CN107043711B - 一株黄绿木霉t-321010菌株及其培养方法与应用 - Google Patents

一株黄绿木霉t-321010菌株及其培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株黄绿木霉(Trichoderma sp.)T‑321010菌株及其培养方法与应用。一株黄绿木霉(Trichoderma sp.)T‑321010菌株，2011年12月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.5638。本发明还涉及利用该菌株制备菌剂的方法及应用。本发明所述黄绿木霉T‑321010菌株较现有的生防菌哈茨木霉菌T‑22，具有更显著的长效性、多功能性，与纹枯病、根腐病、黄萎病、枯萎病病菌抗衡，进而抑制作物土传病菌生长，提高植物抗病性，克服连作障碍效果显著，改善土壤微生态，改良土壤性状。

Description

一株黄绿木霉T-321010菌株及其培养方法与应用
技术领域
本发明涉及一株黄绿木霉(Trichoderma sp.)T-321010菌株及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
木霉菌(Trichoderma spp.)属于真菌(Fungi)真菌门(Eumycota)半知菌亚门(Deuteromycotina)丝孢纲(Hyphomycetes)丝孢目(Hyphomycetales)丛梗孢科(Moniliaceae)木霉属(Trichoderma)，广泛存在于土壤、根围、叶围、种子、球茎、腐烂的秸秆等生态环境中。由于木霉菌适应性广，生存能力强，作用具有广谱性及多机制性，一直是植病生防学家研究的重点对象。
1932年，Weindling实验(Weindling R.Trichoderma lignorum as a parasiteof other soil fungi.Phytopathology,1932,22:837～845)发现木霉菌(Trichodermalignorum)可以寄生于多种植物病原真菌，建议将该菌用于土传植物病害的生物防治，木霉菌生防研究工作从此开始。CN1028883489A描述了深绿木霉防治玉米茎腐病和纹枯病。CN103045483A提供了棘孢木霉防治葡萄灰霉病。Lorito等进一步研究(Lorito M,Harman GE,Hayes C K,et al.Chitinolytic enzymes produced by Trichoderma harzianum:Antifungal activity of purified endochitinase andchitobiosidase.Phytopathology,1993,83:302～307)发现木霉能诱导产生一系列几丁质酶、葡聚糖酶，这些酶能降解病菌细胞壁，抑制病菌孢子萌发，引起病菌菌丝和孢子崩解。Allen等还研究(Allen M C,Haenseler C M.Antagonistic action of Trichoderma onRhizoctonia and other soil fungi.Phytopathology,1935,25:244～252)报道木霉对立枯丝核菌等土传病菌产生抗生作用，陈凯等把抗生素进一步具体化研究(陈凯、杨合同、李纪顺等.木霉菌产生的聚酮类抗生性代谢产物.中国生物防治.2009,25(2)：171～175)证实木霉能产生一些对病菌有拮抗作用的次生代谢产物聚酮类物质。CN 102071148A提供了利用拟康氏木霉SMF2产生的细胞壁降解酶和抗生素哌珀毒素抑制植物病菌作用。
以色列Elad等开发(Elad Y.TRICHODEX:commercialization of Trichodemaharzianum T39-a case study.A grow Report,Biopesticides:Trends andOpportunities.PJB Publications Ltd,Richmond,GB 2001,pp.45～50.)出的Trichodex哈茨木霉制剂能防治灰霉病、霜霉病等多种叶部病害。Harman及其团队(Harman G E.Mythsand dogmas of biocontrol:changes in perceptions derived from research onTrichoderma harzianum T-22.Plant Dis.,2000,84(4):377～393.)成功地研制出商品制剂Top-shield。杨合同等通过毒性试验(杨合同，唐文华，Ryder M.木霉菌与植物病害的生物防治.山东科学.1999,12(4):7-9)表明，用大白鼠进行的绿色木霉菌急性经口毒性测定，LD50/kg至少在500克以上，因此实际木霉制剂是无毒的，木霉菌对植物和人畜的安全系数很高。CN1786150A提供了绿色木霉的发酵工艺的基础、植物抗生素的制备及土传植物病害的生物防治制剂的配制。
Guetsky等实验(Guetsky R,Shtienberg D,Elad Y and Dinoor A.Combiningbiocontrol agents to reduce the variability of biologicalcontrol.Phytopathology,2001,91:621～627)表明，木霉菌与其他生防菌可以互作，木霉对一些杀菌剂如甲基托布津、克露、福生、三乙磷铝、波尔多液等有天然抗性，可以交替防病。木霉生长及孢子萌发能适应较广的温湿度范围和pH范围。进一步实验表明，每克土中含木霉分生孢子2×103～2×104时，可降低土壤根腐病菌群体数量，抗生菌在不同土壤中可连续存活半年到3年并可增殖。CN101781565A描述了拟康氏木霉应用于土壤后诱导植物抗病。
