KR100474136B1

KR100474136B1 - 송이균, 이의 배양방법 및 이의 배양액을 이용한 송이버섯생산방법

Info

Publication number: KR100474136B1
Application number: KR10-2003-0005724A
Authority: KR
Inventors: 성재모; 차주영; 김인엽; 이수영
Original assignee: 주식회사머쉬텍; 성재모
Priority date: 2003-01-29
Filing date: 2003-01-29
Publication date: 2005-03-10
Also published as: KR20040069384A

Abstract

본 발명은 송이균(Tricholoma matsutake) SJM, 이의 배양방법 및 이의 배양액을 이용한 송이버섯 생산방법에 관한 것으로, 경북봉화 송림에서 자연적으로 발생된 송이버섯으로부터 송이균을 분리한 뒤 상기에서 얻은 송이균을 배양하여 얻은 송이 3 균주와 일본 북해도 대학에서 분양받은 2 균주 중에서 우수 송이 균주를 선발하고 상기에서 선발된 송이균(T. matsutake) SJM의 적정배지 및 적정 배양온도를 조사한 후 상기 송이균을 HA 고체배지에 접종하여 25℃ 항온기에서 30∼40일간 확대배양하고 접종원 배양을 위하여 글루코오스, 효모 추출물 및 콩가루로 구성된 접종원 배지 100㎖를 제조하여 상기 단계에서 확대배양된 송이균을 접종하여 25℃에서 30일간 배양한 뒤 액체종균 배양을 위하여 황설탕, 콩가루 및 옥수수 기름으로 구성된 2L 액체배지를 제조하여 상기 단계에서 배양된 접종원 배양액을 접종하여 20~25℃에서 30일간 배양하고 액체종균 대량 배양을 위하여 황설탕, 콩가루 및 옥수수 기름으로 구성된 8L 액체 배지를 제조하여 상기 단계에서 배양된 액체종균을 접종하여 20~25℃에서 30일간 배양한 후 액체종균 대량 배양시 송이균의 접종량과 배양기간에 따른 송이균의 생장속도를 조사한 다음 상기와 같이 배양된 송이균을 소나무 주위에 관주하는 형태로 접종하고 상기와 같이 접종된 송이균을 6개월간 관찰하여 송이가 발생하는 것을 확인함으로써 송이균의 대량 배양이 가능하고 상기 대량배양된 배양액을 소나무 주위에 직접 관주하는 형태로 접종하여 송이버섯을 생산할 수 있어 농임업상 매우 뛰어난 효과가 있다.

Description

송이균, 이의 배양방법 및 이의 배양액을 이용한 송이버섯 생산방법 {Tricholoma matsutake SJM, a method of culture thereof and a method of producing Tricholoma matsutake by using the culture solution thereof}

본 발명은 송이균(Tricholoma matsutake) SJM, 이의 배양방법 및 이의 배양액을 이용한 송이버섯 생산방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 송이균(Tricholoma matsutake) SJM을 분리하여 이를 다단계 액체배양을 하고 상기 배양액을 소나무 주위에 관주하는 형태로 접종하여 송이버섯을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

송이버섯(Tricholoma matsutake)은 주름버섯목 송이과에 속하며 소나무의 뿌리에 공생균을 형성하여 소나무로부터 영양분을 얻는 외생공생균으로 한국을 비롯한 북한, 일본 및 중국 동아시아에서 널리 채집되어지고 있다. 이러한 송이버섯은 외형이 크고 육질이 충실하며, 특히 그 독특한 향과 맛으로 오래 전부터 최고의 식용버섯으로 알려져 왔다.

우리나라에서 송이버섯의 중요성이 크게 나타난 시기는 1967년경 송이버섯이 수출되면서부터이며, 근래에는 해마다 송이버섯의 수출로 벌어들이는 소득이 연평균 약 400억원으로 추산되고 있다. 이러한 소득은 임업부산물로서 특별한 시설투자 없이도 송이발생지의 농민들에게 중요한 소득원이 될 수 있으며, 나아가 산촌민의 경제 안정화의 효과를 생각해 볼 때 경제적 가치가 매우 크다고 할 수 있다.

하지만 과거 30여년의 기록에 의하여 볼 때 송이버섯은 그 발생량이 매년 일정하지 못하고 풍년과 흉년을 번갈아가는 현상을 보이며, 1980년대를 시점으로 하여 점차 그 발생량이 감소하는 문제점을 나타내고 있다. 이는 송이버섯이 기후변동 및 발생지의 주변 환경에 따라 그 발생량의 격차를 심하게 나타내며, 게다가 근래에는 소나무림의 솔잎혹파리 피해, 산불에 의한 소나무림의 감소, 송이산 방치로 인한 하부 식생의 밀생, 유기물의 퇴적이 많이 되므로 송이버섯의 생산량이 전체적으로 감소하고 있기 때문이다. 이에 인위적인 노력에 의한 지속가능한 송이버섯 생산과 나아가 송이버섯의 인공재배를 위한 많은 연구들이 지금까지 이루어져 왔다. 하지만 송이버섯은 특징적으로 소나무의 뿌리와 공생관계에 있을 때에만 자실체를 형성하기 때문에 인공재배를 통한 자실체의 형성은 아직까지 실현되지 못하고 있으며, 다만 소나무림의 환경 조절에 의한 지속적인 송이버섯의 생산과 송이버섯의 발생량의 증가의 가능성은 확인이 되었다. 또한 송이버섯의 발생기에 적합한 기상조건의 조절의 방안은 아직까지 실현되지 못하고 있다.

