CN103320437B - 稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP及制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP及制备与应用。该分子标记Pi2SNP是通过引物对F1和R1从携带有稻瘟病抗性基因Pi2的稻瘟病抗性品种的总DNA中扩增出来得到核苷酸片段I；用限制性内切酶Pst？I或Hinf？I对前述核苷酸片段I进行酶切后，所获得的与稻瘟病抗性基因Pi2呈特异性带型的核苷酸片段II。该分子标记是第一个针对Pi2基因内部序列所开发的Pi2基因特异性SNP标记，具有如下优点：特异性高；在实际应用中，低成本、高通量；能广泛应用于遗传背景不同的群体中。利用该分子标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

Description

稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP及制备与应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及稻瘟病技术领域，特别涉及一种稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP及制备与应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由稻瘟病菌（Magnapothe oryzae）引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业可持续发展的观点来看，选育与利用抗病品种是防治稻瘟病最安全有效的方法。此外，由于稻瘟病生理小种致病性变异频繁，导致单一抗性品种的抗性会在种植后的3～5年时间里逐渐丧失（殷得所等2011），因此，挖掘和合理利用广谱抗性基因是获得持久、广谱抗病品种的重要途径。传统的水稻抗性育种依赖于抗性表型的鉴定，这不仅要求育种者具备丰富的经验及敏锐的观察力，而且鉴定结果也极易受到环境及人为因素的影响，从而导致降低了目标抗性基因的选育效率。随着分子标记技术的产生及发展，其便捷、直接、不受环境影响等优点使其应用价值及前景越来越受到关注。为了能更好地开展稻瘟病抗性育种工作，研究者们对水稻稻瘟病抗性分子机理进行了大量的研究，并开发得到了一批与主效抗性基因紧密连锁的DNA分子标记（Hittalmani et al.,2000；Jena and Mackill,2008），DNA分子标记在抗性基因的定位以及基于分子标记辅助选择（MAS）技术的抗性育种工作中起着越来越重要的作用。然而与目的基因紧密连锁的分子标记在应用过程中有可能受到遗传背景的限制，在不同的群体中需对亲本的多态性进行检测；此外，在减数分裂过程中，该类型的分子标记仍然存在着因染色体发生交换而失去了与目的基因紧密连锁关系的可能性，这使得在目的基因鉴定过程中会出现错选或漏选的情况（Hayashi et al.,2006；Ingvardsen et al.,2008）。同时，越来越多的研究表明，同一个抗性位点存在着多个抗谱不同的功能性等位基因，它们在序列上高度相似（Zhou et al.,2006;Ashikawa et al.,2008;Yuan et al.,2011;Zhai et al.,2011;Hua et al.,2012），因此，在基因聚合工作中，与目的基因紧密连锁的分子标记很难对功能性等位基因进行准确的鉴定与筛选。然而，基于基因内部序列所开发的基因特异性分子标记可以使上述问题得到有效的解决，从而提高抗性基因的利用效率，加快稻瘟病抗性育种的步伐。

到目前为止，至少有9个稻瘟病抗性基因（Pi2,Piz,Piz-t,Pi40,Pigm,Pi9,Pi26,Pi50,Pi2-2）已经被定位在水稻第6染色体短臂端的Pi2/9基因簇内，这些基因都被认为是稻瘟病广谱抗性基因，在稻瘟病抗性育种方面具有重要的应用价值（Jiang et al.2012），其中Pi9、Pi2以及Piz-t已经被成功克隆（Qu et al.2006,Zhou et al.2006）。研究结果表明，Pi2和Piz-t在氨基酸水平上只存在着8个氨基酸残基的差异，二者与Pi9相比，氨基酸序列一致性分别都高达96%（Qu etal.,2006;Zhou et al.,2006）。随着测序技术的发展，人们已经开发出一些与Pi2连锁的基于PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术的分子标记（Hittalmani et al.,2000;Tacconi et al.,2010;Jiang et al.,2012），并将这些标记应用到抗性基因Pi2的筛选工作中。然而，这些标记位于抗性基因Pi2的侧翼，与目标基因存在着一定的物理距离，因此，在减数分裂过程中存在着与目标基因发生交换的风险，在抗性育种工作中容易发生错选或漏选的情况。为了能更准确有效地将稻瘟病广谱抗性基因Pi2应用到水稻抗性育种项目中，有必要在Pi2的基因内部开发出Pi2特异的分子标记。

