CN105543391A - 一种鉴定定位于白菜A03染色体的根肿病抗性QTL的InDel分子标记及其应用 - Google Patents

一种鉴定定位于白菜A03染色体的根肿病抗性QTL的InDel分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定定位于白菜A03染色体的根肿病抗性QTL的InDel分子标记及其应用。本发明提供了鉴别或辅助鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的方法，包括以待鉴别大白菜的基因组DNA为模板，以SEQ？ID？No.2所示的单链DNA为正向引物，SEQ？ID？No.3所示的单链DNA为反向引物，进行扩增，检测扩增产物的大小，根据扩增产物的大小按照下述方法确定所述待鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜：如果所述待鉴别大白菜的扩增产物中含有大小为201bp的条带，所述待鉴别大白菜为抗根肿病大白菜或候选抗根肿病大白菜；如果所述待鉴别大白菜的扩增产物中不含有大小为201bp的条带，所述待鉴别大白菜为非抗根肿病大白菜或非候选抗根肿病大白菜。

Description

一种鉴定定位于白菜A03染色体的根肿病抗性QTL的InDel分子标记及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中鉴别大白菜根肿病抗性的分子标记及其应用，特别涉及与芸薹根肿菌2号和7号生理小种抗性相关的InDel分子标记及其应用。
背景技术
十字花科植物根肿病是鞭毛菌亚门芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)侵染引起的一种土传真菌病害,是十字花科植物的重要根部病害。该病最早发现于1737年英国地中海西岸和欧洲南部。目前，在欧洲、北美和亚洲的日本等地已成为一种主要病害,给十字花科蔬菜生产造成了严重的威胁,现全世界均有分布,尤以温带地区发生更为严重。近年来,十字花科根肿病在我国的东北地区、西南地区、长江中上游地区以及山东青岛等地迅速扩大,危害十分严重,严重制约着我国十字花科蔬菜产业的发展。
我国自1955年首次发现根肿病以来，现已扩散至全国各地。据不完全统计，仅大白菜在全国的发病面积已超过200万亩，且危害面积逐年增加。自从1931年报道了根肿菌存在小种分化后，各国学者利用根肿菌对不同寄主的抗感反应，划分出不同的生理小种，目前在国际上比较公认的有Williams和欧洲鉴别系统(ECD)。2009年，沈向群等率先采用Williams鉴别系统对采自辽宁、吉林、山东和四川等15个地区的根肿菌进行了鉴定，认为11个地区的根肿菌主要以4号生理小种为主，同时发现2、7、10和11号生理小种各一个。国内关于采用欧洲ECD鉴别系统的研究还未见报道，其原因主要是国内尚无完整的ECD鉴别寄主。根肿病虽然可采用化学药剂和加强栽培管理等防治方法，但防治效果并不理想。选育和种植具有持久抗性的品种，是防治大白菜根肿病最经济有效的措施。
近年来迅速发展起来的分子标记辅助选择(Maker-assistedseleetion，MAS)技术为分子育种提供了崭新的途径。这种技术的基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离关系的分子标记对选择个体进行目标区域以及全基因组筛选，从而减少连锁累赘，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的(DudleyJWetal.,1993；Melchingeretal.,1990)。迄今，共有8个抗根肿病基因定位于大白菜不同连锁群(Hiraietal.，2004；Piaoetal.，2004；Suwabeetal.，2006；Hayashidaetal.，2008；Sakamotoetal.，2008)。Piao等(2004)利用两个侧翼标记TCR01和TCR09，将对根肿病生理小种2、4和8表现抗性的CRb基因定位于A03连锁群，标记间的遗传距离为2.9cM。2个侧翼标记同时应用可以显著提高选择的准确性，并且共显性标记TCR01能够准确鉴定出纯合抗性植株(Piao等，2007)。朴钟云等(2010)以具有抗根肿病基因CRb的大白菜‘CRShinkiiDH’为抗源，通过连续多代选择筛选出全部恢复‘BJN3’基因组的9株近等基因系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴别大白菜是否为抗根肿病的大白菜。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种鉴别大白菜根肿病抗性的分子标记，该分子标记在大白菜A03染色体上，由201个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQIDNo.1的第32-232位所示。
