CN113260705A - 具有改进的抗病性的玉米植物 - Google Patents

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Abstract

提供了表现出对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性的玉米植物，以及生产、鉴定或选择具有大斑凸脐蠕孢抗性表型的植物或种质的方法。此类植物包括甜玉米植物以及包含赋予抗病性的渐渗的基因组区域的农艺学上优良的凹痕玉米植物。进一步提供了包含新型多态性标记的组合物，以及用于生产、育种、鉴定和选择具有抗病性表型的植物或种质的方法。

Description

具有改进的抗病性的玉米植物
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年12月21日提交的美国临时申请序列号62/783,899的优先权权益，该美国临时申请的公开内容据此以引用方式整体并入。
序列表的并入
包含文件名“SEMB040WO_ST25.txt”的序列表的全部内容以引用方式并入本文，其大小为4千字节(在
Figure BDA0003135932020000011
中测量)于2019年12月17日创建，包含5个序列。
技术领域
本发明涉及植物育种领域，并且更具体地涉及用于生产表现出改进的抗病性的玉米(corn)植物的方法和组合物。
背景技术
抗病性是农业中的重要性状，特别是对于食用作物生产而言。尽管已在苞米(maize)植物中鉴定出了抗病性等位基因，但将几种抗病性性状组合到单一植物品系中的努力受到了赋予对不同病原体的抗性的紧密连锁或甚至等位的基因座的阻碍。抗病性的引入因控制抗病性的植物基因组区域中的重复序列的高密度而进一步变得复杂，这种高密度可大大降低开发有用遗传标记的可能性。需要鉴定赋予对多个种族的病原体的抗性的附加基因。
发明内容
本发明提供了农艺学上优良的(elite)玉米植物，该农艺学上优良的玉米植物在8号染色体上包含来自马齿型玉蜀黍变种(Zea mays var.indentata)的渐渗物(introgression)，其中所述渐渗物包含相对于缺乏所述渐渗物的植物赋予对大斑凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)的广谱抗性的单一基因，并且其中所述抗性是加性的。在某些实施方案中，所述渐渗物包含在所述植物中的标记M1(SEQ ID NO:1)处的来自马齿型玉蜀黍变种的染色体区段。在进一步的实施方案中，渐渗物的大小为约12cM或更小。在其他实施方案中，植物对于渐渗物是纯合的。在另外的实施方案中，包含渐渗物的种子样品以ATCC登录号PTA-125393保藏。
在某些方面中，广谱抗性包括对多个大斑凸脐蠕孢种族的抗性。例如，广谱抗性包括对大斑凸脐蠕孢种族1、2、M和N的抗性。
本发明另外提供了玉米植物的植物部分，所述植物部分在8号染色体上包含来自马齿型玉蜀黍变种(Zea mays var.indentata)的渐渗物，其中所述渐渗物包含相对于缺乏所述渐渗物的植物赋予对大斑凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)的广谱抗性的单一基因，并且其中所述抗性是加性的。在某些实施方案中，所述植物部分是细胞、种子、根、茎、叶、穗、花或花粉。
此外，本发明提供了渐渗片段，所述渐渗片段包含在标记基因座M1(SEQ ID NO:1)处的来自马齿型玉蜀黍变种的重组染色体区段。在某些实施方案中，该片段赋予对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性。在其他实施方案中，包含所述渐渗物的种子样品以ATCC登录号PTA-125393保藏。
本发明还提供了生产具有改进的大斑凸脐蠕孢抗性的农艺学上优良的玉米品种的方法，所述方法包括使来自马齿型玉蜀黍变种的染色体区段渐渗到所述植物的8号染色体上，所述染色体区段相对于缺乏所述渐渗物的植物赋予对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性，并且其中所述抗性是加性的。在一些实施方案中，所述广谱抗性包括对多个大斑凸脐蠕孢种族的抗性。在进一步的实施方案中，所述广谱抗性包括对大斑凸脐蠕孢种族1、2、M和N的抗性。在进一步的实施方案中，包含所述染色体区段的种子样品以ATCC登录号PTA-125393保藏。在一些实施方案中，所述渐渗包括回交。在其他实施方案中，所述渐渗包括标记辅助的选择。在某些实施方案中，所述渐渗包括测定所述对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性。在一些实施方案中，所述渐渗包括：将包含所述染色体区段的植物与自身或与不同基因型的第二玉米植物杂交，以产生一种或多种子代植物；以及选择包含所述染色体区段的子代植物。在特定实施方案中，选择子代植物包括检测包含标记基因座M1(SEQ ID NO:1)的核酸。在进一步的实施方案中，子代植物是F2-F6子代植物。在选定的实施方案中，产生所述子代植物包括回交。本发明进一步提供了可通过本文提供的方法获得的玉米植物。
此外，本发明提供了选择具有改进的大斑凸脐蠕孢抗性的农艺学上优良的玉米植物的方法，所述方法包括使8号染色体上包含来自马齿型玉蜀黍变种的渐渗物的玉米植物杂交，其中所述渐渗物包含相对于缺乏所述渐渗物的植物赋予对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性的单一基因，并且其中所述抗性与其自身或与不同基因型的第二种玉米植物相加以产生一种或多种子代植物；以及选择包含所述渐渗物的子代植物。在一些实施方案中，选择所述子代植物包括检测与所述渐渗物遗传连锁的标记基因座。在某些实施方案中，选择所述子代植物包括检测包含标记基因座M1(SEQ ID NO:1)的核酸。在其他实施方案中，所述抗性包括对多个大斑凸脐蠕孢种族的抗性。在进一步的实施方案中，所述抗性包括对大斑凸脐蠕孢种族1、2、M和N的抗性。在一些实施方案中，所述子代植物是F2-F6子代植物。在其他实施方案中，产生所述子代植物包括回交。
此外，本发明提供了农艺学上优良的玉米植物，所述农艺学上优良的玉米植物在8号染色体上包含来自马齿型玉蜀黍变种的渐渗物，其中所述渐渗物包含相对于缺乏所述渐渗物的植物赋予对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性的单一基因，其中所述植物进一步包含重组染色体区段，所述重组染色体区段包含含有Ht2基因座的第一等位基因和含有HtN基因座的第二等位基因，其中所述第一等位基因和所述第二等位基因以顺式连锁方式配置在8号染色体上，并且其中所述重组染色体区段赋予对大斑凸脐蠕孢的抗性。在一些实施方案中，在8号染色体上重组染色体区段的两侧是标记基因座Q-NZMAY009401770(SEQ ID NO:2)和Q-NZMAY009430172(SEQ ID NO:5)。在其他实施方案中，在8号染色体上重组染色体区段的两侧是标记基因座Q-ZMHt2(SEQ ID NO:3)和Q-NZMAY009238970(SEQ ID NO:4)。
此外，本发明提供了农艺学上优良的凹痕玉米植物，该农艺学上优良的凹痕玉米植物在8号染色体上包含来自马齿型玉蜀黍变种(Zea mays var.indentata)的渐渗物，其中所述渐渗物包含相对于缺乏所述渐渗物的植物赋予对大斑凸脐蠕孢(Exserohilumturcicum)的广谱抗性的单一基因。在一些实施方案中，所述渐渗物包含在所述植物中的标记M1(SEQ ID NO:1)处的来自马齿型玉蜀黍变种的染色体区段。在其他实施方案中，所述广谱抗性包括对多个大斑凸脐蠕孢种族的抗性。在一些实施方案中，植物对于所述渐渗物是纯合的。在其他实施方案中，包含所述渐渗物的种子样品以ATCC登录号PTA-125393保藏。
