CN111500761B - 一种与辣椒叶色黄化基因连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与辣椒叶色黄化基因连锁的分子标记及应用。利用1份高度纯合的材料以及其辐射突变体库中的叶色黄化材料。利用BSA群体定位的方法获得与辣椒叶色黄化紧密连锁的染色体区域，并在候选区间内开发分子标记。根据候选基因的单碱基突变设计了1个KASP分子标记，利用该标记对F2群体500个单株进行基因型鉴定，符合率达到100％。研究结果不仅在杂交制种效率方面具有广阔的应用前景，还为辣椒叶色黄化突变体的筛选，鉴定和辅助筛选辣椒杂交种纯度鉴定等提供新的途径。
Description
技术领域
本发明属于辣椒育种分子生物学领域，涉及一种与辣椒(Capsicum annuum L)叶色黄化基因连锁的分子标记及该分子标记在辣椒杂交种纯度鉴定和育种中的应用。
背景技术
辣椒(Capsicum annum L)是茄科辣椒属的植物，是我国一种重要的蔬菜和调味品，2015年其种植面积达到3000万亩左右，是我国种植面积最大且产值最大的蔬菜作物，在保证我国蔬菜周年均衡供应中起重要作用。但由于长期的人工选择，使辣椒种内遗传基础日趋狭窄，已经不能满足辣椒一些特殊性状的遗传改良，如高效光能利用、对保护地的适应性等目标，都需要含有相应基因的种质资源和变异类型的存在。叶片是绝大多数植物光合作用的主要场所，叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，能参与天线复合体上光能的捕获，电荷的分离以及电子传递。光合色素的缺失与叶绿体的发育缺陷通常是紧密相关。叶色突变体广泛存在于各种高等植物中，是研究高等植物光合系统结构、叶绿素代谢、叶绿体发育、光合作用、激素生理等一系列生理代谢过程的理想材料，也是遗传和育种研究中的重要标记，近年来受到各国研究者的重视。
目前控制辣椒叶片黄化性状的基因还未被克隆，其分子机制研究未见报道，辣椒叶片黄化的分子机理仍处于未知状态。这些基因的克隆为揭示光合色素代谢、叶绿体发育的研究奠定了基础，也为辣椒黄化基因标记开发以及克隆提供了借鉴。
发明内容
本发明的首要目的在于针对辣椒叶片中出现的黄化现象，提供一种与辣椒叶色黄化基因连锁的分子标记，为辣椒叶色黄化突变体的筛选，鉴定和辅助筛选辣椒杂交种纯度鉴定等提供新的途径。
一种与辣椒叶色黄化基因连锁的分子标记，为辣椒全基因组9号染色体5807922bp处C向T的突变。
进一步的，所述的分子标记对应的基因型：T:T为具有叶色黄化表型的基因型、C:C和C:T为不具有叶色黄化表型的基因型。
针对上述辣椒小果突变设计的引物包括两条正向引物和一条反向引物，
正向引物X：ATAGCCCACGATTTTGGGGGTGGACC，见SEQ ID No.1所示；
正向引物Y：ATAGCCCACGATTTTGGGGGTGGACT，见SEQ ID No.2所示。
两条正向引物分别连接不同的荧光接头序列(LGC公司合成)；
优选：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，见SEQ ID No.3所示；
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，见SEQ ID No.4所示。
分别连接不同的荧光接头序列后的引物序列(YL标记)如下：
正向引物Primer_AlleleX(YL-2)：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATAGCCCACGATTTTGGGGGTGGACC；见SEQ ID No.5所示；
正向引物Primer_AlleleY(YL-3)：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATAGCCCACGATTTTGGGGGTGGACT，见SEQ ID No.6所示。
反向引物Primer_Common：GAGCAATAAAGTTATGGCTCGACAGATA，见SEQ ID No.7所示。
本发明的第二个目的是提供上述分子标记的应用，有利于辣椒叶片颜色的选育，且为克隆叶色黄化基因，研究叶绿素降解的分子机制奠定基础。具体如下：
所述的分子标记用于鉴定和辅助筛选辣椒叶片颜色。
进一步的，
所述的分子标记用于辣椒叶片颜色筛选育种，尤其是叶色突变体的筛选。
进一步的，
所述的分子标记应用时，采用PCR反应进行检测。
进一步的，
所述的分子标记应用时，具体包括以下步骤：
(1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
(2)对扩增产物进行检测与分析。
进一步的，
对扩增产物进行荧光检测时，如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物YL-3对应的荧光信号，则检测位点为T:T基因型，判定为具有叶色黄化表型的纯合突变单株；如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物YL-2对应的荧光信号，则检测位点为C:C基因型，判定为不具有叶色黄化表型的纯合野生单株；若同时检测到连接了荧光接头序列的引物YL-2和YL-3对应的两种荧光信号，则检测位点为C:T基因型，判定为不具有叶色黄化表型的杂合单株。
进一步的，
所述的分子标记应用时，采用Touchdown PCR。
