CN103333828B - 一种抗霉菌芽孢杆菌菌株及其抗菌产物在玉米储藏中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗霉菌芽孢杆菌菌株：枯草芽孢杆菌LPL-NM45，其保藏号为CGMCC No.7762。本发明还提供了一种提取枯草芽孢杆菌LPL-NM45抗菌产物的方法。本发明所述枯草芽孢杆菌LPL-NM45及其抗菌产物对储粮（尤其是玉米）霉菌的生长及孢子的萌发有强烈的抑制作用，在相同喷洒剂量下，较粮食中使用的常规化学防腐剂能更有效地抑制高水分玉米储藏过程的霉菌生长，保障粮食安全，具有作为粮食防霉剂应用的良好前景。

Description

一种抗霉菌芽孢杆菌菌株及其抗菌产物在玉米储藏中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抗霉菌芽孢杆菌菌株、菌株产生的抗菌产物对霉菌生长和孢子萌发的抑制作用及其在玉米储藏中的防霉应用。

背景技术

芽孢杆菌在自然界中广泛存在，是一种嗜热好氧并产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，能产生多种抑菌物质和酶类，具有较强的防霉抗病作用，而且极易分离培养，是目前主要抗菌蛋白生产菌之一。

芽孢杆菌产生抗菌物质的途径分为核糖体和非核糖体合成两种。核糖体途径产生的抑菌物质包括细菌素、类细菌素、酶类和活性蛋白类。非核糖体途径产生的抑菌物质包括脂肽类和多肽类。芽孢杆菌产生的抗菌物质主要通过溶解细胞壁或细胞膜，造成原生质泄漏使菌丝断裂或畸形来抑制霉菌生长，同时抑制孢子萌发。

芽孢杆菌抑菌物质已被广泛应用于小麦、玉米、棉花的植物病害防治当中，但在粮食防霉方面的应用探索极少。目前，生物防腐剂已逐步代替化学防腐剂广泛用在肉类、果蔬等加工食品中。刘倩（刘倩.大米大帐气调保鲜技术的研究：[硕士学位论文].天津：天津科技大学，2009）将生物抑菌剂用于大米贮藏上能够减缓大米的陈化速度。陈伟畅（陈伟畅.大米天然防霉剂的研究：[硕士学位论文].无锡：江南大学，2008）利用天然生姜提取物替代传统化学防霉剂双乙酸钠用于大米的防霉，保鲜效果明显。但生物防腐剂应用于粮食防霉的报道依然相对较少。

目前，对于玉米的储藏还主要是通过控制环境因素来抑制微生物的生长。迄今仍没有芽孢杆菌抗菌产物用于玉米防霉的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗霉菌芽孢杆菌菌株，其抗菌产物可在玉米储藏过程中发挥防霉作用。

本发明的抗霉菌芽孢杆菌菌株：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）LPL-NM45，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2013年6月19日，保藏号CGMCC No.7762。

本发明还提供了所述抗霉菌芽孢杆菌的筛选方法，其包括如下步骤：

（1）用LB培养基从不同样品中分离芽孢杆菌；

（2）用平板对峙法从步骤（1）分离的芽孢杆菌中初步筛选出抗霉菌芽孢杆菌菌株；

（3）对步骤（2）筛选得到的芽孢杆菌的发酵液进行抑菌性测定，进一步筛选出抗霉菌效果最好的芽孢杆菌菌株；

（4）对步骤（3）筛选得到的芽孢杆菌进行形态学、生理生化、16S rRNA分子生物学分析鉴定。

步骤（1）中，为保证所得菌株的多样性及安全性，所以尽量考虑从相对安全、且可能具有较多芽孢杆菌的食品及生物环境中选取样品。所述样品可为新疆烤馕、浓汤宝、猕猴桃、午餐肉、土壤、鸭血、茉莉花茶、养乐多、柠檬、绿茶、咸鸭蛋、红枣干、大曲曲心、大曲曲表、豆腐乳、辣椒酱、橄榄菜、白菜、桃花瓣、蜂蜜、花生糖、东北香肠、纳豆、酱油、葡萄、海滩沙子、荔枝等。

