CN104673723A - 一种极长链霉菌株sl01及其微生物菌剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种极长链霉菌株SL01(Streptomyces longissimus SL01)及由该菌株制备的微生物菌剂：由该SL01菌株制备得到的发酵液及发酵滤液。本发明还公开了两种微生物菌剂在防治苹果树腐烂病中的应用。采用不同处理方法涂抹菌株SL01发酵液及发酵滤液发现，离体枝条和果实的防效均达到90％，与药剂对照甲基硫菌灵达到同一水平；2012年大田试验中，刮病斑后涂抹SL01菌剂防治效果100％，划线后涂抹防效为58％；2013年大田试验中，刮病斑后涂抹SL01菌剂防治效果97.8％，超过甲基硫菌灵药剂对照的防效(84.6％)，划线后涂抹防效为64.4％，均可有效降低为防治苹果树腐烂病而大量施用化学农药所造成的对生态环境的破坏，具有很好的生态和社会效益，开发应用前景广阔。

Description

一种极长链霉菌株SL01及其微生物菌剂和应用
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，涉及一种极长链霉菌株、由该极长链霉菌制备的微生物菌剂以及其在防治苹果树腐烂病中的应用。
背景技术
近年来，中国苹果产业发展势头迅猛，果树栽植面积和产量连续较快增长，截至2012年相关统计结果显示，我国果树种植面积达到接近4000万亩，我国已进入由世界苹果生产大国向苹果产业强国转变的重要阶段。
但是，伴随着苹果种植面积持续扩张及管理果园方法不当，苹果树腐烂病病情逐年加重。2008年我国苹果主要产区的果园腐烂病发生情况调查中，苹果树腐烂病总体发病率达50％以上，并伴随因高毒农药滥用造成生态环境恶化等问题，苹果树腐烂病已严重影响了苹果产业的快速发展。
苹果树腐烂病(Valsa canker of apple)，或称烂皮病、串皮湿和臭皮病，在我国苹果树种植地区发生范围广、造成危害严重、难以有效防治，果农们称以之为“果树癌症”。该病发生较轻时，主干或侧枝上树皮腐烂削弱树势，造成果实减产和果品质量下降；病情严重时，树体病疤累累、果树整株枯死甚至毁园，果实绝产，严重威胁苹果产业的可持续发展并给农民造成重大经济损失。
目前，对于苹果树腐烂病等病害的防控主要依靠化学药剂，而化学农药的长期大量使用不仅会严重污染环境，造成对非靶标生物的有害影响，使果园生态环境恶化，同时也会增加腐烂病菌的突变几率，导致抗、耐药性菌株的大量增加。因此，寻找新的、安全有效的措施来防治苹果树腐烂病显得尤为迫切和重要。
针对上述问题，为了减少对生态环境的破坏，尽量避免因防治苹果树腐烂病而大量施用有毒化学农药，利用微生物制剂来控制植物病害的生物防治手段越来越受到人们的青睐，经检索，申请者在现有的专利和非专利文献中没有检索到极长链霉菌菌株SL01用于苹果树腐烂病生物防治的相关文献报道和专利。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种针对由苹果树腐烂菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)引起的苹果树腐烂病具有显著生物防治效果的极长链霉菌菌株SL01(Streptomyceslongissimus SL01)和由该菌株发酵制备成的微生物菌剂，用来防治苹果树腐烂病。以减少因大量使用有毒化学农药对生态环境造成的破坏，以实现我国苹果产业向着安全、高效、可持续的方向发展。
本发明的第二个目的是提供由极长链霉菌菌株SL01制备的微生物菌剂，并优化了发酵条件。
本发明的第三个目的是提供由极长链霉菌菌株SL01制备的微生物菌剂在防治苹果树腐烂病中的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明从土壤中分离筛选获得一种能够用于用于防治苹果树腐烂病的菌株SL01，经形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析鉴定为极长链霉菌(Streptomyces longissimus)。该菌株SL01已于2014年8月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中CGMCC，菌种保藏号为CGMCC No.9543。
