CN103382447A - 一种绿蓝链霉菌Sv-29及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株绿蓝链霉菌Sv-29菌株及其应用，属于生物技术领域。本发明通过常规的方法从自然界中获得该绿蓝链霉菌（S. viridocyaneus）Sv-29菌株。绿蓝链霉菌（S. viridocyaneus）Sv-29菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC NO.7398。绿蓝链霉菌（S. viridocyaneus）Sv-29菌株能够产生多种抗菌活性物质，对多种病原真菌具有较好拮抗作用。特别是对由芸薹链格孢引起的白菜黑斑病和由尖孢镰孢菌萎焉转化型引起的棉花枯萎病具有较强的防治作用。

Description

一种绿蓝链霉菌Sv-29及其应用

技术领域:

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种绿蓝链霉菌（Streptomyces viridocyaneus）Sv-29菌株及其应用。 

背景技术:

链霉菌是一类重要的微生物资源，它以产生种类繁多、结构多样的生物活性物质而受到重视。在农用抗生素的研究开发中，80%的活性物质都源于土壤中的链霉菌，它具有周期短、易于研究、便于生产、无毒无害等优点，因此发掘利用土壤中具有抑菌活性的链霉菌是生物农药开发的一个重要途径。但随着研究的广泛和深入，发现新化合物的几率变得越来越低，而发现新化合物是药物开发的基本前提，微生物药物开发的最大问题是尽早排除已知化合物。本文在传统研究方法的基础上，结合气相色谱-质谱（GC-MS）技术，初步确定活性物质的结构，为开发利用新型抗生素奠定基础。 

芸薹链格孢（Alternaria brassicae）属半知菌亚门丝孢纲丝孢目暗色孢科链格孢属，是引起植物病害的重要病原真菌之一，侵染小麦、大豆、花生、棉花、番茄、桃、李、杏等多种植物，造成田间和产后损失。白菜黑斑病是由芸薹链格孢引起的真菌病害，一般通过种子传带形成异地扩散和蔓延，为害叶片和整株植物，严重影响产量和品质。尖孢镰孢菌萎焉转化型（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）属半知菌亚门丝孢纲瘤座孢目瘤座孢科镰孢属，侵染多种植物。棉花枯萎病由该病菌引起的维管束病害，靠土壤传播，防治难度较大，一旦发生，轻者致使棉花产量下降、纤维品质变劣、重者可造成绝产。 

对上述病害的防治主要是采用抗病品种、化学防治和生物防治。随着绿色农业的兴起，生物防治逐渐引起人们的重视。对这两种病害的生物防治研究进展较快，但开发力度仍然处于试验探索阶段，存在见效慢、稳定性差、药效受环境因素影响大等缺陷。本研究中的绿蓝链霉菌Sv-29能产生多种抗菌活性物质，对此两种病害具有较好的防治效果，应用前景广泛。 

发明内容：

本发明的目的在于提供一种绿蓝链霉菌Sv-29及其应用。 

发明人2012年3月从云南省曲靖市郊区的红栌根际土中分离得到一株生防菌株Sv-29，通过16SrDNA测序和生理生化指标鉴定，鉴定结果表明该细菌为绿蓝链霉菌（Streptomyces viridocyaneus），该菌株命名为绿蓝链霉菌（Streptomyces viridocyaneus），该菌株已经保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2013年4月1日；保藏号为CGMCC No.7398。 

本发明的绿蓝链霉菌（S. viridocyaneus）Sv-29菌株能够产生多种抗菌活性物质，对多种病原真菌具有较好拮抗作用，作为制备防治植物真菌病害药物的应用。 

菌株Sv-29在PDA平板上对供试植物病原真菌具有广谱、高效的拮抗作用，其中对芸薹链格孢和尖孢镰孢菌萎焉转化型的拮抗作用最强，抑菌圈半径分别达到了10.8 mm和11.3 mm。对菌株进行发酵培养，分别利用丙酮、氯仿、乙酸乙酯萃取代谢产物GC-MS分析发现萃取物中含有多种化学成分，主要包括有机酸类、酯类、苯及其衍生物、烷烃、杂环化合物等几大类。其中发现下面4种物质：（1）11-Oxatetracyclo[5.3.2.0(2,7)]dodecan-9-one、（2）2-Vinyl-9[3-deoxy-.beta.-d-ribofuranosyl]hypoxanthine、（3）2-（Phenyl-piperidin-1-yl-methyl）（4）10-Methoxy-nb-.alpha.-Methylcorynantheol是主要的抗菌活性物质。在500 L发酵罐上进行中试工艺流程，通过液体发酵获得菌株Sv-29的培养物，采用麦饭石为载体得到可湿性粉剂。对制剂进行温室防治效果试验，结果显示制剂对白菜黑斑病和棉花枯萎病具有较强的防治作用，防治效果分别达到88.5%和91.0%。 