우리나라에서 송이버섯의 인공재배와 증수를 위한 연구는 1970년대를 시작으로 현재까지 약 30여 년 동안 이루어져 왔으며, 연구된 분야는 크게 네 부분으로 나누어진다. 첫째는 송이발생에 영향을 주는 기상·환경적인 요인에 관한 연구, 둘째는 송이균의 인공배양 및 균환형성에 관한 연구, 셋째는 송이가 발생하는 소나무림의 생태조사에 관한 연구, 넷째는 송이균의 유전적인 특성에 관한 연구이다.

본 발명은 송이균의 분리와 인공배양 및 대량배양을 통한 새로운 균환의 형성을 위한 것이며 종래 발명과는 커다란 차이가 있다. 송이균의 새로운 균환을 형성하고자 하는 시도는 약 20년동안 여러 가지 방법으로 시도 되어졌다. 그러나, 아직 우리나라에서는 자연에서 발생된 송이균을 분리하는 방법에 대해 기술한 내용의 연구가 없으며 인공배양을 위한 기본배지 실험에서도 1984에 실시한 "송이균의 배양환경에 대한 증식반응에 관한 연구"에서 이용한 꿀, 토양 침출액, 소나무 조직 침출액과 같이 성분이 밝혀지지 않은 재료를 사용하지 않고 정제된 시약을 이용하여 배양 실험을 하였다. 대량배양을 위한 실험에서는 본 발명자가 이전에 제시한 동충하초 자실체의 대량생산을 위한 액체종균 배양방법과 같은 방법으로 송이균을 대량 배양하였으며 배양을 위한 배지의 성분에서는 차이를 나타낸다. 또한 새로운 균환을 형성하는 실험에서도 과거에 실험된 고체종균 균사체 접종에 의한 실험, 포자체 접종에 의한 실험, 균환이식에 의한 실험, 감염묘를 이용한 실험과는 많은 차이를 나타낸다. 이전에 실험된 이상의 4가지 실험들은 새로운 균환을 형성에 있어서 지금까지 효과적인 결과를 나타내지 못하고 있다. 이에 본 발명에서는 새로운 송이균환의 형성을 위해 액체 배양된 균을 직접적인 접종원으로 이용하여 직접 접종하였으며 접종 후 송이균과 소나무뿌리의 균근형성 및 새로운 균환의 발생 가능성을 알아보고자 한다. 이는 과거에 실험된 균사체 접종 실험과는 접종원 배양과정에서 큰 차이를 나타내는데 과거의 실험은 송이균을 흙이나 톱밥과 혼합하여 고체종균의 형태로 접종하였으며, 그 결과에 대해서는 아직 보고된 바가 없다.

본 발명자들은 상기와 같은 점을 감안하여 경북봉화 송림에서 자연적으로 발생된 송이버섯으로부터 송이균을 분리한 뒤 상기에서 얻은 송이균을 배양하여 얻은 송이 3 균주와 일본 북해도 대학에서 분양받은 2 균주 중에서 우수 송이 균주를 선발하고 상기에서 선발된 송이균(T. matsutake) SJM의 적정배지 및 적정 배양온도를 조사한 후 상기 송이균을 HA 고체배지에 접종하여 25℃ 항온기에서 30∼40일간 확대배양하고 접종원 배양을 위하여 글루코오스, 효모 추출물 및 콩가루로 구성된 접종원 배지 100㎖를 제조하여 상기 단계에서 확대배양된 송이균을 접종하여 25℃에서 30일간 배양한 뒤 액체종균 배양을 위하여 황설탕, 콩가루 및 옥수수 기름으로 구성된 2L 액체배지를 제조하여 상기 단계에서 배양된 접종원 배양액을 접종하여 20~25℃에서 30일간 배양하고 액체종균 대량 배양을 위하여 황설탕, 콩가루 및 옥수수 기름으로 구성된 8L 액체 배지를 제조하여 상기 단계에서 배양된 액체종균을 접종하여 20~25℃에서 30일간 배양한 후 액체종균 대량 배양시 송이균의 접종량과 배양기간에 따른 송이균의 생장속도를 조사한 다음 상기와 같이 배양된 송이균을 소나무 주위에 관주하는 형태로 접종하고 상기와 같이 접종된 송이균을 6개월간 관찰하여 송이가 발생하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 송이균(Tricholoma matsutake) SJM을 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 송이균(Tricholoma matsutake) SJM의 배양방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 송이균의 배양액을 소나무 주위에 직접 관주하는 형태로 접종함으로써 송이버섯을 대량으로 생산하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 경북봉화 송림에서 자연적으로 발생된 송이버섯으로부터 송이균을 분리한 뒤 상기에서 얻은 송이균을 배양하여 얻은 송이 3 균주와 일본 북해도 대학에서 분양받은 2 균주 중에서 우수 송이 균주를 선발하고 상기에서 선발된 송이균(T. matsutake) SJM의 적정배지 및 적정 배양온도를 조사한 후 상기 송이균을 HA 고체배지에 접종하여 25℃ 항온기에서 30∼40일간 확대배양하고 접종원 배양을 위하여 글루코오스, 효모 추출물 및 콩가루로 구성된 접종원 배지 100㎖를 제조하여 상기 단계에서 확대배양된 송이균을 접종하여 25℃에서 30일간 배양한 뒤 액체종균 배양을 위하여 황설탕, 콩가루 및 옥수수 기름으로 구성된 2L 액체배지를 제조하여 상기 단계에서 배양된 접종원 배양액을 접종하여 20~25℃에서 30일간 배양하고 액체종균 대량 배양을 위하여 황설탕, 콩가루 및 옥수수 기름으로 구성된 8L 액체 배지를 제조하여 상기 단계에서 배양된 액체종균을 접종하여 20~25℃에서 30일간 배양한 후 액체종균 대량 배양시 송이균의 접종량과 배양기간에 따른 송이균의 생장속도를 조사한 다음 상기와 같이 배양된 송이균을 소나무 주위에 관주하는 형태로 접종하고 상기와 같이 접종된 송이균을 6개월간 관찰하여 송이가 발생하는 것을 확인함으로써 달성하였다.