在上述基础上，申请人利用液体发酵的方法制备了一种微生物菌剂，实际应用显示其对苹果树腐烂病具有防治作用。该微生物菌剂的制备步骤如下：
1)活化菌株：将保存的极长链霉菌菌株SL01划线转接到高氏一号培养基或PDA培养基中，置于培养箱28～30℃恒温培养4～6天；
2)制备种子液：挑取一个单菌落接种到PDB液体培养基中，25-32℃下振荡培养36-48h，振荡频率100-200r/min；
3)制备发酵液：按体积比以1％-3％的接种量将步骤2)中制备的菌株SL01种子液接种于高氏培养液中，装料量为50-100mL/250mL，培养基初始pH值为6-9、发酵温度为25-32℃、振荡频率为150-200r/min、发酵时间为6-9天制得SL01发酵液；
4)制备发酵液滤液：将步骤3)制备得到的SL01发酵液在3000r/min下离心10-20min，取上清，通过Φ＝0.22μm的微孔滤膜过滤得到发酵滤液原液，用无菌水将该发酵滤液原液稀释至20-100倍制得SL01发酵滤液；
所述高氏培养液以高氏一号培养液为基础培养液，其中，碳源选用等质量的玉米粉、小米粉、大米粉中任一种替代可溶性淀粉，氮源选用等质量的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中任一种替代KNO3，无机盐选用占所述高氏培养液重量比为0.1％的CaCl2或0.1％的MgSO4或0.01％的FeSO4中的任一种。
优选的，本发明提供的菌株SL01摇瓶发酵最佳基质配方为小米2.0％，酵母粉1.0％，MgSO40.15％，其余为无菌水。在28℃、初始pH＝7，接种量2％，装液量50mL/250mL，转速180r/min，发酵培养7天得到的发酵液抑菌活性最强。
优选的，用无菌水将发酵滤液原液稀释至100倍得到的发酵滤液对腐烂菌菌丝抑菌效果最好。
最后，本发明公开了上述微生物菌剂在防治苹果树腐烂病中的应用。
在使用时，通过刮除果树病斑后涂抹所述微生物菌剂。根据果树的实际情况，可以适当选择含量的菌剂，优选菌株SL01：3.0×103cfu/g-9×103cfu/g。
申请人利用上述微生物菌剂进行了离体枝条、果实和大田生物防治试验，均达到了良好的效果。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供的极长链霉菌菌株SL01对苹果树腐烂病有显著的防治效果，实施例的研究表明，通过发酵条件优化的菌株SL01的抑菌活性显著提升，采用不同处理方法涂抹菌株SL01发酵液及发酵滤液发现，离体枝条和果实的防效均达到90％，与药剂对照甲基硫菌灵达到同一水平；大田试验中，菌剂SL01对腐烂病的预防和治疗均有一定防治效果，其中，涂干预防效果为48％，刮病斑后涂抹SL01菌剂防治效果100％，划线后涂抹防效为58％。
2.本发明所提供的极长链霉菌菌株SL01(Streptomyces longissimus SL01)防治苹果树腐烂病效果稳定，对环境友好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。
附图说明：
图1菌株SL01菌丝形态观察图(A：40×显微镜图、B：扫描电镜图)
图2菌株SL01系统发育树
图3被菌株SL01抑制的腐烂菌菌丝形态观察
图4菌株SL01发酵滤液对腐烂菌孢子萌发的抑制影响(A：20h对照组分生孢子吸涨情况；B：20h发酵滤液处理组分生孢子吸涨情况；C：36h对照组分生孢子萌发情况；D：36h发酵滤液处理组分生孢子萌发情况)
图5菌株SL01发酵滤液发酵滤液对苹果树腐烂病菌菌丝生长的影响(A：CK、B：SL01发酵滤液稀释50倍)
图6菌株SL01不同处理方式对苹果果实腐烂病病斑扩展抑制作用(A：对照组，B：SL01发酵液处理，C：SL01发酵滤液处理)
图7菌剂SL01对苹果树腐烂病病疤重犯的防治效果(A：涂抹菌剂SL01，B：黑色塑料薄膜包裹，C：试验结果)
图8甲基硫菌灵对苹果树腐烂病病疤重犯的防治效果(A：刮除病斑，B：涂抹甲基硫菌灵，C：试验结果)