本发明的优点在于：绿蓝链霉菌（S. viridocyaneus）Sv-29菌株能够产生多种抗菌活性物质，对多种病原真菌具有较好拮抗作用；特别是对由芸薹链格孢引起的白菜黑斑病和由尖孢镰孢菌萎焉转化型引起的棉花枯萎病具有较强的防治作用，应用前景广泛。 

附图说明:

图1 显示菌株Sv-29产生的抗菌活性物质。其中：物质1、2、3、4标注 同表3。 

具体实施方式:

下面用实施例对本发明进行详细说明，实施例不对本发明构成任何限制。 

实施例1：菌株Sv-29的分离鉴定 

本发明中菌株Sv-29分离于云南省曲靖市郊区的红栌根际土中，保藏号为CGMCC NO.7398。菌种鉴定采用形态特征、生理生化特征及16SrDNA序列比对分析综合确定。 

菌株Sv-29的形态特征：该菌株在高氏一号培养基上生长良好，菌落颜色为灰白色，表面呈粉绒状，凸起，并有明显褶皱。基内菌丝丰富，多分支，不断裂。气生菌丝发育良好，成熟后生成孢子丝，孢子丝直至螺旋状；孢子链长，分化为孢子。 

菌株Sv-29的生理生化特性：生长温度范围为4℃~50℃，生长pH值范围为5.0~11.0，NaCl耐受值为10%，可利用的C源为：L-山梨糖、甘露醇、D-半乳糖、山梨醇、木糖、鼠李糖、棉子糖、蔗糖、L-苹果酸盐、柠檬酸盐。生理生化测定为阳性的指标有：厌氧生长、接触酶反应、吲哚反应、淀粉水解、吐温80水解、硝酸盐还原、D-葡萄糖发酵、甘露醇发酵、D-木糖发酵。生理生化测定为阴性的指标有：VP反应。 

菌株Sv-29的16SrDNA序列分析：16SrDNA片段全长为1426bp，将该序列提交GenBank，登录号为EU430264，通过BLAST分析得知，与绿蓝链霉菌Sv-29的16SrDNA序列同源性大于95%的均为链霉菌（表1）。 

表1 

通过上述分析：菌株Sv-29的16SrDNA同源性与直丝紫链霉菌（S. rectiviolaceus ）最高。生理生化特性测定中，除吲哚反应和木糖利用2项不同外，其它指标与绿蓝链霉菌（S. viridocyaneus）完全相同，而与直丝紫链霉菌差别较大。故将菌株Sv-29鉴定为S. viridocyaneus。 

实施例2：菌株Sv-29的抑菌谱测定 

在PDA平板中央接入植物病原真菌，在平板的垂直交叉线上距中央35 mm处接种菌株Sv-29，于28℃培养观察抑菌圈半径的大小。每处理均设3个重复，统计方法采用SPSS 19. 0 for Windows中的One-Way ANOVA/Daucan，以不同大写字母表示不同处理间在P=0. 01水平上存在显著差异。 

菌株Sv-29对供试植物病原真菌均有抑制作用，对不同病原真菌的抑制效果不同，其中对芸薹链格孢和尖孢镰孢菌萎焉转化型的抑制效果最好，抑菌圈半径分别为10.8 mm和11.3 mm，结果见表2。 

表2 

实施例3：菌株Sv-29的抑菌成分分析 

采用PDB培养基培养菌株Sv-29，28℃振荡培养7 d后, 7000 r/min离心15min分离菌丝和上清液，菌丝用2倍体积丙酮4℃浸泡24 hr，上清液分别用2倍体积的二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，减压浓缩后（真空度0.07 Mpa），采用气相色谱-质谱联用仪对提取物的化学成分进行分析，仪器型号为Agilent6890-5973 N GC-MS，离子源为EI，电子能量为70 Ev，离子源温度为230℃，接口温度为280℃，质量扫描范围为29~500 amu，色谱柱为HP-5MS (30 m×0. 25 mm×0. 25μm)，起始柱温50℃，恒温5 min后以5℃/min升温到300℃，汽化室温度为300℃，载气为氦气，分流比为10：1，进样量为1μL。 

