CN108588264A - 用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记、引物及其应用 - Google Patents

用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记、引物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108588264A
CN108588264A CN201810585638.4A CN201810585638A CN108588264A CN 108588264 A CN108588264 A CN 108588264A CN 201810585638 A CN201810585638 A CN 201810585638A CN 108588264 A CN108588264 A CN 108588264A
Authority
CN
China
Prior art keywords
clubroot
ccr1
ccr2
primer
ccr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810585638.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108588264B (zh
Inventor
宋洪元
司军
何海燕
李勤菲
任雪松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest University
Original Assignee
Southwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest University filed Critical Southwest University
Priority to CN201810585638.4A priority Critical patent/CN108588264B/zh
Publication of CN108588264A publication Critical patent/CN108588264A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108588264B publication Critical patent/CN108588264B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及用于鉴定甘蓝类蔬菜根肿病抗性鉴定的分子标记、引物及其应用。本发明利用抗根肿病品种GZ87、GZ87与感病材料263杂交分离后代，结合大量非抗性甘蓝材料，从100条RAPD引物中筛选到两个RAPD标记与根肿病抗性紧密连锁，并在此基础上成功开发出了两个稳定的SCAR标记，其中，CCR‑SCAR1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，CCR‑SCAR2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，两个分子标记中的任意一个均可用于根肿病抗性品种/材料的辅助筛选以及转育根肿病抗性材料的精确鉴定，在十字花科植物根肿病抗性育种中具有重要的应用价值。

Description

用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记、引物及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记、引物及其应用。
背景技术
甘蓝是十字花科芸薹属作物，包含结球甘蓝、花椰菜、抱子甘蓝、球茎甘蓝和芥蓝等不同变种，是世界上主要的蔬菜栽培类型。根肿病是由芸薹根肿菌(Plasmodiophorabrassicae Woronin)侵染所致，专性寄生十字花科植物根部，引起植株地上部萎蔫，叶片变黄，根生长不良，根部出现肿大的纺锤形或不规则状的根瘤状物的病害。根肿病是一种强传染性的世界性土传病害，甘蓝主产区感染面积呈现逐年加重、蔓延范围逐渐扩大的趋势，给生产上带来巨大的经济损失。因此，选育抗根肿病的甘蓝品种是解决该问题的重要途径，而实现该育种目标的前提是对甘蓝材料的根肿病抗性的有效鉴定和筛选。
目前，根肿病抗性鉴定和筛选的方法主要有两种，一种是利用根肿菌灌根接种苗期植株，该鉴定方法所需时间长，鉴定结果的准确性易受鉴定时的环境条件、温度变化等因素的干扰，为防止根肿病菌的传播，需要建立专门的鉴定圃或者鉴定设施。另一种方法是分子标记辅助选择，即利用与根肿病抗性基因紧密连锁的DNA分子标记进行育种材料根肿病抗性鉴定。该方法不受环境、场地等条件限制，具有鉴定时间短、结果准确、可靠的特点。前期，本实验室结合室内接种鉴定和田间接种鉴定结果，筛选出抗根肿病甘蓝品种GZ87，其中该材料室内接种鉴定的病情指数为6.25，田间病情指数为0。利用该高抗根肿病材料与和高感根肿病的甘蓝自交系杂交，构建了高密度分子标记遗传图谱，但是没有找到与根肿病抗性紧密相关的分子标记，仍然需要传统的根肿病抗性鉴定方法来评价植株抗性。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于甘蓝根肿病抗性鉴定的分子标记，所述分子标记可用于甘蓝抗根肿病育种材料、品种的快速鉴定以及转育根肿病抗性材料的分子辅助选择。
