KR102198575B1 - 잎 말림 연관 양적형질 유전자좌를 이용한 벼의 잎 말림 예측용 마커 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 잎 말림 연관 양적형질 유전자좌를 이용한 벼의 잎 말림 예측용 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명은 유용 농업형질인 잎 말림을 조절하는 잎 말림 연관 양적형질 유전자좌를 이용한 벼의 잎 말림 예측용 마커를 제공함으로써, 육종 초기단계에서 벼의 잎 말림을 빨리 예측할 수 있어, 수량을 증대시키기 위한 이상적인 초형을 가지는 벼 품종 육성에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

잎 말림 연관 양적형질 유전자좌를 이용한 벼의 잎 말림 예측용 마커 및 이의 용도{Marker for predicting leaf rolling in rice using QTL associated with leaf rolling and uses thereof}
본 발명은 잎 말림 연관 양적형질 유전자좌를 이용한 벼의 잎 말림 예측용 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
작물 개량을 위해 분자유전학을 이용하는 목표 중의 하나는 필요한 유용유전자의 탐색, 특성 규명, 분리 및 이용을 통해 우수한 신품종을 육성하는 것이다. 지난 10여 년 동안 작물의 게놈(genome) 연구를 위한 다양한 기술이 개발되었는데, 이 중 DNA 표지인자를 이용한 기술은 전통적인 육종 방법으로 해결하기 힘든 여러문제들에 대한 해법을 제시해 주고 있으며, 대표적인 것들로 양적형질 유전자좌(QTL: quantitative trait locus)의 분석과 야생종 등의 유전자원에서 유용 유전자의 탐색 및 이용 등을 들 수 있다.
야생벼는 작물의 수량성 뿐만 아니라 병해충 저항성, 스트레스 저항성 및 이와 관련된 형질들의 개선을 위한 유용 유전자들의 중요한 공급원이다. 야생 유용 유전자를 탐색하여 이들을 재배종에 도입하고 마커를 이용하여 선발하는(marker-assisted selection) 일련의 기술은 수량성, 각종 저항성 등을 개선하는데 있어 효과적인 수단으로 알려져 있다. 현재 전세계적으로 유전자은행에 보관중인 많은 양의 유전자들이 수량 및 기타 유용한 형질들에 관여하는 새로운 유전자들을 탐색하는데 있어 기초 연구 자료로 광범위하게 활용되고 있다.
식물 게놈 분석 기술의 진보로 양적형질 유전자좌에 관여하는 유전적 변이의 연구가 가능해졌으며, 목표유전자의 이전 및 선발에 MAS(marker-assisted selection)가 효율적으로 이용될 수 있게 되었는데, 특히 양적형질 유전자좌 분석은 분자표지인자를 이용하고 측정이 가능한 형질에 관여하는 염색체의 특정 부분을 확인함으로써, 특정 환경에서 수량성, 과실 무게, 출수기 등 주요 형질에 관여하는 유전자의 수 및 염색체 위치, 개개 유전자의 영향력, 상위작용, 양적형질 유전자좌와 환경과의 상호작용, 그리고 양적형질 유전자좌와 유전적인 배경과의 상호작용 등 주요 농업형질의 유전적 배경에 대한 전반적이고 직접적인 정보를 얻을 수 있다.
한편, 잎은 광합성, 호흡, 증발 등 작물이 생육하는 데에 필요한 여러가지 역할들을 한다. 잎의 넓이, 길이, 직립성 및 말림에 의해 광합성, 호흡 및 증발의 효율성이 달라질 수 있고, 이는 수량과 관련지어질 수 있으므로 잎의 형태는 중요한 농업형질로 생각할 수 있다. 따라서 잎이 말리는 특성 검정과 유전 분석을 통해 잎의 형태를 조절하는 유전자에 대해 밝혀서 잎이 말리게 되는 메커니즘을 연구할 수 있고, 수량을 증대시키기 위한 이상적인 초형을 가지는 품종을 만드는 육종에 이용할 수 있을 것이다.
