CN107586874B

CN107586874B - 用于鉴定辣椒黄色花药性状的引物对及其应用

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Publication number: CN107586874B
Application number: CN201711015765.2A
Authority: CN
Inventors: 张晓芬; 耿三省; 陈斌; 杜和山; 王国云
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2017-10-25
Filing date: 2017-10-25
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2037-10-25
Also published as: CN107586874A

Abstract

本发明公开了一种用于鉴定辣椒黄色花药性状的引物对及其应用。本发明首先提供了一种引物组，由引物1、引物2和引物3组成；引物1如序列1所示，引物2如序列2所示，引物3如序列3所示。所述引物组的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定辣椒黄色花药性状；(b)选育具有黄色花药性状的辣椒。辣椒花药的颜色有多种，采用该引物组，通过KASPar系统(LGC Genomics,UK)进行SNP高通量分型研究，可以直接读取待测辣椒的基因型，从而预测待测辣椒是否具有黄色花药性状，实现早期选育。本发明对于辣椒育种将具有重要意义。

Description

用于鉴定辣椒黄色花药性状的引物对及其应用

技术领域

本发明涉及辣椒育种领域，具体涉及一种用于鉴定辣椒黄色花药性状的引物对及其应用。

背景技术

辣椒(Capicum annuum L.)是世界范围内广泛栽培的重要蔬菜作物。辣椒杂种优势明显，利用杂种优势可有效解决辣椒市场需求。目前辣椒市场上主要应用的是F₁代杂交种。而种子纯度的高低直接影响一代杂交种的产量及产品质量。在辣椒杂交制种过程中，母本自交种子的产生会显著降低杂交种的纯度。在利用辣椒雄性不育两用系制种过程中，若不能完全拔出50％的可育株，同样会大大降低杂交种子的质量。而且不育系本身育性易受环境条件影响而使不育性不稳定,导致自交结实而影响制种纯度。

隐性标记性状的利用可有效解决上述问题。将易于识别的隐性标记标记性状转育给辣椒母本和辣椒雄性不育系,通过目测及标记性状连锁标记分析进行选择,可有效解决辣椒杂种鉴定方法繁琐、耗时、费财,及辣椒雄性不育系、保持系的选育周期较长、费力等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定辣椒黄色花药性状的引物对及其应用。

本发明首先提供了一种引物组，由引物1、引物2和引物3组成；

所述引物1为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物2为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物3为如下(a5)或(a6)：

(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子。

所述引物组的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定辣椒黄色花药性状；(b)选育具有黄色花药性状的辣椒。

本发明还保护所述引物组在鉴定辣椒黄色花药性状中的应用。

本发明还保护所述引物组在选育具有黄色花药性状的辣椒中的应用。

本发明还保护所述引物组在选育具有黄色花药性状的辣椒单株中的应用。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述引物组。所述试剂盒的功能为如下(a)或(b)：(a)鉴定辣椒黄色花药性状；(b)选育具有黄色花药性状的辣椒。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

本发明还保护一种鉴定辣椒花药性状的方法，包括如下步骤：提取待测辣椒的基因组DNA，采用所述引物组进行KASPar分型，根据分型结果判断待测辣椒为具有哪种花药性状的辣椒。如果待测辣椒的基因型为AA型，待测辣椒为候选的具有黄色花药性状的辣椒。如果待测辣椒的基因型为GG型，待测辣椒为候选的具有非黄色花药性状的辣椒。如果待测辣椒的基因型为GA型，待测辣椒为候选的具有非黄色花药性状的辣椒。如果待测辣椒的基因型与DH121一致，待测辣椒为候选的具有黄色花药性状的辣椒。如果待测辣椒的基因型与12-Z65一致，待测辣椒为候选的具有非黄色花药性状的辣椒。如果待测辣椒的基因型为DH121和12-Z65的杂合型，，待测辣椒为候选的具有非黄色花药性状的辣椒。

KASPar分型的“touch-down”PCR反应程序为：95℃15min；94℃变性20s、退火60s，10个循环(第一个循环的退火温度为61℃，每个循环比前一个循环的退火温度降低0.6℃)；94℃变性20s、55℃退火60s，26个循环。

本发明还保护一种鉴定辣椒花药性状的方法，包括如下步骤：

鉴定待测辣椒的基因组DNA中SNP标记ZXF-7的基因型；所述SNP标记ZXF-7为序列表的序列4中自5’末端第23位核苷酸；

如果待测辣椒的基因型为AA型，待测辣椒为候选的具有黄色花药性状的辣椒；如果待测辣椒的基因型为GG型或GA型，待测辣椒为候选的具有非黄色花药性状的辣椒。

本发明还保护一种辣椒育种方法，包括如下步骤：采用以上任一所述方法筛选具有目标花药性状的辣椒，将具有目标花药性状的辣椒用于育种。所述具有目标花药性状的辣椒为具有黄色花药性状的辣椒。

