CN103320330A - 黄绿木霉菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物及微生物应用领域，具体涉及一种黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichodermaaureoviridesp.）及其在抑制植物病害中的应用。该菌株于2012年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012407，该菌株在PDA固体培养基上生长，28℃下生长快，48小时，菌落半径达3.4厘米，72小时达5.4厘米；在光学显微镜下的形态为：形成的菌丝呈白色或无色，短绒状，菌落老熟后呈淡黄绿色。在姜播种的同时，采用本制剂加水比例1：100，对种姜实施木霉制剂浸种，姜立枯病防治率在82%以上。在防治立枯病的同时，还对姜种有催芽促进生根的作用。

Description

黄绿木霉菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物及微生物应用领域，具体涉及一种黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）及其在抑制植物病害中的应用。

背景技术

由于化学农药对环境污染日趋严重，人们对持续农业的呼声越来越烈。要想解决这一问题，利用生物农药来防治植物病虫害是很有效的方法。近年来随着植物病虫害的抗药性日趋严重，化学农药使用数量成倍增加，我国农业生态环境、资源均受到极大破坏。农业的可持续发展问题已是当务之急。由于化学农药的弊端，生物农药市场开始增长，有害生物综合治理（IPM）的概念正逐步深入人心。木霉防治植物病害已有多年的历史，国内外近年来开展此项研究的人也多了起来。木霉属真菌，常见于土壤中，是土壤微生物的重要群落，对植物病原菌的拮抗作用。近年来对木霉的拮抗作用作了研究，并取得令人鼓舞的成果。已证明对多种植病真菌，如立枯丝核菌、腐霉、疫霉、轮支菌、镰刀菌等均有拮抗作用。国内外已有商品化注册登记的木霉产品应用与田间。但是，由于木霉菌株来源广泛，不同菌株之间也有各自特性和防病、增产范围。比如，对使用环境条件的要求差异、对不同植物病源菌拮抗性差异、对不同植物的对象差异点等等。现有木霉菌株中适合投入工厂化菌株并不多，而且每种菌株对植物病害抑制范围较少，使用范围也就受限。

辣椒根腐病主要为害甜、辣椒茎基部及维管束，病株部分枝和叶片变黄萎蔫，茎内维管束褐变，湿度大或生育后期茎基部或根茎部腐烂，有时可见粉红色菌丝及点状粘质物，即病原菌分生孢子梗和分生孢子。此外，木贼镰刀菌等侵染幼苗的根茎部时，也可引起种子腐烂或幼苗猝倒；串珠镰刀菌侵染后种子发芽率下降40%左右，或形成不正常幼苗，如子叶和种皮被菌丝包被，使种皮无法脱落，子叶不能伸展；尖镰孢菌侵染种子后，发芽率下降62%，幼苗矮化、茎部缢缩、弯曲或子叶垂萎等畸形症状，拔出幼苗，主根变为黄褐色，次生根坏死脱落；茄腐镰刀菌侵染种子后，发芽率降低52%，病菌首先侵染根及根茎部，初为水浸状，后腐烂，致幼苗枯死或矮化。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.），该菌株于2012年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012407，该菌株在PDA固体培养基上生长，28℃下生长快，48小时，菌落半径达3.4 厘米，72小时达5.4厘米；在光学显微镜下的形态为：形成的菌丝呈白色或无色，短绒状，菌落老熟后呈淡黄绿色；菌落生长与分生孢子几乎同时产生，产孢形成大量孢子粉覆盖菌落之上，孢子呈绿色，分生孢子梗主分枝纤细，次级分枝2-3个为一组；瓶梗长而细，基部不变细，2—3个一组在终极瓶梗下呈假轮状，座生角度70-90°，分生孢子倒卵形，大小为3.0—3.8×2.4—3.0um；该菌株的生理生化特征是：生长温度最高为38℃。

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）菌株其培养方法为平板法，将菌株的分生孢子稀释成X×10^5-10⁶/ml，均匀涂布在PDA平板上，置26℃恒温箱培养5天，产生大量分生孢子。

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.），大量生产时孢子的培养方法为液体转固体双相培养法，将分生孢子液体转入PD液体培养基中，振荡培养2-4天，然后按照1：6-10的重量比例与灭菌的米糠或麦麸均匀混合，放在经过石灰水或臭氧消毒的不锈钢网筛中，上面覆盖消毒的塑料薄膜，置于22-30℃的室内培养3-5天后，打开塑料薄膜，产孢3-5天；连同培养料收集，晾干，粉碎，包装，贮存。