本发明菌株保藏信息：极长链霉菌菌株SL01(Streptomyces longissimus SL01)已于2014年8月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.9543。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1：极长链霉菌菌株SL01的制备：
菌株SL01存储于高氏1号或PDA培养基上，于4℃冰箱保藏，保存于西北农林科技大学植物病害生物防治试验室。该菌株已于2014年8月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.9543。
将菌株SL01接种于高氏1号或PDA培养基上，25℃培养6d，活化。
所用固体平板为PDA培养基或高氏1号培养基。
PDA培养基组分及配方如下：马铃薯削皮后称取200g，切成小块在水中煮沸15～20min，四层纱布过滤后加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，定容至1000mL，在121℃高压蒸汽灭菌20min。
高氏1号培养基组分及配方如下：1000mL水中分别加入NaCl 0.5g，可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g持续搅拌加热，煮沸后加入琼脂粉15g搅拌均匀，在121℃高压蒸汽灭菌20min。
实施例2：菌株鉴定
(1).形态特征及生理生化鉴定：依据《链霉菌鉴定手册》记载的实验内容和实验方法，对菌株SL01进行鉴定，菌株SL01在高氏平板上生长良好，气生菌丝鲑鱼红色，基内菌丝玫瑰红色，菌落呈圆形，表面有粉状隆起、褶皱，边缘规则，有土腥味。菌丝直形，不卷曲，有分枝，无横隔，孢子短柱状，孢子丝直形，孢子短柱状，革兰氏阳性，能产生几丁质酶，见图1。该菌株淀粉水解和硫化氢产生呈阳性，牛奶不凝固、明胶不液化，可利用葡萄糖、果糖、山梨糖等，不利用纤维素、蔗糖、阿拉伯糖、木糖。
(2).16S rDNA鉴定：将菌株SL01接种到高氏液体培养基中，25℃、150rpm恒温振荡器中培养6天，离心去上清收集菌丝体装入2mL离心管中，采用改良CTAB方法提取该菌株的基因组DNA，以提取的总DNA作为模板，放线菌通用引物：
上游引物PrimerA：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，如SED ID NO：2所示；
下游引物PrimerB：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，如SED IDNO：3所示，进行PCR扩增；
PCR反应体系为：DNA模板1.0μL、上游引物1.0μL、下游引物1.0μL、Mix12.5μL、ddH2O 9.5μL，共计25μL。
PCR反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s、72℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环；72℃终延伸2min。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测为1500bp左右的PCR产物，用TaKaRa琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒回收纯化，回收样品送至南京金斯瑞有限公司进行测序，菌株SL01的16S rDNA序列全长有1530个碱基序列构成，如SED ID NO：1所示。
将序列结果在NCBI文库中进行BLAST同源比对，选取同源性较高的模式菌株的16SrDNA序列作为参比对象，采用软件MEGA4.0构建系统进化树，见图2，生防放线菌菌株SL01与链霉菌(Streptomyces longissimus)的16S rDNA基因序列(相似性为100％)聚在同一个系统进化分支上，故将该生防放线菌鉴定为极长链霉菌SL01。
综上所述，根据培养特征、菌体形态、生理生化特性以及16sDNA序列分析，菌株SL01属于极长链霉菌(Streptomyces longissimus)。
实施例3.微生物菌剂的制备
用于防治苹果树腐烂病微生物菌剂包括菌株SL01发酵液和发酵滤液，制备步骤如下：
