CN113201596B

CN113201596B - 一种十字花科植物抗根肿病基因CRb鉴定的InDel分子标记引物及应用

Info

Publication number: CN113201596B
Application number: CN202110040099.8A
Authority: CN
Inventors: 李金泉; 任志勇; 聂启军; 董斌峰; 胡志伟
Original assignee: Institute of Economic Crop of Hubei Academy of Agricultural Science
Current assignee: Institute of Economic Crop of Hubei Academy of Agricultural Science
Priority date: 2021-01-13
Filing date: 2021-01-13
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2041-01-13
Also published as: CN113201596A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种十字花科植物抗根肿病基因CRb鉴定的InDel分子标记引物及应用，所述的分子标记的引物为F：ATTAATTGAAGTATTAAAGTGGATAGCGA和R：TCGATGCAGTGTGTTGTAATGAT。本发明开发的分子标记特异性更强，在与已公开的分子标记比较时、以及在96份感病的种质资源中进行测试时，均未出现将感病材料检测为抗病的情况，展示出了更强的特异性。同时还可以与其他抗根肿病基因分子标记联合使用，作为抗根肿病鉴定或者育种中的筛选工作。

Description

一种十字花科植物抗根肿病基因CRb鉴定的InDel分子标记引物及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种十字花科植物抗根肿病基因CRb鉴定的InDe l分子标记引物及应用。

背景技术

根肿病是由芸薹属根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染引起的一种严重危害十字花科作物的土传性病害。根肿病菌侵染植株根部，40-60天后，引起根部变形肿大形成肿瘤，植株的正常水分和养分运输被阻碍，植株生长缓慢，最终根部腐烂、叶片发黄枯死。根肿病在世界范围内对油菜(Brassica napus)、大白菜(B.rapa ssp.pekinensis)、甘蓝(B.oleracea var.capitata)等大宗十字花科作物和蔬菜造成了严重的危害(李金萍等2012)。乌塌菜(B.rapa ssp.narinosa)，小白菜(B.rapassp.chinensis)，红菜薹(B.rapassp.chinensis var.purpurea)，白菜苔(B.rapassp.chinensis var.tai-tsai)，菜心(B.rapassp.parachinensis)属于白菜种(B.r apa)下的不同亚种或变种，在我国是非常重要的一类具有不同地域特色的蔬菜品类，如安徽黄心乌塌菜，上海青小白菜，武汉洪山菜薹等，然而在这些白菜种亚种与变种蔬菜中，根肿病危害也在逐年加重，有上升为主要病害的趋势。

育种家在利用抗病基因培育抗病品种时，一个操作简便、效果稳定且准确性高的分子标记至关重要，准确而稳定的分子标记检测结果才能在育种过程中向育种家反馈可靠的信息。目前白菜种中仅在欧洲芜菁(B.rapassp.rapa，白菜种的一个亚种)的部分品系中发现了抗根肿病基因(贾豪2018)，育种家已通过杂交育种的手段将这些来源于欧洲芜菁的抗根肿病基因导入到了大白菜以及油菜品种中。CRb是从一份欧洲芜菁品系ECD01(Piaoetal2004)中鉴定到的抗根肿病基因，位于A03染色体上，该基因已被克隆到，并成功应用在了十字花科抗根肿病育种上，如华中农业大学通过CRb的分子标记进行辅助选择，成功的将CRb导入到甘蓝型油菜(Brassica napus)华油杂62中(李倩等2020)。

在植物育种中，从一个品种的野生种或与亲缘关系较远的其它变种中向该品种导入抗病基因时，导入的抗病基因通常以一个大的染色体片段即与抗病基因紧密连锁区间的方式存在于受体品种中(Lin et al 2014)。由于连锁不平衡的原理，抗病基因内以及其上下游染色体片段上存在的DNA变异位点如Indel、SNP都与抗病基因密切关联，可以转化为分子标记，用来检测一个品种是否携带抗病基因。但是，这些变异位点的基因型与抗病基因的基因型有时会在一些感病品种类型中产生大量不真实的关联，而在育种过程打破连锁不平衡的重组交换是低概率的，因此这种在分子标记检测时经常出现的不真实关联可称之为假阳性问题。这与抗病基因的来源有关，以番茄抗晚疫病基因Ph-3的分子标记为例，已报道的几个Ph-3分子标记中有部分标记在樱桃番茄中要比在大果栽培番茄中较易产生假阳性结果，这是因为P h-3的来源品种L3708属于醋栗番茄，醋栗番茄是现代大果型栽培番茄的野生祖先种，而樱桃番茄是醋栗番茄向大果型栽培番茄演化过程中的中间种，因此樱桃番茄基因组比大果番茄基因组中含有更多与醋栗番茄一样的DNA变异，利用这些变异开发的Ph-3分子标记往往更容易在樱桃番茄品种中产生假阳性(Ren et al 2019)。