用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记为CCR-SCAR1或CCR-SCAR2，CCR-SCAR1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，CCR-SCAR2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明目的之二是提供分子标记CCR-SCAR1的特异性扩增引物对CCR1和分子标记CCR-SCAR2的特异性引物对CCR2，其中，CCR1的上游引物F-CCR1的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，CCR1的下游引物R-CCR1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；CCR2的上游引物F-CCR2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，CCR2的下游引物R-CCR2的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。
本发明的目的之三是提供上述分子标记和引物应用于甘蓝根肿病抗性鉴定中的方法，所述应用方法包括如下步骤：
(1)以鉴定材料的基因组DNA为模板，分别利用引物对CCR1或引物对CCR2进行PCR扩增获得扩增产物；
(2)将扩增产物进行电泳分离，若存在401bp或355bp条带，则待鉴定材料具有根肿病抗性；若不存在相应条带，则待鉴定材料不具有根肿病抗性。
优选的，利用上述引物对CCR1或CCR2进行PCR扩增的反应体系如下所示：所述反应体系总体积25μL，其中模板(100ng/μL)3.0μL；引物对CCR1或CCR2(10μM)1.0μL；dNTP(100mM)0.5μL；Taq buffer 10×(Mg2+plus buffer)2.5μL；Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.2μL；dd H2O补足25μL。
优选的，利用上述引物对CCR1进行PCR扩增的程序为：95℃3min，(95℃30s、62℃30s、72℃30s)循环7次，(95℃30s、58.5℃30s、72℃30s)循环22次，72℃10min，扩增完成后4℃保存。
优选的，上述利用引物对CCR2进行PCR扩增的程序为：95℃3min，(95℃30s，55℃30s，72℃30s)循环28次，72℃10min，扩增完成后保存在4℃条件下。
将上述分子标记CCR-SCAR1和CCR-SCAR2或/和分子标记CCR-SCAR1和CCR-SCAR2对应的引物对CCR1和CCR2在甘蓝根肿病抗性的鉴定及转育甘蓝根肿病抗性基因/位点到其他十字花科植物中的分子标记辅助鉴定筛选中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明利用该抗根肿病品种GZ87、GZ87与感病甘蓝材料263杂交分离后代，结合大量非抗性甘蓝材料，从100条RAPD引物中筛选到两个RAPD标记与根肿病抗性紧密连锁，并在此基础上成功开发出了两个稳定的SCAR标记，可用于根肿病抗性材料/品种的分子辅助筛选。
本发明的有益效果在于：
1.本发明开发的根肿病抗性连锁标记特异性引物对CCR1和CCR2，具有特异性强，准确性和稳定性高的特点；
2.应用引物对CCR1获得的分子标记CCR-SCAR1；引物对CCR2获得的CCR-SCAR2分子标记进行根肿病抗性检测，相对于RAPD标记，明显提升材料抗性鉴定的稳定性和可靠性。
3.本发明提供的应用方法适用于甘蓝根肿病抗源的高通量筛选和转育材料抗性的精确鉴定，在十字花科植物根肿病抗性育种中具有重要的应用价值。
附图说明
图1是抗根肿病甘蓝品种GZ87的特异RAPD1-400条带。GZ87：抗根肿病甘蓝品种；F416、201、219、222、263：感根肿病甘蓝材料。
图2是抗根肿病甘蓝品种GZ87的特异RAPD2-600条带。GZ87：抗根肿病甘蓝品种；F416、201、219、263：感根肿病甘蓝材料。
图3是CCR-SCAR1分子标记辅助筛选抗根肿病甘蓝类品种和感根肿病的甘蓝类品种及材料的结果图。M为标准DNA分子标记(Trans 2K plus DNA Marker)；代号：1、8、9、10、GZ87：抗根肿病结球甘蓝品种；5：抗根肿病抱子甘蓝品种；6：抗根肿病青花菜品种；7：抗根肿病花椰菜品种；2、3、4：感根肿病结球甘蓝品种；F416、263、201：感根肿病结球甘蓝材料。
图4是CCR-SCAR2分子标记辅助筛选抗根肿病甘蓝类品种和感根肿病的甘蓝类品种及材料的结果图。M为标准DNA分子标记(Trans 2K plus DNA Marker)；代号：1、8、9、10、GZ87：抗根肿病结球甘蓝品种；5：抗根肿病抱子甘蓝品种；6：抗根肿病青花菜品种；7：抗根肿病花椰菜品种；2、3、4：感根肿病结球甘蓝品种；F416、263、201：感根肿病结球甘蓝材料。
图5是抗根肿病CCR-SCAR1分子标记CCR1-401与RAPD1-400序列比对结果；
图6是抗根肿病CCR-SCAR2分子标记CCR2-355与RAPD2-600序列比对结果；
图7是利用引物对CCR1进行分子标记辅助筛选抗根肿病甘蓝品种GZ87与感病甘蓝材料263杂交分离群体的结果图。M为标准DNA分子标记(Trans 2K plus DNA Marker)。
图8是利用引物对CCR2进行分子标记辅助筛选抗根肿病甘蓝品种GZ87与感病甘蓝材料263杂交分离群体的结果图。M为标准DNA分子标记(Trans 2K plus DNA Marker)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行进一步的说明，本发明中所用试剂与材料无特别说明的均为通过商业途径购买获得。