本发明还保护序列表的序列4所示的DNA分子。序列表的序列4所示的DNA分子可作为分子标记用于鉴定辣椒花药性状。基于序列表的序列4中自5’末端第23位核苷酸，如果待测辣椒的基因型为AA型，待测辣椒为候选的具有黄色花药性状的辣椒；如果待测辣椒的基因型为GG型或GA型，待测辣椒为候选的具有非黄色花药性状的辣椒。

以上任一所述非黄色花药性状具体可为紫色花药性状。

以上任一所述辣椒可为DH121或12-Z65。

以上任一所述辣椒可为以DH121与12-Z65为亲本得到的后代，例如F₁后代、BC₁后代、BC₂后代、F₂后代等。

辣椒花药的颜色有多种，本发明的发明人通过四亲杂交、单倍体培育选育出的综合性状优良、花药为黄色的辣椒双单倍体材料DH121。将DH121与花药为紫色的辣椒自交系12-Z65作为亲本，构建P₁、P₂、F₁、BC₁、BC₂、F₂六联合世代，最终明确辣椒黄色花药性状由单隐性基因控制，将该基因命名为ayw基因。进一步，本发明的发明人将ayw基因定位在了辣椒第11条染色体上，并获得了SNP标记ZXF-7。进一步，本发明的发明人设计了用于检测SNP标记ZXF-7的引物组(命名为ZXF-7引物组)，采用该引物组，通过KASPar系统(LGC Genomics,UK)进行SNP高通量分型研究，可以直接读取待测辣椒的基因型，从而预测待测辣椒是否具有黄色花药性状，实现早期选育。

本发明对于辣椒育种将具有重要意义。

附图说明

图1为实施例2中构建的连锁群。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

12-Z65，全称为辣椒(Capsicum annuum)12-Z65，已于2016年6月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.12548。12-Z65为花药为紫色的辣椒自交系。

T16-2,全称为辣椒(Capsicum annuum)T16-2，已于2017年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.12163。T16-2又称DH121，为经四亲杂交、单倍体培育选育出的综合性状优良、花药为黄色的辣椒双单倍体材料。DH121具有如下优良性状：植株生长势强，抗病毒病、疫病和南方根结线虫，植株连续座果能力强，果型为中大方灯笼，果色翠绿，果面光亮。

实施例1、群体材料的获得以及花药颜色鉴定

以DH121与12-Z65为亲本，构建P₁、P₂、F₁、BC₁、BC₂、F₂六联合世代。DH121植株即DH121种子长成的植株。12-Z65植株即12-Z65种子长成的植株。F₁代植株即F₁代种子长成的植株。F₂代植株即F₂代种子长成的植株。B₁代植株即B₁代种子长成的植株。B₂代植株即B₂代种子长成的植株。

一、群体材料的获得

1、2013年春季，于北京市农林科学院蔬菜研究中心农场，DH121植株与12-Z65植株杂交，得到F₁代种子。

2、2013年冬季，于海南三亚农场，F₁代植株自交、获得F₂代种子。

3、2013年冬季，于海南三亚农场，F₁代植株与DH121回交，获得BC₁代种子。

4、2013年冬季，于海南三亚农场，F₁代植株与12-Z65回交，获得BC₂代种子。

5、2014年春季，于温室中，将DH121种子、12-Z65种子、F₁代种子、F₂代种子、BC₁代种子和BC₂代种子分别播种，得到25株DH121植株、26株12-Z65植株、30株F₁代植株、126株BC₁代植株、130株BC₂代植株和253株F₂代植株。

6、2014年秋季，于温室中，将DH121种子、12-Z65种子、F₁代种子、F₂代种子、BC₁代种子和BC₂代种子分别播种，得到21株DH121植株、25株12-Z65植株、24株F₁代植株、84株BC₁代植株、86株BC₂代植株和243株F₂代植株。

二、花药颜色鉴定

鉴定步骤一中2014年春季播种得到各个植株以及2014年秋季播种得到各个植株的花药颜色。具体方法为：在辣椒门椒始花期，采用目测法观察已盛开花朵中花药的颜色(2人同时调查以确保结果的准确性)，花药为黄色的单株鉴定为具有黄色花药性状的植株，花药为紫色的单株鉴定为具有紫色花药性状的植株。结果见表1。