Sivan等通过原生质体融合技术(Sivan A.Harman G E,Stasz T E.Transfer ofisolated nuclei into protoplasts of Trichoderma harzianum.Applied andenvironmental microbiology.1990,56(8):2404～2409)获得优良木霉菌株哈茨木霉菌T-22，木霉菌已由单一地从自然界分离筛选达到有目的地利用生物技术进行改造以获得新型菌株。长期使用化学农药，土壤日趋恶化，连作障碍更加严重，生态环境遭到破坏，制约蔬菜、水果、作物高产栽培和质量安全，木霉菌作为生防因子和土壤有益菌，应用潜力巨大，选择多功能木霉菌作为研发对象是合适的。同时木霉菌的营养要求简单，生长速度快，对于将来的工业化生产十分有利。木霉制剂通过种子处理、叶面喷施等方法配合化学农药能够防治立枯病、疫病、枯萎病、灰霉病等多种植物土传病害和叶面病害，降低了作物药害，减少化学污染，是改良农业生态、减少污染的重要措施。
发明内容
本发明是针对现有技术的不足，提供一株黄绿木霉(Trichoderma sp.)T-321010菌株菌株及其培养方法与应用。
本发明技术方案如下：
一株黄绿木霉(Trichoderma sp.)T-321010菌株，2011年12月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.5638，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
黄绿木霉(Trichoderma sp.)T-321010菌株菌落在PDA平板上生长快，气生菌丝层较厚，致密丛束状，初期为白色，平坦，逐渐产生分生孢子而呈黄绿色，产孢区常呈环状，菌落最终颜色为灰黄绿色，反面的培养基颜色为暗黄绿色。菌丝有隔，透明，细胞壁光滑，分生孢子梗主分枝纤细，近直角伸出，次级分枝2～3个为一组。瓶梗长而细，基部微溢缩，2～3个一组在终极瓶梗下呈假轮状，座生角度大。分生孢子卵形，大小为3.6～4.8×2.5～3.6μm。结果如图1和图2所示。
通过PCR(Polymerase Chain Reaction，多聚酶链式反应)对本发明黄绿木霉T-321010菌株进行系统发育学的鉴定，确定黄绿木霉T-321010菌株的进化关系。将引物ITS1用于扩增18S rDNA和5.8S rDNA之间的转录间隔区，从而得到序列段，通过NCBI Gen Bank建立的DNA序列数据库中数据进行比对，1096bp的序列段与黄绿木霉的相似度达到100％，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
引物ITS1核苷酸序列如下：
TCCGTAGGTGAACCTGCGC
将引物ITS4用于扩增5.8S rDNA和28S rDNA之间的转录间隔区，从而得到序列段，通过NCBI Gen Bank建立的DNA序列数据库中数据进行比对，1096bp的序列段与黄绿木霉的相似度达到100％，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上述黄绿木霉(Trichoderma sp.)T-321010菌剂的制备方法，步骤如下：
(1)将黄绿木霉(Trichoderma sp.)T-321010菌株接种于PDA固体培养基中，在25～27℃活化培养6d～9d，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种至PD液体培养基中，在25～27℃摇瓶培养36h～48h，制得液体种子；
(3)将步骤(2)制得的液体种子接种至液体发酵培养基中，在25～27℃的条件下发酵培养，制得发酵液；
(4)将步骤(3)制得发酵液按质量百分比10％～30％的比例接种于固体发酵培养基中，在20℃～30℃、含水量50％～60％、空气相对湿度80％～100％的条件下，固体发酵72h～96h；然后经干燥至含水量为5～10％，即得。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的液体发酵培养基，每升组分如下：
玉米粉12～18g，葡萄糖4～6g，豆粉4～6g，磷酸氢二钾0.8～1.2g，碳酸钙4～6g，水定容至1L，pH6.0。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，发酵培养包括三级液体发酵，具体步骤如下：
a、将步骤(2)制得的液体种子按体积比1％～5％的比例接种至液体发酵培养基中，在25～27℃的条件下，进行一级种子发酵培养36h～48h，制得一级种子液；
b、将一级种子液按体积比3％～8％接种至液体发酵培养基中，在25～27℃的条件下，进行二级发酵培养30h～40h，制得二级发酵液；
c、将二级发酵液按体积比5％～10％接种至液体发酵培养基中，在25～27℃、通气量1：0.6-0.8、搅拌速度为200r/min的条件下，进行三级发酵培养30h～40h，制得发酵液。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，固体发酵培养基按如下方法制备：
将麦麸65～75份、作物秸秆粉末25～35份混合后，加入混合物质量1.1～1.3倍的水，搅拌均匀，调pH 6～6.5，即得。
上述作物秸秆粉末为普通作物秸秆如玉米、花生、小麦等作物秸秆经粉碎机粉碎后制得的，为普通市售产品。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，干燥先进行通风晾干24～48h；然后去除培养基上的覆盖物，再自然晾干24～48h；然后翻倒培养基再33～37℃条件下，干燥至含水量5～10％。
上述黄绿木霉(Trichoderma sp.)T-321010菌株在制备生防菌剂中的应用。