이하 본 발명의 구성을 설명한다.

본 발명은 경북봉화 송림에서 자연적으로 발생된 송이버섯으로부터 송이균을 분리하는 단계; 상기 단계의 송이균을 배양하여 얻은 송이 3 균주와 일본 북해도 대학에서 분양받은 2 균주 중에서 우수 송이 균주를 선발하는 단계; 상기 단계에서 선발된 송이균(T. matsutake) SJM의 적정배지 및 적정 배양온도를 조사하는 단계; 상기 송이균을 HA 고체배지에 접종하여 25℃ 항온기에서 30∼40일간 확대배양하는 단계; 접종원 배양을 위하여 글루코오스, 효모 추출물 및 콩가루로 구성된 접종원 배지 100㎖를 제조하여 상기 단계에서 확대배양된 송이균을 접종하여 25℃에서 30일간 배양하는 단계; 액체종균 배양을 위하여 황설탕, 콩가루 및 옥수수 기름으로 구성된 2L 액체배지를 제조하여 상기 단계에서 배양된 접종원 배양액을 접종하여 20~25℃에서 30일간 배양하는 단계; 액체종균 대량 배양을 위하여 황설탕, 콩가루 및 옥수수 기름으로 구성된 8L 액체 배지를 제조하여 상기 단계에서 배양된 액체종균을 접종하여 20~25℃에서 30일간 배양하는 단계; 액체종균 대량 배양시 송이균의 접종량과 배양기간에 따른 송이균의 생장속도를 조사하는 단계; 상기와 같이 배양된 송이균을 소나무 주위에 관주하는 형태로 접종하는 단계; 및 상기와 같이 접종된 송이균을 6개월간 관찰하여 송이가 발생하는 것을 확인하는 단계로 구성된다.

본 발명에서 송이균은 경북봉화 송림에서 자연적으로 발생된 송이버섯으로부터 포자를 이용하여 분리한 후 한국종균협회에 2003년 1월 13일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM 10458를 부여받았다.

본 발명 송이균의 생장최적배양배지는 글루코오즈 20g/L, 효모추출물 1.5g/L 및 소이톤(soytone) 1.5g/L를 포함하는 TMM 액체배지이고 최적생장온도는 20~25℃이다. 여기서, TMM 액체배지는 트리콜로마 마츄타케 미듐(Tricholoma matsutake medium) 액체배지이다.

본 발명에서 송이균의 액체배양액은 다단계 배양을 통하여 제조된다.

제 1단계는 고체배지에서 확대배양된 송이균을 접종원 배지에 접종하여 배양하는 송이균의 접종원 배양단계이다. 여기서 접종원 배지는 증류수에 글루코오즈 20g/L, 효모 추출물 1.5g/L 및 콩가루 1.5g/L를 첨가하여 제조되며, 20~25℃에서 30일간 배양하는 것이다.

2 단계는 증류수에 황설탕 20g/L, 콩가루 3g/L 및 옥수수 기름 3㎖/L를 첨가하여 제조된 액체배지에 상기 1 단계의 배양액을 접종하여 배양하는 송이 액체종균 배양단계이다. 여기서, 액체배지의 부피는 상기 접종원 배양단계 배지의 20배이다. 본 단계에서 배양시 바람직한 온도 및 배양기간은 20~25℃에서 30일간 배양하는 것이다. 또한, 배양시 주입시키는 제균된 공기의 양은 0.3vvm으로 조절하는 것이 바람직하다.

3 단계는 증류수에 황설탕 200g/L, 콩가루 3g/L 및 옥수수 기름 3㎖/L를 첨가하여 제조된 액체배지에 상기 2 단계의 배양액을 접종하여 배양하는 송이 액체종균 대량 배양단계이다. 여기서, 액체배지의 부피는 상기 액체종균 배양단계 배지의 4배이다. 본 단계에서 배양시 바람직한 온도 및 배양기간은 20~25℃에서 30일간 배양하는 것이며, 배양시 주입시키는 제균된 공기의 양은 0.3vvm으로 조절하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 공기가 유입되었을 때 거품이 발생되는 것을 방지하기 위하여 첨가되는 소포제로는 가정용 식용유, 면실유, 피마자유, 옥수수유, 올리브유 및 야자유가 바람직하며 옥수수유가 가장 바람직하다.

이하 본 발명을 하기 위한 실시예에 의해 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1 : 송이균의 분리

송이균의 인공배양 및 대량배양을 통한 균환형성 실험을 하기위해서는 먼저 자연적으로 발생된 송이버섯의 분리 및 균주 확보의 과정이 필요하다. 하지만 송이균은 공생균으로써 다른 부생균에 비해 인공적인 조건에서 분리가 어려우며, 지금까지도 확실한 분리방법이 제시되지 않았다. 이에 본 발명에서는 송이버섯의 조직을 이용한 분리와 포자를 이용한 분리 두 가지 방법을 이용하여 실험을 실시하였으며, 분리를 위한 배지로는 MMN, PDMP, MYG, HA 4가지의 배지에 맥아추출 성분을 첨가하여 pH를 5.2로 조절한 후 이용하였다(표 1).