表1

计算F₂代群体的分离比，采用Microsoft Excel 2003软件进行数据统计分析，SAS8.0对结果进行卡方测验。2014年春季播种得到的F₂代群体(253株F₂代植株)中，具有紫色花药性状的单株有184株，具有黄色花药性状的单株有69株，具有紫色花药性状的单株与具有黄色花药性状的植株的数量的分离比例经卡方检验符合3﹕1。2014年秋季播种得到的F₂代群体(243株F₂代植株)，具有紫色花药性状的单株有186株，具有黄色花药性状的单株有57株，具有紫色花药性状的单株与具有黄色花药性状的植株的数量的分离比例经卡方检验也符合3﹕1。结果表明，辣椒的黄色花药性状由1对隐性核基因控制，将该基因命名为ayw基因。

实施例2、辣椒ayw基因染色体初定位以及SNP分子标记的开发与加密

本实施例采用的植株均为2014年春季播种得到的植株。

一、辣椒ayw基因染色体初定位

1、筛选在双亲间具多态的SSR和InDel分子标记。双亲即DH121植株和12-Z65植株。从2561对SSR引物和185对InDel引物中筛选出多态性引物357对，多态率为13.94％。

2、利用BSA方法，构建黄色花药基因池(从F₂代植株中随机选取7个具有黄色花药性状的植株，分别提取基因组DNA后混合)和紫色花药基因池(从F₂代植株中随机选取7个具有紫色花药性状的植株，分别提取基因组DNA后混合)，从步骤1筛选出来的标记中进一步筛选。从357对多态性引物中筛选获得9对多态性引物，其中包括8对SSR引物和1对InDel引物，多态率为2.52％。

3、利用步骤2筛选出来的标记，采用多态引物对各个F₂代植株进行基因型分析，并利用JoinMap 4.0软件绘制连锁图。先用Calculate命令计算相关参数，在Groupings(tree)命令下，在LOD≥3.0的状态下进行连锁群分组，然后用Create Groups for Mapping命令作图，用Map命令构建框架图，并进行图距的计算。应用筛选出的9对多态性引物对F₂群体进行标记分析和连锁群的构建。最终将ayw基因定位在第11条染色体上，位于标记genSSR5929和genSSR5955之间，两标记之间的遗传距离为1.8cM，距离ayw基因的遗传距离分别为0.4cM和1.4cM。

二、黄色花药基因初定位区域SNP分子标记的开发与加密

1、根据辣椒全基因组序列信息，确定与花药黄色基因连锁的两侧翼标记在基因组中的位置，截取相应的基因组序列，设计新的PCR引物(引物对BP4，核苷酸序列见表2)。应用引物对BP4分别对双亲的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物进行6.0％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色后进行带型统计分析。

表2

PCR扩增体系(10μL)：3μL模板DNA(2.5ng/μL)、1μL正向引物(50ng/μL)、1μL反向引物(50ng/μL)、5μL Go

Green Master mix(Promega，Wisconsin,USA)。

PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃变性15s、62℃退火15s、72℃延伸30s，34个循环；72℃保温5min。

2、对步骤1得到的扩增PCR产物进行Sanger一代测序，应用BLAST进一步分析两个亲本在ayw基因初定位区域的序列差异，开发SNP标记，共开发了9个SNP标记。从开发的9个SNP标记中筛选在双亲以及两个基因池(黄色花药基因池/紫色花药基因池)间具有多态表现的标记，其中5个具有多态表现。

3、利用步骤二的2中具有多态表现的5个SNP标记以及步骤一的2筛选出来的9个标记(8个SSR标记、1个InDel标记)对F₂代植株群体重新进行连锁分析。构建得到包含5个SNP标记、总长为6.5cM的连锁群(见图1)，SNP标记ZXF-7与ayw基因共分离，连锁最紧密的两侧标记为SSR标记genSSR5929和3个共分离的SNP标记SNP1、ZXF-1和ZXF-8。

用于检测SNP标记ZXF-7的引物组命名为ZXF-7引物组，由三条引物组成，分别如下：

引物1(序列表的序列1)：5’-CCTTAGAAAGCGGAATACCCTG-3’；

引物2(序列表的序列2)：5’-GCCTTAGAAAGCGGAATACCCTA-3’；

引物3(序列表的序列3)：5’-CTACCATCCCTCAGATGGTCTTAGA-3’；

引物1和引物2均为正向引物，分别针对同一SNP的不同的等位基因，引物3为通用的反向引物。

ZXF-7引物组的靶序列如序列表的序列4所示。序列表的序列4中，自5’末端第23位核苷酸为SNP标记ZXF-7。SNP标记ZXF-7为G/A多态，AA基因型植株的花药为黄色，GG基因型植株和GA基因型植株的花药为紫色。