一种农用复合剂，包括上述黄绿木霉(Trichoderma sp.)T-321010菌剂0.5～45份，复配物55～99.5份，均为重量份；
所述复配物选自可溶性甲壳素、豆粕、甲基托布津、农家肥或黄腐酸钾。
有益效果
1、本发明首次分离获得了菌株黄绿木霉T32，并通过辐照诱变的方法获得了黄绿木霉T-321010(原菌号即保存菌号：T321010)菌株；经检测，黄绿木霉T-321010菌株在生长特性、拮抗作用、固体发酵产孢量、耐贮性与孢子存活率、土壤内定殖存活量、生物防治效果均显著优于现有的生防菌哈茨木霉菌T-22，具有更显著的长效性、多功能性，与纹枯病、根腐病、黄萎病、枯萎病病菌抗衡，进而抑制作物土传病菌生长，提高植物抗病性，克服连作障碍效果显著；
2、本发明所述的生防菌剂采用黄绿木霉T-321010菌株与有机质豆粕等复配后，有机质豆粕等为黄绿木霉T-321010菌株提供营养，利于木霉在土壤中快速定殖和增殖，黄绿木霉T-321010菌株对豆粕等利用代谢并转化为寡聚糖、多肽、氨基酸、单糖、有机酸以及植物激素、水解酶及生化活性物质，提高有机质的活性，增强有机质作用，优化组合新的营养链，微生态平衡植物需求，促进植物生长发育，提高作物产量和品质；
3、本发明所述的生防菌剂采用黄绿木霉T-321010与甲基托布津等其他农药化肥配合力高，具有与土壤及土壤有益微生物高度配合力和正向作用，抑制土传病原真菌的生长，同时具有促进土壤有益微生物生长，调整土壤微生物结构，改善土壤微生态，促进土壤水稳性团聚体的形成，改善土壤物理结构，保护植物根系的作用，提高肥料利用率；
4、本发明所述的抗重茬土壤微生态改良剂采用黄绿木霉T-321010与可溶性甲壳素复配，可溶性甲壳素含有羟基等活性基团，羟基与粘粒矿物晶体表面上的氢原子形成氢键，能将分散的土粒胶结在一起形成团聚体，疏水基覆盖在粘粒表面，改变了粘粒的水合性，同时协调、促进植物根系或叶面对土壤中无效养分的吸收利用，从而提高矿物质的利用率；可溶性甲壳素能诱导微生物几丁质酶活性，黄绿木霉T-321010与其同时使用，提高黄绿木霉T-321010及放线菌的防病能力，可以促进土壤中增殖的有益菌固定氮、活化钾、溶解磷，促进作物对氮、磷、钾和微量元素的吸收，提高肥料利用率。
附图说明
图1是黄绿木霉T-321010菌分生孢子梗的显微镜照片；
图2是黄绿木霉T-321010菌瓶梗的显微镜照片；
图3是黄绿木霉野生菌T32与突变株T-321010(图中为T1010)生长性状初步分析实验结果对比柱状图；
图4是黄绿木霉野生菌T32与突变株T-321010(图中为T1010)生物性状深入分析实验结果对比柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例参照标准：
田间药效试验，棉花的出苗率、长势、健康情况判断标准参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治棉花黄、枯萎病GB/T17980.92-2004；
黄瓜、番茄的出苗率、长势、健康情况判断标准参照中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则GB/T17980.144-2004；
小麦的出苗率、长势、健康情况判断标准参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治小麦纹枯病GB/T17980.108-2004；
花生的出苗率、长势、健康情况判断标准参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治大豆根腐病GB/T17980.88-2004；
水稳性团聚体数量的检测标准执行中华人民共和国农业行业标准NY/T 1121.19-2008，有机质检测标准执行中华人民共和国农业行业标准NY/T 1121.6-2006；
微生物群落测定：用去离子无菌水稀释平板培养法，放线菌培养用高氏一号培养基，固氮菌培养用阿须贝氏培养基，菌体个数计算方法按惯用方式计算。土样稀释105倍，取0.1ml在高氏一号培养基涂皿，30℃培养5～7天，测定放线菌数量，土样稀释106倍，取0.1ml涂皿，在阿须贝氏培养基上涂皿，37℃培养3～5天，测定固氮菌数量。
高氏一号培养基每升组分如下：
可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4.7H2O0.01g，3％K2Cr2O7 2ml，琼脂20g，pH 7.0～7.4，水定容至1000ml
阿须贝氏培养基每升组分如下：
KH2PO4 0.2g，MgSO4.7H2O 0.2g，NaCl 0.2g，CaSO4.2H2O 0.2g，CaCO33.0g，甘露醇10.0g，琼脂20g，pH 7.2，水定容至1000ml。
实施例中所述棉花鲁棉18号购自山东棉花研究中心，小麦济麦17号购自山东省农业科学院作物研究所，花生花育22号购自山东省花生研究所。
实施例1黄绿木霉T-321010菌株的选育
野生菌株的采集、分离及纯化
采集样品为日光温室蔬菜田土，地点为潍坊市，用铁锨刨开表层土，在土壤耕作层5～25cm取土，放入牛皮纸袋，外套聚乙烯袋装好，带回实验室。用马丁培养基对稀释土壤涂皿，培养3～4d，挑取菌落形态近似木霉菌落的单菌落，经镜检初步鉴定为木霉菌，再显微技术单孢分离，转接PDA平板纯化培养，编号保存于PDA斜面上。
上述PDA平板培养基、马丁(Martin)培养基均为本领域常用培养基。
PDA平板培养基每升组分如下：
马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，pH自然，水定容至1000ml。