发明内容

为了能更快、更有效地将稻瘟病抗性基因Pi2应用到抗性育种项目中，本发明的首要目的在于提供一种稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP。该分子标记Pi2SNP基于基因序列单碱基差异（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）研究得到，其能提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

本发明的另一发明目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP的制备方法。

本发明的再一发明目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP，是通过引物对F1和R1从携带有稻瘟病抗性基因Pi2的稻瘟病抗性品种的总DNA中扩增出来得到核苷酸片段I；用限制性内切酶Pst I或Hinf I对前述核苷酸片段I进行酶切后，所获得的与稻瘟病抗性基因Pi2呈特异性带型的核苷酸片段II；

F1：5’-TACTCTTCGTTGTATAGGAC-3’；

R1：5’-GGAGGAGGAGATGAAATAGAATC-3’；

所述的携带有稻瘟病抗性基因Pi2的稻瘟病抗性品种优选为水稻抗病品种C101A51；

所述的核苷酸片段I的序列如下：

TACTCTTCGTTGTATAGGACAGTTTCATTATGACAACTTTAGTCTAAACCACCCAATGAAGTGCATAACTAACACAATATGCCTGCCTAAAGTATTCACACCTTTAGTTAGTCGCGATGATCGTGCAAAACAAATTGCTGAATTGCACATGGCCACCAAAAGTTGCTGGTCTGAATCAATCGGTGTGAAGGTACCCAAAGGAATAGGTAAGTTGCGAGACTTGCAGGTTCTAGAGTATGTAGATATCAGGCGGACCAGTAGTAGAGCAATCAAAGAGCTGGGGCAGTTAAGCAAGCTGAGGAAATTAGGTGTGACAACAAACGGGTCGACAAAGGAAAAATGTAAGATACTTTATGCAGCCATTGAGAAGCTCTCTTCCCTCCAATCTCTCCATGTGGATG GAATCTCAGATGGTGGAACACTTGAGTGCCTAGATTCTATTTCATCTCCTCCTCC；

方框所圈住的位点为Pst I酶切位点；下划线的位点为Hinf I酶切位点；

所述的与稻瘟病抗性基因Pi2呈特异性带型的核苷酸片段II具体如下：

①用限制性内切酶Pst I酶切核苷酸片段I后，得到分子量大小分别为406bp和56bp的核苷酸片段；在实际应用时，只需检测到406bp的核苷酸片段即可；

②用限制性内切酶Hinf I酶切核苷酸片段I后，得到分子量大小分别为22bp、32bp、173bp和235bp的核苷酸片段；在实际应用时，只需检测到235bp的核苷酸片段即可；

所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP的制备方法，包含以下步骤：

（1）通过多序列比对软件工具，对已经公开发表的Pi2、Piz-t及Pi9的编码区进行核苷酸序列比对，筛查Pi2特异的、能区别于该位点其他稻瘟病抗性等位基因的特异性单碱基（SNP）差异位点；

（2）利用步骤（1）获得的SNP信息，在该SNP上游400bp处设计基因特异性上游引物，在该SNP下游50bp处设计基因特异性下游引物，引物对碱基序列如下：

F1：5’-TACTCTTCGTTGTATAGGAC-3’；

R1：5’-GGAGGAGGAGATGAAATAGAATC-3’；

（3）以携带有稻瘟病抗性基因Pi2的稻瘟病抗性品种的总DNA为模板，进行PCR扩增，所获得的PCR产物经限制性内切酶Pst I或Hinf I酶切后，得到与稻瘟病抗性基因Pi2呈特异性带型的核苷酸片段，即为稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP；