(1)活化菌株：将保存的极长链霉菌菌株SL01划线转接到高氏一号培养基或PDA培养基中，置于培养箱28～30℃恒温培养4～6天；
(2)制备种子液：挑取一个单菌落接种到PDB液体培养基中，25-32℃下振荡培养36-48h，振荡频率100-200r/min；
(3)制备发酵液：按培养液体积的1％-3％的接种量将步骤(2)中制备的菌株SL01种子液接种于发酵培养液中，装料量为50-100mL/250mL，培养基初始pH值为6-9、发酵温度为25-32℃、振荡频率为150-200r/min、发酵时间为6-9天制得SL01发酵液；
(4)制备发酵液滤液：将步骤3)制备得到的SL01发酵液在3000r/min下离心10-20min，取上清，通过Φ＝0.22μm的微孔滤膜过滤得到发酵滤液原液，用无菌水将该发酵滤液原液稀释至20-100倍制得SL01发酵滤液；
所用PDB液体培养基配制方法为(以配制1L培养基为例)：PDA培养基：土豆200g，切成1cm2小块，在约为1000mL水中煮15～20min，纱布过滤后定容1000mL，葡萄糖20g，pH调至7.0～8.0，121℃灭菌20min。
所用高氏培养液配制方法为(以配制1L培养基为例)：NaCl 0.5g，小米粉20g，酵母粉1g，K2HPO40.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，用水定容至1L，pH调至7.0～8.0，121℃灭菌20min。
实施例4.微生物菌剂对腐烂菌丝生长影响
微生物菌剂包括实施例3制备的菌株SL01发酵液及菌株SL01发酵滤液。
靶标菌：苹果树腐烂菌(Valsa maliMiyabe et Yamada)，由西北农林科技大学植物病害综合防治实验室提供，按常规方法在PDA斜面于4℃冰箱保存。
采用滤纸片法测量SL01发酵液对菌丝生长影响，在PDA平板中心接种苹果树腐烂菌菌饼，无菌滤纸片(Φ＝8mm)蘸取生防菌发酵液后对称贴在距离腐烂菌2.5cm处，25℃暗培养，3d后观察并记录腐烂菌生长直径并计算抑制率(宋宏允等2010)。
发酵滤液对菌丝生长影响采用含滤液平板法，PDA和发酵滤液按体积比9∶1比例混合后，制成发酵滤液平板(吴文君1998)，以PDA培养基作为对照，在平板中心接种苹果树腐烂菌，每个处理3个重复，25℃暗培养，3d后观察并记录腐烂菌生长直径并计算抑制率。
菌丝生长抑制率(％)＝(对照组菌丝直径-处理组菌丝直径)/对照组菌丝直径×100
结果分析：极长链霉菌菌株SL01发酵液及发酵滤液对靶标菌的皿内抑菌试验结果如表1所示。滤纸片法测定菌株SL01发酵液抑菌率为64.2％，抑菌效果显著。含滤液平板法测定滤液抑菌活性发现，菌株SL01发酵滤液抑菌率为42.5％，明显抑制靶标菌生长。结果说明，SL01发酵液和发酵滤液均能显著抑制靶标菌的生长。
表1 极长链霉菌菌株SL01发酵液和发酵滤液的皿内抑菌活性
注：试验数值为3次测量结果的平均值，数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平。
实施例6.持续抑菌作用测定
分别用直径为5mm的打孔器打取实施例4试验后腐烂菌边缘受抑制菌丝及正常菌丝，接种于PDA培养基中心，每个处理设3个重复，25℃暗培养，每天观察腐烂菌菌落生长状况，记录在受到生防菌抑制后其菌丝的生长能力(韩立荣等2006)。
菌株SL01抑制的靶标菌菌丝形态如图3所示，受抑制菌丝局部颜色发黄、粗短、表面粗糙，大部分菌丝弯曲畸形；正常菌丝近于透明、纤细、表面光滑。
实施例7SL01发酵滤液对腐烂菌孢子萌发抑制实验
苹果树腐烂菌分生孢子获取：苹果树腐烂菌在PDA培养基中25℃连续光照培养一个月左右，出现金黄色分生孢子角，挑取金黄色分生孢子角于无菌水中，用血球计数板在显微镜下调节孢子浓度至106个/mL数量级的分生孢子原液，分装于1.5mL离心管中备用。
采用玻片法(董汉松2012)，将分生孢子原液和微生物菌剂SL01发酵滤液按一定比例混合制成发酵滤液2倍稀释液。准备薄层PDA培养基，用小刀切割成1cm2小块，置于载玻片上，取30μL不同浓度梯度发酵滤液稀释液滴于PDA小块上，25℃保湿、暗培养，约40h后在光学显微镜40×镜下观察并记录视野中孢子萌发个数及孢子总数，每个玻片观察5个视野取平均值，计算孢子萌发率。
