CN111961629A - 一种樱桃防腐保鲜微生物制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种樱桃防腐保鲜微生物制剂及其制备方法与应用。本发明中的樱桃防腐保鲜微生物制剂包含贝莱斯芽孢杆菌TA‑3‑BV，所述贝莱斯芽孢杆菌TA‑3‑BV于2020年7月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO.20398。本发明中的微生物制剂可以有效抑制病原菌匍枝根霉的菌丝生长及孢子萌发，同时有效抑制甜樱桃软腐病的发病，将采摘后的樱桃经贝莱斯芽孢杆菌TA‑3‑BV菌悬液浸泡后，可延缓果实腐败进程，果实腐败推迟2‑3天。同时，贝莱斯芽孢杆菌TA‑3‑BV的处理，还能诱导植物的抗病性和抗氧化性，触发樱桃果实的基础免疫，为甜樱桃采后防腐保鲜提供了一种新方法。

Description

一种樱桃防腐保鲜微生物制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种樱桃防腐保鲜微生物制剂及其制备方法与应用，属于植物病害防治技术领域。
背景技术
甜樱桃是一种非常受欢迎的水果，风味可口、营养价值丰富，富含营养物质如维生素、矿物质、花青素等，对辅助降血压，促进血液循环，缓解关节疼痛，提高睡眠质量都有帮助，备受消费者喜爱。在我国，樱桃种植面积约26.67万hm2，甜樱桃栽培面积占2/3以上，并且品种繁多，收集保存种质资源、自主选育甜樱桃新品种以及砧木品种共500余个。但由于甜樱桃本身皮薄多汁，在采摘、运输销售中极易受到机械伤和微生物的侵染，导致果实失水皱缩、腐败变质。其中由匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)引起的软腐病虽然不如褐腐病常见，但也是引起樱桃果实采后病害的重要致病微生物。
匍枝根霉隶属于接合菌纲、毛霉目、毛霉科、根霉属、匍匐茎类，是一种常见的采后致病菌，自然存在于土壤、垃圾和空气中。其孢子在空气中很常见，通常在潮湿的条件下几天内就能生长，一旦侵入果实就会迅速蔓延，匍枝根霉不仅会引起核果类软腐病的发生，葱属、凤梨属、芸薹属、黄瓜属、南瓜属、草莓属、番茄属、菜豆属、豌豆属、茄属也极易受这种真菌感染，被认为是在各种园艺商品贮藏期间最具破坏性的真菌之一。一些化学杀菌剂如氟二氧酰基、特布康唑、芬施米特和阿唑司汀对软腐病的防治效果显著，但却不利于环境可持续发展以及对人体健康产生不良影响，因此非化学防治方法越来越受到人们青睐。
微生物拮抗保鲜作为一种新型保鲜方法成为当下研究热点。微生物拮抗保鲜利用拮抗微生物，直接作用于致病菌，既对果实本身没有负面影响，又能抑制病原微生物的繁殖，可有效控制果实采后腐烂的发展，是防治水果采后主要病害的一种有效手段。拮抗微生物主要分为拮抗酵母菌和拮抗细菌，而芽孢杆菌属(Bacillus spp.)和假单胞杆菌属(Pseudomonas spp.)细菌是应用较多的拮抗细菌。在甜樱桃采后保鲜的拮抗微生物中，国内已报道的主要有罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)、芽孢杆菌属(Bacillusspp.)等外源拮抗菌株，分离于不同基物的功能性菌株，虽然绝大部分功能研究都与抑制植物病原菌相关，但其抑菌谱有很大差别，而目前尚未查阅到甜樱桃内生拮抗菌株及菌剂的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种樱桃防腐保鲜微生物制剂及其制备方法与应用。本发明中的微生物制剂可以有效抑制病原菌匍枝根霉的菌丝生长及孢子萌发，同时有效抑制甜樱桃软腐病的发病，诱导甜樱桃抗病性和抗氧化性相关的酶活力，触发植物的基础免疫，促进甜樱桃防腐保鲜。
本发明的技术方案如下：
一种樱桃防腐保鲜微生物制剂，所述微生物制剂包含贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)TA-3-BV。
根据本发明优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TA-3-BV于2020年7月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.20398。(以下简称贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Q-84或者Q-84)