所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用，特别适合于在鉴别Pi2/9基因簇区域不同的稻瘟病抗性基因的应用；优选包含如下步骤：

（1）扩增：利用引物F1和R1对待检测的水稻品种的基因组进行PCR，PCR结果如下：

①若PCR结果为阴性，则待检测的水稻品种没有携带有稻瘟病抗性基因Pi2；

②若PCR结果为阳性，即得到PCR产物，进行下一步检测；

（2）检测：用如下步骤①或/和②进行检测：

①用限制性内切酶Pst I酶切步骤（1）得到的PCR产物，检测到分子量大小为406bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有稻瘟病抗性基因Pi2；若没有检测到分子量大小为406bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种没有携带有稻瘟病抗性基因Pi2；

②用限制性内切酶Hinf I酶切步骤（1）得到的PCR产物，检测到分子量大小为235bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有稻瘟病抗性基因Pi2；若没有检测到分子量大小为235bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种没有携带有稻瘟病抗性基因Pi2。

本发明的原理：SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）是指基因组同一位点不同等位基因之间由单个核苷酸差异所引起的DNA序列多态性。SNP在基因组中数量多，分布广，为分子标记的开发提供重要的资源。通过常规PCR扩增结合限制性内切酶酶切的方法来实现SNP的检测大大地扩展了SNP位点检测的实用性，其在检测成本上远远低于荧光显色、测序等等。限制性内切酶可以识别DNA的特异序列，并能够在识别位点对双链DNA进行切割，当识别位点发生突变时，限制性内切酶则因无法识别突变的位点而不能完成对双链DNA的切割。基于这一原理，本发明发明人通过巧妙地在设计特异扩增引物获得包含有待检测SNP的扩增片段，然后利用特定的限制性内切酶对PCR产物进行酶切，验证并获得本发明所提供的分子标记。本发明通过多序列比对的方法得到Pi2基因序列上出现的4个特异性SNP，并利用DNAStar里的MapDraw对Pi2、Piz-t以及Pi9相应区域的基因序列进行酶切位点分析，发现Pi2的这4个SNP可与相邻碱基构成2个特异的限制性内切酶识别位点（Pst I与Hinf I），而Piz-t与Pi9则在相应区域缺少这2个酶切位点。也就是说，在带有Pi2的水稻品种中该片段上含有3个Hinf I识别位点（位于第173bp、408bp及440bp处）和1个Pst I识别位点（位于第406bp处），没有Pi2的水稻品种中该片段上只含有2个Hinf I识别位点（位于第173bp及440bp处）。基于此，本发明发明人在这4个SNP的上下游设计引物并获得扩增片段，利用Pst I与Hinf I对扩增产物进行酶切，凡是携带有Pi2的水稻品种，所用的限制性内切酶Pst I与Hinf I都能对其扩增产物进行切割，反之则不能完成切割，而聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果则以低带/高带的形式呈现。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明提供的分子标记特异性高：Pi2所在的基因组区域存在着9个具有抗性基因特征的候选基因，这些候选基因在序列上高度同源，彼此之间在核苷酸水平上的序列一致性可高达95.6%（Zhou et al.,2006.The genomicdynamics and evolutionary mechanism of the Pi2/9locus in rice.MPMI,20:63-71.）；该位点上已经克隆的稻瘟病抗性基因有Pi9、Pi2和Piz-t，其中，Pi2和Piz-t属于抗谱不同的抗性等位基因，两者在氨基酸水平上只存在8个氨基酸的差异；而Pi2与Pi9在氨基酸水平上的序列一致性高达96%（Zhou et al.,2006.The eight amino-acid differences within three leucine-rich repeats between Pi2andPiz-t resistance proteins determine the resistance specificity to Magnaporthe grisea.MPMI,19:1216-1228.）。本发明提供的分子标记经过优化得到，能明显地将Pi2与存在于该基因组区域内与Pi2高度同源的旁系同源基因进行区分；也能能成功区分Pi2、Piz-t、Pi9以及被定位在Pi2/9位点上的其它稻瘟病抗性基因。