一个抗病基因往往会有多个对应的分子标记不断的被开发出来，因为育种家在实践的过程中，经常会发现已发表的分子标记存在假阳性，任平平在抗病性已知的3份大白菜品种和 24份种质资源中对6个已发表的CRb分子标记进行了验证时，发现6个CRb分子标记中只有标记TCR05的检测结果是准确而稳定的(任平平等2016)。沈舒为了找到适用于自己育种材料的抗根肿病分子标记，利用已知抗性的大白菜商品种对43个已发表的根肿病基因的分子标记进行了筛选验证，仅得到了一个与品种抗病性吻合的分子标记(沈舒2019)。尽管已有不少抗根肿病的分子标记发表，并且部分已应用在油菜与大白菜育种中去，但是在更广泛的白菜种亚种与变种上的育种应用效果并未得到检验，其能否用于白菜种亚种与变种的抗根肿病育种中尚未可知。

因此，开发具备普适性的用于根肿病鉴定的分子标记，对于各白菜种亚种与变种的抗根肿病育种极为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种十字花科植物抗根肿病基因CRb鉴定的InDel分子标记引物，所述的分子标记CRb-sepcific-InDel的引物序列为F：ATTAATTGAAGTATTAAAGTGGATAGCGA和R：TCGATGCAGTGTGTTGTAATGAT。

本发明的另一个目的在于提供了一种十字花科植物抗根肿病基因CRb鉴定的InDel分子标记引物的应用，利用该引物可用于包括十字花科植物，特别是各类白菜种亚种与变种的抗根肿病品种的育种，或者抗根肿病品种的鉴定。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

十字花科植物根肿病鉴定的分子标记引物的获得：

1.将携带抗根肿病病基因的纯系甘蓝型油菜Bing409R(携带CRb)(李倩等2020)、Huas huang5R(携带PbBa8.1)(Zhan et al2020)以及抗根肿病红菜薹GJ3(携带德高CR117中的抗根肿病基因)(聂启军等2018)利用二代测序技术获取全基因组重测序数据。同时从NCBI中数据库下载199份包含了各类白菜种亚种与变种如大白菜，小白菜，乌塌菜，芜菁，菜心，红菜薹，白菜苔等的二代测序数据(NCBI登录号：SRP066057)。

2.利用GATK算法(通过sentieon软件实现)，在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的生物信息高性能计算集群上对1中获取的二代测序数据进行分析获取InDel与SNP 的基因型数据(VCF文件)。其中，对于199份白菜种的亚种与变种以及红菜薹GJ3，以白菜参考基因组Chiifu-401-42(V3.0版本，Zhangetal 2018)为参考基因组计算基因型；甘蓝型油菜的基因组是由白菜基因组(A基因组)与甘蓝基因组(C基因组)构成，对于两份甘蓝型油菜B ing409R、Huashuang5R，由于CRb与PbBa8.1位于染色体A03与A08上，为了使这两份甘蓝型油菜在相应染色体上计算的InDel、SNP物理坐标与白菜种保持一致，将甘蓝型油菜参考基因组ZS11(song et al 2020)的A03与A08染色体替换为Chiifu-401-42的A03与A08 染色体后作为参考基因组计算基因型。

3.将199份包含了各类白菜种亚种与变种分别与携带三个抗根肿病基因的自交系在抗病基因所在1Mb连锁区间内的SNP基因型进行聚类分析(CRb所在1Mb连锁区间为:A03:25024902-26024902；PbBa8.1与GJ3/德高CR117携带所抗病基因的连锁区间均为A08:12271594-13271594)，根据聚类结果区分出携带抗病基因与不携带抗病基因的两个品种类群。在1 Mb以内寻找在抗病类群与感病类群中均不同的InDel(>40bp，为了在琼脂糖凝胶电泳中保证足够的分辨率)。

