CN111363695B - 一种苹果树腐烂病生防菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种苹果树腐烂病生防菌剂，所述苹果树腐烂病生防菌剂是丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株B‑1菌悬液，所述苹果树腐烂病生防菌剂用于苹果树腐烂病的防治。本发明丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B‑1对苹果树腐烂病有显著的防治效果，实施例的研究表明，菌株B‑1可显著抑制腐烂病菌菌丝的生长，菌株B‑1的菌悬液对苹果树腐烂病的防治效果均在75％以上；本发明苹果树腐烂病生防菌剂，对环境友好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。

Description

一种苹果树腐烂病生防菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种苹果树腐烂病生防菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
苹果树腐烂病是由黑腐皮壳菌(Vslsa mali)引起的，对苹果产业危害比较严重的毁灭性病害。苹果树腐烂病可危害苹果主枝和主干，导致皮层腐烂，造成死枝死树，甚至毁园。2008年，全国范围内调查发现，我国苹果主产区腐烂病的发病率为52％，部分地区发病率高达85％以上；2001年，苹果树腐烂病在我国烟台苹果产区再次猖獗发生，造成严重经济损失。自1961年，苹果树腐烂病在我国首次发现以来，该病已经造成了4次大流行，相关研究者指出我国苹果产业正面临腐烂病第5次大流行的威胁。
目前，生产上尚无可用的抗苹果树腐烂病果树品种，而且外科手术治疗也无法有效控制病害。腐烂病菌是弱寄生菌，主要通过剪据口、各种微伤口及表皮死组织等侵染或长期潜伏，依靠化学药剂进行防治很难实现。最近，研究发现腐烂病菌可以在苹果树木质部内快速生长，进行纵向扩展，但不表现明显的外部症状，直至病菌到达皮层组织后才能导致树体发病；由于病菌存在于木质部，通过刮治等外科手术仅能去除皮层的病原菌，导致病疤重犯，这也是腐烂病连年复发的主要原因。
由于缺乏针对性强、效果好的防治策略和技术，腐烂病一直是我国苹果生产上的重大防治难题。药剂涂干可以有效预防苹果树腐烂病的发生，但药剂持效期不能维持果树的整个生长期，此项措施费时费工，在很多苹果产区的应用受到限制，且化学农药大量使用不符合我国现代农业减肥减药的发展战略。采用生防菌剂防治苹果树腐烂病对环境友好，可以避免化学防治带来的一系列问题。现有技术中还没有采用丁香假单胞菌用于苹果树腐烂病防治的报道。如何解决上述技术问题，是目前微生物技术领域需要解决的技术问题。
发明内容
本发明所提供的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1，于2015年12 月31日保藏于：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO:M2015813，保藏地址为：湖北省武汉市，洪山区八一路。
本发明所提供的苹果树腐烂病生防菌剂是丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)菌株B-1菌悬液。
本发明所提供的苹果树腐烂病生防菌剂是浓度为107-109cfu·mL-1的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株B-1菌悬液。
本发明所提供的苹果树腐烂病生防菌剂是浓度为109cfu·mL-1的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株B-1菌悬液。
本发明所提供的苹果树腐烂病生防菌剂用于苹果树腐烂病的防治。
本发明所提供的苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将菌株B-1划线接种在NA培养基中，于30℃恒温活化培养24h，得到活化的菌株B-1单菌落A；
(2)将所述活化的菌株B-1单菌落A，接种于装瓶量80mL/250mL的NB 培养基中，180r·min-1，30℃恒温震荡培养12h，得到菌株B-1发酵种子液B；
(3)将所述发酵种子液B按1:100的接种量接种到NB培养基中扩大培养，30℃恒温震荡培养24h，得到109cfu·mL-1B-1菌株的细胞培养液C；
(4)将109cfu·mL-1B-1菌株的细胞培养液C，在4℃条件下，12000r·min-1离心15min，收集B-1菌体沉淀用无菌水重新悬浮，得到109cfu·mL-1的菌悬液，即为生防菌剂。
本发明所提供的NA培养基由以下方法制备：取蛋白胨10g，牛肉膏3g， NaCl 5g，琼脂粉20g，加水定容至1 000mL，调节pH值为7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明所提供的NB培养基由以下方法制备：取蛋白胨10g，牛肉膏3g， NaCl 5g，加水定容至1 000mL，调节pH值为7.0，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明所提供的用于防治苹果树腐烂病的农药复配剂，有效成分为2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)和丁香假单胞菌B-1菌悬液。
本发明所提供的用于防治苹果树腐烂病的农药复配剂，由以下体积份数的有效成分制成：0.1mmol·L-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液1份和105cfu·mL-1的丁香假单胞菌B-1菌悬液1份。