结果分析：
显微观察各处理组和对照组分生孢子形态发现，20h后对照组分生孢子全部吸涨而SL01处理组仅部分孢子吸涨，36h后观察对照组萌发率达到100％，且芽管长出较长，此时观察并统计各处理组孢子萌发情况发现，用SL01发酵滤液处理组的分生孢子全部吸涨，有少部分分生孢子萌发且芽管均较短、畸形、粗细不一致。试验结果(表2，图4)表明：菌株SL01发酵滤液对于靶标菌分生孢子萌发均具有一定的抑制效果抑制率为69.5％。
表2 菌株SL01对苹果树腐烂菌分生孢子萌发的影响
注：试验数据为5次重复测量的平均值，数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平。
实施例8.液培条件下SL01发酵滤液对苹果树腐烂菌菌丝生长影响
分别在装有100mLPDA培养液的锥形瓶中加入5mL、2mL、1mL SL01发酵滤液制成混合液，使SL01发酵滤液稀释20倍、50倍和100倍。不加SL01发酵滤液作为对照，每瓶混合液中加1个腐烂菌菌饼(Φ＝5mm)，每个处理重复3次，在25℃、150r/min恒温振荡器中培养，4d后用布氏漏斗滤去混合液，菌丝于70℃烘箱中烘至恒重，称重并计算抑制率。
结果分析：液培条件下SL01发酵滤液对靶标菌菌丝生长影响结果(表3，图5)表明，菌株SL01在不同稀释倍数下对于靶标菌均有一定的抑制作用，随着发酵滤液稀释倍数增大，SL01发酵滤液的抑制效果也逐渐减弱。其中，菌株SL01发酵滤液20倍稀释液对靶标菌生长抑制作用最强烈。
表3 菌株SL01发酵滤液对苹果树腐烂病菌菌丝生长的影响
注：试验数值为3次测量结果的平均值，数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平，在相同稀释倍数下比较不同菌株间的差异。
实施例9菌株SL01发酵液对离体枝条和果实病斑扩展影响
(1)离体枝条试验：剪取1-2年生、粗细一致的富士苹果枝条并将其截取为25cm小段，清水清洗2-3次后，用1％NaClO溶液表面消毒20min，然后用无菌水冲洗2-3次，自然风干后两头蜡封待用。采用改良烫伤接种法(臧睿2007)，每根枝条用电烙铁等距离烫伤两点，用毛笔在每根枝条上均匀涂抹106cfu/mL菌株SL01发酵液，待菌液晾干后，每个伤口处贴1个腐烂菌菌饼(Φ＝5mm)，菌饼下部缠绕浸泡过无菌水的棉花保湿，用保鲜膜包裹菌饼处，以涂抹培养液作为对照，所有供试枝条放在保湿瓷盘内并存于25℃培养箱中，2d后解除保湿，每天观察病斑扩展情况，分别在5d和10d统计病斑大小，计算防效。
(2)果实病斑扩展试验：取新鲜富士苹果，清水清洗2-3次，75％酒精表面消毒10min，无菌水清洗果面，在苹果赤道处分别用打孔器(Φ＝5mm)打3个孔，3个孔分别涂抹约106cfu/mL SL01发酵液、SL01发酵滤液和培养液，每个孔口接种1个活化3d的腐烂菌菌饼(Φ＝5mm)，用无菌水棉花保湿，所有苹果放在保湿塑封袋于25℃培养箱中保存，每个处理3个苹果，重复3次。6天后统计病斑大小，计算防效。
病斑面积＝π·r2
结果分析：
(1)离体枝条侵染实验结果表明(表4)：涂抹生防菌发酵液5d后，CK的病斑面积达到9.02cm2，与CK相比较，菌株SL01发酵液处理过枝条的病斑长度及面积有抑制作用且差异达到显著水平，抑制效果达67％，但是防效与药剂对照甲基硫菌灵有一定差距。涂抹发酵液10d后，菌株SL01发酵液仍然对病斑扩展有一定的抑制作用，但是防治效果与5d时比较有所下降，但是甲基硫菌灵的抑制效果未发生改变。
表4 SL01发酵液对苹果树腐烂病菌离体枝条病斑扩展抑制作用
注：试验数值为5次测量结果的平均值，同列数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平，防治效果由病斑面积计算得出。
(2)果实病斑扩展实验结果表明(表5，图6)：6d后，涂抹菌株SL01发酵液和发酵滤液的病斑病斑面积分别问2.56cm2和2.47cm2，与对照病斑面积34.11cm2相比差异极显著，说明菌株SL01发酵液和发酵滤液对腐烂菌扩展有明显抑制作用。
表5 菌株SL01对苹果果实病斑扩展抑制作用