4.针对3中筛选到的InDel设计引物，首先在已知的抗病基因纯抗、杂合以及纯感的品系中验证InDel真实性以及引物检测效果；

5.在确定InDel的真实性及引物检测效果之后，再将其与现有分子标记的检测效果进行比较、以及在更多的种质资源中验证，评价新开发的分子标记的使用效；最终获得了3个抗病基因CRb、PbBa8.1以及CRzi8的分子标记分别为：CRb-sepcific-InDel、PbBa8.1-sepcific -InDel及CRzi8-sepcific-InDel，针对这三个分子标记设计的引物为：

CRb-sepcific-InDel：F：ATTAATTGAAGTATTAAAGTGGATAGCGA和R：TCGATGCAGTGTGTTGTAATGAT；抗病条带160bp；感病条带225bp。

PbBa8.1-sepcific-InDel：F：ATTCAAATCAACCAAACTGAATTCG和R：TGTTGGAGCTCTAGTTGTCTG；抗病条带257bp；感病条带299bp。

CRzi8-sepcific-InDel：F：GGTCCACTTGTGTAAGATCCC和R：TGCATGCTCGATCTAGACGAT；抗病条带237bp；感病条带306bp。

一种十字花科植物抗根肿病基因CRb鉴定的InDel分子标记引物的应用，包括单独或者联合利用上述分子标记的引物，对十字花科植物，特别是白菜或其亚种或变种进行抗根肿病的鉴定，或是进行抗根肿病的育种；

以上所述的应用中，优选，当联合应用时，所述的分子标记引物组合为：

CRb-sepcific-InDel：F：ATTAATTGAAGTATTAAAGTGGATAGCGA、R：TCGATGCAGTGTGTTGTAATGAT；和PbBa8.1-sepcific-InDel：F：ATTCAAATCAACCAAACTGAATT CG、R：TGTTGGAGCTCTAGTTGTCTG；

CRb-sepcific-InDel：F：ATTAATTGAAGTATTAAAGTGGATAGCGA、R：TCGATGCAGTGTGTTGTAATGAT和CRzi8-sepcific-InDel：F：GGTCCACTTGTGTAAGATCCC、R：TGCATGCTCGATCTAGACGAT。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

经申请人验证，现有三个抗根肿病基因的分子标记存在假阳性，即存在将感病材料鉴定为抗病的情况；而本发明开发的分子标记特异性更强，在与已公开的分子标记比较时、以及在96份感病的种质资源中进行测试时，均未出现将感病材料检测为抗病的情况。本发明开发的抗根肿病分子标记在对抗根病基因检测时展示出了更强的特异性。

附图说明

图1为本发明抗根肿病分子标记的开发流程图。

图2为CRb、PbBa8.1、CRzi8抗源与重测序的白菜种亚种与变种资源的聚类结果；

其中：A为CRb抗源与重测序的白菜种亚种与变种资源的聚类结果；

B为PbBa8.1抗源与重测序的白菜种亚种与变种资源的聚类结果；

C为CRzi8抗源与重测序的白菜种亚种与变种资源的聚类结果。

图3为实施例2中利用本发明提供的三种分子标记在相应抗根肿病基因的已知基因型材料中的检测效果图；

在下述备注中，括号内的R，H，S分别表示该品种在相应抗病基因上的基因型分别为纯抗、杂合与感病。

其中：A为抗根肿病基因CRb分子标记CRb-sepcific-InDel检测效果：

泳道M：BM5000marker；1：Bing409R(R)；2：Bing409RXGJ3(H)(Bing409R与GJ3杂交F1)；3：大股子(S)(红菜薹)；4：汉珍一号油菜心(S)(菜心)；5：金雪球(S)(乌塌菜，张灵凤2012)；6：白玉2号(S)(快菜)；7：大樱花(S)(红菜薹)；8：白雪公主(S)(小白菜)；

B为抗根肿病基因PbBa8.1分子标记PbBa8.1-sepcific-InDel检测效果：

泳道M：BM5000 marker；1：Huashuang5R(R)；2：Huashuang5RXGJ3(H)(华双5R与GJ3的杂交F1)；3：鄂红1号(S)(红菜薹，鄂审菜001-2003)；4：泡泡青(S)(乌塌菜小白菜中间型的随州传统品种)；5：金雪球(S)(乌塌菜，张灵凤2012)；6：银琳(S)(白菜薹)；7：奶白菜(S)(小白菜)；8：汉珍一号油菜心(S)(菜心)；