本发明根据上述鉴别大白菜根肿病抗性的分子标记还开发了特异引物对，由正向引物和反向引物组成。
上述正向引物为如下a1)或a2)：
a1)SEQIDNo.2所示的单链DNA分子。
a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
上述反向引物为如下b1)或b2)：
b1)SEQIDNo.3所示的单链DNA分子。
b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
其中，上述一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变为所述单链DNA分子3’末端碱基之外一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变。
本发明根据上述鉴别大白菜根肿病抗性的分子标记还开发了一种鉴别或辅助鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的方法。
上述方法包括如下步骤：以待鉴别大白菜的基因组DNA为模板，以SEQIDNo.2所示的单链DNA为正向引物，SEQIDNo.3所示的单链DNA为反向引物，进行扩增，检测扩增产物的大小，根据扩增产物的大小按照下述方法确定所述待鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜：如果所述待鉴别大白菜的扩增产物中含有大小为201bp的条带，所述待鉴别大白菜为抗根肿病大白菜或候选抗根肿病大白菜；如果所述待鉴别大白菜的扩增产物中不含有大小为201bp的条带，所述待鉴别大白菜为非抗根肿病大白菜或非候选抗根肿病大白菜。
上述方法中，所述待鉴别大白菜的扩增产物中含有大小为201bp的条带为所述待鉴别大白菜的扩增产物中仅含有一条大小为201bp的条带或所述待鉴别大白菜的扩增产物中含有两条条带，所述两条条带中一条条带大小为201bp，另一条条带大小为237bp。
上述方法中，所述大小为201bp的条带为抗根肿病亲本大白菜带型；所述大小为237bp的条带为感根肿病亲本大白菜带型。
上述方法中，确定所述PCR扩增产物的大小是通过凝胶电泳实现的；所述凝胶电泳为2-3％的琼脂糖凝胶电泳，具体为2％、2.5％或3％的琼脂糖凝胶电泳。
本发明根据上述鉴别大白菜根肿病抗性的分子标记还开发了另一种鉴别或辅助鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的方法，为检测待鉴别大白菜的基因组DNA中是否含有SEQIDNo.1的第32-232位所示的201bp的DNA片段；如果待鉴别大白菜的基因组DNA中含有SEQIDNo.1的第32-232位所示的201bp的DNA片段，所述待鉴别大白菜为抗根肿病大白菜或候选抗根肿病大白菜；如果待鉴别大白菜的基因组DNA中不含有SEQIDNo.1的第32-232位所示的201bp的DNA片段，所述待鉴别大白菜为非抗根肿病大白菜或非候选抗根肿病大白菜。
上述方法中，所述检测待鉴别大白菜的基因组DNA中是否含有SEQIDNo.1的第32-232位所示的201bp的DNA片段的方法包括：以待鉴别大白菜的基因组DNA为模板，以SEQIDNo.2所示的单链DNA为正向引物，SEQIDNo.3所示的单链DNA为反向引物，进行PCR扩增，检测得到的扩增产物的序列。
上述方法中，检测所述得到的扩增产物的方法为测序。
上述方法中，所述扩增为PCR扩增。
在本发明实施例中，所述PCR扩增采用的PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸7min。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述方法的用途，所述用途为下述1)-4)中任意一种：
1)在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用；
2)在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用；
3)大白菜育种中的应用；
4)预测大白菜根肿病抗性中的应用。