（2）本发明提供的分子标记在实际应用中，低成本、高通量：目前，检测SNP的方法有测序法、荧光检测法、DNA芯片、质谱检测法等，而这些方法大部分成本高，速度慢。本发明提供的分子标记只需PCR结合酶切，成本低、通量高、加上特异性高（即准确度高），特别适用于生产实践中。

（3）本发明是第一个针对Pi2基因内部序列所开发的Pi2基因特异性SNP标记。本发明能通过电泳检测的方法成功地将Pi2与定位在该位点上的其它稻瘟病抗性基因（Piz-t,Pi9,Piz,Pi50,Pi26,Pigm）区分开，到目前为止，还没有有关这类标记的报道。本发明可应用于Pi2转基因鉴定，基因聚合（尤其是序列高度同源的等位基因的聚合，这是现有的与Pi2连锁的分子标记所无法实现的）以及基于MAS技术的水稻抗性育种工作中。该标记存在于Pi2基因内部，因此对Pi2的筛选能力理论值可达100%，这样的筛选能力优于已报道的与Pi2连锁的分子标记。

（4）本发明提供的分子标记能广泛应用于遗传背景不同的群体中。现有的与Pi2连锁的分子标记大部分都是针对同一个群体2个不同亲本的序列多态性所开发的，这些标记在其它群体中的适用性有限。本发明所提供的Pi2特异性分子标记Pi2SNP适用于任何遗传背景下的转基因育种、基因聚合以及基于MAS技术的抗性育种，而无需重复进行亲本多态性的筛选，大大提高了育种效率。

因此，本发明所提供的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记具有重要的应用价值，利用此标记可以提高该基因在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种，以及转基因育种中利用的效率。

附图说明

图1是Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP在Pi2/9基因簇区域不同稻瘟病抗性基因的验证结果图，其中：泳道M为DNA ladder，泳道1～9的DNA模板依次为抗性品种C101A51(Pi2)、抗性品种IRBLzt-T(Piz-t)、抗性品种IRBL9-W(Pi9)、抗性品种IRBLz-Fu（Piz）、抗性品种28占(Pi50)、抗性品种谷梅2号(Pi26)、抗性品种谷梅4号(Pigm)、感病品种日本晴（Nip）、感病品种LTH；图a为使用PstI酶切得到的结果图，图b为使用Hinf I酶切得到的结果图。

图2是Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP在华南地区其它水稻品种中的验证结果图，其中：泳道M为DNA ladder，泳道1～16的DNA模板依次为抗性基因供体品种C101A51(Pi2)、感病品种LTH、感病品种日本晴(Nip)、珍汕97B、谷丰B、五丰B、天丰B、协青早B、地谷B、福伊B、广恢880、巴太香占、华航丝苗、抗白香占、丰八占、马坝银占；图a为使用PstI酶切得到的结果图，图b为使用Hinf I酶切得到的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记及其引物设计与检测

（1）Pi2特异性单碱基差异（SNP）位点的分析：

通过多序列比对软件工具，对已经公开发表的Pi2、Piz-t及Pi9（Genebank收录号分别为：DQ352453，DQ352040，DQ285630）的编码区进行核苷酸序列比对，筛查Pi2特异的、能区别于该位点其他稻瘟病等位抗性基因的特异性单碱基（SNP）差异位点。具有基因特异性SNP的水稻稻瘟病抗性基因Pi2与Pi9、Piz-t的多序列结果如下所示：

                        Pst I     Hinf I

Pi2:CCTCCAATCTCTCCATGTGGATGCTGC A TCTCAG；

Pi9:CCTCCAATCTCTCTATGTGAATGCTGCGTTATTATCAG；

Piz-t:CCTCCAATCTCTCCATGTGGATGCTGTGTTATTCTCAG；

其中，加粗斜体所示的核苷酸即为鉴定到的Pi2基因特异性单碱基差异（SNP），下划线所示为由这些SNP所产生的酶切位点（碱基上方所示为能识别这些酶切位点的限制性内切酶名称）；