C为GJ3/德高CR117中A08染色体上的主效抗根肿病位点CRzi8的分子标记CRzi8-se pcific-InDel检测效果：

泳道M：BM5000 marker；1：GJ3(R)；2：紫御60(H)(红菜薹，抗根肿病杂交品种，聂启军等2019)；3：二早子(S)(红菜薹，吴朝林，陈文超1997)；4：佳红6号(S)(红菜薹)；5： 70天特青菜心(S)(菜心，胡英忠2007)；6：金雪球(S)(乌塌菜，张灵凤2012)；7：白雪公主 (S)(小白菜)；8：紫心乌(S)(乌塌菜)。

图4为本发明的分子标记同已报道相同基因的分子标记准确性对比示意图；

其中方框表示各抗根肿病基因的纯抗(R)与杂抗(H)基因型对照(1、2泳道为R，3、4泳道为H)；箭头表示已发表分子标记检测出的假阳性结果；

其中A为分子标记CRb-sepcific-InDel与分子标记TCR05的比较；

B为分子标记PbBa8.1-sepcific-InDel与分子标记caps_134的比较；

C为分子标记CRzi8-sepcific-InDel与分子标记BSA7的比较。

图5为本发明提供的三种分子标记引物在96份白菜类资源中的检测示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

十字花科植物根肿病鉴定的InDel分子标记引物的获得：

1，将携带抗根肿病病基因的纯系甘蓝型油菜Bing409R(CRb抗源)、Huashuang5R(PbBa 8.1抗源)以及抗根肿病红菜薹GJ3(CRzi8抗源，抗性基因通过与抗根肿病大白菜品种“德高 CR117”杂交转育而来，CRzi8为申请人命名，聂启军等2018；宋莹2019)利用二代测序技术获取全基因组重测序数据。同时从NCBI中数据库下载199份包含了各类白菜种的亚种与变种的二代测序数据(NCBI登录号：SRP066057)。

其中，CRzi8即GJ3/德高CR117中的抗根肿病基因是定位于A08号染色体一段区间上的抗根肿病主效QTL位点，目前仍未克隆到具体基因，而一个已经克隆的抗根肿病基因Crr1a，恰位于CRzi8所在的QTL区间内，存在为相同基因的可能性(宋莹2019)。为了厘清Crr1a与CRzi8位点的关系，申请人通过对GJ3中Crr1a对应的等位基因与Crr1a抗病等位基因序列比较，发现二者存在错义SNP突变C→T(Crr1a处编码亮氨酸，GJ3对应等位基因处编码苯丙氨酸,突变位置在Crr1a的2302处)，即GJ3/德高CR117中的抗根肿病基因与Crr1 a不是相同的抗病基因，故申请人将其新命名为CRzi8。

2.利用GATK算法(通过sentieon软件实现)，在华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的生物信息高性能计算集群上对1中获取的二代测序数据进行分析获取InDel与SNP 的基因型数据(VCF文件)。其中，对于199份白菜种亚种与变种以及红菜薹GJ3，以白菜参考基因组Chiifu-401-42的V3.0版本(Zhangetal 2018)为参考基因组计算基因型；对于甘蓝型油菜Bing409R(CRb抗源)、Huashuang5R(PbBa8.1抗源)，由于CRb与PbBa8.1位于染色体 A03与A08上，为了使这两份甘蓝型油菜在相应染色体上计算的InDel、SNP物理坐标与白菜种亚种与变种保持一致，将甘蓝型油菜参考基因组ZS11(song et al 2020)的A03与A08染色体替换为Chiifu-401-42的A03与A08染色体后作为参考基因组计算基因型。

3.将199份白菜种亚种与变种资源分别与三个抗根肿病基因的抗源在抗病基因所在1 Mb连锁区间内的SNP基因型进行聚类分析(CRb所在1Mb连锁区间为:A03:25024902-2602 4902；PbBa8.1与CRzi8的连锁区间均为A08:12271594-13271594)，