配制方法：将马铃薯去皮。切成约0.5mm见方的小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻璃棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，再补足水至1000mL。
马丁(Martin)培养基即虎红琼脂培养基每升组分如下：
蛋白胨5g，葡萄糖10g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，琼脂20g，孟加拉红(1％)3.3mL，链霉素33mg，pH 7.0～7.2，水1000mL
制作：上述各成分加入蒸馏水溶解后，再加孟加拉红水溶液；待培养基融化后冷却至55～60℃时加入链霉素(链霉素含量为33ug/mL)。
出发菌株黄绿木霉T32获得
将木霉菌株接种于PDA平板培养基上平板培养，然后转接到PD液体培养基中液体培养，在PDA平板培养基上对峙培养病原真菌与木霉菌株。
测定平板培养条件下木霉菌株的生长速度(菌落直径)，木霉菌株的产量(分生孢子量)，测定液体培养条件下木霉菌株的菌丝重量，对峙培养结束后测定病原真菌菌落半径和被木霉覆盖情况。T32比一般木霉菌株生长速度提高10％以上，比一般木霉产孢量提高15％以上，拮抗作用强，覆盖病菌能力达二级。
上述PDA平板培养基、PD液体培养基均为本领域常用培养基。PD液体培养基每升制备过程如下：
采用200g去皮洗净的马铃薯与1000ml水混合煮沸15min，过滤后加入20g葡萄糖，水定容至1L。
PDA固体培养基为在PD液体培养基基础上加入15～20g/L琼脂。
上述所用病原真菌选自：大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖镰刀菌(Fusarium oxysporum)之一。
所述5级拮抗标准如下：
1级：木霉菌完全长过病菌，并覆盖整个培养皿；
2级：木霉菌占整个培养皿面积的2/3以上；
3级：木霉菌占整个培养皿面积的1/2至2/3；
4级：病菌占整个培养皿面积的2/3以上；
5级：病菌长过木霉菌，并覆盖整个培养皿。
出发菌株黄绿木霉T32的筛选及诱变菌剂的选择
T32遗传变异能力强，诱变效应大，进行物理诱变，用无菌蒸馏水将木霉孢子制成孢子悬浮液104CFU/mL放在18×180mm试管中60Co-γ射线0.8～1kGy辐照诱变，孢子致死率在90％～99％，突变率在50％以上，突变频谱宽，所得菌株转接培养三代，变异菌株稳定率在10％～30％，对生长速度及产孢量超过出发菌株的突变菌株再进行紫外线照射0.6～2min，孢子致死率在99％～99.9％，所得菌株转接培养三代，变异菌株稳定率在30％，如表1所示。
表1、黄绿木霉T32菌株复合诱变变异率
Figure BDA0001279253460000071
黄绿木霉T-321010菌株鉴定试验
稳定性试验
黄绿木霉T-321010突变菌株在PDA平板培养基继代培养10代以上稳定，结果如表2所示。
表2、突变菌株后代稳定性
Figure BDA0001279253460000072
生物性状初步试验
黄绿木霉T-321010突变菌株在PDA平板固体培养基，在PD液体培养基液体培养基，与病菌对峙PDA平板固体培养，对峙培养病原真菌选自：大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖镰刀菌(Fusarium oxysporum)之一。
黄绿木霉T-321010突变菌株生长速度、菌丝量、产孢量、覆盖病菌率和抑菌率等方面分别比出发菌株提高13.6％、29％、48.5％、57.4％、87.5％，结果如图3所示。
抗逆性试验
黄绿木霉T-321010突变菌株在定向选择培养培养，将农药定向培养基为PDA培养基加入田间农药使用浓度的1/4，配制土壤浸液或农业副产物滤液贫瘠培养基，平板培养T-321010突变菌株。与出发菌株T32相比，T-321010突变菌株抗逆境能力强，产孢能力比T32多一成以上。
生物性状深入分析试验
PD液体培养基培养T-321010突变菌株。与黄绿木霉T32出发菌株相比，黄绿木霉T-321010突变菌株发酵过程，生长速度快，培养成分利用率高，黄绿木霉T-321010对培养液中氨态氮的吸收率比出发菌株T32提高37.09％，T-321010对无机磷的吸收率比出发菌株提高15.17％，黄绿木霉T-321010对K+吸收率比出发菌株高16.49％，在pH7.34的培养液中培养3d后，黄绿木霉T-321010的pH值为5.77，出发菌株的pH值为6.67，黄绿木霉T-321010菌株调整培养液酸碱能力强；黄绿木霉T-321010对培养液中葡萄糖的吸收能力比出发菌株提高19.64％；黄绿木霉T-321010菌丝水解酶活力产生比例高，培养液和菌丝几丁质酶活力分别比出发菌株提高83.76％、106.88％；葡聚糖酶活力分别比出发菌株提高189.11％、81.99％。结果如图4所示。
上述水解酶活力测定：
酶粗提液分别与基质几丁质胶体、葡聚糖溶液混合，37℃培养30min后，加95％乙醇，离心(4000r/min)15min，用3，5—二硝基水杨酸比色定糖法测定酶反应后葡萄糖含量。
固体发酵培养
固体发酵培养基为按65～75wt％的麦麸与25～35wt％的棉籽皮混合，再加入1.1～1.3倍重量的水搅拌均匀，调pH为6～6.5制得，灭菌后接种黄绿木霉T-321010菌株，生长速度快，产孢量大，比黄绿木霉T32提高21.4％。
黄绿木霉T-321010菌株验证试验
黄绿木霉T-321010菌株的固体发酵培养20批次，产孢量稳定，按以下步骤进行，以下均为重量比或重量百分比。
黄绿木霉T-321010菌原菌种在PDA固体培养基平板活化培养，26℃培养6d～9d；转接PD液体培养基摇瓶培养，26℃，200rpm，培养36h～48h；1～2个摇瓶培养菌转向16LPD液体培养基液体发酵罐，26℃，搅拌速度为200rpm，发酵36h～48h；