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）在抑制辣椒根腐病、草莓根腐病、小麦根腐病、大豆根腐病、番茄根腐病、黄瓜根腐病中的应用；抑制番茄灰霉病、葡萄灰霉病、草莓灰霉病、黄瓜灰霉病、韭菜灰霉病、西红柿灰霉病、辣椒灰霉病中的应用；抑制姜立枯病、棉花立枯病、油菜立枯病、西瓜立枯病、烟草立枯病、番茄立枯病、黄瓜立枯病、辣椒立枯病、豇豆苗立枯病中的应用；抑制豆角白绢病、苦瓜白绢病、花生白绢病中的应用，黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）在抑制上述的植物病害中的应用，是本发明所要保护的范围。

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）在姜种有催芽、促进生根中的作用；对辣椒促进根、苗生长作用；对花生、玉米等促进根、苗生长作用也是本发明保护的范围。

本发明从田间进行选择性地分离、选育和筛选高拮抗性野生菌株入手，结合微生物生物诱变技术和微生物生理生化等手段，不断优化提高新菌株的拮抗性，得到TW351高效菌株；并研制木霉生物杀菌剂以及所需要的生产工艺、发酵条件、培养基配比、培养后处理工艺等一系列条件，最终研制出对人、畜、天敌低毒、保护生态环境、利于绿色食品开发的生物杀菌剂。

完成新菌株的工厂化生产试验，制剂产品的含孢量达到1.3X10¹⁰个/克，高于国际木霉产品含孢量持平；田间防治姜立枯病感染指数降低88.5%；还观察到对多种蔬菜水果的作物有刺激增产作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。

实施例1

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.），该菌株于2012年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012407，该菌株在PDA固体培养基上生长，28℃下生长快，48小时，菌落半径达3.4 厘米，72小时达5.4厘米；在光学显微镜下的形态为：形成的菌丝呈白色或无色，短绒状，菌落老熟后呈淡黄绿色；菌落生长与分生孢子几乎同时产生，产孢形成大量孢子粉覆盖菌落之上，孢子呈绿色，分生孢子梗主分枝纤细，次级分枝2-3个为一组；瓶梗长而细，基部不变细，2—3个一组在终极瓶梗下呈假轮状，座生角度70-90°，分生孢子倒卵形，大小为3.0—3.8×2.4—3.0um；该菌株的生理生化特征是：生长温度最高为38℃。

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）菌株其培养方法为平板法，将菌株的分生孢子稀释成X×10^5-10⁶/ml，均匀涂布在PDA平板上，置26℃恒温箱培养5天，产生大量分生孢子。

实施例2

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.），大量生产时孢子的培养方法为液体转固体双相培养法，将分生孢子液体转入PD液体培养基中，振荡培养2-4天，然后按照1：6-10的重量比例与灭菌的米糠或麦麸均匀混合，放在经过石灰水或臭氧消毒的不锈钢网筛中，上面覆盖消毒的塑料薄膜，置于22-30℃的室内培养3-5天后，打开塑料薄膜，产孢3-5天；连同培养料收集，晾干，粉碎，包装，贮存。

实施例3

黄绿木霉真菌菌株TW351其具体的培养过程描述：

试管菌种培养：PDA培养基上接种该木霉，置28℃恒温箱培养4-5天即可长出分生孢子；

三角瓶液体扩大培养：

在1000ml三角瓶中加入250ml的PD培养基，中接种木霉后放摇床，100-120转，28℃培养72小时。

种子罐深层发酵培养：

麦麸10-20kg，玉米面10-20kg，蔗糖4-9kg，蛋白胨250-500g。煮开保持30-40分钟后过滤待用。尿素300-500g，硫酸亚铁2-10g，氯化钾88-135g，硝酸钠15-32g，磷酸二氢钾125-155g，加入以上麦麸等过滤液，拌匀后加水定容至200kg。灭菌，冷却至28度接种木霉，培养72-96小时后，用于接种固体培养。

固体发酵培养：

① 麦麸∶稻壳=55~70∶30~45，尿素0.05%~0.1%；高压蒸汽灭菌；

② 培养罐培养好的木霉菌液；

③ 凉开水；

按照①∶②∶③ =  2∶1∶1.5 的比例混合均匀，平铺在浅盘上，厚度为4-5cm。放培养室28度培养3-5天，菌丝长满后，降温至24-26度培养2-3天，产包完成后升温至45度以下晾干。