송이포자 발아 실험을 위해 선발된 배지조성표

	배지(g/L)
	HA	MMN	PDMP	MYG
감자			200
덱스트로즈		10	10
글루코오즈	10			20
맥아 추출물	3	3	3	5
효모 추출물	2	2		5
펩톤			1
MgSO₄		0.15
KH₂PO₄	1	0.5
CaCl₂		0.067
NaCl		0.025
FeCl₃		1.2(㎖)
(NH₄)₂HPO₄		0.25
아가	20	20	20	20

1. 조직을 이용한 분리실험

2002년 9월 15일부터 9월 28일까지 경북봉화 송림에서 송이버섯을 채집하여 조직분리를 실시하였다. 분리 방법은 버섯의 갓과 대 두 부분의 조직에서 분리하였으며, 버섯을 절단하여 외부와 닿지 않은 내부 조직을 떼어내어 표 1에 나타낸 4가지 고체배지에 치상하였다. 분리 치상 후 3개월간 배양하면서 관찰한 결과, 4가지 배지에서 모두 분리되지 않았다.

2. 포자를 이용한 분리실험

2002년 9월 15일부터 9월 28일까지 경북봉화 송림에서 갓이 핀지 오래지 않은 신선한 송이버섯을 채집하여, 채집된 송이버섯의 자실체를 물 한천배지(water agar)가 들어 있는 페트리디쉬(petri-dish)의 뚜껑에 테이프로 고정시킨 후 뚜껑을 덮고, 자실체에서 담자포자가 배지상에 떨어지게 하였다.

1) 고체배지에서 포자발아 실험

물 한천배지(water agar)에 떨어진 송이포자를 고체영양배지에서 배양하기 위해 광학현미경으로 포자가 떨어진 부분을 관찰하여 표시하였다. 그리고 6㎜ 코르크 보러(cork borer)로 표시된 부분의 배지를 떼어내어 표 1에 나타난 4가지 고체배지에 치상하였다.

포자가 묻어있는 부분이 영양배지에 접촉하도록 접종을 실시하였으며, 한 배지에 4 내지 5개의 조각을 접종하였다.

접종 후 3개월간 관찰한 결과, MYG 고체배지에서 하나의 포자가 발아되었으며, 그 외의 배지에서는 발아가 되지 않았다.

2) 액체배지에서 포자발아 실험

① 삼각플라스크에서 포자발아

포자가 떨어진 물 한천배지를 광학현미경으로 관찰한 후 살균된 칼을 이용하여 포자가 묻어있는 부분을 2×2㎜의 크기로 떼어내었다. 고체영양배지와는 달리 표 1의 성분에서 아가성분을 제외한 액체배지를 조제한 후 250㎖의 삼각플라스크에 50㎖의 양으로 분주하였다. 배지의 pH는 5.2로 조절하였으며, 살균된 액체배지에 포자가 묻은 조각을 5개씩 접종하였다.

접종된 삼각플라스크는 각각 15, 20, 25℃의 항온기에서 3개월간 포자발아 시켰으며, 그 결과 실험한 3가지 온도 모두에서 포자의 발아가 일어났다. 15℃에서는 MMN 배지에서 발아되었고, 20℃에서는 MMN, HA, MYG 3개의 배지에서 포자가 발아되었으며, 25℃에서는 MMN, HA 2개의 배지에서 포자가 발아되었다. 결과적으로 4종류의 배지에서 송이포자 발아에 효과적인 배지는 MMN, HA배지이었으며, PDMP배지의 경우는 포자발아가 일어나지 않았다.

접종 후 포자의 발아를 눈으로 확인하기까지의 기간은 약 25∼30일정도 소요되었으며 이 후 20∼30일정도 균사가 생장하게 되면 지름이 약 5mm정도의 펠릿을 형성하게 되었다. 또한 포자가 발아된 후 균사의 생장은 15℃에서 가장 느렸으며, 20℃와 25℃는 그 생장정도가 유사하였다.

② 삼각플라스크에서 고체배지로 이식배양

삼각플라스크에서 발아된 송이균을 균주로 확보하기 위해서는 다시 고체배지로 이식 배양할 필요성이 있다. 따라서 본 발명에서는 TMM 및 HA 고체배지를 이용하여 발아된 송이균을 이식배양 하였으며 이식 후 25℃ 배양실에서 약 30일간 배양한 결과 지름이 2㎝정도로 균이 성장함을 볼 수 있었다.

실시예 2 : 우수 송이 균주 선발

본 발명에서 사용한 균주는 경북봉화에서 채집 분리된 3개 균주와 일본의 북해도 대학에서 분양받은 2균주를 포함하며 이 중에서 가장 성장이 양호한 한 균주를 선발하였다(표 2).

EFCC에 보관된 5종의 송이균주

균주번호	속명	종명	채집 장소
T-001	Tricholoma	matsutake	일본 Hokkaido
T-002	Tricholoma	matsutake	일본 Hokkaido
T-003	Tricholoma	matsutake	한국 경북 봉화
T-004	Tricholoma	matsutake	한국 경북 봉화
T-005	Tricholoma	matsutake	한국 경북 봉화

각각의 균주를 HA(Hamada agar)평판배지에 접종하여 25℃의 배양실에서 약 30∼40일간 배양한 후 접종원으로 이용하였으며 균주 선발을 위한 배지는 CDY, TMM 액체배지를 사용하였다. 각각의 액체배지를 250㎖ 삼각플라스크에 50㎖씩 조제한 후 121℃ 1.2psi에서 20분간 고압살균하였으며 배지의 pH는 5.2로 조절하였다. 접종은 평판배지에 자란 균사체를 6mm 코르크 보러(cork borer)로 3개씩 떼어내어 실시하였으며, 25℃ 배양실에서 60일간 배양 후 건조 균체량을 측정하였다.