根据本发明优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Q-84的16SrDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明优选的，所述微生物制剂中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Q-84的有效活菌数在1.0×108CFU/mL以上。
根据本发明优选的，所述微生物制剂中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Q-84的有效活菌数在1.0×109CFU/mL以上。
根据本发明优选的，所述微生物制剂为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Q-84发酵液，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Q-84发酵液的有效活菌数在1.0×108CFU/mL以上。
上述樱桃防腐保鲜微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Q-84接种到LB固体培养基中，37℃活化培养24h，活化后接种于NB液体培养基中，以37℃，150～200r/min条件下震荡培养，培养至发酵液的细胞浓度至1.0×108CFU/mL以上，得樱桃防腐保鲜微生物制剂。
上述微生物制剂在樱桃防腐保鲜中的应用。
根据本发明优选的，所述应用是用上述微生物制剂浸泡采摘后的樱桃果实。
根据本发明优选的，所述浸泡采摘后的樱桃果实的时间在2min以上。
有益效果：
本发明提供了一种樱桃防腐保鲜微生物制剂，所述微生物制剂中含有樱桃的内生拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Q-84。细胞浓度为109CFU/mL的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Q-84发酵液对樱桃软腐病发病有很强的抑制效果，发病率仅为20.58％。将采摘后的樱桃经贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Q-84发酵液浸泡后，可延缓果实腐败进程，果实腐败推迟2-3天。同时，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)Q-84的处理，还能诱导植物的抗病性和抗氧化性，提高抗病性酶(PAL、CHI、GLU)的活性，提高其抗病性，提高抗氧化酶POD的活性，同时降低PPO、LOX的活性，提高其抗氧化性，延缓果实采后衰老，提高果实抗逆性，触发樱桃果实的基础免疫，为甜樱桃采后防腐保鲜提供了一种低成本、安全健康、环境友好型的新方法。
附图说明
图1为软腐病病原菌匍枝根霉的菌落形态照片；
图2为回接病原菌之后樱桃的发病情况，图中，A：12h樱桃发病情况；B：24h樱桃发病情况；C：36h樱桃发病情况；D：48h樱桃发病情况；
图3为基于病原菌的ITS基因序列构建的系统发育树，图中，RF指病原菌；
图4为内生拮抗细菌Q-84的菌落形态照片；
图5为内生拮抗细菌Q-84发酵液对病原菌菌丝微观形态的影响，图中，A：对照组菌丝(150倍)；B：对照组孢子囊(550倍)；C：对照组孢子囊壁(1000K倍)；D：处理组菌丝(150K倍)；E：处理组孢子囊(120K倍)；F：处理组孢子囊壁(1500K倍)；
图6为内生拮抗细菌Q-84的16S rDNA基因序列构建的系统发育树；
图7为贝莱斯芽孢杆菌Q-84不同处理液对采后甜樱桃软腐病抑制效果；图中，左图为腐败率柱状图，右图为菌斑直径柱状图；不同小写字母表示不同处理组间差异显著(p<0.05)；
图8不同浓度贝莱斯芽孢杆菌Q-84发酵液对采后甜樱桃软腐病抑制效果，图中，左图为腐败率柱状图，右图为菌斑直径柱状图，图中横坐标中的A、B、C、D、E分别代表发酵液细胞浓度为109CFU/mL、108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL；不同小写字母表示不同处理组间差异显著(p<0.05)；