实施例4

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）的抑制辣椒根腐病的应用，具体的实验如下：

在洁净的工作台面上将辣椒根腐病致病菌用灭菌后的接种环接种到PDA培养基平板的一侧，同时用将本发明菌株接种到PAD培养基的另一侧，于26℃的恒温培养箱中倒置培养，并观察记录抑制效果，用十字交叉法测量病原菌菌落半径，以只接种致病菌的平板作对照，并按下列公式计算平板培养第7天本发明菌株对辣椒根腐病的抑菌率。

抑菌率的公式如下：

抑菌率（%）=［（对照菌落半径 – 与本发明菌株对峙培养的菌落半径）/对照菌落半径 ］ ×100%。

计算结果：黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）的抑菌率为92.3%，说明本发明的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）对辣椒根腐病的生长有较强的抑制作用，即对辣椒根腐病有较强的抑制效果。

实施例5

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）的抑制黄瓜根腐病的应用，具体的实验如下：

在洁净的工作台面上将黄瓜根腐病致病菌用灭菌后的接种环接种到PDA培养基平板的一侧，同时用将本发明菌株接种到PAD培养基的另一侧，于26℃的恒温培养箱中倒置培养，并观察记录抑制效果，用十字交叉法测量病原菌菌落半径，以只接种致病菌的平板作对照，并按下列公式计算平板培养第7天本发明菌株对黄瓜根腐病的抑菌率。

抑菌率的公式如下同实施例4中的抑菌率公式：

计算结果：黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）的抑菌率为90.8%，说明本发明的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）对黄瓜根腐病的生长有较强的抑制作用，即对黄瓜根腐病有较强的抑制效果。

实施例6

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）抑制姜立枯病的应用，具体的实验如下：

在洁净的工作台面上将姜立枯病病致病菌用灭菌后的接种环接种到PDA培养基平板的一侧，同时用将本发明菌株接种到PAD培养基的另一侧，于26℃的恒温培养箱中倒置培养，并观察记录抑制效果，用十字交叉法测量病原菌菌落半径，以只接种致病菌的平板作对照，并按下列公式计算平板培养第7天本发明菌株对姜立枯病的抑菌率。

抑菌率的公式如下同实施例4中的抑菌率公式：

计算结果：黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）的抑菌率为89.2%，说明本发明的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）对姜立枯病的生长有较强的抑制作用，即对姜立枯病有较强的抑制效果。

实施例7

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）的抑制番茄灰霉病的应用，具体的实验如下：

在洁净的工作台面上将番茄灰霉病致病菌挑取单菌落，用无菌水配成菌悬液，均匀涂布在PDA培养基平皿上，再在28℃下活化3天本发明的菌株的PDA平板上，挑取走私4mm的菌块，将本发明的菌块接种到涂有致病菌液的平皿上，每皿4块，每处理3次重复，以只接种韭菜灰霉病的培养皿为对照，在28℃下恒温培养箱中倒置培养5天，每天记录致病菌及本发明菌块的生长状况，测量其菌落半径。

抑菌率的公式如下同实施例4中的抑菌率公式：

计算结果：黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）的抑菌率为93.1%，说明本发明的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）对番茄灰霉病的生长有较强的抑制作用，即对韭菜灰霉病有较强的抑制效果。

实施例8

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）的抑制黄瓜灰霉病的应用，具体的实验如下：

在洁净的工作台面上将黄瓜灰霉病致病菌挑取单菌落，用无菌水配成菌悬液，均匀涂布在PDA培养基平皿上，再在28℃下活化3天本发明的菌株的PDA平板上，挑取走私4mm的菌块，将本发明的菌块接种到涂有致病菌液的平皿上，每皿4块，每处理3次重复，以只接种巴戟天烟煤病的培养皿为对照，在28℃下恒温培养箱中倒置培养5天，每天记录致病菌及本发明菌块的生长状况，测量其菌落半径。

抑菌率的公式如下同实施例4中的抑菌率公式：

计算结果：黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）的抑菌率为95.4%，说明本发明的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）对黄瓜灰霉病的生长有较强的抑制作用，即对巴戟天烟煤病有较强的抑制效果。

实施例9

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）的抑制豆角白绢病的应用，具体的实验如下：

在洁净的工作台面上将豆角白绢病致病菌挑取单菌落，用无菌水配成菌悬液，均匀涂布在PDA培养基平皿上，再在28℃下活化3天本发明的菌株的PDA平板上，挑取走私4mm的菌块，将本发明的菌块接种到涂有致病菌液的平皿上，每皿4块，每处理3次重复，以只接种豆角白绢病的培养皿为对照，在28℃下恒温培养箱中倒置培养5天，每天记录致病菌及本发明菌块的生长状况，测量其菌落半径。