实施例1：甘蓝抗根肿病特异标记的筛选与纯化
前期研究中，我们通过对大量甘蓝品种和材料的根肿病抗性鉴定，筛选出抗根肿病甘蓝品种GZ87，并对其进行连续三年的室内和室外根肿病抗性鉴定，发现其根肿病抗性稳定，室内接种鉴定的病情指数为6.25，田间病情指数为0。以抗根肿病甘蓝品种GZ87，感根肿病甘蓝材料F416、201、219、222、263(其中，263室内接种鉴定的根肿病病情指数为39.97)为供试材料，同时结合抗根肿病甘蓝品种GZ87与感病材料(263)杂交分离后代群体，从100条RAPD引物中，筛选出两条RAPD引物(RAPD1和RAPD2)的扩增产物与根肿病抗性连锁(图1、2)。
对PCR反应体系和扩增程序进行优化。其中优化后的反应体系为：总体积为25μL，模板(100ng/μL)3.0μL；引物(10μM)1.0μL；dNTP(100mm)0.5μL；Taq buffer 10x(Mg2+plusbuffer)2.5μL；MgCl2(25mm)1.5μL；Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.2μL；ddH2O补足25μL。优化后的扩增程序为：94℃预变性3min，(94℃10s，36℃30s，72℃1min 5s)循环1次，(94℃10s，36℃30s，72℃1min 5s)循环40次，72℃延伸5min，4℃保存。扩增产物采用1.8％琼脂糖凝胶电泳，电压50V，电泳1h左右，在紫外凝胶成像仪中进行观察与分析。
与感病材料相比，抗根肿病甘蓝品种GZ87用RAPD1引物扩增出现一条约400bp的特异条带RAPD1-400；用RAPD2引物扩增出一条约600bp的特异性条带RAPD2-600，而在感病材料中缺少这两个条带。用DNA回收试剂盒对特异性片段进行回收和纯化，纯化后的RAPD—PCR产物克隆于pMDTM 19-T vector载体上，转化大肠杆菌感受态DH 5α感受态，通过蓝白斑筛选，PCR筛选阳性克隆重组质粒后送华大基因组公司测序。
实施例2：甘蓝抗根肿病SCAR引物的设计与鉴定
实施例1中的克隆子测序结果显示，抗根肿病甘蓝品种中两对RAPD引物扩增出的特异条带RAPD1-400和RAPD2-600的核苷酸序列长度分别为401bp和603bp。分别将两条核苷酸序列在NCBI(National Center of Biotechnology Information)数据库中进行比对，没有发现同源性高的序列；在甘蓝数据库(Bolbase)里进行序列比对，也无同源性高的序列。根据RAPD1-400的核苷酸序列，设计了8对SCAR引物；根据RAPD2-600核苷酸序列，设计了5对SCAR引物(表1)。将这13对引物在抗根肿病甘蓝品种GZ87和感病甘蓝材料F416、201、219、222、263中进行筛选和鉴定，结果发现，只有引物对CCR1和CCR2可用于鉴定GZ87。引物对CCR1在抗根肿病甘蓝品种GZ87中扩增出401bp条带，引物对CCR2扩增出355bp条带，而感病甘蓝材料中无任何条带，说明这两个标记为显性标记(图3、4)。将引物对CCR1和引物对CCR2的PCR扩增产物CCR1-400和CCR2-355进行测序，发现获得的核苷酸序列与RAPD1-400和RAPD2-600的核苷酸序列匹配(图5、6)。说明筛选到的CCR1-401和CCR2-355是抗根肿病甘蓝品种GZ87的特异条带。
引物对CCR1和引物对CCR2的PCR反应体系体积为25μL，其中模板(100ng/μL)3.0μL；引物对CCR1或CCR2(10μM)1.0μL；dNTP(100mM)0.5μL；Taq buffer 10×(Mg2+plusbuffer)2.5μL；Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.2μL；dd H2O补足25μL。
引物对CCR1的PCR扩增程序为：95℃3min，(95℃30s、62℃30s、72℃30s)循环7次，(95℃30s、58.5℃30s、72℃30s)循环22次，72℃10min，保存在4℃条件下。
引物对CCR2的PCR扩增程序为：95℃3min，(95℃30s，55℃30s，72℃30s)循环28次，72℃10min，保存在4℃条件下。
表1设计的SCAR引物序列
实施例3：甘蓝根肿病特异性SCAR分子标记快速鉴定抗根肿病甘蓝品种
利用引物对CCR1和引物对CCR2对8个抗根肿病甘蓝类品种(1、8、9、10、GZ87：抗根肿病结球甘蓝品种；5：抗根肿病抱子甘蓝品种；6：抗根肿病青花菜品种；7：抗根肿病花椰菜品种)；8个感根肿病甘蓝品种和材料(2、3、4：感根肿病结球甘蓝品种；263、F416、201、219、222：感根肿病结球甘蓝材料)进行PCR扩增，反应体系体积为25μL，其中模板(100ng/μL)3.0μL；引物对CCR1或CCR2(10μM)1.0μL；dNTP(100mM)0.5μL；Taq buffer 10×(Mg2+plusbuffer)2.5μL；Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.2μL；dd H2O补足25μL。
引物对CCR1的PCR扩增程序为：95℃3min，(95℃30s、62℃30s、72℃30s)循环7次，(95℃30s、58.5℃30s、72℃30s)循环22次，72℃10min，保存在4℃条件下。
引物对CCR2的PCR扩增程序为：95℃3min，(95℃30s，55℃30s，72℃30s)循环28次，72℃10min，保存在4℃条件下。