图9为贝莱斯芽孢杆菌Q-84处理对甜樱桃果实自然腐败的影响；图中同一处理时间不同小写字母表示不同处理组间差异显著(p<0.05)；
图10为贝莱斯芽孢杆菌Q-84处理对甜樱桃果实多酚氧化酶(PPO)活性的影响；
图11为贝莱斯芽孢杆菌Q-84处理对甜樱桃果实过氧化物酶(POD)活性的影响；
图12为贝莱斯芽孢杆菌Q-84处理对甜樱桃果实脂氧合酶(LOX)活性的影响；
图13为贝莱斯芽孢杆菌Q-84处理对甜樱桃果实苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响；
图14为贝莱斯芽孢杆菌Q-84处理对甜樱桃果实几丁质酶(CHI)活性的影响；
图15为贝莱斯芽孢杆菌Q-84处理对甜樱桃果实β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活性的影响。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中的涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
实施例中涉及的微生物：
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TA-3-BV于2020年7月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNO.20398。(以下简称贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Q-84或者Q-84)
匍枝根霉是引起樱桃果实采后软腐病的重要病原菌，可为普通市购，或者直接从樱桃中分离培养得到，本发明中为后者。
实施例中涉及的培养基：
肉膏蛋白胨培养基(LB)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，琼脂20g，水1000mL，pH＝7，在大气压0.1-0.15MPa下，121℃灭菌20min。
NB培养基(1000mL)：蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、氯化钠10.0g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.3。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：新鲜马铃薯200g切块煮沸，过滤得到滤液，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，在大气压0.1-0.15MPa下，115℃灭菌30min。
实施例中涉及的甜樱桃是从山东省果树研究所天平湖基地(泰安)采集的“美早”甜樱桃。
实施例1、病原菌的分离鉴定与致病性验证
1.1病原菌的分离鉴定
将腐败甜樱桃样品先用75％医用酒精进行表面消毒，再用无菌水清洗表面3次，自然风干，用无菌刀片和镊子切取少量腐败果实组织，将其置于抗性(链霉素、青霉素)PDA培养基中央，28℃恒温培养3-4d。待平板菌落长出后，挑取边缘菌块置于另一PDA培养基，28℃恒温培养，多次纯化，直至单一菌落为止。将单一菌落接种于试管斜面上，放于4℃冰箱中保藏备用。以上操作均在无菌环境下进行。
将分离纯化的病原菌置于PDA培养基，28℃恒温培养4d，通过菌落形态观察发现：菌落在PDA平板上菌丝呈白色，外观干燥，不透明，菌丝长而膨松，气生的匍匐菌丝分布在培养基表层，有黑色孢子生成，如图1所示。
1.2病原菌致病性检测
根据柯赫氏法则验证，将分离纯化的病原菌置于PDB试管中，28℃、180r/min培养48h，制成浓度为1×106CFU/mL菌悬液。取健康表面无任何损伤的“美早”甜樱桃，用75％医用酒精浸泡20s，再用无菌水清洗3次，自然晾干，用无菌牙签在果实赤道部位刺3×3mm的伤口一处，吸取10μL的1×106CFU/mL菌悬液置于伤口处，待果实自然吸取后将其置于密封袋中，28℃恒温培养3d，重复3次，观察发病程度。
其中，果实根据腐烂程度可分为5个等级，分级标准见表1所示：
表1果实发病级别
Figure BDA0002654449810000041