그 결과, CDY 및 TMM의 두 가지 액체배지 모두에서 T-003 송이균주가 다른 4개의 균주보다 생장이 우수하게 나타났다(표 3, 도 1). 이에 T-003 송이균주를 Tricholoma matsutake SJM이라 명명하고 이를 한국종균협회에 2003년 1월 13일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM 10458을 부여받았다.

균주선발을 위해 5종의 송이균주를 CDY, TMM 액체배지에서 60일간 배양한 후 측정된 균사체 건중량(g/L)

	송이균주에 따른 균사체 건중량(g/L)
	T-001	T-002	T-003	T-004	T-005
CDY	0.6	0.73	1.3	1.1	0.7
TMM	0.7	0.73	0.96	0.6	0.62

선발된 SJM 균주는 EFCC에서 6개월 간격으로 계대배양 하였으며 접종한 후 25℃의 배양실에서 약 30∼40일간 배양한 후 이후 실험의 접종원으로 이용하였다.

실험예 1 : 송이균의 적정 배양배지 조사

송이균(T. matsutake) SJM의 적정배지를 선발하기 위하여 HA(Hamada media)액체배지를 비롯한 17종의 액체배지를 이용하였다(표 4 및 표 5). 각각의 배지는 250㎖ 삼각플라스크에 150㎖씩 조제하여 pH를 5.2로 조절한 후 121℃ 1.2psi에서 20분간 고압살균 하였으며, 각각의 살균된 액체배지에 HA배지에서 30∼40일간 배양된 SJM의 균사 선단부분을 직경 6mm 코르크 보러(cork borer)로 잘라 낸 다음 3개의 절편씩 접종하였다. 접종한 배지는 25℃의 항온기에서 60일간 배양한 후 60℃ 건조기에 24시간 건조시킨 후 균사의 건중량을 조사하였다.

그 결과, TMM 액체배지에서 가장 높은 생장을 보였으며 SYSP배지와 TMM+PDMP배지 그리고 SYSP+MMN배지에서도 높은 균사생장을 나타냈다. 특이하게도 MMN배지의 경우 초기의 균사생장이 다른 배지들보다 월등히 좋으나, 배양을 오래할수록 생장이 느려짐이 관찰되었다(표 6, 표 7, 도 2).

송이균의 적정배지 조사를 위한 배지조성표(pH 5.2)

	배지(g/L)
	HA	PDB	MMN	PDMP	CDY	YMM	TMM	SYSP	PYMS
감자		200		200				200	200
덱스트로즈		20		20		10
글루코오즈	20		10		10		20		5
맥아 추출물			3	3	3	3	1.5	1.5	3
효모 추출물	3				3	3			3
펩톤				1		5			5
MgSO₄	0.5		0.15	0.5	0.5				0.5
KH₂PO₄	1		0.5		1				1
K₂HPO₄				1
KCl					0.5
NaNO₃				2	2
FeSO₄				0.01	0.01
CaCl₂			0.05	0.5
NaCl			0.025
FeCl₃
(NH₄)₂HPO₄			0.25
티아민(Thiamine)			0.1(㎎)
HCl
소이톤(soytone)							1.5	1.5

송이균의 적정배지 조사를 위한 배지조성표(pH 5.2)

	배지(g/L)
	M+P^*	Y+PD^*	T+PD^*	C+PY^*	H+PY^*	S+M^*	C+Y+P^*	H+C+Y^*
감자	100	100	100	100	100	100	67
덱스트로즈	10	15	10				10	3.3
글루코오즈	5		10	7.5	12.5	5	3.3	10
맥아 추출물	1.5	3	1.5	3		1.5	2	2
효모 추출물		1.5	0.75	3	3	0.75	2	3
펩톤		3	0.5				1.67	1.67
MgSO₄	0.075	0.25	0.25	0.5	0.5	0.075	0.33	0.33
KH₂PO₄	0.25			1	1	0.25		0.67
K₂HPO₄		0.5	0.5
KCl				0.25			0.167	0.167
NaNO₃		1	1	1			0.67	0.67
FeSO₄		0.005	0.005	0.005			0.3	0.3
CaCl₂	0.03	0.25	0.25			0.03
NaCl	0.01					0.01
FeCl₃
(NH₄)₂HPO₄	0.125					0.125
티아민(Thiamine)	0.05(mg)					0.05(mg)
HCl
소이톤(soytone)			0.75			0.75

상기 표 5에서 *가 표시된 배지는 표 4에서 나타낸 배지들의 조합을 나타낸다. 2가지 배지의 조합은 각각 배지량의 1/2의 조합이며, 3가지배지의 조합은 각각 배지량의 1/3의 조합이다. (M; MMN, P; PDB, Y; YMM, PD; PDMP, T; TMM, C; CDY, PY; PYMS, H; HA, S; SYSP)

배지에 따른 송이균(SJM)의 생장조사(g/L)

	기본 배지
	HA	PDB	MMN	PDMP	CDY	YMM	TMM	SYSP	PYMS
균사체 건중량(g/L)	0.800	0.733	0.507	0.933	0.667	0.267	1.707	1.267	0.467

배지에 따른 송이균(SJM)의 생장조사(g/L)

