CN104611332B

CN104611332B - 水稻抗稻瘟病基因Piz‑t特异性SNP分子标记引物及应用

Info

Publication number: CN104611332B
Application number: CN201510039800.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡海亚; 游艾青; 徐得泽; 周雷; 程建平; 闸雯俊; 李三和; 焦春海
Original assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Current assignee: Hubei Academy Of Agricultural Sciences Institute Of Food Crops
Priority date: 2015-01-27
Filing date: 2015-01-27
Publication date: 2017-11-24
Anticipated expiration: 2035-01-27
Also published as: CN104611332A

Abstract

本发明公开了水稻抗稻瘟病基因Piz‑t特异性SNP分子标记引物及应用。申请人通过将不同等位基因测序及序列比对鉴定到一个Piz‑t特异性SNP位点并开发了一套鉴定该SNP的分子标记引物，分别为：AF：TTGCTGAGCCATTGTTAAACA；AR：ATGGCAAATGAACTAAAGG；GF：GGTCCTCTGCA TGGTATG；GR：AGGAGAGATAGAACATTGTTGTAAC。利用该引物对水稻DNA进行PCR扩增，可快速判断待测水稻Piz‑t的基因型。方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Piz‑t基因型鉴定。

Description

水稻抗稻瘟病基因Piz-t特异性SNP分子标记引物及应用

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及水稻抗稻瘟病基因Piz-t特异性SNP分子标记引物及应用，本发明提供的分子标记引物适于在水稻育种中对Piz-t基因型的大量筛选以及从水稻种质资源中筛选新的Piz-t基因型抗原。

技术背景

水稻稻瘟病是危害全球水稻生产最严重的3大病害之一，每年都会对水稻生产造成巨大的损失，通过选育抗性品种防治稻瘟病具有经济、有效与环保的优点，能有效地减少稻瘟病直接或间接带来的损失。然而在实际生产中，稻瘟病生理小种变异很快，含有单一抗性基因的抗性品种长期使用便会因为稻瘟病菌新的优势种群的出现而抗性渐失，因此，并利用分子标记辅助选择组装、聚合具有不同抗谱的抗性基因，培育广谱、持久抗性水稻品种成为解决问题的最佳途径。

Piz-t位于水稻6号染色体短臂(Zhou B,Qu SH,Liu GF et al.The Eight Amino-Aci d Differences Within Three Leucine-Rich Repeats Between Pi2and Piz-tResistance Protei ns Determine the Resistance Specificity to Magnaporthegrisea.MOL PLANT MICROBE I N,2006,19(11):1216-1228)，是一个具有对稻瘟病生理小种具有广谱抗性的基因，因此对于培育具有广谱抗性的水稻品种具有巨大的利用价值，但该基因所在位点具有多个对不同稻瘟病生理小种具有抗性的等位基因包括Pi9、Pi-z、Pi-2以及感病等位基因，因此对于该基因利用的前提是将它与其余等位基因区分开。目前等位性测定的方法是通过对含有不同等位基因的材料在温室内进行不同稻瘟病生理小种接种鉴定，根据它们的抗谱差异将不同等位基因区分开来，但这种方法存在实验周期长、复杂、繁琐，因此限制了它在育种中的应用。

分子标记是一种快速、简便、成本低廉并可在水稻生长早期进行无损检测的一种技术，但目前还没有对Piz-t等位基因鉴定的分子标记报导。本研究通过对含有不同等位基因材料目标位点利用染色体步移(Chromosome walking)技术通过大量测序以及序列比对鉴定到一个Piz-t基因型特异性SNP位点(Piz-t为A碱基，其余均为G碱基)，在两对交叉引物P CR(PCR with confronting two-pair primers，PCR-CTPP)方法的基础上加以改进创新，通过在内引物倒数第三位引入错配碱基，开发出鉴定该SNP位点不同碱基类型的共显性标记，如图1所示，通过设计4条引物(AF、AR、GF、GR)并利用待测品种基因组DNA进行PCR扩增，根据扩增条带类型鉴定Piz-t基因型，如果扩增出160bp条带则为纯合Piz-t基因型，其余等位基因类型扩增条带为221bp，而杂合型则同时具有两条条带，并且三者还会有一条331bp的共有条带。因此该方法简便快速、成本低廉，可广泛应用于分子标记辅助选择育种或者水稻种质资源Piz-t基因型鉴定。

发明内容

本发明的目的在于提供了水稻抗稻瘟病基因Piz-t特异性SNP分子标记引物，分别为：AF：TTGCTGAGCCATTGTTAAACA；AR：ATGGCAAATGAACTAAAGG；GF：GGTCC TCTGCATGGTATG；GR：AGGAGAGATAGAACATTGTTGTAAC。引物特异性好，扩增效率高，可用于水稻抗稻瘟病基因Piz-t的基因型鉴定。