本发明根据上述鉴别大白菜根肿病抗性的分子标记还开发了一种鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒中含有上述鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性的引物对。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述分子标记、上述引物对或上述试剂或试剂盒的用途，所述用途为下述A-F中任意一种：
A、在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用；
B、在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用；
C、大白菜育种中的应用；
D、预测大白菜根肿病抗性中的应用；
E、在制备鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性产品中的应用；
F、在制备预测大白菜根肿病抗性产品中的应用。
本发明中所涉及的大白菜根肿病是由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)所引起的；所述芸薹根肿菌具体为芸薹根肿菌2号生理小种和/或芸薹根肿菌7号生理小种。
本发明所涉及的抗病亲本为大白菜“CR-为民A”，感病亲本为大白菜“北京新3号”。
本发明所涉及的待鉴别大白菜为CR-为民A×北京新3号和/或北京新3号×CR-为民A的杂交后代中的F2及其以后世代的家系。
实验证明，利用本发明所提供的分子标记与其对应的引物对对大白菜根肿病抗性的鉴定结果与利用常规检测方法的鉴定结果完全一致。表明，可利用本发明所提供的分子标记与其对应的引物对大白菜根肿病抗性进行鉴定，也可用选育大白菜根肿病抗病品种。本发明的优点是分子标记为共显性，鉴定结果准确可靠、省时省力、降低了劳动成本，本发明的应用将对加快大白菜抗根肿病育种进程起到重要作用。
附图说明
图1为不同来源的芸薹根肿菌对大白菜根肿抗、感亲本及BC2F2群体的表型鉴定结果。
a为云南通海菌源抗、感亲本鉴定结果(左边为感病亲本，右边为抗病亲本，下同)；b为沈阳新民菌源抗、感亲本鉴定结果；c为大连水师营菌源抗、感亲本鉴定结果；d为云南通海菌源在部分BC2F2群体上的表型鉴定结果。
图2为大白菜根肿病抗、感亲本及BC2F2群体的PCR扩增产物电泳图。
a为接种云南通海菌源的BC2F2群体的扩增产物的部分电泳结果(第1泳道为抗病亲本，第2泳道为感病亲本，下同)；b为接种沈阳新民菌源的BC2F2群体的扩增产物的部分电泳结果；c为接种大连水师营菌源的BC2F2群体的扩增产物的部分电泳结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大白菜“CR-为民”公众可从北京市农林科学院所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
大白菜“北京新3号”公众可从北京市农林科学院所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
Williams鉴别系统的4个鉴别寄主分别为结球甘蓝JerseyQueen(JQ)和BadgerShipper(BS)，甘蓝型油菜Laurentian(LT)和Wilhelmsburger(WB)。
实施例1、芸薹根肿菌生理小种的鉴定
采用Williams鉴别系统对采自云南通海、沈阳新民以及大连水师营大白菜产区的芸薹根肿菌进行生理小种鉴定，接种、调查及生理小种鉴定方法参照文献“汪维红等(2013)，湖北省长阳县十字花科蔬菜根肿病菌生理小种鉴定及抗源筛选，中国蔬菜”中所记载的方法进行。结果表明(表1)：来自云南通海的大白菜根肿病的病原菌为芸薹根肿菌7号生理小种，来自沈阳新民和大连水师营的大白菜根肿病的病原菌为芸薹根肿菌2号生理小种。
表1：不同来源的芸薹根肿菌的小种鉴定结果
注：+代表感病反应(病情指数≥10)；-代表感病反应(病情指数＜10)。
实施例2、大白菜根肿病抗病亲本以及BC2F2群体的获得
一、大白菜根肿病抗病亲本“CR-为民A”的获得
通过大白菜杂交种“CR-为民”自交分离获得连续6代对芸薹根肿菌2号和7号生理小种均呈现抗性的抗大白菜根肿病自交系“CR-为民A”。
二、BC2F2群体的获得
以大白菜“CR-为民A”为抗病亲本(母本)，大白菜“北京新3号”为感病亲本(父本)进行杂交，收获F1代种子。种植F1代种子，获得F1代大白菜植株，将F1代大白菜与感病亲本“北京新3号”进行回交，收获BC2F2群体种子。
实施例3、BC2F2群体大白菜根肿病表型鉴定以及分子标记验证
一、BC2F2群体大白菜根肿病抗性表型鉴定