此外，本发明提供了生产具有改进的大斑凸脐蠕孢抗性的优良玉米品种植物的方法，所述方法包括使来自马齿型玉蜀黍变种的染色体区段渐渗到优良玉米品种的8号染色体上，所述染色体区段相对于缺乏所述渐渗物的植物赋予对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性，并且其中所述抗性是加性的。在一些实施方案中，所述渐渗包括：将包含所述染色体区段的植物与自身或与不同基因型的第二玉米植物杂交，以产生一种或多种子代植物；以及选择包含所述染色体区段的子代植物。在一些实施方案中，所述选择子代植物包括检测包含标记基因座M1(SEQ ID NO:1)的核酸。在其他实施方案中，优良玉米品种是凹痕、硬质(flint)或甜玉米品种。在一些实施方案中，子代植物是F2-F6子代植物。本发明进一步提供了可通过本文提供的方法获得的玉米植物。
附图说明
图1：示出了大斑凸脐蠕孢种族与Ht基因之间的相容性谱(profile)。“S”表示该基因和种族是相容的，因此具有这种基因的植物对该种族敏感；而“R”表示该基因和种族不相容，因此具有这种基因的植物对该种族具有抗性。
图2：示出展示出主要甜玉米市场区域中大斑凸脐蠕孢种族的分布的图表。
图3：示出了在2018年在两个地点测试的HtX基因差异化部署的两种遗传背景(“杂交体7”和“杂交体8”)的平均病害指数(按1-9的标度)。在威斯康星州地点，给杂交体接种特定的大斑凸脐蠕孢种族。在佛罗里达州地点，测试了杂交体对抗自然感染的性能。
图4：示出了在2019年在佛罗里达州测试的HtX基因差异化部署的六种遗传背景(“杂交体A”、“杂交体B”、“杂交体D”、“杂交体E”、“杂交体G”和“杂交体H”)的平均病害指数(按1-9的标度)。测试了杂交体对抗自然感染的性能。
具体实施方式
北方叶枯病(Northern Leaf Blight,NLB)由子囊菌(ascomycete)大斑凸脐蠕孢(也称为大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica))引起，并且导致苞米(玉蜀黍(Zea maysL.))作物的产量和品质显著降低。大斑凸脐蠕孢作为休眠菌丝体或作为厚垣孢子在宿主植物残体中的土壤中越冬，并通过空气传播的分生孢子感染新苞米植物。根据宿主、病原体和环境条件，首发症状通常在感染后十四天出现并生长成2-30cm长的灰绿色椭圆形病斑，所述病斑平行于叶缘变成棕褐色。在歉收年或没有宿主抗性可用时，所述感染可蔓延到整片叶子，从而导致整片叶子枯萎。潮湿的条件和适中的温度有利于所述感染。这与真菌病斑在夜间生长得更快的事实一起使它成为热带和亚热带地区苞米的特别具有破坏性的病害。然而，NLB也存在于温带地区的苞米中。NLB的影响可以通过杀真菌剂、生物控制和改进的管理实践来减少。如果植物也对大斑凸脐蠕孢有抗性，则可以提高这些方法的有效性。
由大斑凸脐蠕孢引起的对NLB的抗性有两种形式：数量抗性，所述数量抗性由多个基因座组成，每个基因座对植物的抗性水平有少量贡献；或质量抗性，所述质量抗性由提供高水平抗性的单个种族特异性基因组成。虽然质量抗性往往是绝对抗性，但是迄今为止，苞米中对NLB的质量抗性并不是绝对的，并且通常提供将大斑凸脐蠕孢感染的发生延迟到超过所述植物的生命阶段(在所述生命阶段中感染将对产量和质量影响最大)的抗性。在有利于大斑凸脐蠕孢生长的环境条件下，病害压力可变得严重到足以克服质量抗性。质量抗性基于植物的Ht基因与真菌的无毒性(avr)基因之间的相互作用(图1)。当这些相互作用不相容时，大斑凸脐蠕孢不能感染植物。迄今为止，已鉴定出来自不同来源的九种不同Ht基因：2号染色体上的Ht1，8号染色体上的Ht2、HtNB和Htn1，7号染色体上的Ht3，1号染色体上的ht4，位置未知的HtM，2号染色体上的HtP以及3号染色体上的rt。基因的命名与大斑凸脐蠕孢种族的命名直接相关。每个大斑凸脐蠕孢种族都是根据相容的Ht基因命名的，即该种族可以感染具有相关基因的植物。例如，大斑凸脐蠕孢种族12可以感染具有Ht1和/或Ht2基因的植物。基因HtNB和Htn1，在本文中都称为并统称为HtN，源自不同的来源，但是都与含有avr基因的大斑凸脐蠕孢种族相容并且具有相同的抗性谱。质量抗性不一定持久，因为相容的大斑凸脐蠕孢种族的出现可使Ht基因无效。此外，大斑凸脐蠕孢群体一般由不同种族的混合物组成。种族的组成因地理区域而异(图2)。
因此，育种者一般已经尝试组合不同的Ht基因来生产抗性培育品种。然而，这并不总是容易或可能的，因为Ht基因源自不同的来源和/或物种，并且所述来源具有不同的遗传背景。此外，如果基因位于基因组上的相似区域(诸如Ht2和HtN)中，则很难将基因以顺式构型组合。在育种群体中引入数量抗性更加困难，因为单个基因座的小抗性效应难以检测并且育种者必须确保所有抗性基因都被转移以便获得供体植物的抗性水平。鉴定以及使用赋予对所有流行的大斑凸脐蠕孢种族的抗性的单个基因的能力将显著简化育种并将提供显著的益处。
本发明人已在苞米中鉴定出了赋予对多于一个大斑凸脐蠕孢种族的广谱抗性的新型Ht基因。在具体的实施方案中，该基因提供了对选自由种族1、种族2、种族N和种族M组成的组的至少两个大斑凸脐蠕孢种族的任何组合的抗性。HtX与Ht2和HtN位于8号染色体上的同一基因簇中。由HtX基因提供的抗性是加性的。HtX的纯合构型将赋予更高水平的抗性。在由美国普渡大学农业实验站(Agricultural Experiment Station of PurdueUniversity)和USDA,ARS开发的苞米品系H111中鉴定出了HtX抗性基因。如实施例4中所解释的，约50％的H111基因组来自凹痕品系B37，而另外约50％来自开放授粉的群体PI209135。PI 209135也称为Mayorbela，并且为热带来源的。鉴于PI 209135的异质性，许多其他遗传上不同的品系已来源于这种群体。
本发明人已经首次探索到，在公共苞米B73参考基因组4.0版(B73 RefGen_v4)的8号染色体上157,566,509bp处具有[C/T]变化的性状连锁SNP标记M1可用于追踪HtX基因并使其渐渗到优良种质中，并且可用于将它与由Ht2和HtN赋予的抗性区分开来，即使这些基因位于同一基因组区域中也如此。苞米的公共参考基因组可从例如www.maizegdb.org处的苞米遗传学和基因组学数据库(Maize Genetics and Genomics Database)获得，并且本领域技术人员将理解本申请中首次提供的标记序列可定位在公共基因组的任何版本(包括以后的版本)上。因此，本发明的一个方面提供了包含渐渗物的甜玉米和农艺学上优良的玉米植物，其中所述渐渗物包含在标记M1(SEQ ID NO:1)处的来自马齿型玉蜀黍变种的染色体区段。
在某些实施方案中，提供了在8号染色体上包含来自马齿型玉蜀黍变种的渐渗物的玉米植物，其中所述渐渗物包含相对于缺乏所述渐渗物的植物赋予对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性的单个基因。在进一步的实施方案中，对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性是加性的。
在其他实施方案中，本发明提供了包含本文提供的新型重组渐渗物中的一种或多种新型重组渐渗物的植物。这些新型渐渗物提供了稳健的对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性。在一些实施方案中，所述广谱抗性包括对多个大斑凸脐蠕孢种族的抗性。在进一步的实施方案中，所述广谱抗性包括对大斑凸脐蠕孢种族1、2、M和N的抗性。进一步提供了生产本文所述的植物的方法。
本发明进一步提供了新型的性状连锁标记，所述新型性状连锁标记可用于生产如本文所述的8号染色体上包含赋予对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性的新型渐渗物的玉米植物。在特定实施方案中，本发明提供了性状连锁标记M1(SEQ ID NO:1)。
进一步提供了生产本文所述的包含来自马齿型玉蜀黍变种的染色体区段的植物的方法。在一些示例中，来自抗性供体亲本的供体DNA被渐渗到玉米品系(轮回亲本品系)中。使用M1(SEQ ID NO:1)来选择抗性供体亲本的等位基因。