	기본 배지
	M+P	Y+PD	T+PD	C+PY	H+PY	S+M	C+Y+P	H+C+Y
균사체 건중량(g/L)	0.640	0.733	1.240	0.667	0.733	1.173	0.753	0.907

실험예 2 : 송이균의 적정 배양온도 조사

송이균(SJM)의 적정 배양온도를 조사하기 위하여 TMM 액체배지를 250㎖ 삼각플라스크에 150㎖씩 조제하여 pH를 5.2로 조절한 후 고압살균 하였다. 살균된 액체배지에 HA배지에서 30∼40일간 배양된 SJM 균주의 균사 선단부분을 직경 6mm 코르크 보러(cork borer)로 떼어내어 3개씩 접종하였으며, 접종된 송이균은 온도를 각각 10, 15, 20, 25, 30℃ 범위로 맞춘 항온기에서 60일간 배양한 후 60℃ 건조기에 24시간 건조시킨 후 균사의 건중량을 조사하였다.

실험결과 30℃에서는 송이균(SJM) 생장이 거의 일어나지 않았으며, 10℃에서 25℃의 조건에서는 송이균의 생장이 일어났다. 송이균의 생장이 높게 나타난 조건은 20~25℃였으며, 25℃에서 온도가 점차 낮아질수록 균의 생장도 느려짐을 볼 수 있었다(표 8, 도 3).

온도조건에 따른 송이균(SJM)의 생장조사

	온도(℃)
	10℃	15℃	20℃	25℃	30℃
균사체 건중량(g/L)	0.91	1.16	1.20	1.25	0.88

실시예 3 : 송이균의 배양

송이균(Tricholoma matsutake) SJM을 HA(글루코오즈 10 g, 효모 추출액 2 g, KH₂PO₄ 1 g, 에비오제 5g, 아가 20g, 증류수) 고체배지 1L에 접종하여 25℃ 항온기에서 30∼40일간 확대배양하였다(도 4). 확대 배양된 송이균을 하기와 같은 3단계의 액체배양과정을 통하여 대량 배양하였다.

제 1단계: 송이균의 접종원 배양단계

송이균(T. matsutake) SJM의 접종원을 배양하기 위하여 하기 표 9에 나타낸 바와 같이 배양액을 제조하고 고압멸균기(Autoclave)를 사용하여 121℃에서 20분간 멸균하였다.

잡균의 오염을 방지하기 위하여 도 5에 도시한 바와 같은 접종기구를 사용하였다. 접종기구는 접종용기(1), 마개부(2), 공기주입관 (3), 에어필터(4) 및 배양액 배출관(5)으로 구성되어 있다. 접종용기(1)의 마개부(2)에는 공기주입관(3)과 배양액 배출관(5)이 연결되어 있다. 공기주입관(3)에는 공기제균용 에어필터(4)가 장착되어 있으며 그 일단은 접종용기(1)의 밑바닥에 위치하고, 그 타단은 콤푸레샤에 연결되어있다. 배양액 배출관(5)의 그 일단은 접종용기(1)의 밑바닥에 위치하고, 그 타단은 액체종균 배양장치 도 6에 설치된 겸용관(13)에 연결되어 있다. 배양액 배출관(5)은 관의 크기를 달리하여 접속되게 하고 고무관을 연결한 다음 호일로 막아 잡균의 오염을 방지하였으며 이들 공기주입관(3)과 배양액 배출관(5)은 모두 마개부(2)에서 1cm안으로 설치하였다.

하기 표 9에 나타낸 접종원배지 100㎖을 제조하여 상기 접종용기(1)에 넣고 상기 확대 배양한 송이균을 접종하여 25℃에서 30일간 배양한다.

송이균의 액체종균 배양용 배지의 조성비

성분	100㎖(접종원 배지)	2L 액체배지	8L 액체배지
글루코오즈	2g
효모 추출물	0.15g
황설탕		40g	1.6㎏
콩가루	0.15g	6g	24g
옥수수 기름(corn oil)		6㎖	24㎖

제 2단계: 액체종균 배양단계

액체종균의 배양은 도 6에 도시한 바와 같은 액체종균 배양장치를 사용하였다. 상기 액체종균 배양장치는 배양용기(11), 마개부(12), 겸용관(13), 잠금장치(14), 에어필터(15), 공기배출관(16) 및 여과기(17)로 구성되어 있다. 상기 배양용기(11)는 액체배양액을 수용하고 있으며 배양용기 상단의 마개부(12)에는 각각 공기, 접종원주입 및 배양이 완료된 후 배양액을 배출하는 역할을 겸하는 겸용관(13)과 공기배출관(16)이 연결되어 있다. 겸용관(13)에는 관의 밀폐를 조절하는 잠금장치(14)와 공기 제균용 에어필터(15)가 장착되어 있으며 공기 배출관(16)에는 배양기내에서 발생될 수 있는 해독성 유해균의 외부로 방출되는 것을 방지하는 여과기(17)가 장착되어 있다. 겸용관(13)의 일단은 배양용기(11)의 밑바닥에 위치하고 타단은 콤퓨레샤에 연결되어 배양용기(11)내부로 공기를 공급하게된다. 공기배출관(16)의 일단은 배양용기(11)의 내부에 연결되어 있고 타단은 외부의 대기에 개방되어 있다.

상기 표 9의 2L 액체배지를 제조하여 상기 배양용기(11)에 넣는다.