固体发酵培养基按70wt％的麦麸与30wt％的棉籽皮混合，再加入1.1～1.3倍重量的水搅拌均匀，调pH为6～6.5制得；121℃灭菌40min后，在混合接种器内将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为8％～15％，固体培养室培养。
参照CN102660627A一种木霉生防菌种质评价办法，将黄绿木霉T-321010菌株进行种质评价：
黄绿木霉T-321010菌株室内生长特性
将黄绿木霉T-321010菌株、哈茨木霉菌T-22分别接种于PDA平板培养基上，25～28℃培养5～7d；然后分别转接到PD液体培养基中，25～28℃摇床培养2～4d，摇床转速180～210r/min。黄绿木霉T-321010菌株比哈茨木霉菌T-22菌落直径、产孢量、菌丝重量提高12.5％、11.2％、15.6％。
黄绿木霉T-321010菌株拮抗作用
在PDA平板培养基上对峙培养病原真菌与黄绿木霉T-321010菌株、病原真菌与哈茨木霉菌T-22，25～28℃培养3～5d；对峙培养结束后测定病原真菌菌落半径和被覆盖情况，黄绿木霉T-321010菌株拮抗作用比T22提高6.5％，拮抗程度为1级或2级；
上述拮抗作用标准：
1级：木霉菌完全长过病菌，并覆盖整个培养皿；
2级：木霉菌占整个培养皿面积的2/3以上；
3级：木霉菌占整个培养皿面积的1/2至2/3；
4级：病菌占整个培养皿面积的2/3以上；
5级：病菌长过木霉菌，并覆盖整个培养皿。
黄绿木霉T-321010菌株孢子贮存期活性
黄绿木霉T-321010菌株、哈茨木霉菌T-22制剂分别0℃处理7d、55℃处理14d，室温放置6个月、12个月、18个月、24个月后，测定稀释平板培养基上的萌发孢子数，计算孢子存活率，贮存24个月以上，黄绿木霉T-321010菌株孢子存活率达78.4％。
黄绿木霉T-321010菌株在盆栽条件下土壤定殖量及生物防治效果
将黄绿木霉T-321010菌株、哈茨木霉菌T-22制剂按每克灭菌土壤加入1～1.5×105cfu分生孢子的量分别与灭菌土壤混合，做盆栽试验，同时按土壤重量20％～30％加水定殖10～15d，然后按每克灭菌土壤注入2～5×104cfu的棉蔫萎镰刀菌菌丝及孢悬液。
观察记录棉花出苗率、长势、健康情况，分别于种植后25d对盆栽土壤进行取样，采用平板计数法，黄绿木霉T-321010菌株在土壤中存活量为7.03×104cfu/g，比哈茨木霉菌T-22在土壤中存活量提高25.54％；施用黄绿木霉T-321010菌株的棉花发病率比施用哈茨木霉菌T-22的棉花发病率降低12.43％；
黄绿木霉T-321010菌株在田间应用条件下定殖存活量、生物防治效果
棉花种植前10～30d，按150～200kg/hm2用量将黄绿木霉T-321010菌株、哈茨木霉菌T-22施入大田15～20cm的耕层土壤，灌溉至耕层土壤相对含水量为55％～65％；
分别于棉花种植后苗期、生长期、结果期对耕层土壤进行取样，采用平板计数法测定，黄绿木霉T-321010菌株在土壤中存活量比哈茨木霉菌T-22提高25.04％；
观察记录棉花出苗率、长势、健康情况，施用黄绿木霉T-321010菌株的木霉防病效果比施用哈茨木霉菌T-22的提高9.51％。
黄绿木霉T-321010菌株制剂生产及应用
黄绿木霉T-321010菌株的固体发酵培养，按以下步骤进行，以下均为重量比或重量百分比。
原种扩配：
黄绿木霉T-321010菌原菌种连续转接活化至生长旺盛。菌种活化，26℃培养6d～9d。
种子扩培过程包括试管斜面菌种、平板、摇瓶(或固体种子培养瓶)、种子罐发酵(或种子固体发酵)培养三个阶段，分别在PDA固体培养基和PD液体培养基培养，26℃，菌种斜面或平板扩大培养3d～7d；种子摇瓶培养36h～48h；摇瓶种子转向种子发酵罐培养的接种量为1％～5％，一级种子罐发酵36h～48h。
液相发酵
培养基，玉米粉1.5％，葡萄糖0.5％，豆粉0.5％，磷酸氢二钾0.1％，碳酸钙0.5％，pH6.0，121℃灭菌30min，种子发酵罐向二级液体发酵罐的接种量为3％～8％，二级液体发酵罐向三级液体发酵罐发酵的接种量为5％～10％，通气量1：0.6～0.8，搅拌速度为200r/min，二级液体发酵30h～40h；三级液体发酵：30h～40h。
固相发酵
固体发酵培养基按65～75wt％的麦麸与25～35wt％的作物秸秆粉末混合，再加入1.1～1.3倍重量的水搅拌均匀，调pH为6～6.5制得；121℃灭菌40min后温度降为30℃，在混合接种器内将液体菌种与固体培养基混合均匀，接种量为10％～30％，接种完毕转移至固体培养室培养。
培养基厚度5cm，发酵温度应控制在20℃～30℃，环境温度不低于15℃，不高于32℃，固体发酵初期适宜发酵的物料含水量为50％～60％，空气相对湿度80％～100％。固体发酵72h～96h。发酵结束时，发酵物含水量应控制在20％～40％，空气相对湿度30％。
培养完毕，无菌通风良好的环境中，第一次在丝网架上自然晾24～48h，第二次去掉曲盘上的覆盖物，自然晾24～48h，第三次倒曲盘，35℃控温干燥40h。制剂含水量控制在5～10％。
制得黄绿木霉T-321010菌固体发酵剂，可用于配制农用制剂，依据产品的不同，细度分原状大小、0.50mm(35目)、0.125mm(120目)、0.0450mm(325目)。
实施例2
一种农用复合剂，组分如下，均为重量份：
实施例1经固体发酵培养制备的细度35目的黄绿木霉T-321010菌粉12份，可溶性甲壳素(购自山东奥康生物科技有限公司)88份；
实施例3
一种农用复合剂，组分如下，均为重量份：
实施例1经固体发酵培养制备的原状大小的黄绿木霉T-321010菌粉1.5份，豆粕(购自东营福可得生物有机肥有限公司)98.5份；
实施例4
一种农用复合剂，组分如下，均为重量份：