以实施例2获得的BC2F2群体为材料，播种后分别接种来源于云南通海、沈阳新民以及大连水师营的芸薹根肿菌，接种和调查方法参照文献“汪维红等(2013)，湖北省长阳县十字花科蔬菜根肿病菌生理小种鉴定及抗源筛选，中国蔬菜”中所记载的方法进行。按0、1、2、3、4病情分级标准调查病情，并计算病情指数(病情指数＝∑(病级的代表值×该病发病株数)/调查总株数×4(划分级别的最高级代表值)×100)，根据病情指数确定BC2F2代单株大白菜对根肿病的抗性。结果表明：接种来源于云南通海的芸薹根肿菌(芸薹根肿菌7号生理小种)的95株BC2F2代大白菜植株中，37株表现为抗病，58株表现为感病；接种来源于沈阳新民的芸薹根肿菌(芸薹根肿菌2号生理小种)的119株BC2F2代大白菜植株中，60株表现为抗病，59株表现为感病；接种来源于大连水师营的芸薹根肿菌(芸薹根肿菌2号生理小种)的122株BC2F2代大白菜植株中，60株表现为抗病，62株表现为感病(图1d和表2)。
二、BC2F2群体大白菜根肿病抗性的分子标记验证
采用CTAB法分别提取抗病亲本大白菜“CR-为民A”、感病亲本大白菜“北京新3号”以及步骤一中分别接种了来源于云南通海、沈阳新民以及大连水师营的芸薹根肿菌的BC2F2群体单株大白菜的基因组DNA。
以上述DNA为模板，利用特异引物对Indel1409-3进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。特异引物对Indel1409-3由F和R这两条单链DNA组成，其序列如下：
F：5’-gtgacagggcctttgaaaga-3’(SEQIDNo.2)；
R：5’-gcaaggctatttccaccagg-3’(与SEQIDNo.3)。
其中，20μL的PCR体系包括：2.0μL10×PCRBuffer(购自TaKaRa公司，产品目录号为9151A)、0.8μLdNTPs(每种2.5mM)(购自TaKaRa公司，产品目录号为D4030A)、浓度均为10μmol/L的上述的两条引物各1.0μL、0.2μLTaqDNApolymerase(浓度为5U/μL)(购自TaKaRa公司，产品目录号为R001)、1.0μL模板DNA(200ng/μL)和14μLddH2O。
PCR扩增程序为:94℃预变性5min；94℃变性40s,56℃复性40s,72℃延伸40s,35个循环；72℃延伸7min。
对PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，120v电泳30min，EB染色后用凝胶成像系统观察结果。其中，感病亲本仅扩增出一条大小为237bp的条带，记为a型条带；抗病亲本仅扩增出一条大小为201bp的条带，记为b型条带；同时扩增出双亲条带(一条大小为237bp的条带和一条大小为201bp的条带)记为ab型条带。结果表明：接种来源于云南通海的芸薹根肿菌(芸薹根肿菌7号生理小种)的95株BC2F2代大白菜植株中，表型鉴定为抗病的37株大白菜中均扩增到含有抗病亲本的b型条带，其中17株大白菜中扩增到仅含有抗病亲本的b型条带，20株大白菜中扩增到含有双亲亲本的ab型条带；表型鉴定为感病的58株大白菜扩增到仅含有感病亲本的a型条带(图2a和表2)。接种来源于沈阳新民的芸薹根肿菌(芸薹根肿菌2号生理小种)的119株BC2F2代大白菜植株中，表型鉴定为抗病的60株大白菜中均扩增到含有抗病亲本的b型条带，其中27株大白菜中扩增到仅含有抗病亲本的b型条带，33株大白菜中扩增到含有双亲亲本的ab型条带；表型鉴定为感病的59株大白菜中均扩增到仅含有感病亲本的a型条带(图2b和表2)。接种来源于大连水师营的芸薹根肿菌(芸薹根肿菌2号生理小种)的122株BC2F2代大白菜植株中，表型鉴定为抗病的60株大白菜均扩增到含有抗病亲本的b型条带，其中30株大白菜中扩增到仅含有抗病亲本的b型条带，30株大白菜中扩增到含有双亲亲本的ab型条带；表型鉴定为感病的62株大白菜中均扩增到仅含有感病亲本的a型条带(图2c和表2)。由此可知，利用特异引物对Indel1409-3PCR扩增鉴定分别接种来自云南通海的芸薹根肿菌、自大连水师营的芸薹根肿菌和来自沈阳新民的芸薹根肿菌BC2F2群体单株大白菜的抗性结果与表型鉴定结果吻合率达到100％(表2)。
表2：特异引物对Indel1409-3对不同菌源根肿病抗性的验证结果
对抗大白菜根肿病的BC2F2代大白菜植株的PCR扩增产物中的b型条带(201bp的DNA)进行测序。结果表明：b型条带(201bp的DNA片段)均含有SEQIDNo.1的第32-232位所示的核苷酸序列。对感大白菜根肿病的BC2F2代大白菜植株的PCR扩增产物中的a型条带(237bp的DNA)进行测序。结果表明：a型条带(237bp的DNA片段)均不含有SEQIDNo.1的第32-232位所示的核苷酸序列。