本发明的另一个目的是提供了水稻抗稻瘟病基因Piz-t特异性SNP分子标记引物的应用，利用该引物可以有效的对抗稻瘟病基因Piz-t进行基因型选择，既可以用于水稻资源的筛选鉴定，又可以用于水稻抗稻瘟病基因Piz-t的分子育种。

为了实现上述目的，本发明采取了以下技术措施：

本发明技术方案采取以下思路：Piz-t位于水稻第6号染色体的短臂，cDNA全长3335b p，含有两个内含子，长度分别是3839bp和116bp，并且在该位点Piz-t还具有Pi9、Pi-z、P i-2这3个抗病等位等位基因以及1个没有功能的感病等位基因，因此通过寻找Piz-t特异性序列或碱基并设计引物进行PCR扩增是区分Piz-t与其余等位基因的最好方法。

通过对4个抗性等位基因及1个感病基因的基因组编码区进行序列比对并没有发现Piz-t特异性序列或者碱基，因此我们通过设计引物在Piz-t编码区的上下游通过Chromosome Walk ing的方法对Piz-t来源材料基因组进行了PCR扩增、测序，将获得序列首先与包含感病等位基因的材料Nipponbare及9311的对应序列进行比对(因为Nipponbare与9311是已测序品种，全基因序列均可获得)，对于具有差异序列的位点再利用包含其余3个等位基因的材料进行测序比对确认，最终在Piz-t下游15387bp处获得一个Piz-t特异性SNP位点，Piz-t等位基因型为A碱基，其余基因型均为G碱基；因此，通过设计特异性引物对该SNP位点特异性扩增即可实现Piz-t等位基因的鉴定。

引物设计原理如下(图1)：在设计A型等位基因鉴定引物时，根据PCR-CTPP方法原理，首先以该SNP位点的A碱基作为3’端在该位点上游设计正向引物AF(表1)，在下游设计反向引物AR，理论上AF的3’端的A碱基与A型等位基因材料正常结合扩增而与G型材料形成A/C错配无法扩增，而我们的实验结果表明该错配并不能区分两种基因型，在G型材料中也有较微弱的扩增，因此为增强该引物特异性我们在AF的倒数第三位引入了一个错配碱基A增强其特异性，结果表明该引物只有与A型等位基因材料扩增时有一条160bp条带，与G型材料没有条带扩增；同理，按照上述思路开发出扩增G型等位基因材料的GF与GR；4条引物名称、序列、Tm值及扩增片段长度见表1所示。

我们接着做了一个PCR扩增退火温度的梯度及引物浓度梯度测试(图2)，退火温度分别为55℃、57℃和59℃，由于PCR-CTPP方法中一般将外引物(即GF、AR)浓度设置为内引物(即GR、AF)浓度的一半，我们也设置了3个不同的引物浓度比：AF、AR、GF与GR浓度比分别为1:1:1:1、1.5:1:1:2以及2:1:1:1.5，结果表明在退火温度为55℃引物浓度比为1:1:1:1时扩增条带清晰。

水稻抗稻瘟病基因Piz-t特异性SNP分子标记引物的应用，包括以下步骤：

1)水稻DNA的提取

2)合成表1所示的引物序列。

3)PCR扩增

PCR反应体系为20μL，含2.0μL 10×Buffer，1.0μL dNTPs(10mmol/L),4条引物均为0.2μM，0.2μL Taq酶(5U/μL)，2.0μL模板DNA，12.8μL ddH2O；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，扩增产物在3％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。

4.结果判断

4条引物AF、AR、GF与GR等量混合扩增，根据扩增条带类型判断基因型，SNP位点为A碱基的Piz-t型等位基因材料扩增出160bp和331bp 2条条带，SNP位点为G碱基的其它等位基因材料扩增出221bp和331bp 2条条带，AG杂合型则扩增出160bp、221bp和331bp的3条条带。331bp的共有条带扩增不明显或不稳定，但对本方法的结果判定无任何影响。

表1引物序列

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.申请人设计引物在Piz-t编码区的上下游通过Chromosome Walking的方法对Piz-t来源材料基因组进行了PCR扩增、测序最终在Piz-t下游15387bp处获得一个Piz-t特异性SN P位点，Piz-t等位基因型为A碱基，其余基因型均为G碱基。