实施例3、应用ZXF-7引物组鉴定黄色花药性状

从2014年春季播种得到的126株BC₁代植株中随机取92株植株作为验证材料，对SNP标记ZXF-7与ayw基因的紧密连锁进行验证，确定SNP标记ZXF-7用于育种的准确性。

92株植株依次命名为QB1至QB92。

1、提取植株的基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用ZXF-7引物组，应用KASPar系统(LGCGenomics,UK)进行SNP高通量分型研究。

KASPar SNP的“touch-down”PCR反应程序为：95℃15min；94℃变性20s、退火60s，10个循环(第一个循环的退火温度为61℃，每个循环比前一个循环的退火温度降低0.6℃)；94℃变性20s、55℃退火60s，26个循环。

结果见表3。KASPar分型结果中；B代表蓝色圆点，表示该植株基于该SNP位点的基因型与12-Z65植株相同，为GG型；A代表红色圆点，表示该植株基于该SNP位点的基因型与DH121植株相同，为AA型；H代表绿色圆点，表示该植株基于该SNP位点的基因型为GA型。

基于KASPar分型结果，按照如下标准鉴定待测植株的花药颜色性状：如果待测植株的基因型为GG型或GA型，待测植株为候选的具有紫色花药性状的植株；如果待测植株的基因型为AA型，待测植株为候选的具有黄色花药性状的植株。

结果表明：92株植株中，仅有1株基于KASPar分型结果的鉴定结果与实际花药颜色不相符，正确率为98.9％。

表3

SEQUENCE LISTING

<110> 北京市农林科学院

<120> 用于鉴定辣椒黄色花药性状的引物对及其应用

<130> GNCYX171825

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ccttagaaag cggaataccc tg 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gccttagaaa gcggaatacc cta 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ctaccatccc tcagatggtc ttaga 25

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> Capsicum annuum

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)

<223> r =g or a

<400> 4

gccttagaaa gcggaatacc ctrgacaaag gtatctaaga ccatctgagg gatggtag 58

Claims

1.一种引物组，由引物1、引物2和引物3组成；

所述引物1为序列表的序列1所示的单链DNA分子；

所述引物2为序列表的序列2所示的单链DNA分子；

所述引物3为序列表的序列3所示的单链DNA分子。

2.权利要求1所述引物组在鉴定辣椒黄色花药性状中的应用；

所述辣椒为DH121或12-Z65或以DH121与12-Z65为亲本得到的后代；

所述12-Z65，其保藏登记号为CGMCC No.12548；

所述DH121，其保藏登记号为CGMCC No.12163。

3.权利要求1所述引物组在选育具有黄色花药性状的辣椒中的应用；

所述辣椒为DH121或12-Z65或以DH121与12-Z65为亲本得到的后代；

所述12-Z65，其保藏登记号为CGMCC No.12548；

所述DH121，其保藏登记号为CGMCC No.12163。

4.权利要求1所述引物组在选育具有黄色花药性状的辣椒单株中的应用；

所述辣椒为DH121或12-Z65或以DH121与12-Z65为亲本得到的后代；

所述12-Z65，其保藏登记号为CGMCC No.12548；

所述DH121，其保藏登记号为CGMCC No.12163。

5.一种试剂盒，包括权利要求1所述引物组。

6.权利要求5所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。

7.一种鉴定辣椒花药性状的方法，包括如下步骤：提取待测辣椒的基因组DNA，采用权利要求1所述引物组进行KASPar分型，根据分型结果判断待测辣椒为具有哪种花药性状的辣椒；

所述待测辣椒为DH121或12-Z65或以DH121与12-Z65为亲本得到的后代；

所述12-Z65，其保藏登记号为CGMCC No.12548；

所述DH121，其保藏登记号为CGMCC No.12163。

8.一种鉴定辣椒花药性状的方法，包括如下步骤：

如果待测辣椒的基因型为AA型，待测辣椒为候选的具有黄色花药性状的辣椒；如果待测辣椒的基因型为GG型或GA型，待测辣椒为候选的具有非黄色花药性状的辣椒；

所述12-Z65，其保藏登记号为CGMCC No.12548；

所述DH121，其保藏登记号为CGMCC No.12163。

9.一种辣椒育种方法，包括如下步骤：采用权利要求7或8所述的方法筛选具有目标花药性状的辣椒，将具有目标花药性状的辣椒用于育种；

所述辣椒为DH121或12-Z65或以DH121与12-Z65为亲本得到的后代；

所述12-Z65，其保藏登记号为CGMCC No.12548；

所述DH121，其保藏登记号为CGMCC No.12163。

10.序列表的序列4所示的DNA分子。