取10μL PCR反应产物与1μL上样缓冲液混匀在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，用1×TAE为电泳缓冲液，电压110V下电泳20分钟，凝胶分析系统进行照相分析。
在8个抗根肿病甘蓝类品种中，引物对CCR1扩增出401bp特异条带，引物对CCR2扩增出355bp特异条带，所有抗根肿病甘蓝品种中含有CCR-SCAR1和CCR-SCAR2两个标记，其余3个感病甘蓝品种和5个感病甘蓝材料中均无任何条带产生(图3、图4)。说明这两个SCAR标记为显性标记，可用于抗根肿病甘蓝品种的分子标记辅助筛选。
实施例4：抗根肿病甘蓝品种GZ87与感根肿病材料263杂种CP分离群体的甘蓝根肿病抗性的分子标记辅助选择
以抗根肿病甘蓝品种(GZ87)与感病材料(263)杂交，构建CP分离群体的无性系。利用引物对CCR1和引物对CCR2对分离群体的110个无性系进行基因型分型。反应体系体积为25μL，其中模板(100ng/μL)3.0μL；引物对CCR1或CCR2(10μM)1.0μL；dNTP(100mM)0.5μL；Taqbuffer 10×(Mg2+plus buffer)2.5μL；Taq DNA Polymerase(5U/μL)0.2μL；dd H2O补足25μL。
引物对CCR1的PCR扩增程序为：95℃3min，(95℃30s、62℃30s、72℃30s)循环7次，(95℃30s、58.5℃30s、72℃30s)循环22次，72℃10min，保存在4℃条件下。
引物对CCR2的PCR扩增程序为：95℃3min，(95℃30s，55℃30s，72℃30s)循环28次，72℃10min，保存在4℃条件下。
取10μL PCR反应产物与1μL上样缓冲液混匀在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，用1×TAE为电泳缓冲液，电压110V下电泳20分钟，凝胶分析系统进行照相分析。
分离群体的110个株系中，56个基因型能扩增出特异性条带，54个基因型未扩增出特异性条带，抗病标记和感病标记的比例约为1:1，说明了这两个鉴定根肿病抗性的分子标记为显性单基因分子标记(图7，图8)。
实施例5：GZ87与263杂种BC1群体的甘蓝根肿病抗性鉴定
以利用分子标记CCR-SCAR1和CCR-SCAR2鉴定后的CP无性系分离群体为亲本，选单株与感病材料263进行回交，获得BC1回交群体。对BC1群体进行根肿病苗期灌根接种鉴定，统计BC1群体的根肿病病情指数。并将具有CCR-SCAR1和CCR-SCAR2标记的CP单株产生的BC1株系病情指数，无CCR-SCAR1和CCR-SCAR2标记的CP单株产生的BC1株系病情指数，和感病对照甘蓝材料263的病情指数进行方差分析，发现凡是含有CCR标记的株系平均病情指数为13.13，显著低于无CCR标记的株系的平均病情指数(32.19)和对照263的病情指数(39.97)(P<0.05)。说明了含有SCAR分子标记的株系为抗病株系，无SCAR分子标记的为感病株系，并且这两个SCAR标记可以用于甘蓝根肿病抗性分子标记辅助筛选。
本发明所涉及的SCAR标记对甘蓝根肿病具有特异性，能够用于鉴定甘蓝根肿病抗性分子标记辅助选择。这是目前国际首例有关甘蓝根肿病抗性鉴定的特异性SCAR分子标记。
SEQUENCE LISTING
<110> 西南大学
<120> 用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记、引物及其应用
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 401
<212> DNA
<213> Brassica oleracea L
<400> 1
tacacacgct gatataccaa caaaggtaca gagagagaag ggaacctaac taatgtgttg 60
ccattgagtt aaatgctaac aagagatcag aagaatcata tcagcatata ctattcagaa 120
tacagaaacc aagtgggtga ccatggagtt attttttaac aatcgactaa gaaagattta 180
ccattggtac aacaatatcc tcctttcctg tgctcctcag aaatgtatat gatagcagcc 240
cgatgctctg cgtagagctg aaaccaacat caaataaaaa tataaactat tcagaagtga 300
aaatacaatc caaaacgatt gaagacataa tagccaaaag gggtaacaaa ttggtaataa 360
agaactaacc tctttccatt ttttccaggg cagcgtgtgt a 401
<210> 2
<211> 355
<212> DNA
<213> Brassica oleracea L
<400> 2
caacctgaac cacataagag atggattcgt aatgctgcta gagtcagctg atgactttgt 60
ggtggataca cctgacactg tcgatgttct cgctttgttc cttgcacgtg ttgttgttga 120
tgacatcctt cctcaagatt ttctcccaac ggcaaccagg acacttcaag tatcttcaat 180
aggttatcag gttgctcaaa cggtcaagaa aagctatcta tcagctgcac accatgcgaa 240