本发明所提供的用于防治苹果树腐烂病的农药复配剂，用于苹果树腐烂病防治。
本发明的有益效果是：本发明丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1 对苹果树腐烂病有显著的防治效果，实施例的研究表明，菌株B-1可显著抑制腐烂病菌菌丝的生长，菌株B-1的菌悬液对苹果树腐烂病的防治效果均在75％以上；本发明苹果树腐烂病生防菌剂，对环境友好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。
附图说明
图1为菌株B-1提取DNA的16S rDNA序列PCR扩增示意图；
其中，图中M为核酸Marker DL2000；图中1为菌株B-1基因组DNA的16S rDNA序列扩增结果；
图2为不同浓度菌株B-1对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制作用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所提供的生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将菌株B-1划线接种在NA培养基中，于30℃恒温活化培养24h，得到活化的菌株B-1单菌落A；
(2)将所述活化的菌株B-1单菌落A，接种于装瓶量80mL/250mL的NB培养基中，180r·min-1，30℃恒温震荡培养12h，得到菌株B-1发酵种子液B；
(3)将所述发酵种子液B按1:100的接种量接种到NB培养基中扩大培养，
30℃恒温震荡培养24h，得到109cfu·mL-1B-1菌株的细胞培养液C；
(4)将109cfu·mL-1B-1菌株的细胞培养液C，在4℃条件下，12000r·min-1离心15min，收集菌体沉淀用无菌水重新悬浮，得到109cfu·mL-1的菌悬液，即为生防菌剂。
需要说明的是，所述109cfu·mL-1的菌悬液在使用的时候，一般要稀释 0-100000倍。
本发明所提供的NA培养基由以下方法制备：取蛋白胨10g，牛肉膏3g， NaCl 5g，琼脂粉20g，加水定容至1 000mL，调节pH值为7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明所提供的NB培养基由以下方法制备：取蛋白胨10g，牛肉膏3g， NaCl 5g，加水定容至1 000mL，调节pH值为7.0，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121℃高压蒸汽灭菌20min。
实施例1
丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1的分离筛选与菌株鉴定
1.菌株的分离与筛选
从山东烟台商品化富士苹果园采集成熟健康果实，表面消毒后取果实组织研磨，加入无菌水，采用常规梯度稀释涂布分离法，用NA培养基分别在28℃条件下培养，挑取菌落形态差异明显的菌落，在NA培养基上纯化保存，并以苹果轮纹病菌为靶标病原菌进行拮抗菌的初筛和多次复筛，最终得到一株抑菌活性强的细菌菌株，命名为B-1。
2.菌株的鉴定
(1)形态特征：菌株B-1在NA培养基上培养24h后，菌落呈乳白色，圆形或近圆形，表面光滑中间凸起，菌落质地均匀，生长较快，菌体镜检呈杆状，为革兰氏阴性菌。
(2)生理生化特性：菌株B-1可利用葡萄糖、果糖、D-木糖作为碳源，不能利用蔗糖、麦芽糖、乳糖等作为碳源；氧化酶反应阴性，多聚物颗粒阴性，不水解淀粉，不产生H2S，不产生吲哚，精氨酸，接触酶反应阳性；能液化明教， VP反应呈阳性，上述特性符合《常见细菌鉴定手册》中假单胞属丁香假单胞菌 (Pseudomonas syringae)的描述。
(3)16S rDNA序列分析：采用CTAB法提取细菌基因组DNA，采用通用引物Primer F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，Primer R： 5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’对DNA模板进行PCR扩增；PCR扩增反应体系 (25μL)：2.5μL 10×Taq酶缓冲液，0.2μmol/L引物，2μL200mmol/L dNTPs， 20ng DNA模板，1U Taq酶(TaKaRa)，17μL ddH2O。PCR扩增程序：94℃预变性4min，94℃变性45s，54℃退火60s，72℃延伸2min，进行35个循环，72℃延伸5min。扩增产物(8μL)经1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测(PCR扩增结果如图1所示)。
PCR扩增产物经切胶回收后，直接送交上海生物工程有限公司进行序列测定。测定序列的分析结果表明ITS序列扩增片段长度为1402bp，其序列如序列表SEQ ID NO:1所示。将所得序列采用NCBI数据库(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)中的BLAST软件与GenBank中的核酸序列进行比对，与丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)IPPBC-R30菌株(Accession No: HQ840766.1)的16S rDNA序列同源性为100％。
结合以上3点，形态学特征、生理生化特性及基因组的16S rDNA序列分析，将菌株B-1鉴定为丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。
实施例2
丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1不同浓度菌悬液对苹果树腐烂病菌菌丝生长的抑制作用
将丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1的种子发酵液接种于NB培养基中，30℃恒温震荡培养24h，得到菌株B-1的细胞培养液，离心后收集菌株 B-1菌体。
配置PDA培养基，在其中添加菌株B-1的菌体，使其终浓度为104、105、106和107cfu·mL-1，以不添加菌株B-1的PDA作为对照，在上述PDA培养基中接种活化好的苹果炭疽叶枯病菌。于25℃恒温暗培养3d，测量菌落直径。
需要说明的是，上述所用PDA培养基，其组分及配方如下：马铃薯削皮后称取200g，切成小块在水中煮沸15～20min，四层纱布过滤后加入葡萄糖20g，琼脂粉15g，定容至1000mL，pH值天然，在121℃高压蒸汽灭菌20min。
结果表明，添加不同浓度菌株B-1菌体对苹果树腐烂病菌均有显著的抑制作用，菌株B-1菌悬液浓度为104cfu·mL-1时，抑菌率为67.82％；B-1菌体浓度为105cfu·mL-1时，抑菌率为80.84％；B-1菌体浓度为106cfu·mL-1—107 cfu·mL-1时，抑菌率达90％以上(图2)。
实施例3
丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1不同浓度菌悬液对苹果树腐烂病的防治效果
制备丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1不同浓度菌悬液：107 cfu·mL-1，108cfu·mL-1和109cfu·mL-1。苹果树腐烂病菌在PDA上活化培养3 d，在菌落边缘打取直径5mm的菌饼备用。
选取长势一致的1-2年生健康富士枝条，用电烙铁烫伤，伤口长约3mm，深1mm，每伤口接种20μL丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1菌悬液 107cfu·mL-1，108cfu·mL-1和109cfu·mL-1，室温晾干后接种上述已活化的苹果树腐烂病菌菌饼，以接种无菌水再接种苹果树腐烂病菌的处理作为对照。
接种后7d和14d分别观察并测量病斑长度，计算病斑面积和防治效果，防效均达75％以上(表1)。
表1丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1不同浓度菌悬液对腐烂病菌的防治效果
Figure BDA0002386194060000081
实施例4
丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1对多种植物病原真菌的抑制作用
丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1对果蔬灰霉病菌、果蔬青霉病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌、苹果霉心病菌、桃褐腐病菌等主要果蔬病原真菌具有显著的抑制作用，表现出良好的广谱抗菌特性，培养5d时抑菌率见表2。抑菌率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％。
表2丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)B-1对果蔬主要病原真菌的抑制作用
Figure BDA0002386194060000082
实施例5
农药复配剂对苹果树腐烂病的防治效果
配置0.1mmol·L-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液，制备丁香假单胞菌B-1菌悬液105cfu·mL-1，进行等体积混合，制备用于防治苹果树腐烂病的农药复配剂。
按照上述实施例3中方法，选取健康苹果果实和枝条并造成伤口，每伤口处接种20μL的农药复配剂，室温晾干后，接种活化的轮纹病菌菌饼；以单独接种0.1mmol·L-1的2,6-二叔丁基对甲酚溶液、105cfu·mL-1的丁香假单胞菌 B-1菌悬液、无菌水，再接种轮纹病菌菌饼的处理作对照。
接种后7d观察并测量病斑长度，计算病斑面积和防治效果，防治效果＝(对照组病斑面积-处理组病斑面积)/对照组病斑面积×100％。
农药复配剂可显著提高丁香假单胞菌B-1单独对苹果轮纹病的防治效果，防效由75.61％提高至95.12％。
表3 2,6-二叔丁基对甲酚提高丁香假单胞菌B-1对苹果树腐烂病的防治效果
Figure BDA0002386194060000091
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种苹果树腐烂病生防菌剂及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1402
<212> DNA
<213> 丁香假单胞菌 B-1 的16S rDNA(16S rDNA of Pseudomonas syringae B-1)
<400> 1
gtccccccga aggttagact agctacttct ggtgcaaccc actcccatgg tgtgacgggc 60
ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcgacattc tgattcgcga ttactagcga 120
ttccgacttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgga ctacgatcgg ttttgtgaga 180
ttagctccac ctcgcggctt ggcaaccctc tgtaccgacc attgtagcac gtgtgtagcc 240