2.与传统的利用接种不同的稻瘟病生理小种鉴定稻瘟病抗性等位基因不同，本发明在P CR-CTPP方法的基础上加以改进，利用目标SNP位点开发出仅利用PCR电泳技术即可鉴定亲本及F2子代Piz-t基因型的共显性分子标记。

3.在利用Piz-t基因对水稻稻瘟病抗性改良时，分子标记辅助选择(MAS)在回交过程中成为一种最直接、有效的筛选工具，利用本发明的方法可准确实现子代基因型检测，筛选携带目的基因的个体连续回交后自交纯合从而完成品种改良；因此，该方法具有简单、准确、成本低并可以在水稻生长早期进行非破坏性检测等一系列优点，适于在育种中对Piz-t基因型的大量筛选以及对于水稻种质资源中Piz-t等位基因型鉴定。

附图说明

图1为利用两对交叉引物PCR扩增(PCR-CTPP)方法对水稻Piz-t特异性SNP位点扩增示意图。

图2为利用3个不同退火温度(55℃、57℃、59℃)3种不同引物浓度比(AF、AR、GF与GR浓度比分别为1:1:1:1、1.5:1:1:2以及2:1:1:1.5)对3种不同Piz-t基因型DNA模板PCR扩增的电泳图

M：DL500DNA marker；其中AA型模板即泳道1、4、7为SNP位点为纯合A碱基，含有Piz-t基因的亲本材料IRBLzt-T；GG型模板即泳道3、6、9为SNP位点为纯合G碱基，含有Piz-t的感病等位基因亲本材料Nipponbare；AG型模板即泳道2、5、8为SNP位点为AG杂合型碱基，由IRBLzt-T与Nipponbare杂交获得的F1代材料。

图3为利用本发明开发的Piz-t分子标记引物检测具有不同等位基因亲本的电泳图。

M：DL500DNA marker；泳道1-6分别为含有不同Piz-t等位基因的亲本材料，依次分别为：IRBLzt-T(Piz-t)、IRBLz-Fu(Piz)、IRBL9-W(Pi9)、1517B(Pi2)、Nipponbare(感病等位基因)、9311(感病等位基因)

图4为利用本发明开发的Piz-t分子标记引物检测目标SNP位点分离的F2群体电泳图。

M：DL500DNA marker；P1、P2为目标SNP位点分别为A和G碱基的亲本IRBLzt-T(Piz-t)与Nipponbare(感病等位基因)，泳道1-22为利用两亲本构建的随机选取的部分F2单株，各材料所属基因型标注于对应泳道下方。

具体实施方式

本实施例中未特别说明的实验方法即为分子生物学常规方法。本研究所用Taq酶及dN TP产自上海博彩生物科技有限公司，其余均为常规生化试剂

实施例1：

水稻抗稻瘟病基因Piz-t特异性SNP分子标记引物及检测方法PCR条件优化

1)生物材料

AA型材料为含有Piz-t基因的亲本材料IRBLzt-T；GG型材料为含有感病等位基因的亲本材料Nipponbare；AG型材料为由IRBLzt-T与Nipponbare杂交获得的F1代材料。

2)水稻DNA提取及引物合成

CTAB方法提取上述材料的DNA，合成合成表1所示的引物序列，具体为：

AF：TTGCTGAGCCATTGTTAAACA

AR：ATGGCAAATGAACTAAAGG

GF：GGTCCTCTGCATGGTATG

GR：AGGAGAGATAGAACATTGTTGTAAC。

3)PCR

PCR反应体系为20μL，含2.0μL 10×Buffer，1.0μL dNTPs(10mmol/L),4条引物AF、AR、GF与GR设置了3个不同的浓度比(分别为0.2μM、0.2μM、0.2μM、0.2μM；0.3μM、0.2μM、0.2μM、0.4μM；0.4μM、0.2μM、0.2μM、0.3μM)，0.2μL Taq酶(5U/μL)，2.0μL模板DNA，12.8μLddH2O；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，设置3个不同退火温度(55℃、57℃、59℃)1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min，扩增产物在3％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。

4)结果分析

1、4、7泳道为SNP位点为纯合A碱基的Piz-t型材料，利用本发明标记扩增结果在55℃和57℃两种退火温度及三种不同引物浓度比中均有一条160bp的特异性条带；3、6、9泳道为SNP位点为纯合G碱基的感病等位基因亲本材料，在55℃和57℃两种退火温度及三种不同引物浓度比中均有一条221bp的特异性条带；2、5、8为SNP位点为AG杂合型碱基的材料，在55℃和57℃两种退火温度及三种不同引物浓度比中分别有160bp及221bp条带。