1단계에서 배양된 접종원 배양액을 상기 액체종균 배양장치에 접종할 때에는 공기주입관(3)에 콤퓨레샤를 이용하여 공기를 주입하고 배양액 배출관(5)을 액체종균 배양장치의 겸용관(13)에 연결하여 공기주입관(3)에 들어온 공기의 압력에 의해 접종원 배양액이 액체종균 배양장치로 배출되도록 하였다. 온도는 20~25℃를 유지시키고, 0.3 vvm 정도의 제균된 공기를 주입하면서 30일 동안 배양하여 액체종균을 얻었다.

제 3단계: 액체종균 대량 배양단계

액체종균 대량 배양은 도 7에 도시한 액체종균 배양장치를 사용하였다. 상기 표 9에 나타낸 8L 액체배지를 제조하여 상기 배양용기(21)에 넣는다. 그리고 상기 2단계에서 배양된 액체종균을 배출한 다음 이 중 400㎖를 상기 접종용기(11)에 넣고, 상기 2단계의 방법과 동일하게 상기 배양용기(21)에 있는 8L액체 배지에 접종하였다. 그리고 온도는 20~25℃로 유지하게 하고 0.3vvm의 속도로 제균된 공기를 주입하면서 30일간 배양하여 액체배양액을 제조하였다.

실험예 3: 8L 배양시 접종량과 배양기간에 따른 송이균의 생장조사

송이균의 접종량 및 배양기간에 따른 균사체양을 조사하기 위하여 8L의 배양병에 표 9의 8L 액체배지와 동일한 양의 동일 성분을 넣고 증류수를 채워 7L의 배지를 조제한 후 121℃ (1.2psi)에서 40분간 멸균하였다. 멸균된 8L 배양병에 2L 배양병에서 약 45일간 배양한 송이균을 각각 200㎖, 400㎖, 600㎖, 800㎖, 1000㎖로 접종량을 달리하여 접종한 후 초기 접종된 균사체의 양을 측정하고 상기에 제시한 대량방법에 따라 8주간 통기배양을 실시하였다. 8주간의 배양에서 매 1주마다 통기의 과정을 중단하고 30분간 균사체를 침전시킨 후 생장한 균사체의 양을 조사하였다.

실험한 결과 접종 후 약 1∼3주까지는 전체적으로 송이균(SJM)의 생장이 빠르게 일어났지만 약 3∼8주까지는 균사의 생장이 점차로 느려짐을 볼 수 있었다. 초기 접종량을 많게 하여 8주간 배양한 경우 증가된 균사체량이 높게 나타났지만, 초기 접종량에 비해 증가된 송이균사체를 배수로 나타내보면, 200㎖의 경우 약 8.55배, 400㎖의 경우 5.69배, 600㎖의 경우 4.86배, 800㎖의 경우 4.29배, 그리고 1000㎖의 경우 3.42배로 나타났다. 이런 결과로 볼 때 접종량을 작게 한 경우에는 이용할 수 있는 영양분이 충분하였기 때문에 송이균의 지속적인 생장이 가능했지만 접종량을 많이 한 경우는 어느 정도 생장하게 되면 이용할 수 있는 배지의 영양분이 감소로 인하여 점차 생장속도가 느려지게 되었다고 판단된다(표 10, 도 8).

접종량과 배양기간에 따른 송이균(SJM)의 생장조사

접종량	배양기간에 따른 균사체 생장량(mm)
접종량	0주	1주	2주	3주	4주	5주	6주	7주	8주
200㎖	11	28	44	54	59	69	78	86	94
400㎖	16	38	53	63	70	74	80	84	91
600㎖	21	46	60	70	78	83	91	95	102
800㎖	28	55	75	85	94	101	107	110	120
1000㎖	38	69	88	102	113	121	125	129	130

실시예 4: 송이균 액체배양액을 이용한 송이버섯의 생산

1. 송이균의 접종

송이균 접종을 위한 포장은 경상북도 봉화군 어지리에 위치한 송이산이며 배양된 송이균의 접종은 2002년 4월에서 10월까지 총 6차례 실시하였다(표 11). 접종 방식은 도 9와 같은 접종기를 제작하여 액체로 배양된 송이균을 접종통에 넣은 후 소나무 주위에 관주하는 형태로 실시하였으며, 1회 관주에서 접종되는 균사체량은 약 80-100㎖정도로 접종하였다. 접종 후 해충에 의한 피해를 막기 위해 접종구를 수수깡으로 막아두고, 색끈을 이용하여 접종지점을 표시하여 이 후에 접종된 송이균의 변화를 관찰할 수 있게 하였다.

배양한 송이균(SJM)의 접종시기 및 접종량

	접종시기	접종량
1차 접종	2002년 4월 24일	32L
2차 접종	2002년 5월 08일	20L
3차 접종	2002년 6월 01일	100L
4차 접종	2002년 7월 05일	130L
5차 접종	2002년 9월 27일	170L
6차 접종	2002년 10월 31일	130L

2. 접종 후 송이균의 관찰

송이균은 액체 통기배양을 하면 작고 둥근 형태의 펠릿을 형성하게 되는데 이렇게 형성된 펠릿은 질긴 막과 같은 형태를 하며 그 내부는 공간이 비어있음을 볼 수 있다. 펠릿의 막이 두텁고 질기다는 것은 배양된 균사체가 토양속에 접종되었을 때 어떤 불리한 환경에서도 쉽게 사멸되지 않을 가능성을 나타낸다.