CRb、PbBa8.1、CRzi8抗源与199份白菜种亚种与变种资源的聚类结果分别如图2中的A、B、C所示，从上述聚类结果来看，每个抗病基因对应的抗源(箭头所示)都聚到了芜菁(turnip)中，这也与目前白菜种亚种与变种中仅在部分芜菁品系中发现了根肿病抗源的情况吻合，同时与抗源亲缘关系最近的均是芜菁品系，也说明图中的其它白菜品种中并不携带这三个抗病基因。因此将CRb、PbBa8.1、CRzi8抗源分别作为每种抗病基因对应的抗病类群(即每个抗类群里只有一份抗源)，其它199份白菜类资源均作为感病类群。

根据聚类结果区分出携带抗病基因与不携带抗病基因的两个品种类群。在1Mb以内寻找在抗病类群与感病类群中均不同的InDel(>40bp，为了在琼脂糖凝胶电泳中保证足够的分辨率)；

4.针对3中筛选到的InDel设计引物，首先在已知的抗病基因纯抗、杂合以及纯感的品系中验证InDel真实性以及引物扩增效果；

5.在确定InDel的真实性及引物扩增效果之后，再将其与现有分子标记进行比较、以及在更多的种质资源中验证，评价新开发的分子标记的使用效果；最终获得了3个抗根肿病基因CRb、PbBa8.1以及CRzi8的分子标记，分别为：CRb-sepcific-InDel、PbBa8.1-sepcific-In Del及CRzi8-sepcific-InDel，针对这三个分子标记设计的引物为：

PCR反应体系：总体积20μL，其中：10X Easy Taq buffer 2.0μL，dNTP(10mM)0.4μL，正反引物(10μM)各0.4μL，DNA模板(50-200ng/μL)1μL，Easy Taq酶(5U/uL)0.2μL，ddH₂O15.6μL；

PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，72℃延伸5min，4℃保存10min；

凝胶电泳检测：PCR产物用2.5％琼脂糖凝胶在130V电压条件下电泳25min，结果在凝胶成像系统上显示。

实施例2：

十字花科植物根肿病鉴定的InDel分子标记引物在植物抗根肿病鉴定中的应用：

以下各品种括号内的R、H与S表示该品种在相应抗病基因上的基因型分别为纯抗、杂合与感病，品种前的编号顺序对应图3中各标记检测结果的泳道编号。

1)验证CRb-sepcific-InDel分子标记引物检测效果的已知基因型品种为：

1：Bing409R(R)；2：Bing409RXGJ3(H)(Bing409R与GJ3杂交F1)；3：大股子(S)(红菜薹)；4：汉珍一号油菜心(S)(菜心)；5：金雪球(S)(乌塌菜，张灵凤2012)；6：白玉2号(S)(快菜)；7：大樱花(S)(红菜薹)；8：白雪公主(S)(小白菜)。

按照实施例1中的PCR方法对上述品种进行鉴定，结果如图3中A所示，仅纯抗和杂抗品种存在160bp的抗病条带。

2)验证PbBa8.1-sepcific-InDel分子标记引物检测效果的已知基因型品种为：

1：Huashuang5R(R)；2：Huashuang5RXGJ3(H)(华双5R与GJ3的杂交F1)；3：鄂红1 号(S)(红菜薹，鄂审菜001-2003)；4：泡泡青(S)(乌塌菜小白菜中间型的随州传统品种)；5：金雪球(S)(乌塌菜，张灵凤2012)；6：银琳(S)(白菜薹)；7：奶白菜(S)(小白菜)；8：汉珍一号油菜心(S)(菜心)；

按照实施例1中的PCR方法对上述品种进行鉴定，结果如图3中B所示，仅纯抗和杂抗品种存在257bp的抗病条带。

3)验证CRzi8-sepcific-InDel分子标记引物检测效果的已知基因型品种为：

1：GJ3(R)；2:紫御60(H)(红菜薹，抗根肿病杂交品种，聂启军等2019)；3：二早子(S)(红菜薹，吴朝林，陈文超1997)；4：佳红6号(S)(红菜薹)；5：70天特青菜心(S)(菜心，胡英忠2007)；6：金雪球(S)(乌塌菜，张灵凤2012)；7：白雪公主(S)(小白菜)；8：紫心乌(S)(乌塌菜)；