caggccgtaa gggccatgat gacttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg 300
cagtctcctt agagtgccca ccataatgtg ctggtaacta aggacaaggg ttgcgctcgt 360
tacgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga cagccatgca gcacctgtct 420
caatgttccc gaaggcacca atccatctct ggaaagttca ttggatgtca aggcctggta 480
aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac cgcttgtgcg ggcccccgtc 540
aattcatttg agttttaacc ttgcggccgt actccccagg cggtcaactt aatgcgttag 600
ctgcgccact aagagctcaa ggctcccaac ggctagttga catcgtttac ggcgtggact 660
accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgca cctcagtgtc agtatcagtc 720
caggtggtcg ccttcgccac tggtgttcct tcctatatct acgcatttca ccgctacaca 780
ggaaattcca ccaccctcta ccatactcta gcttgccagt tttggatgca gttcccaggt 840
tgagcccggg gatttcacat ccaacttaac aaaccaccta cgcgcgcttt acgcccagta 900
attccgatta acgcttgcac cctctgtatt accgcggctg ctggcacaga gttagccggt 960
gcttattctg tcggtaacgt caaaacaatc acgtattagg taactgccct tcctcccaac 1020
ttaaagtgct ttacaatccg aagaccttct tcacacacgc ggcatggctg gatcaggctt 1080
tcgcccattg tccaatattc cccactgctg cctcccgtag gagtctggac cgtgtctcag 1140
ttccagtgtg actgatcatc ctctcagacc agttacggat cgtcgccttg gtgagccatt 1200
acctcaccaa ctagctaatc cgacctaggc tcatctgata gcgcaaggcc cgaaggtccc 1260
ctgctttctc ccgtaggacg tatgcggtat tagcgtccgt ttccgagcgt tatcccccac 1320
taccaggcag attcctaggc attactcacc cgtccgccgc tcgccaccag gtacaagtac 1380
ccgtgctgcc gctcgactgc at 1402

Claims (5)

1.一种苹果树腐烂病生防菌剂，其特征是：所述苹果树腐烂病生防菌剂是浓度为107-109cfu·mL-1的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株B-1菌悬液；所述菌株B-1保藏于：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO:M2015813。
2.根据权利要求1所述的苹果树腐烂病生防菌剂，其特征是：所述苹果树腐烂病生防菌剂是浓度为109cfu·mL-1的丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株B-1菌悬液。
3.一种权利要求1-2任一项所述的苹果树腐烂病生防菌剂的应用，其特征是：所述苹果树腐烂病生防菌剂用于苹果树腐烂病的防治。
4.一种权利要求1所述的苹果树腐烂病生防菌剂的制备方法，其特征是：包括以下步骤：
(1)将菌株B-1划线接种在NA培养基中，于30℃恒温活化培养24h，得到活化的菌株B-1单菌落A；
(2)将所述活化的菌株B-1单菌落A，接种于装瓶量80mL/250mL的NB培养基中，180r·min-1，30℃恒温震荡培养12h，得到菌株B-1发酵种子液B；
(3)将所述发酵种子液B按1:100的接种量接种到NB培养基中扩大培养，30℃恒温震荡培养24h，得到109cfu·mL-1B-1菌株的细胞培养液C；
(4)将109cfu·mL-1B-1菌株的细胞培养液C，在4℃条件下，12000r·min-1离心15min，收集B-1菌体沉淀用无菌水重新悬浮，得到109cfu·mL-1的菌悬液，即为生防菌剂。
5.一种农药复配剂的应用，其特征是：所述农药复配剂用于苹果树腐烂病防治；所述农药复配剂中的有效成分为2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)和丁香假单胞菌菌株B-1菌悬液；所述丁香假单胞菌菌株B-1保藏于：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO:M2015813。
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Title
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