实施例1经固体发酵培养制备的细度120目的黄绿木霉T-321010菌粉45份，甲基托布津(农药市场购买)55份；
实施例5
一种农用复合剂，组分如下，均为重量份：
实施例1经固体发酵培养制备的原状大小的黄绿木霉T-321010菌粉0.5份，农家肥99.5份；
实施例6
一种农用复合剂，组分如下，均为重量份：
实施例1经固体发酵培养制备的细度35目的黄绿木霉T-321010菌粉9.3份，黄腐酸钾90.7份(购自山东创新腐植酸科技有限公司)；
对比例1
如实施例2所述的农用复合剂，不同之处在于，菌种为中国专利文献CN102660627A(申请号201210112684.5)中所述的哈茨木霉菌T 22。
对比例2
如实施例3所述的农用复合剂，不同之处在于，菌种为中国专利文献CN102660627A(申请号201210112684.5)中所述的哈茨木霉菌T 22。
对比例3
如实施例实施例4所述的农用复合剂，不同之处在于，菌种为中国专利文献CN102660627A(申请号201210112684.5)中所述的哈茨木霉菌T 22。
对比例4
如实施例实施例5所述的农用复合剂，不同之处在于，菌种为中国专利文献CN102660627A(申请号201210112684.5)中所述的哈茨木霉菌T 22。
对比例5
如实施例实施例6所述的农用复合剂，不同之处在于，菌种为中国专利文献CN102660627A(申请号201210112684.5)中所述的哈茨木霉菌T 22。
对比例6
如实施例2所述的农用复合剂，不同之处在于，将可溶性甲壳素替换为玉米纤维素(山东寿光巨能金玉米开发有限公司提供)。
对比例7
如实施例3所述的农用复合剂，不同之处在于，将豆粕替换为牛粪(山东大地乳业有限公司提供)。
对比例8
如实施例4所述的农用复合剂，不同之处在于，将甲基托布津替换为多菌灵。
对比例9
如实施例5所述的农用复合剂，不同之处在于，将农家肥替换为玉米秸秆。
对比例10
如实施例6所述的农用复合剂，不同之处在于，将黄腐酸钾替换为硅藻土(购自青岛三星硅藻土有限公司)。
实验例1
实验地块为山东省寿光市日光温室。参照CN102660627A生防菌株种质评价标准、黄瓜田间药效试验参照中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则GB/T17980.144-2004。
测试样品分别为实施例2制备的黄绿木霉T-321010农用复合剂、对比例1制得的农用复合剂、实施例1经固体发酵培养制备的细度35目的黄绿木霉T-321010菌粉和对比例6制得的农用复合剂，分别标记为检测组、对比组1、对比组2和对比组3。
田间使用重量相同。
对育苗床处理，做黄瓜种育苗试验，黄瓜苗移栽前将试验基质进行穴施，移栽黄瓜。不同的配比剂具有以下结果：
表3、黄瓜出苗比较
Figure BDA0001279253460000121
表4、黄瓜生长比较
Figure BDA0001279253460000122
通过对检测组和对比组1的数据比较可以看出，检测组黄瓜出苗整齐，成苗率好，苗叶茂株壮，对黄瓜出苗和成苗作用明显，分别比对比组1提高56.81％和8.24％，立枯病感病指数比对比组1降低31.24％，黄瓜单株干重比对比组1提高44.29％，黄瓜侧根数比对比组1提高40.49％，开花时间更集中，花期比对比组1缩短6天，与对比组1相比防病效果更好。
通过对检测组和对比组2的数据比较可以看出，检测组较对比组2出苗率提高38％，利于黄瓜出苗，立枯病感病指数比对比组2降低50％，黄瓜单株干重比对比组2提高12.22％，黄瓜侧根数比对比组1提高46.79％，开花时间集中，花期比对比组2缩短4天，防病效果提高7.68％。
通过对检测组和对比组3的数据比较可以看出，检测组比对比组3黄瓜出苗整齐、苗壮，成苗率，苗叶深绿色，出苗率、成苗率分别比对比组3提高81.58％和22.67％，立枯病感病指数比对比组3降低90.62％，黄瓜单株干重比对比组3提高274.07％，黄瓜侧根数比对比组3提高47.74％，开花时间更集中，花期比对比组3缩短6天，与对比组3相比防病效果提高25.22％。
黄绿木霉T-321010与可溶性甲壳素配比，明显促进黄瓜生长发育，促进侧根发育，提高黄瓜防病能力。
实验例2
实验地块为山东省寿光市日光温室。参照CN102660627A生防菌株种质评价标准、番茄田间药效试验参照中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则GB/T17980.144-2004。
测试样品分别为实施例3制备的黄绿木霉T-321010农用复合剂、对比例2制得的农用复合剂、实施例1经固体发酵培养制备的原状大小的黄绿木霉T-321010菌粉和对比例7制得的农用复合剂，分别标记为检测组、对比组1、对比组2和对比组3。
番茄种植前20天，对复配生物肥作为基肥撒施，灌溉至耕层土壤相对含水量为55～60％，土壤发酵15～20d，番茄移栽。不同的配比剂具有以下结果：
表5、番茄果比较
Figure BDA0001279253460000131
通过对检测组和对比组1的数据比较可以看出，检测组番茄叶片绿色浓，棵壮，果大小均匀，成熟时间一致，单功能叶干重比对比组1提高23.75％，坐果数比对比组1提高10.81％，正常果数比对比组1提高42.31％。
通过对检测组和对比组2的数据比较可以看出，检测组番茄叶片绿色浓，棵壮，果大小均匀，成熟时间一致，单功能叶干重比对比组2提高40.76％，坐果数比对比组2提高20.59％，正常果数比对比组2提高8.82％。
通过对检测组和对比组3的数据比较可以看出，检测组番茄叶片绿色浓，棵壮，果大小均匀，成熟时间一致，单功能叶干重比对比组3提高104.83％，坐果数比对比组3提高24.24％，正常果数比对比组3提高37.04％。
黄绿木霉T-321010与豆粕配比，明显促进番茄生长，调控发育，裂果、畸形果少，大果、小果少，每穗开花结果及成熟时间一致。