한편, 한국등록특허 제1696679호에는 '벼의 간장 관련 양적형질 유전자좌 결정 및 이를 위한 CAPS 마커'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1700596호에는 '벼의 줄기굵기 관련 양적형질 유전자좌 결정 및 이를 위한 CAPS 마커'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '잎 말림 연관 양적형질 유전자좌를 이용한 벼의 잎 말림 예측용 마커 및 이의 용도'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 유용 농업형질인 벼의 잎 말림을 조절하는 양적형질 유전자좌인 qARO1(adaxial rolled leaf 1) 및 qARO9(adaxial rolled leaf 9)를 확인하였으며, qARO1 또는 qARO9 유전자좌가 이입된 벼의 잎 말림이 조절된 근동질유전자 계통을 선발할 수 있는 마커를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 벼의 잎 말림을 예측하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는, 벼의 잎 말림을 예측하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 벼의 잎 말림을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명은 유용 농업형질인 잎 말림을 조절하는 잎 말림 연관 양적형질 유전자좌를 이용한 벼의 잎 말림 예측용 마커를 제공함으로써, 육종 초기단계에서 벼의 잎 말림을 빨리 예측할 수 있어, 수량을 증대시키기 위한 이상적인 초형을 가지는 벼 품종 육성에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 재조합 자식계통에서 잎 말림 형질의 표현형 분포 양상을 나타낸 것이다. A: 지엽, B: 상위 2엽, 파랑 및 빨강 화살표: 통887호 및 밀양23호의 표현형 평균치.
도 2는 BC2F2 분리집단에서 상위 2엽의 잎 말림 지수(leaf roolling index) 의 변이 양상을 나타낸 것이다.
도 3은 BC2F2 분리집단에서 잎 말림을 조절하는 양적형질 유전자좌인 qARO1(adaxial rolled leaf 1) 및 qARO9(adaxial rolled leaf 9)의 대립유전형이 상위 2엽의 잎 말림 지수에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 4는 통일형인 밀양23호와 자포니카인 통887호에 대한 qARO1 및 qARO9 유전자좌 연관 마커(01id4052916, 01id4738572, 09id19121466 및 09id20424529)의 다형성 양상을 나타낸 것이다.
도 5는 qARO1 및 qARO9의 근동질유전자 계통에서 잎 말림 형질 발현을 나타낸 것이다. A: 모본(T887 또는 M23)과 근동질유전자 계통(T887-qARO9, T887-qARO1+qARO9, M23-qARO9 또는 M23-qARO1+qARO9)의 잎 형태 비교, B: 모본과 근동질유전자 계통에서 나타난 지엽 및 상위 2엽의 잎 말림 지수 비교.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 벼의 잎 말림을 예측하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트에 있어서, 상기 잎은 지엽(flag leaf) 또는 상위 2엽(secondary leaf)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물은 150 bp 및 172 bp 크기의 산물을 나타낼 수 있고, 150 bp의 산물을 나타내는 벼는 밀양23호와 같은 잎 말림 지수(leaf rolling index)를 가진다고 예측할 수 있고 172 bp의 산물을 나타내는 벼는 통887호와 같은 잎 말림 지수를 가진다고 예측할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물은 138 bp 및 161 bp 크기의 산물을 나타낼 수 있고, 138 bp의 산물을 나타내는 벼는 밀양23호와 같은 잎 말림 지수를 가진다고 예측할 수 있고 161 bp의 산물을 나타내는 벼는 통887호와 같은 잎 말림 지수를 가진다고 예측할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물은 131 bp 및 158 bp 크기의 산물을 나타낼 수 있고, 131 bp의 산물을 나타내는 벼는 밀양23호와 같은 잎 말림 지수를 가진다고 예측할 수 있고 158 bp의 산물을 나타내는 벼는 통887호와 같은 잎 말림 지수를 가진다고 예측할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용한 증폭 반응의 산물은 161 bp 및 190 bp 크기의 산물을 나타낼 수 있고, 161 bp의 산물을 나타내는 벼는 밀양23호와 같은 잎 말림 지수를 가진다고 예측할 수 있고 190 bp의 산물을 나타내는 벼는 통887호와 같은 잎 말림 지수를 가진다고 예측할 수 있다(표 3 및 도 5).
통887호는 지엽과 상위 2엽의 잎 말림 지수(leaf rolling index, %)가 평균 13.5 및 4이고, 밀양23호는 지엽과 상위 2엽의 잎 말림 지수가 평균 20.3 및 22.5로, 밀양23호가 통887호에 비해 잎 말림 정도가 높다.