回接病原菌之后的甜樱桃果实出现软化，病斑直径逐渐增大，有白色菌丝生成，直至完全腐败，菌丝呈灰黑色。如图2所示，接种病原菌之后的甜樱桃果实12h后出现软化现象，24h后出现很明显的病斑，36h后每个果实基本都出现不同程度的病状，发病率100％，发病级别最高达4级，48h后每个果实包裹灰黑色菌丝，完全腐败。回接后的发病症状与自然条件下软腐病发病症状相一致，说明该菌是造成甜樱桃采后软腐病的主要病原菌。
1.3病原菌生物学鉴定
将分离纯化的病原菌接种至PDB培养基中，28℃180r/min培养48h，制成菌悬液。挑取100mg菌丝球液氮研磨3次，按照真菌基因组试剂盒法提取DNA，采用真菌通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行PCR扩增，PCR产物由睿博兴科生物技术有限公司纯化后测序。将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，在GenBank数据库中进行同源性比较，选择同源性较高的菌株序列，利用MEGA7.0软件构建系统发育树。
将测序结果进行同源性比较和构建系统发育树后发现：病原菌的序列在GenBank中和Rhizopusstolonifer有比较高的同源性，同源性达到100％。从GenBank数据库中选取代表根霉属不同种的ITS序列，以作为外群，构建系统发育树，发现：该病原菌菌株与亲缘关系较近的Rhizopusstolonifer聚于同一支(如图3所示)。结合其形态学培养特征，将病原菌鉴定为匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)。
实施例2、拮抗菌的分离、筛选与鉴定
2.1内生拮抗细菌的分离筛选
取30颗健康“美早”甜樱桃整果研磨，称取1g果肉加入9mL无菌生理盐水中，混匀配成原液，静置20min。采用梯度稀释法，将稀释成10-3、10-4、10-5的浓度稀释液，分别取100μL涂布于LB固体培养基中，每个梯度设3个平行，37℃恒温培养24h。将生长出的菌落接种至另一LB固体培养基上进行三区划线，37℃恒温培养，直至长出单菌落。将单菌落挑取至LB斜面，待菌落长出后置于4℃保藏。
采用滤纸片法，在培养病原菌匍枝根霉7-10d的PDA平板上取6mm菌饼，将其接种于另一PDA平板中央，将6mm无菌滤纸片置于距病原菌2.5cm处，吸取6μL上述分离纯化后的细菌发酵液打在滤纸片上，每个PDA平板3个平行，以仅接种病原菌的PDA平板作为对照，重复3次，28℃恒温培养5-7d，测量菌落直径，计算抑制率。
Figure BDA0002654449810000051
从健康甜樱桃果实上获得形态有差异的细菌17株。从17株菌株中筛选得到3株对甜樱桃软腐病具有一定生防作用的细菌。如表2所示，Q-84菌株对软腐病病原菌匍枝根霉的抑制效果最为明显，病原菌菌落直径最小，直径为1.98±0.17cm，抑制率达69.82±1.43％。在P<0.05的情况下，处理组Q-84与Q-2、Q-8呈显著性差异，处理组Q-2和Q-8差异不显著。通过观察，Q-84生防菌菌落呈淡黄色、形状不规则，不透明(图4)。
表2内生拮抗细菌对甜樱桃软腐病原菌生长的抑制作用
Figure BDA0002654449810000052
注：同列不同小写字母表示不同处理组间差异显著(p<0.05)。
在上述实验中，用无菌牙签挑取Q-84抑菌圈周围的菌丝，为处理组；正常生长培养的病原菌菌丝为对照组。取处理组和对照组菌丝，用2.5％戊二醛溶液4℃固定24h，依次放入不同浓度(45％、55％、65％、75％、85％、95％、100％)的乙醇各脱水20min，采用临界点干燥法进行样品干燥，喷金处理。在扫描电镜(JCM-7000)下观察并进行拍照。结果如图5所示，从扫描电镜图可以看出，对照组和处理组菌丝微观结构上有较大的差别。由图A和D可知，对照组(A)菌丝较长，孢子囊柄直立，不分枝；处理组(D)孢子囊柄断裂；由图B和E可知，对照组(B)孢子囊健康饱满，呈近球形，有疣状突起；处理组(E)孢子囊呈畸形并伴有表面凹陷、褶皱、粗糙、不平整现象；由图C和F可知，对照组(C)表面有黑色点状物质，表面不光滑；处理组(F)有裂痕产生。说明Q-84能够破坏病原菌的菌丝结构，从而杀死病原菌。
2.2内生拮抗细菌的鉴定