gctagttgat agaaatgggg tggaatgatt cgaacttact tccgttgagt aaatcaagaa 300
aaatatcgct aggaatatat agagattgga gacatttatg aggtgtatcg ctgtg 355
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 3
tacacacgct gatataccaa ca 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 4
tacacacgct gccctggaaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 5
caacctgaac cacataagag 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 引物
<400> 6
cacagcgata cacctcata 19

Claims (10)

1.用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记CCR-SCAR1，CCR-SCAR1的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.权利要求1所述分子标记的PCR特异性扩增引物对CCR1，CCR1的上游引物F-CCR1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，CCR1的下游引物R-CCR1的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记CCR-SCAR2，CCR-SCAR2的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。
4.权利要求3所述分子标记的PCR特异性扩增引物对CCR2，CCR2的上游引物F-CCR2的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，CCR2的下游引物R-CCR2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
5.权利要求1或3所述分子标记、权利要求2或4所述引物应用于鉴定甘蓝根肿病抗性中的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)以待鉴定材料的基因组DNA为模板，利用引物对CCR1或引物对CCR2进行PCR扩增获得扩增产物；
(2)将扩增产物进行电泳分离，若存在401bp或355bp条带，则待鉴定材料具有根肿病抗性，若不存在条带，则待鉴定材料不具有根肿病抗性。
6.如权利要求5所述方法，其特征在于，利用引物对CCR1或引物对CCR2进行PCR扩增的反应体系如下所示：所述反应体系总体积25μL，其中模板(100ng/μL)3.0μL；引物对CCR1或CCR2(10μM)1.0μL；dNTP(100mM)0.5μL；Taq buffer 10×(Mg2+plus buffer)2.5μL；Taq DNAPolymerase(5U/μL)0.2μL；dd H2O补足25μL。
7.如权利要求6所述方法，其特征在于，利用引物对CCR1进行PCR扩增的程序为：95℃3min，(95℃30s、62℃30s、72℃30s)循环7次，(95℃30s、58.5℃30s、72℃30s)循环22次，72℃10min，扩增完成后4℃保存。
8.如权利要求6所述方法，其特征在于，利用引物对CCR2进行PCR扩增的程序为：95℃3min，(95℃30s，55℃30s，72℃30s)循环28次，72℃10min，扩增完成后保存在4℃条件下。
9.权利要求1所述分子标记CCR-SCAR1或/和权利要求2所述引物对CCR1在鉴定甘蓝根肿病抗性中的应用。
10.权利要求3所述分子标记CCR-SCAR2或/和权利要求4所述引物对CCR2在甘蓝根肿病抗性的鉴定及转育甘蓝根肿病抗性基因/位点到其他十字花科植物中的分子标记辅助鉴定筛选中的应用。
CN201810585638.4A 2018-06-08 2018-06-08 用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记、引物及其应用 Active CN108588264B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810585638.4A CN108588264B (zh) 2018-06-08 2018-06-08 用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记、引物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810585638.4A CN108588264B (zh) 2018-06-08 2018-06-08 用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记、引物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108588264A true CN108588264A (zh) 2018-09-28
CN108588264B CN108588264B (zh) 2021-05-28

Family

ID=63623265