分析结果表明：菌丝丙酮提取液中检索到47种物质、上清乙酸乙酯提取液中检测到27种物质，上清二氯甲烷提取液中检测到38种物质，其化学成分种类主要有：烷烃、酮类等。其中菌丝丙酮提取液中的（1）11-Oxatetracyclo[5.3.2.0(2,7).0(2,8)]dodecan-9-one，上清乙酸乙酯提取液中的（2）2-Vinyl-9-[3-deoxy-.beta.-d-ribofuranosyl]hypoxanthine，上清二氯甲烷提取液中的（3）2-(Phenyl-piperidin-1-yl-methyl)-cyclohexanol和（4）10-Methoxy-nb-.alpha.-Methylcorynantheol，是起抗生作用的主要物质(表3、图1)。 

表3 

实施例4：菌株Sv-29可湿性粉剂的工业化生产流程 

    菌株Sv-29具有抗菌作用，活性物质存在于菌丝和上清液中，为发挥最佳抗菌活性效果，制剂中应包括菌丝和上清液。本例介绍制剂的工业化生产流程，该工艺采用液体发酵，利用麦饭石为载体制备可湿性粉剂。 

（1）斜面菌种：采用高氏一号培养基，将菌株Sv-29接种在试管培养基上，28℃培养3～4d。 

（2）三角瓶菌种：采用液体PDB培养基，将试管菌种接种在液体三角瓶中，置于摇床上28℃振荡培养1～2d。 

（3）液体培养：采用发酵培养基（玉米粉40 g、豆粉20 g、葡萄糖10 g、K₂HPO₄ 1. 5 g、 

MgSO₄ 1. 5 g、CaCO₃ 1 g、水1000 mL、pH 7. 0）。121℃灭菌20 min，将三角瓶种接种500 L发酵罐，接种量0.2 %，28℃培养，溶氧量40%~50%，通气量1：0.6～0.8，搅拌速度为120～160 r/min， 28℃培养4～5 d，发酵结束。 

（4）制剂制备：菌株Sv-29可湿性粉剂制备，配方如下： 

L-10发酵液            10 mL                         

麦饭石（300目）       99 g               

黄原胶                1 g      

实施例5：菌株Sv-29在温室条件下对白菜黑斑病的防治效果 

取健康土，过筛灭菌后装入分苗营养钵中，并移栽健康白菜幼苗1株，正常栽培管理。取培养5 d的芸薹链格孢，调节孢子的浓度为10⁷ cfu/mL，用毛笔蘸取该孢子悬浮液后均匀涂抹于白菜叶片上。接种白菜黑斑病菌24 hr后，用菌株Sv-29可湿性粉剂100×倍液均匀喷雾，以50%的多菌灵可湿性粉剂500倍液作为药剂对照，以清水作为空白对照。每处理20株，重复3次。6 d后取出白菜幼苗，调查发病情况，计算病情指数和防治效果。白菜黑斑病病害分级标准如下： 

0级：叶片上没有病斑， 

1级：叶片上有病斑，病斑数较少，1～3个， 

2级：叶片上有病斑，病斑数较多，4～8个， 

3级：叶片上有病斑，病斑数多，9个以上。 

病株率%=100×每个处理的病株数/ 每个处理的总株数 

病情指数%=100×∑（各病级×各级株数）/ （最高病级×总调查株数） 

防治效果%=100×（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数 

采用SPSS 19.0统计软件中的Duncan方法，以不同大写字母标记表示在P=0.01水平上存在显著性差异。 

结果显示：菌株Sv-29在温室条件下对白菜黑斑病有较好的防治作用，与多菌灵处理间在P=0.01水平上存在显著性差异，防治效果达88.5%（表4）。 

表4 

实施例6：菌株Sv-29在温室条件下对棉花枯萎病的防治效果 

取健康土，过筛灭菌后装入营养钵中，棉花种子保湿培养，露白后用菌株Sv-29可湿性粉剂10×倍液浸泡种子30 min，均匀播种在营养钵中，取尖孢镰孢菌萎焉转化型培养物，调节孢子浓度为10⁷ cfu/mL，每钵20 mL，以50%的多菌灵可湿性粉剂500倍液作为药剂对照，以清水作为空白对照。每处理20株， 重复3次。30 d后取出幼苗，调查发病情况，计算病情指数和防治效果。棉花枯萎病害分级标准如下： 