由此可知，利用SEQIDNo.1的第32-232位所示的核苷酸序列及其引物对对大白菜根肿病的鉴定结果与表型鉴定结果一致。表明，SEQIDNo.1的第32-232位所示的核苷酸序列与大白菜的根肿病抗性是连锁标记的，可利用该核苷酸序列及其引物对对大白菜的根肿病抗性进行辅助鉴定。

Claims (10)

1.鉴别或辅助鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的方法，包括以待鉴别大白菜的基因组DNA为模板，以SEQIDNo.2所示的单链DNA为正向引物，SEQIDNo.3所示的单链DNA为反向引物，进行扩增，检测扩增产物的大小，根据扩增产物的大小按照下述方法确定所述待鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜：
如果所述待鉴别大白菜的扩增产物中含有大小为201bp的条带，所述待鉴别大白菜为抗根肿病大白菜或候选抗根肿病大白菜；如果所述待鉴别大白菜的扩增产物中不含有大小为201bp的条带，所述待鉴别大白菜为非抗根肿病大白菜或非候选抗根肿病大白菜。
2.鉴别或辅助鉴别大白菜是否为抗根肿病大白菜的方法，包括检测待鉴别大白菜的基因组DNA中是否含有SEQIDNo.1的第32-232位所示的201bp的DNA片段；如果所述待鉴别大白菜的基因组DNA中含有SEQIDNo.1的第32-232位所示的201bp的DNA片段，所述待鉴别大白菜为抗根肿病大白菜或候选抗根肿病大白菜；
如果所述待鉴别大白菜的基因组DNA中不含有SEQIDNo.1的第32-232位所示的201bp的DNA片段，所述待鉴别大白菜为非抗根肿病大白菜或非候选抗根肿病大白菜。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述检测待鉴别大白菜的基因组DNA中是否含有SEQIDNo.1的第32-232位所示的201bp的DNA片段的方法包括：以待鉴别大白菜的基因组DNA为模板，以SEQIDNo.2所示的单链DNA为正向引物，SEQIDNo.3所示的单链DNA为反向引物，进行扩增，检测得到的扩增产物的序列。
4.权利要求1-3任一所述的方法的用途，所述用途为下述1)-4)中任意一种：
1)在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用；
2)在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用；
3)大白菜育种中的应用；
4)预测大白菜根肿病抗性中的应用。
5.鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性的引物对，由正向引物和反向引物组成；
所述正向引物为如下a1)或a2)：
a1)SEQIDNo.2所示的单链DNA分子；
a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；
所述反向引物为如下b1)或b2)：
b1)SEQIDNo.3所示的单链DNA分子；
b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。
6.含有权利要求5所述引物对的鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性的试剂或试剂盒。
7.SEQIDNo.1的第32-232位所示的201bp的DNA片段。
8.权利要求4所述的引物对、权利要求5所述的试剂或试剂盒或权利要求6所述的DNA片段的用途，所述用途为下述A-F中任意一种：
A、在鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性中的应用；
B、在选育大白菜根肿病抗病品种中的应用；
C、大白菜育种中的应用；
D、预测大白菜根肿病抗性中的应用；
E、在制备鉴别或辅助鉴别大白菜根肿病抗性产品中的应用；
F、在制备预测大白菜根肿病抗性产品中的应用。
9.根据权利要求1-3任一所述的方法、权利要求5所述的引物对、权利要求6所述的试剂或试剂盒或权利要求4或8所述的应用，其特征在于：所述大白菜根肿病是由芸薹根肿菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)所引起的。
10.根据权利要求1-3任一所述的方法、权利要求5所述的引物对、权利要求6所述的试剂或试剂盒或权利要求4或8所述的应用，其特征在于：所述待鉴别大白菜为CR-为民A×北京新3号和/或北京新3号×CR-为民A的杂交后代中的F2及其以后世代的家系。
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