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810585638.4A Active CN108588264B (zh) 2018-06-08 2018-06-08 用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记、引物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108588264B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113201596A (zh) * 2021-01-13 2021-08-03 湖北省农业科学院经济作物研究所 一种十字花科植物抗根肿病基因CRb鉴定的InDel分子标记引物及应用
CN113528698A (zh) * 2021-07-14 2021-10-22 中国农业科学院油料作物研究所 一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4469992B2 (ja) * 2003-12-16 2010-06-02 三重県 根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜マーカー
KR20100068713A (ko) * 2008-12-15 2010-06-24 주식회사 농우바이오 배추 뿌리혹병 저항성 연관 분자표지 및 이의 용도
CN102511368A (zh) * 2011-12-31 2012-06-27 云南省农业科学院园艺作物研究所 一种芸薹属植物对根肿病抗性的鉴定方法
CN103275972A (zh) * 2012-09-05 2013-09-04 沈阳农业大学 大白菜抗根肿病CRb基因的连锁分子标记、引物及抗根肿病植株的选择方法
CN103313595A (zh) * 2010-11-29 2013-09-18 贝霍种子有限公司 抗甘蓝根肿菌的芸苔属植物及其种子和植物部分以及其获得方法
CN104185684A (zh) * 2011-09-27 2014-12-03 陶氏益农公司 对根肿病具有抗性的ho/ll芸苔
CN105063033A (zh) * 2015-08-15 2015-11-18 华中农业大学 一种甘蓝型油菜抗根肿病基因的分子标记及其在抗根肿病育种中的应用
CN105142394A (zh) * 2012-12-21 2015-12-09 瑞克斯旺种苗集团公司 抗根肿病的芸苔属植物
CN105969881A (zh) * 2016-06-22 2016-09-28 沈阳农业大学 大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541、引物及应用
CN106011134A (zh) * 2016-06-22 2016-10-12 沈阳农业大学 大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540、引物及应用
CN107937599A (zh) * 2018-01-17 2018-04-20 天津科润农业科技股份有限公司 一种鉴定大白菜抗根肿病的分子标记kb2、引物及应用
CN108018375A (zh) * 2018-01-17 2018-05-11 天津科润农业科技股份有限公司 一种鉴定大白菜抗根肿病的分子标记kb1、引物及应用

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4469992B2 (ja) * 2003-12-16 2010-06-02 三重県 根こぶ病抵抗性ナタネ類の選抜マーカー
KR20100068713A (ko) * 2008-12-15 2010-06-24 주식회사 농우바이오 배추 뿌리혹병 저항성 연관 분자표지 및 이의 용도
CN103313595A (zh) * 2010-11-29 2013-09-18 贝霍种子有限公司 抗甘蓝根肿菌的芸苔属植物及其种子和植物部分以及其获得方法
CN104185684A (zh) * 2011-09-27 2014-12-03 陶氏益农公司 对根肿病具有抗性的ho/ll芸苔
CN102511368A (zh) * 2011-12-31 2012-06-27 云南省农业科学院园艺作物研究所 一种芸薹属植物对根肿病抗性的鉴定方法
CN103275972A (zh) * 2012-09-05 2013-09-04 沈阳农业大学 大白菜抗根肿病CRb基因的连锁分子标记、引物及抗根肿病植株的选择方法
CN105142394A (zh) * 2012-12-21 2015-12-09 瑞克斯旺种苗集团公司 抗根肿病的芸苔属植物
CN105063033A (zh) * 2015-08-15 2015-11-18 华中农业大学 一种甘蓝型油菜抗根肿病基因的分子标记及其在抗根肿病育种中的应用
CN105969881A (zh) * 2016-06-22 2016-09-28 沈阳农业大学 大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541、引物及应用
CN106011134A (zh) * 2016-06-22 2016-10-12 沈阳农业大学 大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540、引物及应用
CN107937599A (zh) * 2018-01-17 2018-04-20 天津科润农业科技股份有限公司 一种鉴定大白菜抗根肿病的分子标记kb2、引物及应用
