CN112458023B - 一株弯曲芽孢杆菌及其培养方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)，于2020年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.21107，所述弯曲芽孢杆菌对甜樱桃具有广谱抑菌性，对甜樱桃的致病菌隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigma)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)抑菌效果显著。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种弯曲芽孢杆菌及培养方法与应用。
背景技术
甜樱桃又名大樱桃、车厘子，是蔷薇科(Rosaceae)、李属、樱桃亚属(Cerasus)植物。甜樱桃营养价值丰富，可溶性蛋白含量约为589mg/100g，还有较多的Vc和多种微量元素，其中含铁丰富，约为8mg/100g，具有抗癌、抗肿瘤和促进血红蛋白再生的功效。甜樱桃果肉中富含多种酚类化合物，包括羟基肉桂酸、原花青素、黄酮醛以及花青素，具有较强的抗氧化能力，在预防疾病和人体健康方面起着非常重要的作用。
由真菌性病原微生物引起的腐败是樱桃产业生产中面临的重大问题，引起的腐烂损失可达总损失50％以上。目前国内甜樱桃主要的采后病害有青霉病、灰霉病、根腐病、褐腐病、软腐病和黑斑病等，导致其病害的真菌性病原菌有扩展青霉菌(Penicilliumexpansum)、美澳型核果褐腐病菌(Monilinia fructicola)、葡萄孢霉菌(Botrytiscinerea)、根霉菌(Rhizopus sp.)、毛霉菌(Mucor sp.)、链格孢霉(Alternariaalternata)及炭疽菌(Colletotrichum sp.)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、黑曲霉(Aspergillus niger)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)等。
中国专利文献CN105557756A(申请号：201610082878.3)公开了一种利用甲基营养型芽孢杆菌HKG-1实施的植物抑菌方法，利用甲基营养型芽孢杆菌HKG-1的菌液制得的生物杀菌剂对灰葡萄孢菌、葡萄座腔菌、黑腐皮壳菌、葡萄球座菌、稻巨座壳菌、辣椒炭疽菌、葫芦科刺盘孢菌、匍枝根腐菌、禾谷镰孢菌、尖镰孢菌、褐孢霉菌、天门冬拟茎点霉菌、玉蜀黍平脐蠕孢菌、链格孢菌、卵菌门疫霉菌、青枯假单胞杆菌、地毯草单胞菌锦葵变种等都有明显的抑制作用；但是并未涉及塔宾曲霉。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株弯曲芽孢杆菌及其培养方法与应用。
本发明涉及的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)是从健康的“美早”甜樱桃中分离筛选得到的，对甜樱桃具有广谱抑菌性，对甜樱桃的致病菌隐秘刺盘孢菌(Colletotrichumaenigma)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)抑菌效果显著，所述隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigma)是炭疽菌属的一种。
本发明涉及的技术方案
一种弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)，于2020年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.21107。(以下简称弯曲芽孢杆菌TA-12)
上述弯曲芽孢杆菌TA-12的培养方法，包括如下步骤：
挑取活化好的弯曲芽孢杆菌TA-12，于LB培养基中培养种子液，将种子液接种于LB培养基中发酵培养。
根据本发明优选的，所述培养种子液和发酵培养的条件为：35～40℃下150～200r/min 发酵培养；进一步优选为：37℃下180r/min发酵培养。
上述弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)在抑制由隐秘刺盘孢菌(Colletotrichumaenigma)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)和/或塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)引起的樱桃病害中的应用。
有益效果
本发明涉及的弯曲芽孢杆菌TA-12对甜樱桃具有广谱抑菌性，对甜樱桃的致病菌隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigma)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)抑菌效果显著。
附图说明
图1隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigma)的显微镜观察照片；
图2匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)的显微镜观察照片；
图3塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)的显微镜观察照片；
图4接种隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigma)之后樱桃的发病情况；
图5接种匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)之后樱桃的发病情况；
图6接种塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)之后樱桃的发病情况；
图7为弯曲芽孢杆菌TA-12的16S rDNA基因序列构建的系统发育树；
图8弯曲芽孢杆菌TA-12抑制隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigma)的实验平板照片；
图9弯曲芽孢杆菌TA-12抑制匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)的实验平板照片；
图10弯曲芽孢杆菌TA-12抑制塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)的实验平板照片；
图11弯曲芽孢杆菌TA-12菌种的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例与附图对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
实施例中涉及的微生物：
弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)，于2020年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNo. 21107；(以下简称弯曲芽孢杆菌TA-12)。
隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigma)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、塔宾曲霉 (Aspergillus tubingensis)为普通市购，或者从甜樱桃中分离筛选得到，本发明中为后者。
实施例中涉及的培养基：
PDA培养基：马铃薯去皮200g，葡糖糖20g，琼脂20g，补足水1000mL，115℃灭菌30min。不添加琼脂即为PDB培养基。
LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，琼脂20g，1000mL去离子水煮沸，调pH7.0，121℃灭菌20min。
实施例1中涉及的樱桃购于大连“萨米脱”大棚樱桃。
实施例2中涉及的樱桃购于泰安曼华庄园大棚“美早”樱桃。
实施例1
病原菌的分离鉴定与致病性验证
1.1病原菌的分离鉴定
将腐败甜樱桃样品先用75％医用酒精进行表面消毒，再用无菌水清洗表面3次，自然风干，用无菌刀片和镊子切取少量腐败果实组织，将其置于抗性(链霉素、青霉素)PDA培养基中央，28℃恒温培养3～4d。待平板菌落长出后，挑取边缘菌块置于另一PDA培养基，28℃恒温培养，多次纯化，直至单一菌落为止。将单一菌落接种于试管斜面上，放于4℃冰箱中保藏备用。以上操作均在无菌环境下进行。
将经过灭菌的盖玻片以45°角插入PDA培养基中央，用无菌接种环挑取分离纯化的单一菌落置于盖玻片与PDA培养基的交界处，28℃恒温培养5d，用灭菌的镊子轻轻的将盖玻片取出来，用酒精棉球轻轻擦拭盖玻片另一面，将菌丝生长旺盛的一面与滴有1滴乳酸酚棉蓝染液的载玻片接触，在显微镜下观察菌丝体和孢子生长情况，见图1、图2、图3。
1.2病原菌致病性检测
根据柯赫氏法则验证，将分离纯化的病原菌置于PDB试管中，28℃、180r/min培养48h，制成浓度为1×105CFU/mL菌悬液。取健康表面无任何损伤的大棚樱桃，用75％医用酒精浸泡20s，再用无菌水清洗3次，无菌条件下自然晾干，用灭菌的黄枪头在果实赤道部位刺3mm 深的伤口，吸取10μL的1×105CFU/mL菌悬液置于伤口处，待果实自然吸取后将其置于密封袋中，28℃恒温培养3d，重复3次，观察接菌后24h、36h、48h、60h、72h的发病程度。
接种隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigma)之后樱桃的发病情况，见图4；由图4可以看出，在接种隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigma)病原菌后72h，果实表面出现较大面积的腐烂。
接种匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)之后樱桃的发病情况，见图5；由图5可以看出，在接种匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)病原菌后36h，果实表面就出现大面积的腐烂，接种48h 后，果实完全腐烂。
接种塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)之后樱桃的发病情况，见图6；由图6可以看出，在接种塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)病原菌后36h，果实表面就出现大面积的腐烂，接种48h后，果实完全腐烂。
1.3病原菌生物学鉴定
将分离纯化的病原菌接种至PDB培养基中，28℃180r/min培养48h，制成菌悬液。挑取 100mg菌丝球液氮研磨3次，按照真菌基因组试剂盒法提取DNA，采用真菌通用引物 ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)进行 PCR扩增，PCR产物由睿博兴科生物技术有限公司纯化后测序。将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，在GenBank数据库中同源性比较，选择同源性较高的菌株序列，利用MEGA7.0 软件构建系统发育树。
生物学鉴定结合形态学特征将三种病原菌鉴定为隐秘刺盘孢菌(Colletotrichumaenigma)、匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)。
实施例2
拮抗菌的分离、筛选与鉴定
2.1细菌的分离
取30颗健康“美早”樱桃整果研磨粉碎，称取1.0g果肉加入9mL无菌水中，混匀配成原液，静置20min。采用梯度稀释法，得到四个稀释梯度的溶液，分别是原液、10-1、10-2、10-3；分别取100μL涂布于LB培养基中，每个梯度设3个平行，37℃恒温培养24h。将生长出的菌落接种至另一LB培养基上进行三区划线，37℃恒温培养，直至长出单菌落。将单菌落挑取至LB斜面，待菌落长出后置于4℃保藏。
2.1细菌的DNA鉴定
根据细菌基因组DNA试剂盒法提取细菌DNA，PCR扩增序列并测序，根据MEGA软件建树，分析得到菌株的系统发育树，分析鉴定出多种细菌，其中弯曲芽孢杆菌TA-12的系统发育树见图7中的12。
2.2弯曲芽孢杆菌TA-12的抑菌实验
利用平板对峙法测定弯曲芽孢杆菌TA-12抑菌作用，在PDA平板的中心点接病原菌，在平板中心的一侧点接浓度为1×109CFU/mL的弯曲芽孢杆菌TA-12发酵液，28℃恒温培养，过程平板菌落的变化情况；弯曲芽孢杆菌TA-12抑制隐秘刺盘孢菌(Colletotrichumaenigma) 的实验平板照片见图8；抑制匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)的实验平板照片见图9；抑制塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)的实验平板照片见图10；弯曲芽孢杆菌TA-12对所述三种病原菌的抑制作用都产生的明显的透明圈，对隐秘刺盘孢菌(Colletotrichum aenigma)的抑制作用最佳。
上述抑菌实验中点接的弯曲芽孢杆菌TA-12发酵液的培养方法，包括如下步骤：
LB培养基制备：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，1000mL去离子水煮沸，调pH 7.0(亦可直接购买LB培养基)，250mL锥形瓶每瓶50mL LB培养基，8层纱布封口，121℃灭菌20min。
种子液制备：将活化好的菌株用接种环接种到灭菌LB培养基中，置于37℃、180r/min 的恒温摇床荡培养24h，制得种子液。
发酵液制备：将摇好的种子液接种于灭菌LB培养基中，每瓶接种1mL(利用灭菌的1mL 枪头)，置于37℃、180r/min的恒温摇床荡培养24h，制得弯曲芽孢杆菌TA-12发酵液。
实施例3
弯曲芽孢杆菌TA-12菌种的生长曲线
将菌株的活化液分别接种在LB液体培养基中，37℃、150r/min摇床培养。并接种后0 h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、24h、26h时取样检测，以未接种菌种的空白LB液体培养基作为空白对照，取菌液于1cm比色皿利用分光光度计测定 600nm处的吸光度，3个平行，绘制出菌株的生长曲线见图11，由图11可以得出弯曲芽孢杆菌TA-12在12h时进入平稳期，并在12h OD值最高。
Claims (4)
1.一种弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)，于2020年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCC No.21107。
2.权利要求1所述弯曲芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
挑取活化好的弯曲芽孢杆菌，于LB培养基中培养种子液，将种子液接种于LB培养基中发酵培养。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述培养种子液和发酵培养的条件为：35～40℃下150～200r/min发酵培养。
4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，在37℃下180r/min发酵培养。
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