（2）设计引物：

在该SNP上游400bp处设计基因特异性上游引物，在该SNP下游50bp处设计基因特异性下游引物，引物对碱基序列如下所示：

F1：5’-TACTCTTCGTTGTATAGGAC-3’；

R1：5’-GGAGGAGGAGATGAAATAGAATC-3’。

（3）选择水稻代表品种：

选择携带有Pi2基因以及Pi2/9基因簇等位基因的代表品种如下：

水稻品种C101A51，为Pi2供体品种（在文献“Inukai et al.,1994.Allelism ofblast resistance genes in near-isogenic lines of rice.Phytopathology,84：1278-1283”中公开），为阳性对照；

水稻品种IRBLzt-T，为Piz-t供体品种（在文献“Zhou et al.,2006.The eightamino-acid differences within three leucine-rich repeats between Pi2and Piz-tresistance proteins determine the resistance specificity to Magnaporthe grisea.MPMI,19:1216–1228”中公开）；

水稻品种IRBL9-W，为Pi9供体品种（在文献“Tsunematsu et al.,2000.Development of monogenic lines of rice for blast resistance.Breed Sci,50:229-234”中公开）；

水稻品种IRBLz-Fu，为Piz供体品种（在文献“Kobayashi et al.,2007.Development of new sets of international standard differential varieties for blastresistance in rice(Oryza saliva L.).JARQ,41:31-37”中公开）；

水稻品种28占，为Pi50供体品种（在文献“Zhu et al.,2012.The identificationof Pi50(t),a new member of the rice blast resistance Pi2/9multigene family.TAG,124:1295–1304”中公开）；

水稻品种谷梅2号，为Pi26供体品种（在文献“Wu et al.,2005.Genetic controlof rice blast resistance in the durably resistant cultivar Gumei2against multipleisolates.Theor Appl Genet,111:50–56”中公开）；

水稻品种谷梅4号，为Pigm 供体品种（在文献“Deng et al.,2006.Geneticcharacterization and fine mapping of the blast resistance locus Pigm(t) tightly linked toPi2and Pi9in a broad-spectrum resistant Chinese variety. Theor Appl Genet,113:705–713”中公开）；

感病对照品种：日本晴；日本晴是日本选育的一个品种，通过国际水稻研究所（http://www.irri.org）的国际共享种质资源库可免费获得。

感病对照品种：丽江新团黑谷（LTH，在文献“凌忠专等2001.水稻品种丽江新团黑谷普感特性的研究和利用.中国农业科学,34:1-4”中公开）。

（4）PCR扩增，获得含有Pi2基因特异性SNP的片段

利用上述引物对F1和R1，以上述水稻品种的总DNA（使用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒抽提得到，BioTeke,cat#DP3112）为模板，进行常规PCR扩增，扩增得到的片段大小为462bp。使用限制性内切酶Pst I酶切后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到的结果如图1a所示；使用限制性内切酶Hinf I酶切后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，得到的结果如图1b所示。

扩增反应体系如下：

10×PCR buffer (Mg²⁺Plus)：2μl

dNTPs(2.5mM each)：       1.6μl

引物F1(10μM)：           1μl

引物R1(10μM)：           1μl

TaKaRa Taq^TM(5U/μl)：     0.1μl

DNA模板（20-50ng/μl）：  1μl

ddH₂O：补足至20μl。

PCR温度循环条件如下：94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。

PCR反应结束后，利用限制性内切酶PstI或HinfI对所获得的PCR产物进行酶切，反应体系如下：

10×H buffer：1.2μl

PCR产物：5μl

Pst I/Hinf I：0.3μl

ddH₂O：补足至12μl。

在37℃条件下酶切3小时后，取适量酶切样品在8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为120V，2小时。

