDNA),并且在恢复系基因的隐性或维持者等位基因方面是纯合的);(2)维持者系(其含有能育或正常的mtDNA(F),但是在核遗传基因座上与CMS系是同基因的),和(3)恢复系品系(其通常含有雄性不育mtDNA,但是在显性核Rf基因方面是纯合的)。图6中显示了杂种种子生成方案中的这些组分的用途。可用于本发明的雄性不育性系统和恢复系包括但不限于:Polima系统;Ogura系统;美国专利6,365,798中描述的系统;和美国专利公开文本No.2004/0237141中描述的系统(每篇的全部内容通过提及并入本文)。
本文中引用的所有出版物、专利和专利申请在此通过提及并入。除非本文中另有记录,DNA纯化、限制酶消化、琼脂糖凝胶分析、DNA片段分离、连接和转化的标准方法可以用于本发明的目的。此类方法记载于例如Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,ColdSpring Harbor Laboratory Press;及Ausubel等(1987)Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley and Sons,New York(两篇通过提及并入本文)。
提供以下实施例以例示某些具体的特征和/或实施方案。实施例不应解释为将公开内容限制为例示的具体特征或实施方案。应当预期,本领域技术人员可以辨别并实施本文中在不偏离本发明范围的前提下提供的具体教导的变型或备选。