注：试验数值为5次测量结果的平均值，同列数据后标不同小写字母表示处理间差异达到5％显著水平，防治效果由圆形病斑面积计算得出。
实施例10.菌剂SL01对田间刮除病斑的治疗作用
SL01菌剂制备：将菌株SL01发酵液用菌丝粉碎机打碎按一定比例与海藻酸钠均匀混合制成SL01菌剂备用。
试验地点1：铜川印台区楼子组惠天社家果园，树龄12年，富士品种，树势一般。2012年春季，选取无病斑果树30棵，15棵处理方式为SL01菌剂涂干，另15棵为对照不做处理，翌年秋天调查并统计树体有无病斑出现，分别取涂抹SL01菌剂和对照树皮2cm2，利用组织研磨法、稀释平板法测定和记录树皮中生防菌的定殖数量。
试验地点2：铜川广阳镇西崮村三组董维家果园，树龄15年，富士品种，果园疏于管理，树势衰弱，有大量病斑，在病树上选取病斑。分别于2012年和2013年春季，按照如下方法处理：(1)将病斑刮除后涂抹SL01菌剂后用黑色塑料薄膜包裹病斑处；(2)在病斑上用刮刀横纵切割约为1cm2正方块，深至木质部，后涂抹SL01菌剂后用黑色塑料薄膜包裹。(3)将病斑刮除后涂抹甲基硫菌灵(PA)(4)将病斑刮除后不做处理。2012年每个处理5个病斑，重复3次，2013年每个处理15个病斑，重复3次，以未处理病斑作为对照组，于当年秋季和翌年春季调查病疤的复发情况。
结果分析：
试验地点1：试验结果显示，使用SL01菌剂涂干的果树中共出现11个病斑，对照组的果树中出现21个病斑，在处理组树皮中检测SL01定殖约为：6.0×103cfu/g。说明SL01菌剂涂干方法的相对预防效果为48.6％。
试验地点2：2012年试验结果显示(表6，图7，图8)，刮除病斑后涂抹SL01菌剂，无复发，防治效果为100％；在病斑上划线后涂抹SL01菌剂，复发5块，防治效果为58.3％；药剂对照，无复发。结果说明，使用SL01菌剂可以抑制腐烂病复发有一定作用，刮斑后涂SL01菌剂优于划线法涂SL01菌剂。2013年实验结果显示，刮除病斑后涂抹SL01菌剂，仅有1个病斑复发，防治效果达97.8％；在病斑上划线后涂抹SL01菌剂，复发16块，防治效果为64.4％；甲基硫菌灵药剂对照有6个病斑复发，防治效果(84.6％)低于刮除病斑后涂抹SL01菌剂的效果。
表6 不同处理对苹果树腐烂病病疤重犯的防治效果

Claims (10)

1.一种极长链霉菌(Streptomyces longissimus)菌株SL01，其特征在于，所述菌株SL01保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC No.9543，保藏日期为2014年8月25日。
2.根据权利要求1所述的极长链霉菌菌株SL01在抑制苹果腐烂菌中的应用。
3.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为由权利要求1所述菌株SL01经菌株活化、种子液培养和发酵培养制得的菌株SL01发酵液以及由该发酵液经过滤稀释制备得到的发酵滤液。
4.一种如权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为菌株SL01发酵液和发酵滤液，其制备步骤如下：
1)活化菌株：将保存的极长链霉菌菌株SL01划线转接到高氏一号培养基或PDA培养基中，置于培养箱28～30℃恒温培养4～6天；
2)制备种子液：挑取一个单菌落接种到PDB液体培养基中，25-32℃下振荡培养36-48h，振荡频率100-200r/min；
3)制备发酵液：按体积比以1％-3％的接种量将步骤2)中制备的菌株SL01种子液接种于高氏培养液中，装料量为50-100mL/250mL，培养基初始pH值为6-9、发酵温度为25-32℃、振荡频率为150-200r/min，发酵时间为6-9天制得SL01发酵液；
4)制备发酵液滤液：将步骤3)制备得到的SL01发酵液在3000r/min下离心10-20min，取上清，通过Φ＝0.22μm的微孔滤膜过滤得到发酵滤液原液，用无菌水将该发酵滤液原液稀释至20-100倍制得SL01发酵滤液；