进一步的，Touchdown PCR扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
本发明利用BSA定位的方法，定位到一个与辣椒叶片颜色的连锁的标记，该突变位点(位于9号染色体的5807922bp处)，开发了与该辣椒叶色黄化蛋白基因相关联的KASP分子标记。可以直接用于辣椒叶色颜色表型和对应基因型的鉴定，进而依赖该分子标记进行辅助育种，能够有效的解决杂交种纯度鉴定周期长，易受到环境影响的问题。通过早期利用该分子标记可以快速筛选到满意的植株，有效的减小了种植规模，减少了后期田间鉴定的工作量。提高了选择的效率和准确性。因此，本发明在辣椒叶片颜色育种实践及叶绿素代谢理论研究上均具有重要意义，可以用于所有品种辣椒的叶色黄化鉴定。
附图说明
图1为本发明的YL分子标记在6421与R24-12-6构建的F2群体中进行基因分型的部分结果；
A处表示：PCR产物为连接了荧光接头序列的引物YL-3对应的荧光信号，为叶色黄色的纯合单株；
B处表示：PCR产物为连接了荧光接头序列的引物YL-2对应的荧光信号，为叶色绿色的纯合单株；
C处表示：PCR产物具有连接了荧光接头序列的引物YL-3和YL-2两种荧光信号，为叶色绿色的杂合单株。
图2为BSA群体定位的2个亲本：R24-12-6(左)叶片黄色，6421(右)叶片绿色。
图3为R24-12-6与6421构建群体的BSA定位结果；
1-12代表染色体号，叶色黄化基因位于9号染色体，即箭头指示处，位于9号染色体的5807922bp处。
图4为本发明候选区段内标记开发与连锁定位示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。本发明中所涉及的辣椒种质均由湖南省蔬菜研究所提供，也可保证对外出售至少20年。
实施例1辣椒叶色黄化基因连锁的分子标记YL分子标记的获得
BSA定位方法
1.群体的构建
利用经过多代自交选育出的叶色为绿色辣椒材料‘6421’(如图2右边所示)，及其突变体叶色为黄色的辣椒材料‘R24-2-6’为亲本(如图2中左边所示)，均为重测序辣椒种质资源，将R24-2-6与6421进行杂交得到F1代，F1代自交后获得F2群体。
2.叶色颜色鉴定
在叶片苗期，可对叶片颜色进行绿/黄鉴定。
3.叶色黄化基因的定位
在R24-2-6×6421的F2群体中分别选取30个叶片颜色为黄色的植株苗期叶片和30个叶片颜色为绿色植株苗期叶片。混池样本：显性子代混池样本F2-R；隐性子代混池样本F2-S；显性亲本混池6421及隐性亲本R24，进行建库测序得到全基因组测序数据。对。利用CTAB法提取4个混池总的RNA。利用TruSeqDNA LT Sample Prep Kit(Illumina公司)对4个混池DNA建库，通过IlluminaNovaseq6000平台测序，进行基因组重测序，获得的数据利用samtools进行SNP的calling，筛选碱基质量值大于等于20，mapping质量值大于等于20，碱基depth在两个F2混池中大于等于2且小于等于60，同时两个亲本中大于等于2且小于等于60，共获得270,630个差异SNP。以10个SNP为窗口，4个SNP为步长做图，如图3(SNP-index分布图)对于与表型差异无关的基因组区域，平均Δ(SNP-index)为0，而候选区间的Δ(SNP-index)大于0.5，与目标性状相关联的SNP在染色体上与其周围的SNPs是连锁遗传集中在一个候选区域位于9号染色体的0Mb到17Mb。
4.叶色黄化基因的精细定位
通过步骤3获得控制叶色黄化的染色体区域。为了进一步缩小控制叶色黄化基因的候选区域，根据亲本重测序结果，比对参考基因组序列，找到SNP变异位点，开发KASP标记，利用开发的KASP分子标记对F2群体的单株进行基因分型，确定交换单株。基于叶片颜色表型调查数据和确定的交换单株的基因型，将控制叶色黄化的基因定位在9号染色体的5791587-601121区间，如图4。
最终是通过测序结合KASP验证为辣椒9号染色体5807922bp处C向T的突变。
5.叶色黄化基因相连锁的分子标记的开发
用该标记对6421与R24-2-6构建的F2群体500个单株进行基因分型。出现了3种荧光信号，其中C:C的荧光信号有125个单株，C:T的荧光信号有247个单株，T:T的荧光信号有128个单株。结合表型调查数据发现基因型与叶色表型高度一致，符合率达到了100％。以上结果充分说明，本发明YL标记具有通用性和准确性，可以应用于辣椒叶色黄化性状的预测、鉴定和筛选。
分子标记应用时，具体包括以下步骤：
(1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行Touchdo-
wnPCR扩增，获得扩增产物；
(2)对扩增产物进行检测与分析。
反向引物Primer_Common：GAGCAATAAAGTTATGGCTCGACAGATA。
正向引物Primer_AlleleX(YL-2)：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATAGCCCACGATTTTGGGGGTGGACC；
正向引物Primer_AlleleY(YL-3)：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATAGCCCACGATTTTGGGGGTGGACT。
本发明引物经过辣椒全基因组序列测序验证，具有专一性。
两个正向引物分别连接不同的荧光接头序列；荧光接头序列为FAM或HEX。