将分离纯化的内生拮抗细菌Q-84置于LB固体培养基，37℃恒温培养24h，进行菌落形态观察。内生拮抗细菌的生理生化特征鉴定具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》，发现其与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)生理生化指标相同。
采用细菌基因组提取试剂盒法提取Q-84菌株DNA，利用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行细菌的16S rDNA的PCR扩增，用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并对其进行测序，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。序列在GenBank上进行序列Blast比对，选择具有代表性的菌株序列，利用MEGA7.0软件进行聚类分析构建系统发育树。
结果显示，菌株Q-84与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)聚类(图6)，同源性为89％，结合形态鉴定和生理生化鉴定结果，最终鉴定Q-84菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。
上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)Q-84，于2020年7月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.20398。
实施例3、内生拮抗细菌不同处理液对病原菌生长的影响
将贝莱斯芽孢杆菌Q-84培养配制成不同处理液，(A)发酵液：将贝莱斯芽孢杆菌Q-84接种于NB液体培养基在37℃、180r/min发酵培养96h；(B)菌悬液：将贝莱斯芽孢杆菌Q-84接种于NB液体培养基在37℃、180r/min发酵培养96h，6000g离心10min，弃去上清液，加相同体积无菌水摇匀；(C)上清液：将贝莱斯芽孢杆菌Q-84接种于NB液体培养基在37℃、180r/min发酵培养96h，6000g离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜；(D)对照：NB液体培养基。采用滤纸片法，方法同实施例2中2.1，观察不同处理液对匍枝根霉抑制效果的影响，实验重复3次。
结果如表3所示，通过对不同处理组病斑直径的测定发现，贝莱斯芽孢杆菌Q-84的菌悬液、发酵液和发酵上清液对病原菌的抑制效果不同。菌悬液与对照组无显著性差异，对软腐病病原菌抑菌效果不明显，而发酵液和发酵上清液抑菌效果显著(P＜0.05)，抑菌率达到69.82±1.43％和59.14±0.85％，发酵液的抑菌效果更强。
表3贝莱斯芽孢杆菌Q-84的不同处理液对病原菌的抑制效果
Figure BDA0002654449810000071
注：同列不同小写字母表示不同处理组间差异显著(p<0.05)。
实施例4、内生拮抗细菌对樱桃软腐病的发病影响
4.1内生拮抗细菌不同处理液对樱桃软腐病的抑制效果
按照实施例3制备贝莱斯芽孢杆菌Q-84的不同处理液。
将匍枝根霉于PDA培养基上28℃活化48h，用灭菌接种环在无菌环境下将菌丝和孢子刮下，无菌水冲洗，四层灭好菌的纱布过滤菌丝，血球计数法计数，调整到104CFU/mL孢子悬浮液待用。
选择大小一致、成熟度均一的甜樱桃果实，经100ppm次氯酸钠消毒2min，自然晾干后，用接种针在赤道部位刺3mm×3mm伤口，移液枪吸取20μL不同处理液，处理液如下：A发酵液、B菌悬液、C上清液、D NB液体培养基，4h后分别接种10μL104CFU/mL匍枝根霉孢子悬浮液，以无菌水为对照，然后将果实自然风干，并放入塑料托盘中，该托盘用高密度聚乙烯套筒包裹，以保持高湿度。28℃下每12h观察发病情况，并测量病斑直径。
测量结果如图7所示，菌悬液、发酵液以及上清液对甜樱桃软腐病都有一定抑制作用，其中发酵液的效果最好，上清液效果较差。在28℃培养48h后，对照组(果实+病原菌+水)和对照组(果实+病原菌+NB培养基)均已全部发病，病斑直径达23.54±1.56mm和22.87±1.24mm，而此时发酵液处理组发病率仅20.58％，病斑直径6.77±1.41mm，与其他处理组均成显著性差异(p<0.05)。菌悬液处理组和发酵上清液处理组对甜樱桃软腐病的抑制效果较弱，且两者不呈显著性差异(p<0.05)。