상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열; 내의 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열 내의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는, 벼의 잎 말림을 예측하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은
벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 벼의 잎 말림을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할수도 있고, Wizard prep 키트(Promega사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 벼의 잎 말림을 예측하는 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 벼의 잎 말림을 예측은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트에 따른 증폭 산물의 크기에 기반하여 밀양23호 또는 통887호와 같은 잎 말림 지수를 가진다고 판단하고, 이를 통해 벼의 잎 말림을 예측할 수 있다. 구체적인 내용은 전술한 것과 같다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 잎 관련 형질들의 표현형 변이
본 발명에서 사용된 유전분석 집단은 통일형인 밀양23호(M23)와 자포니카인 통887호(T887)를 각각 모본과 부본으로 하여 교배된 163계통의 F16 재조합 자식계통(RILs, Recombinant Inbred Lines)으로 구성되어있다. 163계통의 F16 재조합 자식계통을 대상으로 잎 말림 지수(leaf rolling index)로 잎 말림 형질의 표현형을 2015년과 2016년에 각각 확인하였다. 잎 말림 지수는 이삭이 완전히 출수된 이후에 지엽과 상위 2엽에서 측정되었으며, 완전히 펴진 잎의 가장 긴 엽폭을 측정한 값(Lw)과 자연적으로 말려있는 상태에서 잎의 가장자리 사이의 거리를 측정한 값(Ln)을 식((Lw-Ln)/Lw×100)에 대입하여 계산하였다(ZhenYing Shi et al., 2007, Planta., 226(1):99-108). 그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 지엽(flag leaf)의 말림 지수는 통887호에서 7.9%와 4.9%, 밀양23호에서 23.8%와 29%로 각각 계산되었다. 재조합 자식계통들에서의 표현형 분포를 보았을 때 지엽의 말림지수는 2015년과 2016년에 모두 양친의 것보다는 높은 쪽으로 초월분리를 나타내었고, 잎 말림 지수가 낮은 쪽으로 치우치는 경향을 나타내었다. 상위 2엽(secondary leaf)의 말림지수는 통887호에서 2015년과 2016년에 각각 5.4%와 3.1%, 밀양23호에서 23.1%와 25.6%인 것으로 나타났다. 상위 2엽의 말림지수 역시 지엽의 경우와 유사하게 두 해에 모두 잎 말림 지수가 양친의 것보다 높은 쪽으로 분리하는 초월분리를 나타내었고, 잎 말림 지수가 낮은 쪽으로 치우쳐 분포를 이루는 것을 확인하였다(도 1).
실시예 2. 잎 말림 형질 연관 양적형질 유전자좌 분석
밀양23호/통887호의 조합에서 유래한 163계통의 F16 재조합 자식계통에 대해 차세대염기서열분석 기반 유전형분석을 통해 획득한 6,141개의 유전형 정보를 이용하여 유용 농업형질인 잎 말림을 조절하는 양적형질 유전자좌 분석을 실시하였다. 그 결과, 2015년과 2016년에 걸쳐 안정적으로 탐지되는 2개의 양적형질 유전자좌를 탐지할 수 있었다(표 1). 1번 및 9번 염색체상에 위치한 양적형질 유전자좌는 지엽 및 상위 2엽의 잎 말림지수에 동시에 관여하는 것으로 나타났다. 따라서 이들 유전자좌를 각각 qARO1(adaxial rolled leaf 1) 및 qARO9(adaxial rolled leaf 9)라 명명하였다. 1번 염색체 상의 40.5-46.7Mbp 사이에서 탐지된 양적형질유전자좌 qARO1의 경우에, 밀양23호의 대립유전형일 경우 잎을 말리게 하는 표현형을 나타내었으며, qARO1의 지엽과 상위 2엽에 대한 LOD(logarithm of odds, 값이 3보다 큰 경우 유전적 연관이 인정됨) 값이 각각 6.9~11 및 2.9~5.1로 나타났으며, 지엽에 대해서는 10~15.2%, 상위 2엽에 대해서는 4.5~7%의 PVE(Phenotypic variance explained)값을 나타내었다. 실제로 통887호와 밀양23호의 대립유전형을 지닌 계통들의 잎 말림 지수의 평균값을 비교해봤을 때, 밀양23호의 대립유전형을 지닌 계통들에서 13.9~16.4%의 증가된 지엽 말림 지수, 11.9~17.7%의 증가된 2엽 말림 지수를 확인할 수 있었다(표 2).