对扩增产物进行荧光检测时，如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物YL-3对应的荧光信号，则检测位点为T:T基因型，判定为具有叶色黄化表型的纯合单株；如果样品PCR产物只检测到连接了荧光接头序列的引物YL-2对应的荧光信号，则检测位点为C:C基因型，判定为不具有叶色黄化表型的纯合单株；若同时检测到连接了荧光接头序列的引物YL-2和YL-3对应的两种荧光信号，则检测位点为C:T基因型，判定为不具有叶色黄化表型的杂合单株。
分子标记应用时，采用Touchdown PCR。
进一步的，Touchdown PCR扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
待测样本是叶片。
表1为YL标记在6421与R24-12-6构建的F2群体中98个单株叶片颜色及基因型。
上述鉴定结果表明，在育种中通过分子标记鉴定筛选，保留检测到引物连接了荧光接头序列的引物YL-3对应的荧光信号的材料(见图1中A区域)，就能够选育出叶色为黄色的纯合材料。保留检测到连接了荧光接头序列的引物YL-2对应的荧光信号的材料(见图1中B区域)，就能够选育出叶色为绿色的纯合材料。保留检测到连接了荧光接头序列的引物YL-2和YL-3两种荧光信号的材料(见图1中C区域)，就能够选育出叶色为绿色的杂合材料。通过前期分子标记的筛选可以减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。
序列表
<110> 湖南省蔬菜研究所
<120> 一种与辣椒叶色黄化基因连锁的分子标记及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atagcccacg attttggggg tggacc 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atagcccacg attttggggg tggact 26
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
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<212> DNA
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gaaggtgacc aagttcatgc tatagcccac gattttgggg gtggacc 47
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<211> 47
<212> DNA
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gaaggtcgga gtcaacggat tatagcccac gattttgggg gtggact 47
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagcaataaa gttatggctc gacagata 28
Claims (10)
1.一种与辣椒叶色黄化基因连锁的分子标记，其特征在于，通过它的特异性PCR引物获得，正向引物X：ATAGCCCACGATTTTGGGGGTGGACC；正向引物Y：ATAGCCCACGATTTTGGGGGTGGACT；反向引物：GAGCAATAAAGTTATGGCTCGACAGATA。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的分子标记对应的基因型：T:T为具有叶色黄化表型的基因型，C:C和C:T为不具有叶色黄化表型的基因型。
3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，两条正向引物分别连接不同的荧光接头序列。
4.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于，荧光接头序列如下：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
5.权利要求1-4任一项所述的分子标记的应用，其特征在于，用于鉴定和辅助筛选辣椒叶片颜色。
6.权利要求5所述的分子标记的应用，其特征在于，用于辣椒叶片颜色筛选育种。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，采用PCR反应进行检测。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
（2）对扩增产物进行检测与分析。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，对扩增产物进行荧光检测时，若是T:T基因型，则判定为具有叶色黄化表型的纯合单株；若是C:C基因型，则判定为不具有叶色黄化表型的纯合单株；若是C:T基因型，则判定为不具有叶色黄化表型的杂合单株。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，采用Touchdown PCR；
Touchdown PCR 扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
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