4.2不同浓度内生拮抗细菌发酵液对樱桃软腐病的抑制效果
将贝莱斯芽孢杆菌Q-84接种于NB液体培养基在37℃、180r/min发酵培养，分别得到细胞浓度为109CFU/mL、108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL贝莱斯芽孢杆菌Q-84发酵液后，停止发酵。选择大小一致、成熟度均一的甜樱桃果实，经100ppm次氯酸钠消毒2min，自然晾干后，用接种针在赤道部位刺3mm×3mm伤口，移液枪吸取20μL不同浓度贝莱斯芽孢杆菌Q-84发酵液，4h后分别接种10μL104CFU/mL匍枝根霉孢子悬浮液，以无菌水为对照，果实自然风干，并放入塑料托盘中，该托盘用高密度聚乙烯套筒包裹，以保持高湿度。28℃下每12h观察发病情况，并测量病斑直径。
结果如图8所示，不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌Q-84发酵液对甜樱桃软腐病抑制效果不同，随着浓度的变化，抑制作用显著变化。处理组A发酵液浓度为1×109CFU/mL时，抑制效果最好，软腐病的发病率仅为20.58％，病斑直径6.77±1.41mm，且与其他处理组均成显著性差异(p<0.05)。此时处理组发病率已达100％。随着发酵液浓度越低，对软腐病效果越弱。当发酵液浓度为1×107CFU/mL，抑制效果不显著。因此贝莱斯芽孢杆菌Q-84发酵液的最佳抑菌浓度为1×109CFU/mL。
实施例5、内生拮抗细菌对采摘后甜樱桃自然腐败和贮藏品质的影响
挑选采摘后成熟度一致、大小均匀、无机械损伤的甜樱桃果实，于109CFU/mL拮抗菌贝莱斯芽孢杆菌Q-84的发酵液中浸泡2min，对照组用无菌水处理，以纳他霉素为阳性对照。各处理组放置于透明保鲜盒中，28℃下贮藏，每3d测定果实发病情况和品质指标。每个处理200个果实，重复3次，整个实验重复2次。
结果如图9所示，纳他霉素对甜樱桃果实腐烂抑制作用最好，经过纳他霉素处理的果实，腐烂率最低。但拮抗菌贝莱斯芽孢杆菌Q-84对甜樱桃果实采后腐败也有较好抑制效果，与未经任何处理的对照相比差异显著。经过贝莱斯芽孢杆菌处理，可延果实腐败进程，果实腐败推迟2-3天。果实腐烂是由于果实表面真菌病原大量繁殖所致，由此可见，拮抗菌贝莱斯芽孢杆菌Q-84具有广谱抑菌性，对于多种病原真菌有抑制作用。
实施例6、内生拮抗细菌对樱桃果实抗性相关酶活的影响
用无菌接种针的尖端，在甜樱桃果实赤道附近刺伤3mm×3mm的小孔，在伤口处接种20μL 109CFU/mL的贝莱斯芽孢杆菌Q-84发酵液，以无菌水作为对照(Control)，4h后在伤口处接种10μL 105CFU/mL病原菌匍枝根霉的孢子悬浮液，并贮于常温下，每隔12h取样测定酶活性，每次取样20个果实(病斑与完好组织的交接部位)，整个试验重复2次。
多酚氧化酶活性(PPO)：采用愈创木酚法测定，参考文献Yang X,JiangX.Antifungal activity and mechanism of tea polyphenols againstRhizopusstolonifer[J].Biotechnology letters,2015,37(7):1463-1472。
多酚氧化酶(PPO)：采用邻苯二酚法测定，参考文献Wu S,Zhen C,Wang K,etal.Effects of Bacillus Subtilis CF-3VOCs Combined with Heat Treatment on theControl of Moniliniafructicola in Peaches and Colletotrichumgloeosporioidesin Litchi Fruit[J].Journal of food science,2019,84(12):3418-3428。
脂氧合酶(LOX)：测定方法参照文献曹建康，姜微波，赵玉梅.果蔬釆后生理生化实验指导[M].北京:中国轻工业出版社，2007。
苯丙氨酸解氨酶(PAL)：测定方法参照文献Arrebola E,Sivakumar D,BacigalupoR,et al.Combined application of antagonist Bacillus amyloliquefaciens andessential oils for the control of peach postharvest diseases[J].Cropprotection,2010,29(4):369-377。