按照实施例1中的PCR方法对上述品种进行鉴定，结果如图3中C所示，仅纯抗和杂抗品种存在237bp的抗病条带。

实施例3：

十字花科植物根肿病鉴定的InDel分子标记引物鉴定抗根肿病基因的准确性(与已发表的标记比较)：

1)分子标记CRb-sepcific-InDel与分子标记TCR05(任平平等2016)的比较

分子标记TCR05的引物为：TCR05-F：AGAATCATGACCGGGGAAAT TCR05-R：GCAGCTAAGTCATCGACCAA；使用TCR05的引物对待测材料进行常规PCR扩增，在CRb 阳性与阴性的材料中可分别扩增出279bp的抗病条带与250bp的感病条带。CRb-sepcific-In Del的使用如实施例1所述，使用这两个CRb的分子标记对如下品种进行检测，待测品种(R、 H分别表示抗病基因的纯抗与杂合对照，其余均为已知的感病品种)依次为：

1：Bing409R-5(R)(Bing409R扩繁后的株系)；2：Bing409R-6R)(Bing409R扩繁后的株系)； 3：Bing409RX白玉2号(H)(Bing409R与白玉2号杂交F1)；4：Bing409RX四月慢(H)(Bing 409R与四月慢杂交F1)；5：紫心乌(乌塌菜)；6：奶白菜(小白菜)；7：白玉2号(快菜)；8：鄂红60(红菜薹)；9：BT45(白菜薹，2020年武汉种博会推荐菜薹品种)；10：鄂红1号(红菜薹，鄂审菜001-2003)；11：LH70(红菜薹，2020年武汉种博会推荐菜薹品种)；12：高山红(红菜薹，鄂审菜2015001)；13：鄂红2号(红菜薹，鄂审菜002-2003)；14：鄂红4号(红菜薹，鄂审菜2010001)；15：四月慢(小白菜)；16：鄂红5号(红菜薹，鄂审菜2015002)。

结果如图4中A所示(品种前的编号顺序对应泳道编号)，除了纯抗与杂抗的阳性对照(方框)外，其余材料均为已知感病的各类白菜种亚种与变种品种，但TCR05出现了假阳性结果 (箭头)，CRb-sepcific-InDel则没有。

2)分子标记PbBa8.1-sepcific-InDel与分子标记caps_134(战宗祥2020)的比较

分子标记caps_134的引物为：caps_134-F：TCTTCTACTTTGTCAGTCCGTTCAC和ca ps_134-R：TACGAGGTTGGTTTTCCACATGATG；使用caps_134对待测材料进行常规PCR 扩增，可得到条带大小为338bp的PCR产物，用限制性内切酶TaqI对PCR产物进行酶切，在PbBa8.1阳性的材料中，扩增条带可被酶切开，带型为87bp+251bp；在PbBa8.1阴性的材料中，扩增条带无法被酶切开，仍为338bp。PbBa8.1-sepcific-InDel的使用如实施例1所述，使用这两个PbBa8.1的分子标记对如下品种进行检测，待测品种(R、H分别表示抗病基因的纯抗与杂合对照，其余均为已知的感病品种)依次为：

1：Huashuang5R-7(R)(Huashuang5R扩繁后的株系)；2：Huashuang5R-8(R)(Huashuang 5R扩繁后的株系)；3：Huashuang5RXGJ3(H)(Huashuang5R与GJ3杂交F1)；4：Huashuang 5RX二早子(H)(Huashuang5R与二早子杂交F1)；5：宜宾摩登红(红菜薹，汪李平2005)；6： LH70(红菜薹，2020年武汉种博会推荐菜薹品种)；7：金雪球(乌塌菜，张灵凤2012)；8：鄂红60(红菜薹)；9：70天特青菜心(菜心，胡英忠2007)；10：二早子(红菜薹，吴朝林，陈文超1997)；11：四月慢(小白菜)；12：紫婷2号(红菜薹，邱孝育等2008)；13：佳红6 号(红菜薹)；14：鄂红5号(红菜薹，鄂审菜2015002)。

结果如图4中B所示(品种前的编号顺序对应泳道编号)，除了纯抗与杂合的阳性对照(方框)外，其余材料均为已知感病的各类白菜种亚种与变种品种，但caps_134出现了假阳性结果(箭头)，PbBa8.1-sepcific-InDel则没有。

3)分子标记CRzi8-sepcific-InDel与分子标记BSA7(宋莹2019)的比较

BSA7分子标记的引物为：BSA7-F：AAGCAGAAGGGTTCTTGTCTGAACTBSA-R：TCACTCTGAGACATGAGGACACTTG；使用BSA7对待测材料进行常规PCR扩增，在CRz i8阳性与阴性的材料中可分别扩增出330bp的抗病条带与352bp的感病条带。CRzi8-sepcifi c-InDel的使用如实施例1所述，使用这两个CRzi8的分子标记对如下品种进行检测，待测品种(R、H分别表示抗病基因的纯抗与杂合对照，其余均为已知的感病品种)依次为：