또한, 9번 염색체 상의 19.3~19.7Mbp 사이에서 탐지된 qARO9의 경우, qARO1과 유사하게 밀양23호 유래 대립유전형이 잎을 말리게 하였으며, 지엽과 상위 2엽에 대한 LOD 값은 각각 8.5~9.3 그리고 11.1~14.4로 나타났으며, qARO1에 비해 상대적으로 높은 PVE 값을 나타내었다(표 1). 밀양23호 대립유전형을 가진 개체들의 잎 말림지수의 평균값은 통887호의 대립유전형을 보유한 개체들의 평균보다 지엽에서 약 2.3배, 2엽에서 약 2.5배가 더 높은 것을 확인할 수 있었다(표 2).
잎 말림 지수 연관 양적형질 유전자좌 분석결과
형질 조사년도 QTL 염색체 물리적 위치 (Mbp) LOD PVE (%)*
지엽말림 2015 qARO1 1 40.5 - 46.7 6.9 10.0
2엽 말림 2015 1 40.5 - 46.7 5.1 7.0
지엽말림 2016 1 40.5 - 46.7 11.0 15.2
2엽 말림 2016 1 40.5 - 46.7 2.9 4.5
지엽말림 2015 qARO9 9 19.3 - 19.7 9.3 14.1
2엽 말림 2015 9 19.3 - 19.7 14.4 23.9
지엽말림 2016 9 19.3 - 19.7 8.5 11.3
2엽 말림 2016 9 19.3 - 19.7 11.1 18.2
*PVE(Phenotypic variance explained): 표현형 변이에 대한 설명력을 의미한다.
탐지된 잎 말림 연관 양적형질 유전자좌의 대립유전자형에 따른 재조합 자식계통들의 표현형 비교
　 2015 2016
형질 지엽말림지수 2엽말림지수 지엽말림지수 2엽말림지수
대립유전자형 T887 M23 T887 M23 T887 M23 T887 M23
qARO1 18.5 34.9 15.3 33.0 13.5 27.4 11.3 23.1
qARO9 14.5 36.0 12.5 33.0 8.2 29.2 6.7 25.6
실시예 3. 분리세대에서의 qARO1 및 qARO9 의 표현형에 대한 영향 검증
잎 말림에 대해 높은 설명력을 나타내었던 주요 양적형질 유전자좌인 qARO1및 qARO9의 효과의 반복검증과 헤테로 유전형의 표현형 양상을 검증하기 위해 171개의 BC2F2 집단을 전개하였다. 전개된 집단의 경우 밀양23호가 반복친(recurrent parent, RP)으로 이용되어 유전적 배경이 밀양23호로, qARO1 및 qARO9의 대립유전자형은 이형접합으로 구성된 개체들에서 유래되었다. 2017년 하계 포장에 전개된 본 집단을 대상으로 상위 2엽 말림을 조사하였다. 그 결과, BC2F2 집단에서의 상위 2엽 변이 양상은 상기 재조합 자식계통들의 변이양상과 비교했을 때, 0-50%의 잎 말림 지수를 지닌 개체만이 관찰되어 그 변이의 폭이 좁아진 것으로 나타났다(도 2). 이를 통해 상위성에 의해 나타나던 극단적인 잎 말림 효과가 배제되었음을 알 수 있었다. 또한, qARO1 및 qARO9의 대립유전형을 이형접합으로 보유할 시 나타나는 표현형 변이 양상을 살펴보았을 때, 통887호의 대립유전형을 지닌 개체들의 잎 말림 지수의 평균이 밀양23의 대립유전형을 갖는 개체들의 평균보다 높은 것으로 반복해서 관찰되었다. 두 양적형질 유전자좌는 모두 이협접합 유전형일 경우 동형접합 유전형 개체의 잎 말림 정도 평균의 중간값을 나타내어 상가적효과를 갖는 유전양식을 나타내었다(도 3).