在某些实施方案中，本发明提供了生产或选择表现出改进的对大斑凸脐蠕孢的抗性的玉米植物的方法，所述方法包括：a)将本文提供的玉米植物与自身或与不同基因型的第二玉米植物杂交，以产生一种或多种子代植物；以及b)选择包含所述渐渗物的子代植物。在一些实施方案中，本发明的方法包括通过检测包含标记基因座M1(SEQ ID NO:1)的核酸来选择子代植物。
因为遗传上不同的植物品系可能难以杂交，所以使用常规育种方法将大斑凸脐蠕孢抗性等位基因渐渗到栽培的品系中可能需要过大的分离群体用于子代筛选，且结果不确定。因此，标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)是将大斑凸脐蠕孢抗性等位基因有效渐渗到优良栽培品种中所必需的。这已经由于之前无法解析与抗病性相关联的特定区域而变得复杂。本发明首次通过提供用于检测与抗病性相关联的基因型的改进且经验证的标记而实现有效的MAS，而无需为了观察表型而使大的植物群体生长至成熟。
I.与玉米植物抗病性相关联的基因组区域、等位基因和多态性
北方叶枯病(NLB)是由大斑凸脐蠕孢(也称为大斑刚毛座腔菌)引起的叶面病害，其导致苞米作物的产量显著损失。已经鉴定出了大斑凸脐蠕孢抗性基因座，包括Ht1、Ht2、Ht3、HtN和HtM。Ht2和HtN都位于8号染色体(NLB_8.1)上的大斑凸脐蠕孢抗性基因簇中，而Ht1位于2号染色体上。这些基因中的每一个基因都赋予了对某些大斑凸脐蠕孢分离株的抗性。为了生产对大斑凸脐蠕孢具有广谱且持久的抗性的苞米植物，可以将几个不同的抗性基因座和等位基因组合在单个苞米品系中。通过组合不同的基因座，植物将具有广谱且持久的抗性。由于病原体不太可能进化来克服多种抗性模式，因此抗性很可能是持久的。本发明提供了一个或多个与对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性相关联的等位基因在玉米植物中的新型渐渗物，以及用于在植物育种期间追踪所述渐渗物的多态性核酸和连锁标记。
表现出大斑凸脐蠕孢抗性的苞米品系是本领域中已知的，并且可以与根据本发明的某些实施方案的本文提供的新型性状连锁标记一起使用。例如，品系H111，也带有名称PI550527，可用作大斑凸脐蠕孢抗性的来源。这种来源可在美国国家植物种质系统(U.S.National Plant Germplasm System)和美国爱荷华州艾姆斯的中北部植物引进站(North Central Plant Introduction Station in Ames,Iowa,USA)获得。此外，以ATCC登录号PTA-125393保藏的种子可用作抗性性状的来源。
使用本发明的改进的遗传标记和测定，本发明人能够成功地鉴定来自马齿型玉蜀黍变种的新型渐渗物，所述新型渐渗物赋予植物中对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性。在某些实施方案中，本发明提供了甜玉米植物，其在8号染色体上包含在标记基因座M1(SEQ ID NO:1)处的马齿型玉蜀黍变种DNA。在其他实施方案中，本发明提供了包含这种标记基因座和与其相关联的对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性的任何类型的农艺学上优良的玉米植物。
本文提供的新型渐渗物赋予对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性，而无需组合多个种族特异性抗性基因座。因此，本发明代表了本领域中的显著进步。
II.与大斑凸脐蠕孢抗性相关联的基因组区域的渐渗
标记辅助渐渗涉及将由一个或多个标记限定的染色体区域从第一遗传背景转移到第二遗传背景中。含有渐渗的基因组区域的杂交的后代可通过来自第一遗传背景的所需渐渗的基因组区域所特有的标记与第二遗传背景所特有的连锁和非连锁标记的组合来鉴定。
本发明提供了用于鉴定和追踪本文公开的基因组区域中的一个或多个基因组区域从大斑凸脐蠕孢抗性植物向甜玉米品系中的渐渗的新型准确标记。本发明进一步提供了用于在植物育种期间鉴定和追踪本文公开的新型渐渗物的标记，包括标记M1。
在本发明的基因组区间中的任何基因组区间内或与之连锁的标记可用于包括使与抗病性相关联的基因组区域渐渗到所需的遗传背景中在内的多种育种工作。例如，与本文所述的抗病性相关联的标记的40cM、20cM、15cM、10cM、5cM、2cM或1cM内的标记可用于与抗病性表型相关联的基因组区域的标记辅助渐渗。
还提供了苞米植物，所述苞米植物包含一个或多个与所需表型相关联的渐渗区域，其中至少10％、25％、50％、75％、90％或99％的剩余基因组序列携带轮回亲本种质所特有的标记。还提供了包含渐渗区域的甜玉米植物，所述渐渗区域包含与本文提供的与抗病性表型相关联的基因组区域和标记紧密连锁或相邻的区域。
III.抗病苞米品种的开发
对于大多数育种目标，商业育种者利用的是“栽培”、“栽培类型”或“优良”种质。如本文所用，“优良”或“栽培”品种意指通过育种并针对用于农业中的优异(superior)农艺学性能进行选择而获得的品种。这包括可以被栽培的杂交品种的亲本，以及本身被栽培的品种。这些栽培的品系在育种期间可用作轮回亲本或轮回亲本等位基因的来源。栽培的或优良的种质更容易育种，因为这些种质在评估园艺性能时一般表现良好。许多栽培的甜玉米类型已经被开发并且在本领域中被称为是农艺学上优良的并且适合于商业栽培。然而，栽培种质提供的性能优势可能会被缺乏等位基因多样性所抵消。育种者通常会接受这种折衷，因为用栽培材料进行育种比用遗传多样的来源进行育种进展更快。
相反，当栽培种质与非栽培种质杂交时，育种者可以获得来自非栽培类型的新型等位基因。非栽培种质可在育种期间用作供体等位基因的来源。然而，由于与不同品系之间的杂交相关联的育性问题以及来自非栽培亲本的负连锁阻力，这种途径一般存在重大问题。在苞米植物中，非栽培植物类型可以提供与抗病性相关联的等位基因。然而，这些非栽培类型可能具有较差的园艺品质，诸如易受某些有害性状或病害的损害。
如本文所提及的苞米或玉米植物是指选自玉蜀黍属的任何植物，包括但不限于选自玉蜀黍物种的任何植物。在进一步的实施方案中，所述植物可以选自亚种玉蜀黍亚种(Zea mays L.ssp)。玉蜀黍属，例如玉蜀黍亚种马齿型玉蜀黍(Zea mays L.subsp.maysIndentata)，也称为凹痕玉米；玉蜀黍亚种硬粒玉蜀黍(Zea mays L.subsp.maysIndurata)，也称为硬质玉蜀黍；玉蜀黍亚种甜质型玉蜀黍(Zea mays L.subsp.maysSaccharata)，也称为甜玉米；玉蜀黍亚种粉质型玉蜀黍(Zea mays L.subsp.maysAmylacea)，也称为面粉玉米；或玉蜀黍亚种爆裂型玉蜀黍(Zea mays L.subsp.maysEverta)，也称为爆玉米花。玉蜀黍属植物包括杂交体、近交系、部分近交系，或确定或未确定群体的成员。
在避免连锁阻力或遗传力低的问题的同时使合乎需要的抗性基因从非栽培品系渐渗到优良栽培品系中的过程是一个漫长且通常艰巨的过程。因此，部署源自野生近缘种的等位基因的成功强烈取决于缺乏有害效应的最小或截短的渐渗物和替代表型筛选的可靠标记测定。通过简化关键属性的遗传学以允许集中于数量性状(诸如抗病性)的遗传增益来进一步界定成功。用于标记辅助选择(MAS)的准确标记的可获得性可极大地促进来自非栽培品系的基因组区域渐渗的过程。
因此，本领域技术人员将理解，本发明提供的等位基因、多态性和标记允许对本文中鉴定出的任何基因组区域进行追踪并将其引入到任何遗传背景中。另外，本文公开的与抗病性相关联的基因组区域可以从一种基因型渐渗到另一种基因型中，并可使用MAS来追踪。因此，申请人的与抗病性相关联的准确标记的发现将促进具有有益表型的苞米植物的开发。例如，可以使用本发明的标记对种子进行基因分型，以便选择包含与抗病性相关联的所需基因组区域的植物，而无需使植物生长至成熟以评估表型。此外，MAS允许鉴定对于所需渐渗物纯合或杂合的植物。