其中，图1的泳道1为Pi2供体品种水稻品种C101A51基因组为模板PCR得到的片段再经酶切得到核酸片段，呈现的是与稻瘟病抗性基因Pi2呈特异性带型，即泳道1为Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP。图1的结果显示，Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP既能区分抗感等位基因，又能区分Pi2/9位点上所鉴定到的其它抗性基因。也就是说，凡是携带有Pi2的水稻品种，其PCR扩增产物可以被Pst I或Hinf I酶切，电泳检测以低带（分子量大小分别为406bp（图1a泳道1）、235bp（图1b泳道1））呈现，而在Pi2/9位点上所定位的其它稻瘟病抗性基因以及感病等位基因因不存在这个单碱基差异而缺少一个可以被Pst I或Hinf I识别并酶切的位点，电泳检测以高带（分子量大小分别为462bp（图1a泳道2～9）、267bp（图1b泳道2～9））。

实施例2：抗性基因Pi2基因特异性分子标记在鉴别Pi2/9基因簇区域不同稻瘟病抗性基因的应用。

根据多态性的PCR产物条带，可以把含有目标基因Pi2与其它Pi2/9基因簇上的抗性基因区分开来。如图1所示，根据条带位置可以将Pi2与该位点所鉴定到的其它抗性基因区分开来，PstI酶切后核苷酸片段大小为406bp或是Hinf I酶切核苷酸片段大小为235bp表示含有Pi2基因，PstI酶切后核苷酸片段大小不为406bp或是Hinf I酶切核苷酸片段大小不为235bp则表示不含有Pi2基因。可见试验结果与设计分析的相吻合，说明抗性基因Pi2基因特异性分子标记特异性强，可在鉴别Pi2基因与Pi2/9基因簇等位基因等方面得到应用。

实施例3：抗性基因Pi2基因特异性分子标记在华南地区其它水稻品种中的检测应用

选择13个华南地区重要水稻品种，依次为：珍汕97B、谷丰B、五丰B、天丰B、协青早B、地谷B、福伊B、广恢880、巴太香占、华航丝苗、抗白香占、丰八占、马坝银占。