실시예 4. 근동질유전자 계통을 이용한 qARO1 및 qARO9 의 QTL 영향력 검증
잎 말림을 조절하는 주요 양적형질 유전자좌로 탐지된 qARO1 및 qARO9를 공여친 유래 대립유전형으로 지니며 대부분의 유전적 배경이 반복친 유전형으로 회복된 근동질유전자 계통들을 대상으로 qARO1 및 qARO9 유전자좌 연관 분자마커를 이용하여 선발하였다(표 3 및 도 4). qARO1의 선발에 01id4052916(서열번호 1 및 2) 및 01id4738572(서열번호 3 및 4) 마커를 사용하였고, qARO9의 선발에 09id19121466(서열번호 5 및 6) 및 09id20424529(서열번호 7 및 8) 마커를 사용하였다(표 3). 상기 분자마커들은 IRGSP(International Rice Genome Sequencing Project) 1.0 버전의 표준 유전체 정보(https://rapdb.dna.affrc.go.jp/index.html)를 참고하여 개발하였다. 01id4052916 및 01id4738572 마커들은 1번 염색체상의 4,052,916 bp 및 4,738,572 bp에 존재하는 염기서열의 삽입/결실 변이를 이용하여 제작하였으며, 09id19121466 마커 및 09id20424529 마커의 경우 9번 염색체상의 19,121,466 bp 및 20,424,529 bp에 존재하는 삽입/결실 변이를 이용하여 제작하였다. 모든 분자마커는 Primer 3 plus 프로그램(http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)을 사용하여 제작하였다. 상기 마커 선발을 통해 육성된 통887호 유전적 배경에 밀양23호 유래 qARO9 및 qARO1+qARO9를 지닌 2개의 근동질유전자 계통을 각각 M23-qaro9 및 M23-qaro1+qaro9으로 명명하였고, 밀양23호 유전적 배경에 통887호 유래 qARO9 및 qARO1+qARO9를 지닌 2개의 근동질유전자 계통을 T887-qARO9 및 T887-qARO1+qARO9으로 각각 명명하였다. 이들 근동질 유전자계통을 이용하여 각 모본 및 부본에서 나타나는 표현형과 비교분석을 실시한 결과, 4개의 근동질 유전자계통 모두 잎 말림 지수에 대해서는 추정된 양적형질 유전자의 효과와 유사하게 표현형이 나타나는 것을 확인하였다. 지엽 및 상위 2엽 말림 지수에서 모두 유의한 차이를 나타내었으며 두 개의 양적형질이 함께 이입되었을 경우, 이전 분석결과와 동일하게 상가적으로 표현형이 영향을 받는다는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통해 본 발명의 01id4052916, 01id4738572, 09id19121466 및 09id20424529 마커가 잎 말림 형질조절 유전자좌의 이입 과정 중에 효과적인 분자마커로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
잎 말림 조절 유전자좌 연관 분자 마커 정보
연관 QTL 마커 정방향 서열 (5' -> 3') 역방향 서열(5' -> 3') PCR 산물 길이 (bp)
밀양23 통887
qARO1 01id4052916 AGTGGATGCGGGAAATTCAT
(서열번호 1)		 GCTGGCGTGTAGGATACGTA
(서열번호 2)		 150 172
qARO1 01id4738572 GTACGCTGTTTATTCCCCTTCTTC(서열번호 3) ACATCCCACTCGAAAGCTATCTG(서열번호 4) 138 161
qARO9 09id19121466 CTCTGCCATCGAAGTCACGT
(서열번호 5)		 ACCGTGCATTGCATAGGATTG
(서열번호 6)		 131 158
qARO9 09id20424529 AATATGGCACCGCAGAGTCC
(서열번호 7) 		CATACAACCCAGGCAGCTGA
(서열번호 8)		 161 190
<110> Seoul National University R＆DB Foundation <120> Marker for predicting leaf rolling in rice using QTL associated with leaf rolling and uses thereof <130> PN19315 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agtggatgcg ggaaattcat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gctggcgtgt aggatacgta 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtacgctgtt tattcccctt cttc 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 acatcccact cgaaagctat ctg 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctctgccatc gaagtcacgt 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 accgtgcatt gcataggatt g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aatatggcac cgcagagtcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 catacaaccc aggcagctga 20

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는, 벼의 잎 말림을 예측하기 위한 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 잎은 지엽(flag leaf) 또는 상위 2엽(secondary leaf)인 것을 특징으로 하는 벼의 잎 말림을 예측하기 위한 프라이머 세트.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는, 벼의 잎 말림을 예측하기 위한 키트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 벼의 잎 말림을 예측하기 위한 키트.
  5. 벼 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 프라이머세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 벼의 잎 말림을 예측하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 벼의 잎 말림을 예측하는 방법.
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Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Guo Yuan et al., Rice Science, 17(1), p.28-34, 2010.* *
LUO ET AL, GENOME. 2007 SEP;50(9):811_817 *
P. KANAGARAJ ET AL, CURRENT SCIENCE,2010, 98(6),836_839 *
Shao Yuanjian et al., Chinese Science Bulletin, 50(21), p.2466-2472, 2005.* *
Zengke Luo et al., Genome, 50, p.811-817, 2007.* *

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