物种间杂交也可导致重组受到抑制，并且可导致植物的育性或繁殖力低。例如，已在番茄线虫抗性基因Mi、大麦中的Mla和Mlg基因、小麦中的Yr17和Lr20基因、葡萄藤中的Run1基因以及花生中的Rma基因中观察到重组受到抑制。减数分裂重组是经典育种所必需的，因为它能够使有利的等位基因在遗传背景之间转移，去除有害的基因组片段，以及累加在遗传上紧密连锁的性状。因此，受到抑制的重组迫使育种者扩大用于子代筛选的分离群体，以便达到所需的遗传组合。
大量群体的表型评估是一项耗时的、资源密集的工作，而且不是在每种环境下均可再现的。标记辅助选择提供了一种可行的替代方案。被设计成检测独特多态性(诸如SNP)的分子测定是通用的。然而，它们可能无法在单次测定中区分苞米物种内和苞米物种之间的等位基因。染色体的结构重排(如缺失)会损害合成标记的寡核苷酸的杂交和延伸。在发生复制事件的情况下，多个拷贝在单个反应中无区别地扩增。因此，准确的高预测性标记的开发和验证对于成功的MAS育种程序至关重要。本文提供的玉米植物、种子或细胞可以被遗传转化。
已经开发了许多植物转化方法，包括生物和物理植物转化方案。参见例如Miki等人，“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”，Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology,Glick和Thompson编著，CRC Press,Inc.,BocaRaton，第67-88页(1993)。此外，用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达载体和体外培养方法也是可获得的。参见例如Gruber等人，“Vectors for Plant Transformation,”Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology,Glick和Thompson编著，CRCPress,Inc.,Boca Raton，第89-119页(1993)。
一种将表达载体引入到植物中的方法是基于农杆菌属(Agrobacterium)的天然转化系统。参见例如Horsch等人，A Simple and General Method for Transferring Genesinto Plants.Science,227:1229-1231(1985)。根癌农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)是植物病原性土壤细菌，它们对植物细胞进行遗传转化。例如美国专利号5,563,055提供了用于农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述，该美国专利的全部内容以引用方式并入本文。
已经开发了统称为直接基因转移的几种植物转化方法作为农杆菌介导的转化的替代方案。一种普遍适用的植物转化方法是微粒介导的转化，其中DNA携带在微粒的表面上。使用基因枪设备将表达载体引入植物组织中，所述基因枪设备将微粒加速至300m/s至600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和细胞膜。
另一种将DNA物理递送至植物中的方法是对靶细胞进行超声处理。替代地，脂质体和原生质体融合已被用来将表达载体引入植物中。也可以使用原生质体和整个细胞和组织的电穿孔。
在玉米靶组织转化后，上述选择性标记基因的表达允许使用本领域公知的再生和选择方法优先选择转化的细胞、组织和/或植物。
通常使用前述转化方法生产转基因品种。然后可以将转基因品种与另一个(非转化或转化的)品种杂交，以产生新转基因品种。替代地，可以使用植物育种领域中公知的传统回交技术将已经使用前述转化技术工程化到特定玉米品系中的遗传性状移动到另一品系中。例如，回交途径可用来将工程化的性状从公共、非优良品种移动到优良品种中，或者从基因组中含有外源基因的品种移动到一个或多个不含该基因的品种中。
许多可以通过渐渗或转化引入的理想性状，诸如在此描述的那些理想性状，也可以通过使用基因组编辑分子技术直接引入植物中。本发明的一个方面包括具有已通过位点特异性基因组修饰技术改变的基因组的植物。
本文提供的玉米植物、种子或细胞也可以通过一种或多种基因组工程化技术产生或经受进一步的基因组编辑。例如，可以将一个或多个NLB抗性等位基因引入到NLB易感背景中。示例性的基因组工程化技术包括大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALEN和CRISPR/Cas9系统。参见例如，Gaj等人，ZFN,TALEN,and CRISPR/Cas-based methods for genomeengineering.Trends in Biotechnology,31:397-405(2013)。还设想了本领域普通技术人员已知的另外的基因组工程化技术。位点特异性基因组修饰技术包括使用酶，诸如核酸内切酶、重组酶、转座酶、解旋酶以及它们的任何组合。在一个方面中，核酸内切酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)、Argonaute和RNA引导的核酸酶，例如CRISPR相关核酸酶。在另一方面中，核酸内切酶是Cas9或Cpf1。
位点特异性基因组修饰酶在基因组序列的靶位点处诱导基因组修饰，诸如双链DNA断裂(DSB)或单链DNA断裂，所述基因组修饰然后被同源重组(homologousrecombination,HR)或非同源末端连接(non-homologous end-joining,NHEJ)的自然过程修复。然后在切割的位点处发生序列修饰，所述序列修饰可包括在NHEJ的情况下导致基因破坏的缺失或插入，或由同源重组所致的外源序列的整合。例如，这些技术可用来改变含有本发明的偶联事件的植物中的另一个基因座、改变本发明的偶联事件，或在不同的植物背景中重新创建本发明的偶联事件。
IV.标记辅助育种技术
可用于实施本发明的遗传标记包括但不限于限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列重复序列(SSR)、简单序列长度多态性(SSLP)、单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失多态性(Indel)、可变数量串联重复序列(VNTR)和随机扩增多态性DNA(RAPD)、同工酶和本领域技术人员已知的其他标记。作物植物中的标记发现和开发为针对标记辅助育种活动的应用提供了初始框架(美国专利公布号：2005/0204780、2005/0216545、2005/0218305和2006/0504538)。所得的“遗传图谱”是所表征的基因座(多态性核酸标记或其中等位基因可被鉴定的任何其他基因座)彼此之间相对位置的表示。
包含少至单个核苷酸变化的多态性可以通过许多方式测定。例如，可以通过包括单链构象多态性(Orita等人(1989)Genomics,8(2),271-278)、变性梯度凝胶电泳(Myers(1985)EPO 0273085)或切割片段长度多态性(Life Technologies,Inc.,Gathersberg,MD)在内的电泳技术进行检测，但DNA测序的广泛可获得性往往使直接对扩增产物进行简单测序变得容易。一旦已知多态性序列差异，就可以设计用于子代测试的快速测定，通常涉及特定等位基因的某些型式的PCR扩增(PASA；Sommer等人，Biotechniques 12(1),82-87,1992)或多个特定等位基因的PCR扩增(PAMSA；Dutton和Sommer，Biotechniques,11(6),700-7002,1991)。
多态性标记充当用于测定植物以确定品系或品种的同一性程度的有用工具(美国专利号6,207,367)。这些标记形成了用于确定与表型的相关性的基础，并且可用于驱动遗传增益。在本发明方法的某些实施方案中，多态性核酸可以用来在苞米植物中检测与抗病性相关联的基因型，鉴定具有与抗病性相关联的基因型的苞米植物，以及选择具有与抗病性相关联的基因型的苞米植物。在本发明方法的某些实施方案中，多态性核酸可用来生产在基因组中包含与抗病性相关联的渐渗的基因座的苞米植物。在本发明的某些实施方案中，多态性核酸可用来育种包含与抗病性相关联的基因座的子代苞米植物。