β-1,3-葡聚糖酶(GLU)：测定方法参照文献Lin F,Xue Y,Huang Z,etal.Bacillomycin D inhibits growth of Rhizopusstolonifer and induces defense-related mechanism in cherry tomato[J].Applied microbiology and biotechnology,2019,103(18):7663-7674。
几丁质酶(CHI)：测定方法参照文献Gu R,Zhu S,Zhou J,et al.Inhibition onbrown rot disease and induction of defence response in harvested peach fruitby nitric oxide solution[J].European journal of plant pathology,2014,139(2):369-378。
6.1内生拮抗细菌对樱桃果实多酚氧化酶(PPO)活性的影响
PPO是引起果蔬褐变的主要酶类，高活力的PPO会对果实品质造成不良影响。接种贝莱斯芽孢杆菌Q-84之后，樱桃果实PPO的活性如图10所示，从图中可以看出，处理组的PPO活性低于对照组，整个处理期间，PPO酶活大致呈上升的趋势，处理组PPO活性在第12h达到最高峰后波动变化，显著低于对照组。对照组PPO酶活性在36h达到高峰后略微下降。贮藏期间，贝莱斯芽孢杆菌Q-84处理组都表现一个较低的活性，这说明贝莱斯芽孢杆菌Q-84能抑制樱桃果实PPO活性，减少果实褐变。
6.2内生拮抗细菌对樱桃果实过氧化物酶(POD)活性的影响
POD是植物酶促防御系统的关键酶之一，可以催化H2O2分解为水，消除氧自由基，解除H2O2对果实的毒害，从而延缓果实采后衰老，提高抗逆性。接种贝莱斯芽孢杆菌Q-84之后，樱桃果实POD的活性如图11所示，从图中可以看出，处理组和对照组POD酶活性均呈现先升高后降低的趋势，并且都在第36h达到峰值，此时，对照组POD活性395U，而处理组POD活性470U，是对照组的1.18倍，在36h后POD酶活性均开始下降，但处理组也保持了较高的酶活力，是对照组的1.41倍。结果表明，接种贝莱斯芽孢杆菌Q-84能明显诱导樱桃果实POD活性增加，提高其抗病抗氧化能力。
6.3内生拮抗细菌对樱桃果实脂氧合酶(LOX)活性的影响
LOX是催化细胞膜脂肪酸氧化反应的酶，其代谢途径的产物主要参与膜脂过氧化作用，在果实成熟过程中起重要作用，增加细胞膜透性，加剧细胞膜降解，同时生成的自由基、脂质氢过氧化物等具有毒害作用物质。接种贝莱斯芽孢杆菌Q-84之后，樱桃果实LOX的活性如图12所示，从图中可知，处理组、对照组均呈现先升高后降低的趋势。对照组LOX活性在0-12h迅速升高，酶活力达到高峰，为60.67U，此时，处理组LOX活性也达到最大值，为50.16U，之后，虽然对照组酶活性下降，但也一直保持较高活性，在第48h，对照组酶活性仍是处理组的1.38倍。这说明贝莱斯芽孢杆菌Q-84处理可以抑制由匍枝根霉引起樱桃果实的LOX活性，减轻自由基对细胞膜的破坏程度。
6.4内生拮抗细菌对樱桃果实苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响
PAL是苯丙烷途径的关键酶，植物的抗病力越强，PAL活力越高。接种贝莱斯芽孢杆菌Q-84之后，樱桃果实PAL的活性如图13所示，从图中可以看出，处理组和对照组均呈现先升高后降低的趋势，并且均在36h达到最高点，其中处理组PAL酶活性为33.12U，是对照组的1.18倍，到第48h，处理组、对照组PAL酶活均有不同程度的降低，整个处理期间，处理组PAL酶活始终高于对照组。结果表明贝莱斯芽孢杆菌Q-84处理能够进一步提高樱桃果实中的PAL活性，增强果实对病原菌的抵抗能力。
6.5内生拮抗细菌对樱桃果实几丁质酶(CHI)活性的影响