접종한 후 2주가 지난 송이균사체의 변화를 살펴보면 균사체가 한덩어리로 뭉쳐지거나, 토양속에 그대로 존재하고 있었고(도 10), 4주에서 8주가 지난 송이균사체는 접종된 균사체가 접종구의 벽을 따라 약하게 토양으로 뻗어 가는 모습과 토양과 같이 섞여 뭉쳐진 흰 균사 덩어리의 모습, 그리고 접종구를 하얗게 메우고 있는 균사체의 모습 등을 볼 수 있었다(도 11, 도 12). 12주에서 20주가 지난 송이균사체는 때때로 소나무뿌리와 엉겨서 많이 자라 있는 모습을 보이며, 또한 어떤 것들은 토양속에 균사체가 스며든 것처럼 보이는 것들도 있었다(도 13, 도 14, 도 15). 상기와 같이 접종 후 약 6개월까지의 실험결과 접종된 송이균은 쉽게 사멸되지 않고 살아있으며 오히려 균사들이 덩어리 형태를 이루어 천천히 토양으로 뻗어가고 있음을 볼 수 있었다. 마침내 송이가 발생하였다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 경북 봉화 송림에서 채취한 자연산 송이로부터 송이균(Tricholoma matsutake) SJM을 분리하여 이를 액체배양배지에서 다단계 배양하여 송이균을 대량 배양하는 효과가 있으며, 상기에서 얻은 송이균 액체 배양액을 소나무 주위에 직접 관주하는 형태로 접종함으로써 송이버섯을 대량으로 생산하는 효과가 있으므로 농임업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 본 발명에서 우수 균주를 선발하기 위한 5종의 송이균주를 CDY, TMM 액체배지에서 60일간 배양한 후 측정한 균사체 건중량(g/L)을 나타낸 그래프이다.

도 2는 배지 종류에 따른 송이균(Tricholoma matsutake) SJM의 생장을 조사하기 위하여 각 배지에서 송이균을 60일간 배양한 후 측정한 균사체 건중량을 나타낸 그래프이다.

도 3은 온도 조건에 따른 송이균(Tricholoma matsutake) SJM의 생장을 조사하기 위하여 각 온도 조건에서 송이균을 60일간 배양한 후 측정한 균사체 건중량을 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 송이균(Tricholoma matsutake) SJM과 고체배지에 확대 배양된 송이균(Tricholoma matsutake) SJM을 보여준다.

도 5는 본 발명에서 확대 배양된 송이균을 무균적으로 접종하기 위하여 사용된 바람직한 접종기구를 도시한 것이다.

도 6은 본 발명 송이 액체종균의 접종, 배양 및 배출을 용이하게 하기 위한 액체종균 배양장치를 도시한 것이다.

도 7은 본 발명 송이 액체종균의 대량 배양을 용이하게 하기 위한 액체종균 배양장치를 도시한 것이다.

도 8은 송이균의 접종량 및 배양기간에 따른 송이균(Tricholoma matsutake) SJM의 생장을 조사한 후 그 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 본 발명 송이 액체종균을 관주하기 위한 송이균 접종기(상)와 송이균의 접종과정(하)을 보여주는 사진이다.

도 10은 본 발명 송이균을 접종한 후 2주 뒤의 균사체 모습을 보여주는 사진이다.

도 11은 본 발명 송이균을 접종한 후 4주 뒤의 균사체 모습을 보여주는 사진이다.

도 12은 본 발명 송이균을 접종한 후 8주 뒤의 균사체 모습을 보여주는 사진이다.

도 13은 본 발명 송이균을 접종한 후 12주 뒤의 균사체 모습을 보여주는 사진이다.

도 14은 본 발명 송이균을 접종한 후 16주 뒤의 균사체 모습을 보여주는 사진이다.

도 15은 본 발명 송이균을 접종한 후 20주 뒤의 균사체 모습을 보여주는 사진이다.

Claims

생장최적배양배지는 글루코오즈 20g/L, 효모추출물 1.5g/L 및 소이톤 1.5g/L를 포함하는 TMM(Tricholoma Matsutake Medium) 액체배지이고 최적생장온도는 20~25℃임을 특징으로 하는 송이균(Tricholoma matsutake) SJM KCCM 10458.
송이균(Tricholoma matsutake) SJM(KCCM 10458)을 증류수에 글루코오즈 10g/L, 효모 추출액 2g/L, KH₂PO₄ 1g/L, 에비오제 5g/L, 아가 20g/L를 첨가하여 제조된 고체배지에 접종하여 25℃에서 30∼40일간 확대배양하는 단계;

확대배양된 송이균을 증류수에 글루코오즈 20g/L, 효모 추출물 1.5g/L, 콩가루 1.5g/L를 첨가하여 제조한 배지로서 상기 확대배양 단계 배지의 1/10배 부피를 가진 배지에 접종하여 25℃에서 30일간 배양하는 송이균의 접종원 배양단계;

상기 접종원 배양단계에서 배양된 배양액을 증류수에 황설탕 20g/L, 콩가루 3g/L, 옥수수 기름 3㎖/L를 첨가하여 제조한 배지로서 상기 접종원 배양단계 배지의 20배 부피를 가진 배지에 접종하여 20~25℃에서 0.3vvm으로 제균된 공기를 주입하면서 30일간 배양하는 송이 액체종균 배양단계;

상기 액체종균 배양단계에서 배양된 배양액을 황설탕 200g/L, 콩가루 3g/L, 옥수수 기름 3㎖/L를 첨가하여 제조한 배지로서 상기 액체종균 배양단계 배지의 4배 부피를 가진 배지에 접종하여 20~25℃에서 0.3vvm으로 제균된 공기를 주입하면서 30일간 배양하는 송이 액체종균 배양단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 송이균의 배양방법.
제 2항의 배양방법을 이용하여 액체 배양된 송이균을 소나무 주위에 관주하는 것을 특징으로 하는 송이버섯 생산방법.