该结果表明，我们设计的标记对于引物浓度适应性广，在退火温度为55℃，4引物等量混合扩增时条带相对清晰。在三种不同类型材料中，331bp的共有条带扩增不明显，但对我们的结果判定无任何影响(图2)。

实施例2：

水稻抗稻瘟病基因Piz-t特异性分子标记引物的应用，包括以下步骤：

对已知不同等位基因材料扩增：

1)生物材料

IRBLzt-T(Piz-t纯合子)、IRBLz-Fu(Piz纯合子)、IRBL9-W(Pi9纯合子)、C101A51(Pi2纯合子)、Nipponbare(感病等位基因纯合子)、9311(感病等位基因纯合子)。

2)CTAB方法提取上述材料的DNA

3)PCR

PCR反应体系为20μL，含2.0μL 10×Buffer，1.0μL dNTPs(10mmol/L),4条引物均为0.2μM，0.2μL Taq酶(5U/μL)，2.0μL模板DNA，12.8μL ddH₂O；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10m in，扩增产物在3％琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶成像仪扫描记录结果。

4)结果分析

利用本发明的Piz-t特异性标记鉴定含有不同等位基因的材料表明，Piz-t纯合子类型材料具有一条160bp特异性条带，而其余等位基因类型均为221bp特异性条带，因此该标记可以将Piz-t同其余等位基因区分开，331bp的共有条带扩增不明显但不影响判断。如图3所示，泳道1-6对应亲本材料及所属等位基因类型依次分别为：IRBLzt-T(Piz-t纯合子)、IR BLz-Fu(Piz纯合子)、IRBL9-W(Pi9纯合子)、C101A51(Pi2纯合子)、Nipponbare(感病等位基因纯合子)、9311(感病等位基因纯合子)。

本实施例中的应用过程，可用于有效的对抗稻瘟病基因Piz-t进行基因型选择，既可以用于水稻资源的筛选鉴定，又可以用于水稻抗稻瘟病基因Piz-t的分子育种。

实施例3：

本实施例是对水稻抗稻瘟病基因Piz-t F2群体的单基因分离的检测

1)生物材料

P1、P2为目标SNP位点分别为A和G碱基的亲本IRBLzt-T(Piz-t纯合子)与Nipponbare(感病等位基因纯合子)，IRBLzt-T(Piz-t纯合子)与Nipponbare(感病等位基因纯合子)杂交构建的F2群体。

3)PCR

PCR体系同实施例2。

5)结果分析

P1、P2分别为亲本IRBLzt-T(Piz-t纯合子，SNP位点为AA)和与Nipponbare(感病等位基因纯合子，SNP位点为GG)。

利用亲本IRBLzt-T(Piz-t)与Nipponbare(感病等位基因)杂交构建了F2群体，通过对108个单株基因型检测表明，3种不同基因型的分离比为26AA：60AG：22GG，经卡方检验符合1:2:1的孟德尔单基因分离比(χ²＝0.44<χ² _0.05＝5.99)，因此该标记为共显性标记，可以将两种不同的纯合子以及杂合子区分开，检测位点同时表现为单基因分离(见图4)。泳道1-22为利用两亲本构建的随机选取的部分F2单株。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省农业科学院粮食作物研究所

<120> 水稻抗稻瘟病基因Piz-t特异性SNP分子标记引物及应用

<130> 水稻抗稻瘟病基因Piz-t特异性SNP分子标记引物及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgctgagcc attgttaaac a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcaaatg aactaaagg 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggtcctctgc atggtatg 18

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggagagata gaacattgtt gtaac 25

Claims

1.水稻抗稻瘟病基因Piz-t特异性SNP分子标记引物，分别为：AF：TTGCTGAGCCATTGTTAAACA；AR：ATGGCAAATGAACTAAAGG；GF：GGTCCTCTGCATGGTATG；GR：AGGAGAGATAGAACATTGTTGTAAC；所述的水稻为籼稻。

2.一种对水稻抗稻瘟病基因Piz-t的鉴定方法，包括：

利用AF：TTGCTGAGCCATTGTTAAACA；AR：ATGGCAAATGAACTAAAGG；GF：GGTCCTCTGCATGGTATG；GR：AGGAGAGATAGAACATTGTTGTAAC，对水稻DNA进行PCR扩增；纯合Piz-t基因型扩增出160bp和331bp条带，其余等位基因类型扩增条带为221bp和331bp条带，杂合型的扩增条带为160bp、221bp和331bp条带，所述的水稻为籼稻。

3.权利要求1所述的引物在水稻抗稻瘟病基因分子育种中的应用，所述的水稻为籼稻。

4.权利要求1所述的引物在水稻资源的筛选鉴定中的应用，所述的水稻为籼稻。