所述高氏培养液以高氏一号培养液为基础培养液，其中，碳源选用等质量的玉米粉、小米粉、大米粉中任一种替代可溶性淀粉，氮源选用等质量的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中任一种替代KNO3，无机盐选用占所述高氏培养液重量比为0.1％的CaCl2或0.1％的MgSO4或0.01％的FeSO4中的任一种。
5.如权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于所述高氏培养液中碳源为小米粉；氮源选用等量酵母膏替代KNO3；无机盐选用占所述培养液重量比0.1％的MgSO4。
6.如权利要求4中所述的微生物菌剂，其特征在于所述制备发酵液步骤为：按体积比以2％的接种量将所述菌株SL01种子液接种于发酵培养液中，装料量为50mL/250mL，培养液初始pH值为7、发酵温度为28℃、振荡频率为180r/min，发酵时间为7天。
7.如权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于用无菌水将权利要求7中所述发酵滤液原液稀释至100倍。
8.如权利要求3至7中任一项所述的微生物菌剂在防治苹果树腐烂病中的应用。
9.如权利要求8所述的微生物菌剂在防治苹果树腐烂病中的应用，其特征在于，刮除果树病斑后涂抹所述微生物菌剂。
10.如权利要求9所述的微生物菌剂在防治苹果树腐烂病中的应用，其特征在于，刮除果树病斑后涂抹所述微生物菌剂，处理树皮组织中菌株SL01定殖约为：3.0×103cfu/g-9×103cfu/g。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105693385A (zh) * 2016-01-26 2016-06-22 陈琳 一种微生物肥料
CN109439591A (zh) * 2018-12-06 2019-03-08 四川农业大学 一种暗色产色链霉菌sicau417及其应用
CN114304146A (zh) * 2021-12-07 2022-04-12 西北农林科技大学 一种含Xcn1的微生物源杀菌膏剂、制备方法及应用
CN114467976A (zh) * 2021-12-31 2022-05-13 延安大学 治疗苹果树腐烂病的抗菌药膏及制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101525587A (zh) * 2009-03-25 2009-09-09 中国农业大学 一株链霉菌菌株及其应用
CN103382447A (zh) * 2013-06-25 2013-11-06 昆明保腾生化技术有限公司 一种绿蓝链霉菌Sv-29及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101525587A (zh) * 2009-03-25 2009-09-09 中国农业大学 一株链霉菌菌株及其应用
CN103382447A (zh) * 2013-06-25 2013-11-06 昆明保腾生化技术有限公司 一种绿蓝链霉菌Sv-29及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BO，D.P.: "KM670435", 《GENBANK》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105693385A (zh) * 2016-01-26 2016-06-22 陈琳 一种微生物肥料
CN109439591A (zh) * 2018-12-06 2019-03-08 四川农业大学 一种暗色产色链霉菌sicau417及其应用
CN109439591B (zh) * 2018-12-06 2020-09-22 四川农业大学 一种暗色产色链霉菌sicau417及其应用
CN114304146A (zh) * 2021-12-07 2022-04-12 西北农林科技大学 一种含Xcn1的微生物源杀菌膏剂、制备方法及应用
CN114467976A (zh) * 2021-12-31 2022-05-13 延安大学 治疗苹果树腐烂病的抗菌药膏及制备方法和应用

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