０级：生长正常， 

１级：叶片或茎萎蔫面积由下而上占全株的１/４或不足１/４； 

２级：叶片或茎萎蔫面积由下而上占全株的１/２； 

３级：叶片或茎萎蔫面积由下而上占全株的３/４； 

４级：全株叶全部萎蔫或整株死亡。 

病株率%=100×每个处理的病株数/ 每个处理的总株数 

病情指数%=100×∑（各病级×各级株数）/ （最高病级×总调查株数） 

防治效果%=100×（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数 

采用SPSS 19.0统计软件中的Duncan方法，以不同大写字母标记表示在P=0.01水平上存在显著性差异。 

结果显示：菌株Sv-29在温室条件下对棉花枯萎病有较好的防治作用，与多菌灵处理间在P=0.01水平上存在显著性差异，防治效果达91.0%（表5）。 

表5 

SEQUENCE LISTING

 

<110>  昆明保腾生化技术有限公司;云南省烟草公司曲靖市公司;云南大学

 

<120>  一种绿蓝链霉菌Sv-29及其应用

 

<130>  1

 

<160>  1    

 

<210>  1

<211>  1426

<212>  DNA

<213>  Streptomyces viridocyaneus

 

 

<220>

<221>  gene

<222>  (1)..(1426)

<223>  16srDNA

<400>  1

      gccagtagcg tttgagtacg atcgcggtcg aacgtgaagc ccttcggggt ggattagtgg   60     

      cgaacgggtg agtaacacgt gggcaatctg ccctgcactc tgggacaagc cctggaaacg  120

      gggtctaata ccggatgaca ctttctctcg catgggagaa ggttgaaagc tccggcggtg  180

      caggatgagc ccgcggccta tcagctagtt ggtgaggtag aagctcacca aggcgacgac  240

      gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct  300

      acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca gcgacgccgc  360

      gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac ctctttcagc agggaagaag cgcaagtgac  420

      ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggc  480

      gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agagctcgta ggcggcttgt cacgtcggtt  540

      gtgaaagccc ggggcttaac cccgggtctg cagtcgatac gggcaggcta gagtgtggta  600

      ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg aaatgcgcag atatcaggag gaacaccggt  660

      ggcgaaggcg gatctctggg ccattactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac  720

      aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacggtggg aactaggtgt tggcgacatt  780

      ccacgtcgtc ggtgccgcag ctaacgcatt aagttccccg cctggggagt acggccgcaa  840

      ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagca gcggagcatg tggcttaatt  900

      cgacgcaacg cgaagaacct taccaaggct tgacatcgcc cggaaagccg tagagatacg  960

      gccccccttg tggtcgggtg acaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020

      gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgttctgt gttgccagca tgcccttcgg 1080

      ggtgatgggg actcacagga gactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggacgacgtc 1140

      aagtcatcat gccccttatg tcttgggctg cacacgtgct acaatggcag gtacaatgag 1200

      ctgcgaagcc gcaaggcgga gcgaatctca aaaagcctgt ctcagttcgg attggggtct 1260

      gcaactcgac cccatgaagt cggagttgct agtaatcgca gatcagcatt gctgcggtga 1320

      atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacgtcac gaaagtcggt acacccgaag 1380

      ccggtggccc acccccttgt ggggaggagc ttcgaagtga cgtagg                1426

Claims (2)

1.一种绿蓝链霉菌（Streptomyces viridocyaneus）Sv-29，其保藏号为：CGMCCNO.7398。

2.权利要求1所述的绿蓝链霉菌（Streptomyces viridocyaneus）Sv-29菌株的应用，其特征在于绿蓝链霉菌（S. viridocyaneus）Sv-29菌株能够产生多种抗菌活性物质，对多种病原真菌具有较好拮抗作用，能够作为制备防治植物真菌病害药物的应用。

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