接种贝莱斯芽孢杆菌Q-84之后，樱桃果实CHI的活性如图14所示，从图中可知，处理组和对照组CHI酶活性均呈现先上升后下降的趋势，在0-24h，处理组和对照组酶活都迅速增加，24-36h变化缓慢，但也有所增加，在第36h CHI酶活均达到最大，此刻处理组CHI活性为20.08U，而对照组CHI活性17.18U，在第48h，虽然CHI酶活性有所降低，但都保持较高活性，整个处理期间，处理组的CHI酶活性均大于对照组，结果表明贝莱斯芽孢杆菌Q-84处理能诱导樱桃果实CHI酶活性，提高果实抗病性。
6.6内生拮抗细菌对樱桃果实β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活性的影响
GLU是植物抗真菌的重要抗性物质之一，接种贝莱斯芽孢杆菌Q-84之后，樱桃果实GLU的活性如图15所示，由图所知，处理组和对照组GLU酶活性均呈现先升高的趋势，0-12h，酶活性都迅速上升，对照组在第12h达到最大，为20.92U，处理组GLU活性则继续升高，至第24h达到最高，为25.49U，是对照组的1.26倍，24h后，处理组和对照组GLU活性都有所降低，但处理组酶活性始终高于对照组。结果表明，贝莱斯芽孢杆菌Q-84可显著提高甜樱桃果实的GLU活性。
综上可知，本发明中的贝莱斯芽孢杆菌Q-84应用在植物体表时，除了对病原菌具有抑制作用外，还能诱导植物的抗病性和抗氧化性，提高抗病性酶(PAL、CHI、GLU)的活性，提高其抗病性，提高抗氧化酶POD的活性，同时降低PPO、LOX的活性，提高其抗氧化性，延缓果实采后衰老，提高果实抗逆性，触发樱桃果实的基础免疫。

Claims (10)

1.一种樱桃防腐保鲜微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂包含贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TA-3-BV。
2.如权利要求1所述的樱桃防腐保鲜微生物制剂，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TA-3-BV于2020年7月17日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC NO.20398。
3.如权利要求2所述的樱桃防腐保鲜微生物制剂，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TA-3-BV的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1所述的樱桃防腐保鲜微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TA-3-BV的有效活菌数在1.0×108CFU/mL以上。
5.如权利要求1所述的樱桃防腐保鲜微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TA-3-BV的有效活菌数在1.0×109CFU/mL以上。
6.如权利要求1所述的樱桃防腐保鲜微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TA-3-BV发酵液，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)TA-3-BV发酵液的有效活菌数在1.0×108CFU/mL以上。
7.权利要求1所述的樱桃防腐保鲜微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：
将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)TA-3-BV接种到LB固体培养基中，37℃活化培养24h，活化后接种于NB液体培养基中，以37℃，150～200r/min条件下震荡培养，培养至发酵液的细胞浓度至1.0×108CFU/mL以上，得樱桃防腐保鲜微生物制剂。
8.权利要求1所述的微生物制剂在樱桃防腐保鲜中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用是用权利要求1所述的微生物制剂浸泡采摘后的樱桃果实。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述浸泡采摘后的樱桃果实的时间在2min以上。
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