实验例3
实验地块为山东省农业科学院试验地。参照CN102660627A生防菌株种质评价标准、棉花田间药效试验参照中华人民共和国国家标准GB/T17980.92-2004。鲁棉研18号，山东省棉花中心提供。
测试样品分别为实施例4制备的黄绿木霉T-321010农用复合剂、对比例3制得的农用复合剂、实施例1经固体发酵培养制备的细度120目的黄绿木霉T-321010菌粉和对比例8制得的农用复合剂，分别标记为检测组、对比组1、对比组2和对比组3。
将各种制剂穴施后种棉花，不同的配比剂具有以下结果：
表6、棉花防病比较
Figure BDA0001279253460000141
通过对检测组和对比组1的数据比较可以看出，检测组棉花生长旺盛，结铃集中，吐絮好，叶面感病指数比对比组1降低14.45％，茎杆感病指数比对比组1降低12.39％，成株发病率比对比组1降低32.02％。
通过对检测组和对比组2的数据比较可以看出，检测组棉花生长旺盛，结铃集中，吐絮好，叶面感病指数比对比组2降低28.12％，茎杆感病指数比对比组2降低21.74％，成株发病率比对比组2降低46.49％。
通过对检测组和对比组3的数据比较可以看出，检测组棉花生长旺盛，结铃集中，吐絮好，叶面感病指数比对比组3降低48.75％，茎杆感病指数比对比组3降低45.60％，成株发病率比对比组3降低54.00％。
黄绿木霉T-321010与甲基托布津混合施用，明显防治棉花黄枯萎病，而与多菌灵混合抑制木霉生长，降低了多菌灵药效。
实验例4
本实验例地块为山东省济南市华山镇。采用平板计数法，培养测定木霉定殖存活的数量。参照CN102660627A生防菌株种质评价标准。参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治小麦纹枯病GB/T17980.108-2004。
测试样品分别为实施例5制备的黄绿木霉T-321010农用复合剂、对比例4制得的农用复合剂、实施例1经固体发酵培养制备的原状大小的黄绿木霉T-321010菌粉和对比例9制得的农用复合剂，分别标记为检测组、对比组1、对比组2和对比组3。
小麦种植前10d，按3000kg/hm2用量将黄绿木霉T-321010农用复合剂，施入耕层土壤，不同处理的耕层土壤进行取样，测定各指标。结果如下：
表7、小麦田土壤性状比较
Figure BDA0001279253460000151
通过对检测组和对比组1的数据比较可以看出，小麦生长后期，检测组黄绿木霉T-321010在土壤中存活量为1.24×104cfu/g干土，比对比组1中的哈茨木霉菌T 22提高24％，与对比组1相比水稳性团聚体、固氮菌、放线菌分别提高17.97％、23.18％、22.06％。
通过对检测组和对比组2的数据比较可以看出，检测组较对比组2土壤水稳性团聚体数量提高8.24％、土壤黄绿木霉T-321010种群数提高10.71％、土壤固氮菌、放线菌群落数提高8.5％和10.37％。
通过对检测组和对比组3的数据比较可以看出，检测组较对比组3土壤水稳性团聚体数量提高29.85％、土壤黄绿木霉T-321010种群数提高34.78％、土壤固氮菌、放线菌群落数提高37.76％和32.17％。
由以上数据可以看出，黄绿木霉T-321010菌株与农家肥复配后，农家肥比玉米秸秆好，为黄绿木霉T-321010菌株提供营养，利于木霉在土壤中快速定殖和增殖，黄绿木霉T-321010菌株对腐熟农家肥进行有机物再降解比降解玉米秸秆强，提高有机质的活性，增强有机质作用，增加土壤营养，改善土壤性状。
实验例5
本实验地块为山东省临沂市莒南县。参照CN102660627A生防菌株种质评价标准。观察记录花生出苗率、长势、健康情况，参照中华人民共和国国家标准杀菌剂防治大豆根腐病GB/T17980.88-2004。
测试样品分别为实施例6制备的黄绿木霉T-321010农用复合剂、对比例5制得的农用复合剂、实施例1经固体发酵培养制备的细度35目的黄绿木霉T-321010菌粉和对比例10制得的农用复合剂，分别标记为检测组、对比组1、对比组2和对比组3。
花生种植时，按450kg/hm2用量将黄绿木霉T-321010农用复合剂施入耕层土壤，花生垄做，记录花生农艺性状。结果如表8所示：
表8花生生长发育比较
Figure BDA0001279253460000161
通过对检测组和对比组1的数据比较可以看出，检测组中黄绿木霉T-321010菌株促进了侧根的生长和发育，根瘤菌着生多，果针入土深度增加，荚果饱满，检测组较对比组1花生病情指数比哈茨木霉菌T 22降低38.41％，防治根结线虫效果明显，产量提高38.57％，花生的侧根数、根瘤数、果针入土深度均大幅度提高，提高数量分别为60.56％、296.88％、14.04％。
通过对检测组和对比组2的数据比较可以看出，检测组较对比组2花生侧根长提高23.36％，根瘤数提高115.25％，主茎高度增加22.73％，植株鲜重提高24.27％，双荚果单穴粒重提高14.6％。
通过对检测组和对比组3的数据比较可以看出，检测组较对比组3花生侧根数提高132.65％，根瘤数提高423.35％，主茎高度增加26.09％，果针入土深度提高24.25％，产量提高57.69％。
由以上数据可以看出，黄绿木霉T-321010分生孢子粉为微生物活体和有效杀菌成分，黄腐酸钾、硅藻土作为载体促进木霉土壤中分散定殖，黄绿木霉T-321010菌株与黄腐酸钾复配，黄腐酸具有螫合作用和络合作用，能将难溶的金属离子络合或螫合，协调、促进植物根系或叶面对微量元素在体内的吸收、运转，黄腐酸钾添加后，利于花生吸收利用钾及其他矿物质，提高花生抗病能力，促进木霉的增殖，同时木霉提高黄腐酸钾的利用率，两者混合增效作用显著。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院农产品研究所