遗传标记可以包括“显性”或“共显性”标记。“共显性”标记揭示存在两个或更多个等位基因(每个二倍体个体两个)。“显性”标记揭示仅存在单个等位基因。标记优选以共显性方式遗传，以便二倍体基因座上两个等位基因或者三倍体或四倍体基因座上多个等位基因的存在可容易地被检测到，并且它们没有环境变化，即，其遗传力为1。标记基因型通常在二倍体生物的每个基因座处包含两个标记等位基因。每个基因座的标记等位基因组成可以是纯合或杂合的。纯合性是基因座处的两个等位基因都被表征为相同核苷酸序列的情况。杂合性是指基因座处的等位基因的不同状态。
用于确定遗传多态性的存在或不存在(即，用于基因分型)的基于核酸的分析可以用于育种程序以进行鉴定、选择、渐渗等。用于遗传多态性分析的多种多样的遗传标记是可获得的，并且是本领域技术人员已知的。该分析可用来选择包含或连锁至与苞米植物中的抗病性连锁或相关联的遗传标记的基因、基因部分、QTL、等位基因或基因组区域。
如本文所用，核酸分析方法包括但不限于基于PCR的检测方法(例如，TaqMan测定)、微阵列方法、基于质谱的方法和/或核酸测序方法(包括全基因组测序)。在某些实施方案中，通过使用核酸扩增方法可促进DNA、RNA或cDNA样品中多态性位点的检测。此类方法特别增加跨多态性位点或包括位于其远端或近端的位点和序列的多核苷酸的浓度。此类扩增的分子可容易地通过凝胶电泳、荧光检测方法或其他手段检测。
一种实现此种扩增的方法采用聚合酶链式反应(PCR)(Mullis等人，(1986)ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263-273；欧洲专利50,424；欧洲专利84,796；欧洲专利258,017；欧洲专利237,362；欧洲专利201,184；美国专利4,683,202；美国专利4,582,788；和美国专利4,683,194)，使用能够与以其双链形式定义多态性的近端序列杂交的引物对。也可以使用基于质谱的DNA分型方法。此类方法公开在美国专利6,613,509和6,503,710以及见于其中的参考文献中。
可通过本领域中熟知的多种有效方法来检测或分型DNA序列中的多态性，所述有效方法包括但不限于以下专利中公开的那些：美国专利号5,468,613、5,217,863；5,210,015；5,876,930；6,030,787；6,004,744；6,013,431；5,595,890；5,762,876；5,945,283；5,468,613；6,090,558；5,800,944；5,616,464；7,312,039；7,238,476；7,297,485；7,282,355；7,270,981和7,250,252，这些专利全部以引用方式整体并入本文。然而，本发明的组合物和方法可与任何多态性分型方法结合使用以对基因组DNA样品中的多态性进行分型。所用的这些基因组DNA样品包括但不限于直接从植物分离的基因组DNA、克隆的基因组DNA或扩增的基因组DNA。
例如，可通过与等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交来检测DNA序列中的多态性，如美国专利号5,468,613和5,217,863中所公开的。美国专利号5,468,613公开了等位基因特异性寡核苷酸杂交，其中核酸序列中的单个或多个核苷酸变异可通过这样的过程在核酸中检测到，在所述过程中对含有核苷酸变异的序列进行扩增，将其点涂在膜上并用标记的序列特异性寡核苷酸探针进行处理。
靶核酸序列也可通过例如如美国专利号5,800,944中所公开的探针连接方法来检测，在所述探针连接方法中对感兴趣的序列进行扩增并将其与探针杂交，之后进行连接，以检测探针的经标记部分。
微阵列也可用于多态性检测，其中寡核苷酸探针组以重叠的方式被组装从而表示单个序列，使得靶序列在一个点处的差异将导致部分探针杂交(Borevitz等人，GenomeRes.13:513-523,2003)；Cui等人，Bioinformatics 21:3852-3858,2005)。在任何一个微阵列上，预期将存在多个靶序列，其可表示基因和/或非编码区，其中每个靶序列是由一系列重叠寡核苷酸而不是单个探针来表示。此平台提供对多个多态性的高通量筛选。美国专利号6,799,122；6913879；和6,996,476中公开了通过基于微阵列的方法对靶序列的分型。
用于检测SNP和Indel的其他方法包括单碱基延伸(single base extension,SBE)方法。SBE方法的实例包括但不限于美国专利号6,004,744；6,013,431；5,595,890；5,762,876；和5,945,283中公开的那些。
在另一种用于检测多态性的方法中，SNP和Indel可以通过美国专利号5,210,015；5876930；和6,030,787中公开的方法来检测，在该方法中寡核苷酸探针具有共价连接到所述探针的5'和3'端的5'荧光报告染料和3'淬灭染料。当探针完整时，报告染料与猝灭染料的接近导致报告染料荧光的抑制，例如由Forster型能量转移所致的抑制。在PCR期间，正向引物和反向引物与侧接多态性的靶DNA的特异性序列杂交，而杂交探针与扩增的PCR产物内的含有多态性的序列杂交。在随后的PCR循环中，具有5’→3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶切割探针并将报告染料与猝灭染料分离，从而导致报告物的荧光增加。
在另一个实施方案中，可使用核酸测序技术对一个或多个感兴趣的基因座直接测序。用于核酸测序的方法是本领域中已知的，并且包括由以下公司提供的技术：454LifeSciences(Branford,CT)、Agencourt Bioscience(Beverly,MA)、Applied Biosystems(Foster City,CA)、LI-COR Biosciences(Lincoln,NE)、NimbleGen Systems(Madison,WI)、Illumina(San Diego,CA)和VisiGen Biotechnologies(Houston,TX)。此类核酸测序技术包括诸如以下的形式：平行珠粒阵列、连接法测序、毛细管电泳、电子微芯片、“生物芯片”、微阵列、平行微芯片和单分子阵列。
V.附加育种技术
本文提供的苞米植物或种子也可以经受使用本领域中的一种或多种已知方法进行的附加育种，例如谱系育种、轮回选择、混合选择(mass selection)和突变育种。系谱育种从两个基因型的杂交开始，所述两个基因型为例如本文提供的包含一个大斑凸脐蠕孢抗性基因或大斑凸脐蠕孢抗性等位基因或两个偶联的大斑凸脐蠕孢抗性QTL或两个偶联的大斑凸脐蠕孢抗性等位基因的苞米品种和另一个缺乏此种基因座的苞米品种。如果两个原始亲本没有提供所有所需的特征，则可以将其他来源包括在育种群体中。在系谱方法中，使优异植物自交并在后续杂交世代(filial generation)中进行选择。在后续杂交世代中，由于自我受精和选择，杂合条件让位于同质品种。通常在系谱育种方法中，实施以下五个或更多个后续杂交世代的自交和选择：F1至F2；F2至F3；F3至F4；F4至F5等。在足够量的近交后，后续杂交世代将有助于增加已开发品种的种子。开发的品种可在其约95％或更多的基因座上包含纯合等位基因。
除了用于创建回交转换外，回交还可以与谱系育种组合使用。如前所讨论的，回交可用来将一个或多个特别合乎需要的性状从一个品种(供体亲本)转移到称为轮回亲本的已开发品种中，该已开发品种具有总体良好的农艺学特性但缺乏所述合乎需要的一种或多种性状。然而，可以利用相同的程序使子代移向轮回亲本的基因型，但与此同时通过在早期停止回交并继续进行自交和选择来保留非轮回亲本的许多组分。例如，可以使苞米品种与另一个品种杂交以产生第一代子代植物。然后可以将第一代子代植物与其亲本品种中的一个亲本品种回交以创建BC1或BC2。子代被自交和选择为使得新开发的品种具有轮回亲本的属性中的许多属性和非轮回亲本的所需属性中几种所需属性。这种途径利用轮回亲本的价值和优势用于新苞米品种。