1：GJ3(R)(红菜薹，抗根肿病纯系，聂启军等2018)；2：GJ9(R)(红菜薹，抗根肿病纯系，聂启军等2018)；3：德高CR117(H)(大白菜，抗根肿病杂交品种，宋莹2019)；4：紫御 70(H)(红菜薹，抗根肿病杂交品种，聂启军等2019)；5：鄂红60(红菜薹)；6：LH70(红菜薹，2020年武汉种博会推荐菜薹品种)；7：BT45(白菜薹，2020年武汉种博会推荐菜薹品种)； 8：鄂红2号(红菜薹，鄂审菜002-2003)；9：高山红(红菜薹，鄂审菜2015001)；10：鄂红5 号(红菜薹，鄂审菜2015002)；11：大股子(红菜薹)。

结果如图4中C所示(品种前的编号顺序对应泳道编号)，除了纯抗与杂合的阳性对照(方框)外，其余材料均为已知感病的各类白菜种亚种与变种品种，但BSA7出现了假阳性结果(箭头)，CRzi8-sepcific-InDel则没有。

因此，本发明针对三个抗根肿病基因开发的分子标记与已发表的分子标记相比准确度更高，可以单独或者联合使用进行植物抗根肿病性状的鉴定。

实施例4：

十字花科植物根肿病鉴定的InDel分子标记引物的普适性：

本实施例中利用本发明的三对分子标记引物，对申请人收集的96份白菜种亚种与变种资源(均为感病材料)进行了鉴定，

结果如图5所示，除开Marker，每排左数第一泳道为阳性对照(抗病基因CRb的阳性对照为Bing409R；抗病基因PbBa8.1的阳性对照为Huashuang5R；抗病基因CRzi8的阳性对照为GJ3)，本发明提供的三个分子标记在96份白菜类资源中均未发现假阳性。

96份白菜类资源信息

本发明针对CRb、PbBa8.1及CRzi8开发的分子标记CRb-sepcific-InDel、PbBa8.1-sepci fic-InDel及CRzi8-sepcific-InDel与现有的分子标记相比展现了良好的准确性，同时在广泛的种质资源中均为发现假阳性结果，展现了高度的特异性。显示出了其在白菜类植物抗根肿病育种中广阔的应用前景，可以单独或者联合使用，用于十字花科植物抗根肿病的鉴定或育种。

序列表

<110> 湖北省农业科学院经济作物研究所

<120> 一种十字花科植物抗根肿病基因CRb鉴定的InDel分子标记引物及应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attaattgaa gtattaaagt ggatagcga 29

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcgatgcagt gtgttgtaat gat 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attcaaatca accaaactga attcg 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgttggagct ctagttgtct g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtccacttg tgtaagatcc c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcatgctcg atctagacga t 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agaatcatga ccggggaaat 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcagctaagt catcgaccaa 20

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcttctactt tgtcagtccg ttcac 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tacgaggttg gttttccaca tgatg 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagcagaagg gttcttgtct gaact 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcactctgag acatgaggac acttg 25

Claims

1.一种十字花科植物抗根肿病基因鉴定的InDel分子标记引物组合：所述的分子标记引物组合为：

F：ATTAATTGAAGTATTAAAGTGGATAGCGA、R：TCGATGCAGTGTGTTGTAATGAT；和F：ATTCAAATCAACCAAACTGAATTCG、R：TGTTGGAGCTCTAGTTGTCTG。

2.一种十字花科植物抗根肿病基因鉴定的InDel分子标记引物组合：所述的分子标记引物组合为：

F：ATTAATTGAAGTATTAAAGTGGATAGCGA、R：TCGATGCAGTGTGTTGTAATGAT和F：GGTCCACTTGTGTAAGATCCC、R：TGCATGCTCGATCTAGACGAT。

3.权利要求1或2所述的引物组合在十字花科植物抗根肿病鉴定中的应用，所述的十字花科植物为白菜或其亚种或变种。

4.权利要求1或2所述的引物组合在抗根肿病十字花科植物育种中的应用，所述的十字花科植物为白菜或其亚种或变种。