抑菌率的公式如下同实施例4中的抑菌率公式：

计算结果：黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）的抑菌率为90.5%，说明本发明的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）对豆角白绢病的生长有较强的抑制作用，即对豆角白绢病有较强的抑制效果。

实施例10

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）对姜种有催芽促进生根的作用： 

在姜播种之前，取20块种姜，实施木霉制剂浸种，TW351制剂浓度是加水比例1：100，浸种时间4-7小时。播种后15~30天测量姜的根干重、苗干长；并按下列公式计算本发明菌株对姜根、苗的促进生长率。

促进生根率的公式如下：

促进生根率（%）=［（与本发明菌株浸种根干重–对照根干重）/对照根干重 ］ ×100%。

促进苗生长率的公式如下：

促进苗生长率（%）=［（与本发明菌株浸种苗干重–对照苗干重）/对照苗干重 ］ ×100%。

计算结果：

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）的苗干重比对照平均增加33.5%，根干重比对照平均增加42.3%；说明本发明的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）对姜根和姜苗生长有较强的促生长作用和效果。

实施例11

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）对花生催苗、促进生根的作用：

取口径18cm塑料盆进行盆播试验。盆土为河污土，土质肥沃，每盆播花生5粒，均采用穴施播种，每处理重复5次。在花生播种之前，将花生种，实施TW351制剂浸种，TW351制剂浓度是加水比例1：100，浸种时间4-7小时。播种后15~25天倒盆，测量花生苗根干重、苗干重；并按下列公式计算本发明菌株对姜根、苗的促进生长率。

株高、根长、分枝数、鲜重以及病害情况。

促进生根率的公式如下：

促进生根率（%）=［（与本发明菌株浸种根干重–对照根干重）/对照根干重 ］ ×100%。

促进苗生长率的公式如下：

促进苗生长率（%）=［（与本发明菌株浸种苗干重–对照苗干重）/对照苗干重 ］ ×100%。

计算结果：

黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）的苗干重比对照平均增加46.1%，根干重比对照平均增加57.6%；说明本发明的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）对姜根和姜苗生长有较强的促生长作用和效果。

Claims (8)

1.黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.），其特征在于：该菌株于2012年10月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012407，该菌株在PDA固体培养基上生长，28℃下生长快，48小时，菌落半径达3.4 厘米，72小时达5.4厘米；在光学显微镜下的形态为：形成的菌丝呈白色或无色，短绒状，菌落老熟后呈淡黄绿色；菌落生长与分生孢子几乎同时产生，产孢形成大量孢子粉覆盖菌落之上，孢子呈绿色，分生孢子梗主分枝纤细，次级分枝2-3个为一组；瓶梗长而细，基部不变细，2—3个一组在终极瓶梗下呈假轮状，座生角度70-90°，分生孢子倒卵形，大小为3.0—3.8×2.4—3.0um；该菌株的生理生化特征是：生长温度最高为38℃。

2.如权利要求1所述的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.），其特征在于：所述的菌株其培养方法为平板法，将菌株的分生孢子稀释成X×10^5-10⁶/ml，均匀涂布在PDA平板上，置26℃恒温箱培养5天，产生大量分生孢子。

3.如权利要求1所述的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.），其特征在于：生产时孢子的培养方法为液体转固体双相培养法，将分生孢子液体转入PD液体培养基中，振荡培养2-4天，然后按照1：6-10的重量比例与灭菌的米糠或麦麸均匀混合，放在经过石灰水或臭氧消毒的不锈钢网筛中，上面覆盖消毒的塑料薄膜，置于22-30℃的室内培养3-5天后，打开塑料薄膜，产孢3-5天；连同培养料收集，晾干，粉碎，包装，贮存。

4.如权利要求1所述的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）在抑制辣椒根腐病、草莓根腐病、小麦根腐病、大豆根腐病、番茄根腐病、黄瓜根腐病中的作用。

5.如权利要求1所述的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）在抑制番茄灰霉病、葡萄灰霉病、草莓灰霉病、黄瓜灰霉病、韭菜灰霉病、辣椒灰霉病中的应用。

6.如权利要求1所述的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）在抑制姜立枯病、棉花立枯病、油菜立枯病、西瓜立枯病、烟草立枯病、番茄立枯病、黄瓜立枯病、辣椒立枯病、豇豆苗立枯病中的应用。

7.如权利要求1所述的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）在抑制豆角白绢病、太子参白绢病、苦瓜白绢病、花生白绢病中的应用。

8.如权利要求1所述的黄绿木霉真菌菌株TW351（Trichoderma aureoviride sp.）在促进姜种催芽生根、促进辣椒根苗、花生根苗、玉米根苗生长中的应用。