轮回选择是一种在植物育种计划中用于改进植物群体的方法。该方法需要各个植物彼此异花授粉以形成子代。使子代生长并通过包括单个植物、半同胞子代、全同胞子代和自交子代的多种选择方法选择优异子代。选定的子代彼此异花授粉以形成另一个群体的子代。种植该群体并再次选择优异植物以进行彼此异花授粉。轮回选择是一个循环过程，并且因此可以根据需要重复多次。轮回选择的目的是改进群体的性状。然后可以将改进的群体用作育种材料的来源，以获得用于商业或育种用途的新品种，包括合成品系的生产。合成品系是由几个选定品种杂交而成的子代。
当与分子标记增强的选择结合使用时，混合选择是另一种有用的技术。在混合选择中，基于表型或基因型选择来自个体的种子。然后将这些选定的种子散装在一起，并将其用于生长下一代。集团选择(bulk selection)需要使植物群体在大面积地块中生长，从而使植物自花授粉，大量收获种子，然后使用大量收获的种子样品种植下一代。此外，可以使用定向授粉代替自花授粉作为育种计划的一部分。
突变育种也可用来将新性状引入本文提供的玉米植物或种子中。自发发生或人为诱发的突变对于植物育种者来说可能是有用的变异性来源。人工诱变的目标是增加所需特征的突变率。突变率可以通过许多不同的手段增加，所述手段包括温度、长期种子存储、组织培养条件、辐射(诸如X射线、伽马射线(例如，钴-60或铯-137)、中子(原子反应堆中的铀-235核裂变的产物)、β辐射(从放射性同位素诸如磷-32或碳-14发出)，或紫外线辐射(从2500nm至2900nm)，或化学诱变剂(诸如碱类似物(5-溴尿嘧啶)、相关化合物(8-乙氧基咖啡因)、抗生素(链霉素)、烷化剂(硫芥、氮芥、环氧化物、乙胺、硫酸盐、磺酸盐、砜、内酯)、叠氮化物、羟胺、亚硝酸或吖啶)。本公开还涵盖基于转座子或T-DNA的诱变。一旦通过诱变观察到所需性状，就可以随后通过传统育种技术将该性状整合到现有种质中。
VI.定义
提供了以下定义来更好地限定本发明并指导本领域普通技术人员实践本发明。除非另外说明，否则术语应按照相关技术领域普通技术人员的常规用法来理解。
如本文所用，“北方叶枯病”或“NLB”或“北方玉米叶枯病”或“NCLB”是指由真菌病原体大斑凸脐蠕孢引起的植物病害，所述大斑凸脐蠕孢也被称为大斑病长蠕孢(Helminthosporium turcicum)和大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)。
如本文所用，术语“顺式构型”或“顺式连锁”是指其中两个或更多个等位基因在同一亲本染色体上连锁的布置。术语“反式构型”或“反式连锁”是指其中两个或更多个等位基因布置在不同亲本染色体上的构型。
如本文所用，术语“重组”或“重组的”在染色体区段的情境下是指包含呈某一构型的一个或多个遗传基因座的重组DNA序列，它们在自然界中未被发现，是例如由于减数分裂期间同源染色体之间的重组事件而产生的。
如本文所用，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、可从其再生甜玉米植物的组织培养物的植物细胞、植物愈伤组织、植物块(plant clump)以及在植物或植物部分(如花粉、花、种子、叶、茎等)中完整的植物细胞。
如本文所用，术语“群体”意指共有共同亲本来源的植物的遗传异质集合体。
如本文所用，术语“品种”和“栽培品种”意指根据其遗传谱系和性能可以从同一物种内的其他品种中鉴定出的一组类似植物。
如本文所用，“等位基因”是指染色体上给定基因座处的基因组序列的两种或更多种替代形式之一。
“数量性状基因座(quantitative trait locus,QTL)”是编码影响表型的表达度的至少第一等位基因的染色体位置。
如本文所用，“标记”意指可用来区分生物体的可检测特征。此类特征的实例包括但不限于遗传标记、生物化学标记、代谢物、形态特征和农艺学特征。
如本文所用，术语“表型”意指可受基因表达影响的细胞或生物体的可检测特征。
如本文所用，术语“基因型”意指植物的特定等位基因组成。
如本文所用，“优良”或“栽培”品种意指这样的任何品种，其是通过育种和针对优异农艺学性能进行选择而获得的，因此在杂交品种的情况下适合用于商业栽培，或者适合用于杂交以产生栽培的杂交品种。关于植物或品种的术语“栽培的”包括杂交栽培玉米品种的亲本品系。“优良植物”是指属于优良品种的植物。许多优良品种是玉米育种领域的技术人员可获得且已知的。“优良群体”是可用于代表给定作物物种(诸如玉米)在农艺学上优异的基因型方面的现有技术水平的优良个体或品种的分类。类似地，“优良种质”或优良种质株系是农艺学上优异的种质。
如本文所用，关于植物或品种的“农艺学上优良的凹痕玉米”是指其中基因组的至少95％源自如上文所述的优良凹痕玉米品种的植物或品种。
如本文所用，术语“渐渗的”，当针对遗传基因座使用时，是指已引入到新遗传背景中(诸如通过回交)的遗传基因座。遗传基因座的渐渗可通过植物育种方法和/或分子遗传学方法来实现。此类分子遗传学方法包括但不限于各种植物转化技术和/或提供同源重组、非同源重组、位点特异性重组的方法和/或提供基因座替代或基因座转化的基因组修饰。
如本文所用，术语“重组”或“重组的”在染色体区段的情境下是指包含呈某一构型的一个或多个遗传基因座的重组DNA序列，它们在自然界中未被发现，是例如由于减数分裂期间同源染色体之间的重组事件而产生的。
如本文所用，术语“连锁的”，当在核酸标记和/或基因组区域的情境下使用时，意指标记和/或基因组区域位于同一连锁群或染色体上，使得它们在减数分裂时倾向于一起分离。
如本文所用，“耐受基因座”意指与对病害的耐受性或抗性相关联的基因座。例如，在一个实施方案中，根据本发明的耐受基因座可控制对大斑凸脐蠕孢的耐受性或易感性。
如本文所用，植物中的“耐受性”或“改进的耐受性”是指植物在病害条件下例如通过维持产量而表现良好的能力。耐受性还可以是指植物在病害条件下维持植物活力表型的能力。耐受性是一个相对术语，表示与在类似病害条件下生长的不同(耐受性较差)植物(例如，不同植物品种)相比，“耐受性”植物更能够保持性能。本领域技术人员将了解，植物对病害条件的耐受性变化很大，并且可代表耐受性更高或耐受性更低的表型谱。然而，通过简单观察，本领域技术人员一般可确定不同植物、植物品种或植物科在病害条件下的相对耐受性，且此外，还将识别“耐受性”的表型等级。
如本文所用，植物中对病害条件的“抗性”或“改进的抗性”是所述植物比非抗性或抗性较低的植物更能减少病害负担的指示。抗性是一个相对术语，表示“抗性”植物与在类似病害条件下生长的不同(抗性较低)植物(例如，不同植物品种)相比，更能够减轻病害负担。本领域技术人员将了解，植物对病害条件的抗性变化很大，并且可代表抗性更高或抗性更低的表型谱。然而，通过简单观察，本领域技术人员一般可确定不同植物、植物品种或植物科在病害条件下的相对抗性，且此外，还将识别“抗性”的表型等级。
如本文所用，“抗性等位基因”意指与对病害的耐受性或抗性相关的核酸序列。
术语“约”用于指示值包括用于确定所述值的设备或方法的误差的标准偏差。除非明确指明仅指代替代方案或替代方案相互排斥，否则权利要求书中所用的术语“或”用于意指“和/或”，但本公开支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。当在权利要求书中与词语“包含(comprising)”或其他开放语言结合使用时，除非明确指出，否则词语“一个/种(a/an)”表示“一个(种)或多个(种)”。术语“包含(comprise)”、“具有(have)”和“包括(include)”是开放式连系动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅具有那一个或多个步骤并且还涵盖其他未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个性状的任何植物不限于仅具有这一个或多个性状并且还覆盖其他未列出的性状。
VII.保藏信息
保藏物由至少625颗甜玉米品系种子组成，所述甜玉米品系种子包含如本文所述的来自马齿型玉蜀黍变种的渐渗物。保藏物是在美国典型培养物保藏所(American TypeCulture Collection(ATCC)),10801University Boulevard,Manassas,Va.20110-2209USA中进行保藏的。保藏物被分配了ATCC登录号PTA-125393，并且保藏日期为2018年10月9日。在本申请未决状态期间，享有保藏物权利的人可以请求获取所述保藏物。保藏物将在作为公共保藏所的ATCC保藏所中被保存30年，或者在最近一次请求后的5年或者专利的可执行寿命内被保存，以较长者为准，并且如果保藏物在此期间不能存活，则将被替换。申请人不允许对根据本专利或任何其他形式的品种保护(包括植物品种保护法(7U.S.C.2321以及以下等等))授予的权利的任何侵犯。
实施例
实施例1.具有对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性的来源的鉴定
由大斑凸脐蠕孢(也称为大斑刚毛座腔菌)引起的苞米对北方叶枯病(NLB)的抗性由质量(单基因)抗性和数量(多基因)抗性赋予。已充分表征的苞米的大斑凸脐蠕孢抗性的质量基因是Ht1、Ht2、Ht3、HtN和HtM。有已知的大斑凸脐蠕孢分离株可以克服这些质量抗性基因中的每一个质量抗性基因。基于分离株可以克服的抗性基因，将分离株表征为多个种族。因此，大斑凸脐蠕孢种族被表征为种族0、种族1、种族2、种族3、种族N、种族M及其所有可能的排列(例如种族12、种族2N等)，其中种族编号或字母表示分离株对其具有毒性的Ht基因。通过多次温室测定，H111被鉴定为提供了对所有大斑凸脐蠕孢种族的抗性。H111在被接种大斑凸脐蠕孢时呈现出抗性病斑类型(小坏死斑点)，所述抗性病斑类型可与由其他已知抗性基因引起的抗性病斑类型区分开来。H111源自杂交B37×PI 209135。PI 209135，也称为Mayorbela，是一种非优良热带群体，在其对大斑凸脐蠕孢和许多其他病害(包括南方叶枯病、炭疽病、苞米矮花叶病毒和苞米褪绿矮缩病毒)的抗性方面得到充分的表征。H111先前被证明对大斑凸脐蠕孢种族1和2具有抗性。据报道，PI 209135来源品系H102(C123×PI209135)中存在基因HtM，但该基因不赋予对大斑凸脐蠕孢分离株的广谱抗性。因此，H111提供对大斑凸脐蠕孢的抗性的新型来源。
实施例2.H111来源的大斑凸脐蠕孢抗性的QTL定位
开发了来自两个双亲群体的F2衍生的F3(F2:3)家族，以对品系H111：“近交系1”×H111和“近交系2”×H111中赋予对大斑凸脐蠕孢的抗性的基因座进行定位。“近交系1”和“近交系2”是对大斑凸脐蠕孢完全易感的优良甜玉米近交品系。当给这两个群体接种大斑凸脐蠕孢种族2NM分离株时，在重复的田间试验中对这两个群体进行评估。参数连锁分析在8号染色体上鉴定出了跨越约12cM的单个QTL。该基因座解释了高达97％的观察到的表型变异。这表明来自H111的大斑凸脐蠕孢抗性是由单个质量抗性基因赋予的。QTL处的等位基因的作用主要是加性的。QTL的位置与已知的大斑凸脐蠕孢抗性基因簇在8号染色体上共定位，该8号染色体还具有质量抗性基因Ht2和HtN。鉴于给所述群体接种了大斑凸脐蠕孢种族2NM分离株，所述分离株对Ht2、HtN和HtM是剧毒的，来自H111的质量抗性不是由Ht2、HtN、和/或HtM赋予的。此外，据报道HtM是独立于Ht2和HtN分离的，提供了对品系H111所展现出的抗性不是由于从品系H102鉴定出的HtM基因引起的进一步支持。来自H111的抗性基因是新型的，并且被命名为HtX。
从这两个定位群体中，在温室中给源自对HtX纯合(抗性)、易感或杂合的F2植物的选定F3家族接种大斑凸脐蠕孢种族2NM和大斑凸脐蠕孢种族12分离株。HtX抗性基因的存在解释了F2:3家族中针对两种分离株的77-80％的病害发生率(表现出病害症状的植物的百分比)。对于温室测定中的发病率，HtX基因以显性方式对抗大斑凸脐蠕孢种族2NM，而它以部分显性方式对抗大斑凸脐蠕孢种族12。用于检测HtX的存在的性状连锁标记M1(SEQ IDNO:1)是使用一组204个甜玉米近交品系开发的，并且具有99.5％的遗传准确度。M1在公共玉米B73参考基因组4.0版(B73 RefGen_v4)的8号染色体上的157,566,509bp处包含[C/T]变化，并且可用于追踪种质中的性状并将所述性状与由同一基因组区域中的Ht2和HtN赋予的抗性区分开。
实施例3.HtX赋予广谱抗性的功效
在2018年，将抗性基因HtX引入两种不同的遗传背景中以测试它们对不同地区的不同组的种族的功效。确认了HtX基因的共显性性质。使用1至9的标度确定所有植物的病害指数。感染很少或没有感染的植物被评为1级，感染很少或没有感染被定义为植物在植物的下部区域中至多有少量分散的病斑；轻度感染的植物给予被评为3级，轻度感染被定义为下部叶片上有中等数量的病斑；中度感染给予被评为5级，中度感染被定义为下部叶片上有丰富的病斑并且中部叶片上有少量病斑；严重感染的植物被评为7级，严重感染被定义为下部和中部叶片上有丰富的病斑并且病斑延伸至上部叶片；感染非常严重的植物被评为9级，感染非常严重被定义为植物在所有叶片上都有丰富的病斑并且植物可能过早死亡。发现HtX的杂合部署结果使1至9的标度的病害指数降低了2分，而纯合部署使病害指数平均降低了附加2分(图3)。因此，对HtX杂合的植物表现出中等至高抗性，特征是轻微的症状，而具有纯合HtX的植物表现出高抗性，病害症状为零至可忽略不计。在温带地区中，病害指数<4被认为是商业上可接受的。
在2019年将HtX基因以不同的构型渐渗到六个附加杂交体背景中。在佛罗里达州针对来自大斑凸脐蠕孢的自然感染测试这些杂交体(6个杂交体背景×每个杂交体的3种型式)。本试验中使用的六种杂交体背景与2018年测试的两种杂交体背景不同。对每个杂交体在单次重复中进行测试，但是将结果在杂交体之间进行组合以用于基因构型之间的差异的统计分析。对HtX杂合的植物表现出中等至高抗性，特征是轻度症状，而具有纯合HtX的植物表现出高抗性，无论遗传背景如何，病害症状都为零至可忽略不计(图4)。此外，检查表明田间的大斑凸脐蠕孢种族对除HtX以外的所有已知抗性基因都是剧毒的。结果证实了由HtX基因提供的新型广谱抗性以及跨不同遗传背景的基因作用的加性模式。
由HtX基因赋予的抗性可能与由其他Ht基因赋予的抗性性状叠加。可以将HtX基因引入在8号染色体上包含含有呈顺式构型的Ht2和HtN抗性等位基因的重组染色体区段的苞米植物中。Ht2与HtN之间的偶联事件可以通过使近交品系B68HTN(携带HtN基因)和A619HT2(携带Ht2基因)杂交并选择Ht2与HtN之间的重组事件来创建。B68HTN和A619HT2均可从美国国家植物种质系统(U.S.National Plant Germplasm System)获得。表1给出了与Ht2和HtX抗性等位基因相关联并且可用于选择重组事件的标记。性状连锁标记Q-NZMAY009401770(SEQ ID NO:2)和Q-ZMHt2(SEQ ID NO:3)与Ht2抗性等位基因相关联。性状连锁标记Q-NZMAY009238970(SEQ ID NO:4)和Q-NZMAY009430172(SEQ ID NO:5)与HtN抗性等位基因相关联。
在8号染色体上包含呈顺式构型的Ht2和HtN抗性等位基因的重组染色体区段的鉴定和与重组事件相关联的标记描述于2018年9月28日提交的美国专利申请序列号16/145,987中，所述美国专利申请的公开内容以引用方式整体并入本文。
表1.Ht2和HtN的性状连锁标记
Figure BDA0003135932020000281
实施例4.H111的亲缘关系
如上所讨论的，H111源自杂交B37×PI 209135。H111中亲本单倍型的遗传是通过针对两个亲本来源的贡献测定整个基因组的35,971个SNP来估计的。假设在B37与H111之间具有高基因型相似性(>0.975)的基因组区域表明通过H111遗传了B37单倍型。使用这种方法可以明白地定义亲本重组断裂点和单倍型区块。基于此分析，鉴定了源自PI 209135的亲本单倍型的H111的染色体区域。发现HtX基因的位置在8号染色体上从PI 209135遗传的染色体区段内，从而确认了来自PI 209135选择Mb.2的HtX的起源。总体而言，发现H111是50％起源于B37并且50％起源于PI 209135选择Mb.2，这比预期的B37百分比要低得多。
Figure IDA0003135932130000011
Figure IDA0003135932130000021
Figure IDA0003135932130000031

Claims (48)

1.一种甜玉米植物，所述甜玉米植物在8号染色体上包含来自马齿型玉蜀黍变种的渐渗物，其中所述渐渗物包含相对于缺乏所述渐渗物的植物赋予对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性的单一基因。
2.如权利要求1所述的植物，其中所述对大斑凸脐蠕孢的抗性是加性的。
3.如权利要求1所述的植物，其中所述渐渗物包含在所述植物中的标记M1(SEQ ID NO:1)处的来自马齿型玉蜀黍变种的染色体区段。
4.如权利要求1所述的植物，其中所述渐渗物是约12cM或更小。
5.如权利要求1所述的植物，其中所述广谱抗性包括对多个大斑凸脐蠕孢种族的抗性。
6.如权利要求5所述的植物，其中所述广谱抗性包括对大斑凸脐蠕孢种族1、2、M和N的抗性。
7.如权利要求1所述的植物，其中所述植物对于所述渐渗物是纯合的。
8.如权利要求1所述的植物，其中包含所述渐渗物的种子样品以ATCC登录号PTA-125393保藏。
9.如权利要求1所述的植物，所述植物被定义为近交或杂交植物。
10.一种如权利要求1所述的植物的植物部分。
11.如权利要求10所述的植物部分，其中所述植物部分是细胞、种子、根、茎、叶、穗、花或花粉。
12.一种渐渗片段，所述渐渗片段包含在标记基因座M1(SEQ ID NO:1)处的来自马齿型玉蜀黍变种的重组染色体区段。
13.如权利要求12所述的渐渗片段，其中所述片段赋予对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性。
14.如权利要求12所述的渐渗片段，其中在标记基因座M1(SEQ ID NO:1)处的来自马齿型玉蜀黍变种的所述染色体区段的两侧是来自甜玉米品种的基因组DNA。
15.如权利要求12所述的渐渗片段，其中包含所述渐渗物的种子样品以ATCC登录号PTA-125393保藏。
16.一种生产具有改进的大斑凸脐蠕孢抗性的甜玉米品种的方法，所述方法包括使来自马齿型玉蜀黍变种的染色体区段渐渗到所述植物的8号染色体上，所述染色体区段相对于缺乏所述渐渗物的植物赋予对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性，并且其中所述抗性是加性的。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述渐渗包括：
a)将包含所述染色体区段的植物与自身或与不同基因型的第二甜玉米植物杂交，以产生一种或多种子代植物；以及
b)选择包含所述染色体区段的子代植物。
18.如权利要求17所述的方法，其中选择子代植物包括检测包含标记基因座M1(SEQ IDNO:1)的核酸。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述广谱抗性包括对多个大斑凸脐蠕孢种族的抗性。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述广谱抗性包括对大斑凸脐蠕孢种族1、2、M和N的抗性。
21.如权利要求17所述的方法，其中所述子代植物是F2-F6子代植物。
22.如权利要求17所述的方法，其中产生所述子代植物包括回交。
23.如权利要求16所述的方法，其中包含所述染色体区段的种子样品以ATCC登录号PTA-125393保藏。
24.如权利要求16所述的方法，其中所述渐渗包括回交。
25.如权利要求16所述的方法，其中所述渐渗包括标记辅助选择。
26.如权利要求16所述的方法，其中所述渐渗包括测定所述对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性。
27.一种可通过如权利要求16所述的方法获得的植物。
28.一种选择具有改进的大斑凸脐蠕孢抗性的甜玉米植物的方法，所述方法包括：
a)将如权利要求1所述的植物与自身或与不同基因型的第二甜玉米植物杂交，以产生一种或多种子代植物；以及
b)选择包含所述渐渗物的子代植物。
29.如权利要求28所述的方法，其中选择所述子代植物包括检测与所述渐渗物遗传连锁的标记基因座。
30.如权利要求28所述的方法，其中选择所述子代植物包括检测包含标记基因座M1(SEQ ID NO:1)的核酸。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述抗性包括对多个大斑凸脐蠕孢种族的抗性。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述抗性包括对大斑凸脐蠕孢种族1、2、M和N的抗性。
33.如权利要求28所述的方法，其中所述子代植物是F2-F6子代植物。
34.如权利要求28所述的方法，其中产生所述子代植物包括回交。
35.如权利要求1所述的植物，其中所述植物进一步包含重组染色体区段，所述重组染色体区段包含含有Ht2基因座的第一等位基因和含有HtN基因座的第二等位基因，其中所述第一等位基因和所述第二等位基因以顺式连锁的方式配置在8号染色体上，并且其中所述重组染色体区段赋予对大斑凸脐蠕孢的抗性。
36.如权利要求35所述的植物，其中在8号染色体上所述重组染色体区段的两侧是标记基因座Q-NZMAY009401770(SEQ ID NO:2)和Q-NZMAY009430172(SEQ ID NO:5)。
37.如权利要求36所述的植物，其中在8号染色体上所述重组染色体区段的两侧是标记基因座Q-ZMHt2(SEQ ID NO:3)和Q-NZMAY009238970(SEQ ID NO:4)。
38.一种农艺学上优良的凹痕玉米植物，所述农艺学上优良的凹痕玉米植物在8号染色体上包含来自马齿型玉蜀黍变种的渐渗物，其中所述渐渗物包含相对于缺乏所述渐渗物的植物赋予对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性的单一基因。
39.如权利要求38所述的植物，其中所述渐渗物包含在所述植物中的标记M1(SEQ IDNO:1)处的来自马齿型玉蜀黍变种的染色体区段。
40.如权利要求38所述的植物，其中所述广谱抗性包括对多个大斑凸脐蠕孢种族的抗性。
41.如权利要求38所述的植物，其中所述植物对于所述渐渗物是纯合的。
42.如权利要求38所述的植物，其中包含所述渐渗物的种子样品以ATCC登录号PTA-125393保藏。
43.一种生产具有改进的大斑凸脐蠕孢抗性的优良玉米品种植物的方法，所述方法包括使来自马齿型玉蜀黍变种的染色体区段渐渗到优良玉米品种的8号染色体上，所述染色体区段相对于缺乏所述渐渗物的植物赋予对大斑凸脐蠕孢的广谱抗性，并且其中所述抗性是加性的。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述渐渗包括：
a)将包含所述染色体区段的植物与自身或与不同基因型的第二玉米植物杂交，以产生一种或多种子代植物；以及
b)选择包含所述染色体区段的子代植物。
45.如权利要求43所述的方法，其中选择子代植物包括检测包含标记基因座M1(SEQ IDNO:1)的核酸。
46.如权利要求43所述的方法，其中所述优良玉米品种是凹痕、硬质或甜玉米品种。
47.如权利要求43所述的方法，其中所述子代植物是F2-F6子代植物。
48.一种可通过如权利要求43所述的方法获得的植物。
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