珍汕97B已在文献“李道品等,珍汕97B改良新不育系与珍汕97A的制种产量比较研究.杂交水稻，2012年03期，第28页-29页”中公开；

谷丰B和福伊B已在文献“黄利兴等,系列抗稻瘟病水稻亲本抗性基因的经典遗传学分析.福建农林大学学报(自然科学版)，2011年03期，第225页-230页”中公开；

五丰B已在文献“梁世胡等,优质高产抗病杂交籼稻五丰优2168的选育.农业科技通讯,2009,(7)：132-134”中公开；

天丰B已在文献“梁世胡等,高产优质杂交稻新组合天丰优3550的选育.广东农业科学,2007,(4):14-15”中公开；

协青早B已在文献“黄得润等，协青早B//协青早B/东乡野生稻BC1F5群体产量性状QTL分析.农业生物技术学报.2008,(6):977-982”中公开；

地谷B已在文献“雷捷成等,地谷A主要特性及利用技术.杂交水稻.1992,(4):32-35”中公开；

广恢880已在文献“梁世胡等,杂交稻稻米品质的遗传研究.广东农业科学2000年第5期，17-19”中公开；

巴太香占已在文献“张绍春等,特优高效香稻品种巴太香占1号的选育.广东农业科学.2002,(5):2-3”中公开；

华航丝苗已在文献“王慧等,优质高抗水稻新品种华航丝苗的选育.广东农业科学.2006，（9）：43-44”中公开；

抗白香占已在文献“曾列先等，广东水稻品种抗白叶枯病鉴定与评价.广东农业科学.2006，（5）：38-40”中公开；

丰八占已在文献“周少川,泰国丝苗型香稻品种——丰八占.广东农业科学.1999,(2):19”公开；

马坝银占已在文献“熊兆刚等,水稻“三控”施肥技术在曲江区的应用效果.广东农业科学.2009（3）：27-29”中公开。

分别提取上述水稻的基因组DNA，并以此为模板，按照实施例1的方法，进行PCR扩增、酶切及电泳检测。根据酶切产物（条带）的大小，可以把抗性基因Pi2与其他稻瘟病抗性基因区分开来。如图2所示，在抗谱表型为Pi2型的个体（携带有稻瘟病抗性基因Pi2的抗病品种C101A51，图2第1泳道）中能检测到Pi2SNP基因特异性分子标记的存在，而其他抗谱表型的个体则不能检测到该分子标记。可见，该Pi2基因特异性分子标记可在鉴别Pi2基因与其他稻瘟病抗性基因，包括Pi2/9基因簇等位基因等方面得到应用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP，其特征在于：是通过引物对F1和R1从携带有稻瘟病抗性基因Pi2的稻瘟病抗性品种的总DNA中扩增出来得到核苷酸片段I；

F1：5’-TACTCTTCGTTGTATAGGAC-3’；

R1：5’-GGAGGAGGAGATGAAATAGAATC-3’；

所述的携带有稻瘟病抗性基因Pi2的稻瘟病抗性品种为水稻抗病品种C101A51。

2.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)通过多序列比对软件工具，对已经公开发表的Pi2、Piz-t及Pi9的编码区进行核苷酸序列比对，筛查Pi2特异的、能区别于其他稻瘟病抗性等位基因的特异性单碱基差异位点；Pi2的编码区在Genebank中的收录号为DQ352453、Piz-t的编码区在Genebank中的收录号为DQ352040及Pi9的编码区在Genebank中的收录号为DQ285630；

其中，Pi2与Pi9、Piz-t的具有特异性单碱基差异位点的多序列结果如下所示：

Pi2:CCTCCAATCTCTCCATGTGGATGCTGCAG G AATCTCAG；

Pi9:CCTCCAATCTCTCTATGTGAATGCTGCGT T ATTATCAG；

Piz-t:CCTCCAATCTCTCCATGTGGATGCTGTGT T ATTCTCAG；

(2)利用步骤(1)获得的SNP信息，在该SNP上游400bp处设计基因特异性上游引物，在该SNP下游50bp处设计基因特异性下游引物，引物对碱基序列如下：

F1：5’-TACTCTTCGTTGTATAGGAC-3’；

R1：5’-GGAGGAGGAGATGAAATAGAATC-3’；

(3)以携带有稻瘟病抗性基因Pi2的稻瘟病抗性品种的总DNA为模板，进行PCR扩增，所获得的PCR产物为稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP。

3.权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用。

4.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用，其特征在于：所述的水稻品种稻瘟病抗性基因为Pi2/9基因簇区域不同的稻瘟病抗性基因。

5.根据权利要求3所述的稻瘟病抗性基因Pi2基因特异性分子标记Pi2SNP在鉴别水稻品种稻瘟病抗性基因的应用，其特征在于包括如下步骤：

(1)扩增：利用引物F1和R1对待检测的水稻品种的基因组进行PCR，PCR结果如下：

①若PCR结果为阴性，则待检测的水稻品种没有携带有稻瘟病抗性基因Pi2；

②若PCR结果为阳性，即得到PCR产物，进行下一步检测；

其中，引物序列如下：

F1：5’-TACTCTTCGTTGTATAGGAC-3’；

R1：5’-GGAGGAGGAGATGAAATAGAATC-3’；

(2)检测：用如下步骤①或/和②进行检测：

①用限制性内切酶Pst I酶切步骤(1)得到的PCR产物，检测到分子量大小为406bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有稻瘟病抗性基因Pi2；若没有检测到分子量大小为406bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种没有携带有稻瘟病抗性基因Pi2；

②用限制性内切酶Hinf I酶切步骤(1)得到的PCR产物，检测到分子量大小为235bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种携带有稻瘟病抗性基因Pi2；若没有检测到分子量大小为235bp的核苷酸片段，则待检测的水稻品种没有携带有稻瘟病抗性基因Pi2。