CN108018375A (zh) * 2018-01-17 2018-05-11 天津科润农业科技股份有限公司 一种鉴定大白菜抗根肿病的分子标记kb1、引物及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. NOMURA: "Evaluation of F 2 and F 3 plants introgressed with QTLs for clubroot resistance in cabbage developed by using SCAR markers", 《PLANT BREEDING》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113201596A (zh) * 2021-01-13 2021-08-03 湖北省农业科学院经济作物研究所 一种十字花科植物抗根肿病基因CRb鉴定的InDel分子标记引物及应用
CN113201596B (zh) * 2021-01-13 2022-09-16 湖北省农业科学院经济作物研究所 一种十字花科植物抗根肿病基因CRb鉴定的InDel分子标记引物及应用
CN113528698A (zh) * 2021-07-14 2021-10-22 中国农业科学院油料作物研究所 一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用
CN113528698B (zh) * 2021-07-14 2022-01-25 中国农业科学院油料作物研究所 一种鉴定和/或区分甘蓝类蔬菜的InDel分子标记及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108588264B (zh) 2021-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Identification of a candidate gene for panicle length in rice (Oryza sativa L.) via association and linkage analysis
CN104877996B (zh) 簇毛麦6vs染色体特异性分子标记6vs-bh1及其用途
CN109468315B (zh) 水稻耐淹基因Sub1共显性分子标记及应用
CN113637789B (zh) 小麦抗条锈病基因YrTD121连锁的KASP分子标记及引物、试剂盒和应用
CN105950747A (zh) 一种稻瘟病抗性基因Pi1功能特异性分子标记及其应用
CN107619881B (zh) 一种与烟草黑胫病0号、1号生理小种抗性基因Bs_t连锁的SSR标记及其应用
CN110551843B (zh) 可区分烟草抗斑萎病位点rtsw纯合杂合基因型的共显性标记引物、区分方法及其应用
CN110499390B (zh) 用于烟草抗斑萎病rtsw基因辅助选择的分子标记引物、辅助选择的方法及其应用
CN111893209B (zh) 一种与小麦千粒重相关的插入缺失位点检测标记及其应用
CN101899437B (zh) 用于甜瓜枯萎病抗性鉴定的功能性分子标记及其用途
CN110499389B (zh) 与烟草抗斑萎病位点rtsw紧密连锁的共显性标记引物、鉴别方法及其应用
Chand et al. Genetics and molecular mapping of a novel purple blotch-resistant gene ApR1 in onion (Allium cepa L.) using STS and SSR markers
CN109234423B (zh) 大豆分子标记及其多态性在鉴定大豆分枝数性状中的应用
CN108588264A (zh) 用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记、引物及其应用
Borowska-Zuchowska et al. Cytomolecular Analysis of Ribosomal DNA Evolution in a Natural Allotetraploid Brachypodium hybridum and Its Putative Ancestors—Dissecting Complex Repetitive Structure of Intergenic Spacers
CN111334597B (zh) 用于检测西瓜白粉病抗性的snp位点、kasp标记及其应用
CN105543366B (zh) 水稻抗稻瘟病基因Pi25基因内特异SNP共显性分子标记开发及应用
CN111926104A (zh) 一种鉴定甘蔗与斑茅杂交后代真实性的ssr分子标记及其方法
CN115976248B (zh) 一种特有鉴别胡杨派植物方法及使用试剂盒
CN108531644B (zh) 与陆地棉as98矮化性状紧密连锁的分子标记及应用
CN113308566B (zh) 大豆主茎节数关联的InDel分子标记的引物和应用
CN115976266A (zh) 一种与陆地棉棉铃大小紧密连锁的InDel功能分子标记BW07-InDel及其应用
CN104762298A (zh) 一种水稻苗期耐盐基因qST11及其分子标记方法
CN113151575B (zh) 一种水稻粒形主效QTL的InDel分子标记GW6a-InDel及其检测引物和应用
CN103789431B (zh) 辅助筛选和培育抗条锈病小麦新品系的专用引物、试剂和试剂盒及其选育方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant