CN112251363A - 玉米大斑病菌弱毒菌株stam-226及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物病理学，具体地涉及玉米大斑病菌弱毒菌(STAM‑226)及其应用，具体涉及玉米大斑病菌弱毒菌及其在玉米大斑病防治中的应用。本发明通过ATMT转化、筛选、鉴定、盆栽实验和田间实验,获得对玉米大斑病具有显著控制作用的玉米大斑病菌弱毒菌株，即大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica),保藏编号为：CGMCC NO.20269。试验结果表明，先接种玉米大斑病菌弱毒菌株,1‑3天后接种玉米大斑病菌强毒菌株STAM‑YC，各个生育期都表现出显著的弱毒交叉保护作用。其中玉米大斑病菌弱毒菌株接种2d后接种STAM‑YC对玉米大斑病的防控效果最显著，平均达到89.6％。玉米大斑病菌弱毒菌株防治玉米大斑病对人畜、昆虫和作物安全,环境友好。

Description

玉米大斑病菌弱毒菌株STAM-226及其应用
技术领域：
本发明涉及植物病理学，具体地涉及玉米大斑病菌弱毒菌(STAM-226)及其应用，具体涉及玉米大斑病菌弱毒菌及其在玉米大斑病防治中的应用。
背景技术：
在我国，玉米大斑病主要分布在北方和高海拔山区等玉米种植区，直接影响玉米的产量和品质，造成严重的经济损失。玉米大斑病菌属子囊菌亚门座囊菌目。玉米大斑病菌是目前发现的变异较快的一种丝状真菌，针对玉米中的抗性基因会很快产生能克服它的毒性基因，从而形成一个新的生理小种。近年来，由于新小种的不断出现，玉米大斑病仍是生产中的重要病害，且由东北向华北、西北以及东南沿海逐渐漫延，并开始有加重趋势。目前生产上主要利用抗病育种防治玉米大斑病，但由于新型生理小种的产生速度非常快，使一些生产上农艺性状优良的玉米品种推广时间很短就丧失了抗病性，由于培育一个新的抗病品种需要至少5-10年的时间，而化学防治既污染环境又效果较差，因此，探索一种新型防治技术是延长优良玉米品种推广寿命的迫切任务。
弱毒株交叉保护(MSCP)又被称为获得性免疫或诱导免疫，最早是由wingard在烟草上发现的，此后的研究表明MSCP不仅存在于病毒之间，而且还存在于类病毒、卫星病毒和真菌之中。但是利用弱毒菌株的弱毒保护进行玉米大斑病的防治未见相关研究。
本发明利用玉米大斑病菌弱毒菌株对玉米大斑病进行防治，对于玉米大斑病的生物防治具有重要意义。
发明内容：
本发明的一个目的是提供一种玉米大斑病菌弱毒菌STAM-226，即大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)。
本发明的另外一个目的是提供该菌株在防控玉米大斑病方面的应用。所述菌株对玉米大斑病具有明显的防控效果，对人畜、昆虫和作物安全。对于玉米大斑病的生物防治具有重要意义。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)。
所述的大斑刚毛座腔菌通过常规的ATMT技术得到。
本发明还提供了大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)在防治玉米大斑病中的应用。
进一步地，本发明提供了大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)在玉米大斑病菌弱毒交叉保护中的应用。
先接种大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)，1-3天以后再接种强毒菌株，至少2天以后接种效果最佳。
所述的强毒菌株可以为玉米大斑病菌强毒菌株STAM-YC。
本发明从玉米大斑病菌ATMT突变体库中通过室内致病力的测定，筛选出具有稳定遗传特性的弱毒菌株。
具体地，所述的玉米大斑病菌弱毒菌筛选方法如下：
(1)在PDA培养基上培养10d的各突变菌株中加入少量的无菌水，用灭过菌的载玻片轻轻刮动，然后2层纱布过滤，配成孢子悬浮液；
(2)待玉米幼苗长至4～6叶时，将配制的各孢子悬浮液均匀喷洒在感病玉米自交系OH43的叶片上，进行摩擦接种；
(3)利用薄膜保湿24h，去膜后按常规方法管理，室内温度控制在20～30℃之间。接种2周后进行发病调查，确定玉米大斑病菌弱毒菌株和强毒菌株。
步骤(1)中，
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉11g，加水定容至1L。
所述的孢子悬浮液的浓度为105-106个孢子/ml。
本发明通过室内栽培实验和田间试验证明，先接种本发明的玉米大斑病菌弱毒菌株STAM-226，然后再接种玉米大斑病菌强毒菌株STAM-YC，玉米的发病程度显著降低。
室内栽培实验：接种玉米大斑病菌弱毒菌株后再接种强毒菌株，测定病斑面积，结果发现，接种本发明的玉米大斑病菌弱毒菌株STAM-226后再接种强毒菌株STAM-YC，发病程度显著降低。
田间试验：在玉米幼苗期(7～8叶期)、抽雄期、近成熟期(11～12叶期)，分别采用针刺接种、带菌高粱粒接种、微伤口接种，玉米大斑病菌弱毒菌株STAM-226接种1-3d后接种强毒菌株STAM-YC。结果表明，在各个生育期都表现出显著的弱毒交叉保护作用，其中玉米大斑病菌弱毒菌株STAM-226接种2d后接种STAM-YC保护作用最显著，平均保护效果达到89.6％。近成熟期保护作用最显著，平均达到87.5％。玉米大斑病菌弱毒菌株STAM-226对玉米大斑病具有明显的防治效果。
采用上述技术方案的本发明与现有技术相比，有益的技术效果如下：
所述菌株是从玉米大斑病菌ATMT突变体库中筛选得到的弱毒菌株STAM-226，对玉米大斑病具有明显的防控效果，对人畜、昆虫和作物安全。对于玉米大斑病的生物防治具有重要意义。
本发明的大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2020年9月15日，保藏编号：CGMCC NO.20269。
具体实施方式
实施例1
玉米大斑病菌弱毒菌株的制备：
挑取农杆菌(含pBHtl质粒)单菌落于LB液体培养基中，28℃120rpm下摇培48h，取1mL菌液于4℃10000rpm下离心1min，弃上清。用诱导培养基(IM)洗2次，并用IM培养基稀释至OD600≈0.15，加入终浓度为200～400μM的AS(乙酞丁香酮)，然后28℃180rpm下活化7h。取1mL孢子悬浮液于40mL离心管中，加入3mL Fries液体培养基，25℃100rpm下振动培养培24h，加入1mL已活化的农杆菌共培养48h。取500μL大斑病菌与农杆菌共培养物，涂于含有潮霉素B(50μg/mL)、头孢噻肟钠和羧苄青霉素(各200μg/mL)的PDA培养基上，25℃下培养1周左右。挑取单菌落置于含50μg/mL潮霉素B的PDA培养基上培养，筛选对潮霉素具有抗性的转化子。
所用培养基：
LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g加水至1L，pH 7.0。
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉11g，水1000mL。
诱导培养基(IM)：10mL K-buffer(pH7.0)，20mLM-N(30g/LMgSO4·7H20，15g/LNaC1)，l mL1％CaCl2·2H20(w/v)，10mL0.01％FeSO4(w/v)，5mL Spore Elements，2.5mL20％NH4NO3(w/v)，10mL50％glSTAM-229erol，40mL l mol/L MES，pH5.3，5mL2 mol/Lglucose，2mL100mmoL/L acetosyringone，加dH20 898.7mL至1L。
改良Fries培养基：蔗糖15g，酒石酸铵2.5g，硝酸铵0.5g，硫酸镁0.25g，氯化钠0.25g，无水氯化钙0.05g，酵母浸膏0.25g，加水定容至500mL。
实施例2从玉米大斑病菌ATMT突变体库中筛选弱毒菌株：
在PDA培养基上培养10d的各突变菌株中加入少量的无菌水，用灭菌的载玻片轻轻刮动，然后2层纱布过滤去掉培养基碎片，配成孢子悬浮液(105个孢子/ml)。待玉米幼苗长至4～6叶时，将配制的各孢子悬浮液均匀喷洒在感病玉米自交系OH43的叶片上，进行摩擦接种。接种后薄膜保湿24h，去保湿膜后按常规方法管理，室内温度控制在20～30℃之间。接种2周后进行发病调查，确定玉米大斑病菌弱毒菌株和强毒菌株。结果表明，玉米大斑病菌STAM-226接种玉米自交系OH43系列后不产生任何病斑，对玉米没有致病力。玉米大斑病菌强毒菌株STAM-YC突变菌株致病力增强，可使玉米自交系OH43品种致病，且发病程度加深。
实施例3
玉米大斑病弱毒交叉保护作用分析：
(1)不同时期玉米接种方法
玉米幼苗期(7-8叶期)采用针刺接种：利用微量注射器的针尖制造伤口，针刺部位要求紧凑，4个伤口呈菱形，伤口不能穿透叶片。然后将培养7d的玉米大斑病菌菌盘(直径1.4cm)以菌丝面接触玉米叶片覆盖于微伤口上，并用大头针进行固定。
玉米抽雄期采用高粱粒接种：将3块培养7d的玉米大斑病菌菌盘(直径1.4cm)接种于高压灭菌的高粱粒(100g高粱粒+100g水)中，23℃～25℃下黑暗培养5d后，将高粱粒培养基摇匀摇散，使菌丝断裂，然后在23℃～25℃下黑暗培养5d即可，将带菌高粱粒接种于玉米心叶内，4粒/株。
玉米近成熟期(11-12叶期)采用微伤口接种：利用细砂纸制造成微伤口，然后将培养7d的菌盘(直径1.4cm)以菌丝面接触并覆盖于玉米叶片的微伤口上，用大头针进行固定。
(2)盆栽实验
品种为京科，播种3盆，每盆3株，于自然环境栽培。采用针刺接种方法。试验处理包括：玉米大斑病菌弱毒菌株STAM-226接种、强毒菌株STAM-YC接种、弱毒菌株STAM-226接种1-3d后接种强毒菌株STAM-YC。每天调查不同处理的发病情况，测定病斑面积，结果(表1)显示，接种玉米大斑病菌弱毒菌株STAM-226再接种强毒菌株STAM-YC发病程度显著降低。保护效果％＝(强毒菌株处理平均每叶病斑面积-弱接强处理平均每叶病斑面积)/强毒菌株处理平均每叶病斑面积×100
表1：玉米大斑病菌弱毒交叉保护作用分析(盆栽实验)
Figure BDA0002744035540000041
(3)田间致病性测定
分别设置弱毒菌株STAM-226处理、强毒菌株STAM-YC处理、弱毒菌株STAM-226处理后再用强毒菌株STAM-YC处理和一个自然诱发。每个处理2行，约100株玉米。各处理间均有1-2个不接种间隔行。不同生育期的弱毒交叉保护效果见表2。在各个生育期都表现出显著的弱毒交叉保护作用，其中STAM-226接种2d后接种STAM-YC保护作用最显著，平均保护效果达到89.6％。近成熟期保护作用最显著，平均达到87.5％。玉米大斑病菌弱毒菌株STAM-226对玉米大斑病具有明显的防治效果。
表2不同生育期的弱毒交叉保护效果(％)(玉米品种：京科)
Figure BDA0002744035540000051

Claims (7)

1.大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)，其保藏编号为：CGMCC NO.20269。
2.权利要求1所述的大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)在防治玉米大斑病菌中的应用。
3.权利要求1所述的大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)在玉米大斑病菌弱毒交叉保护中的应用。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，先接种大斑刚毛座腔菌(Setosphaeriaturcica)，再接种强毒菌株。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，在接种大斑刚毛座腔菌(Setosphaeriaturcica)1-3天以后接种强毒菌株。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，接种大斑刚毛座腔菌(Setosphaeriaturcica)至少2天以后接种强毒菌株。
7.如权利要求4-6任何一项所述的应用，其特征在于，所述的强毒菌株为玉米大斑病菌STAM-YC。
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