<120> 一株黄绿木霉T-321010菌株及其培养方法与应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 595
<212> DNA
<213> Trichoderma sp.
<400> 1
gggcctcggg gtcactccca acccaatgtg aacgttacca aactgttgcc tcggcgggat 60
ctctgccccg ggtgcgtcgc agccccggac caaggcgccc gccggaggac caaccaaaac 120
tcttattgta taccccctcg cgggtttttt ttataatctg agccttctcg gcgcctctcg 180
taggcgtttc gaaaatgaat caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat 240
gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat 300
ctttgaacgc acattgcgcc cgccagtatt ctggcgggca tgcctgtccg agcgtcattt 360
caaccctcga acccctccgg ggggtcggcg ttggggatcg gccctgcctt ggcggtggcc 420
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ggatcaggta ggaatacccg ctgaacttaa gcatatcaag ggcgccggga gggga 595
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<212> DNA
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tcattttcga aacgcctacg agaggcgccg agaaggctca gattataaaa aaaacccgcg 420
agggggtata caataagagt tttggttggt cctccggcgg gcgccttggt ccggggctgc 480
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Claims (8)

1.一株黄绿木霉(Trichoderma sp.)T-321010菌株，2011年12月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.5638，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述黄绿木霉(Trichoderma sp.)T-321010菌剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将黄绿木霉(Trichoderma sp.)T-321010菌株接种于PDA固体培养基中，在25～27℃活化培养6d～9d，制得活化菌株；
(2)将步骤(1)制得的活化菌株接种至PD液体培养基中，在25～27℃摇瓶培养36h～48h，制得液体种子；
(3)将步骤(2)制得的液体种子接种至液体发酵培养基中，在25～27℃的条件下发酵培养，制得发酵液；
(4)将步骤(3)制得发酵液按质量百分比10％～30％的比例接种于固体发酵培养基中，在20℃～30℃、含水量50％～60％、空气相对湿度80％～100％的条件下，固体发酵72h～96h；然后经干燥至含水量为5～10％，即得。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的液体发酵培养基，每升组分如下：
玉米粉12～18g，葡萄糖4～6g，豆粉4～6g，磷酸氢二钾0.8～1.2g，碳酸钙4～6g，水定容至1L，pH6.0。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，发酵培养包括三级液体发酵，具体步骤如下：
a、将步骤(2)制得的液体种子按体积比1％～5％的比例接种至液体发酵培养基中，在25～27℃的条件下，进行一级种子发酵培养36h～48h，制得一级种子液；
b、将一级种子液按体积比3％～8％接种至液体发酵培养基中，在25～27℃的条件下，进行二级发酵培养30h～40h，制得二级发酵液；
c、将二级发酵液按体积比5％～10％接种至液体发酵培养基中，在25～27℃、通气量1：0.6-0.8、搅拌速度为200r/min的条件下，进行三级发酵培养30h～40h，制得发酵液。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，固体发酵培养基按如下方法制备：
将麦麸65～75份、作物秸秆粉末25～35份混合后，加入混合物质量1.1～1.3倍的水，搅拌均匀，调pH 6～6.5，即得。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，干燥先进行通风晾干24～48h；然后去除培养基上的覆盖物，再自然晾干24～48h；然后翻倒培养基再33～37℃条件下，干燥至含水量5～10％。
7.权利要求1所述黄绿木霉(Trichoderma sp.)T-321010菌株在制备生防菌剂中的应用。
8.一种农用复合剂，其特征在于，包括权利要求2制备的黄绿木霉(Trichoderma sp.)T-321010菌剂0.5～45份，复配物55～99.5份，均为重量份；
所述复配物选自可溶性甲壳素、豆粕、甲基托布津、农家肥或黄腐酸钾。
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