具体地，步骤（1）为取25g用无菌研钵研碎的固体样品或取25mL液体样品，加入到225mL无菌生理盐水中，充分震荡，得到样液，75℃-85℃水浴10-20min，样液用无菌生理盐水梯度稀释10-1000倍后吸取0.1mL涂布LB平板，37℃培养36-48小时，挑取单菌落，划线纯化，对已纯化菌株经革兰氏染色后镜检，确认产生芽孢后LB斜面保存，待用。

优选地，步骤（1）中80℃水浴10min。

步骤（2）中，处理组为在PDA平板中央接种直径5mm的霉菌菌饼，用灭菌竹签挑取步骤（1）中芽孢杆菌点种在距PDA平板中心25mm处，37℃培养8h后，28℃下培养3d，观察拮抗作用并测量菌落大小；以单独接种霉菌菌柄的平板作为对照组，按下列公式计算抑菌率，从步骤（1）分离的芽孢杆菌中初步筛选出抗霉菌芽孢杆菌菌株。

抑菌率(%)=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100%。

所述霉菌为玉米霉菌黑曲霉(Aspergillus niger)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)。

步骤（3）中，将步骤（2）筛选得到的抗霉菌芽孢杆菌分别接种于装有30mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，37℃下140rpm培养48h，发酵液经10000rpm离心12min取得发酵上清液，采用杯碟法测定各菌株发酵上清液的抑菌活性。

处理组为将直径5mm的霉菌菌饼放置于PDA平板中央，牛津杯放置在距PDA平板中心25mm处，每个牛津杯中加入0.1mL发酵上清液及20μL质量浓度为1%的氯霉素，超净工作台中放置30min吹干，28℃培养72h后测量霉菌菌落大小并计算抑菌率，以未接种芽孢杆菌的培养基上清液作为空白对照组，每处理三个重复。

抑菌率(%)=（空白对照组菌落直径-处理组菌落直径）/空白对照组菌落直径×100%。

步骤（4）中，16S rRNA的分子生物学鉴定的方法为：

1）提取步骤（3）筛选得到的芽孢杆菌的基因组DNA；

2）以基因组DNA为模板，采用通用引物：

上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;

下游引物：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’

进行PCR扩增反应。25μL PCR反应体系包括模板DNA1μL，上下引物(10μmol/L)各1μL，2×Taq PCR Master Mix，用ddH₂O补足至25μL。反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，47℃引物复性1min、72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。

3）将PCR产物进行电泳检测并测序，在NCBI中比对分析所述芽孢杆菌的同源性，对其进行分类。

本发明所述枯草芽孢杆菌LPL-NM45是采用LB培养基从市售柠檬中分离得到的：在LB培养基中培养24h后，本发明筛选得到的菌株LPL-NM45菌落形态规则，菌落表面褶皱，边缘整齐，不透明，湿粘。菌体细长杆状，芽孢形状为椭圆形，膨大，近端生。经形态学、生理生化、16S rRNA分子生物学分析鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌LPL-NM45。

本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌LPL-NM45的抗菌产物。

本发明还提供了一种提取枯草芽孢杆菌LPL-NM45抗菌产物的方法，所述方法为：将枯草芽孢杆菌LPL-NM45接种于LB液体培养基中，37℃下140rpm培养48h，得到发酵液，发酵液经10000rpm离心12min取得发酵上清液，向发酵上清液中加入硫酸铵固体粉末至饱和度为65%，4℃，200rmp搅拌1h后，4℃过夜，10000rpm离心12min，弃上清，沉淀复溶于发酵液体积1/10的磷酸盐缓冲液(25mM pH7.0)中，3.5kDa透析袋透析，将透析液冷冻干燥，备用。

所述磷酸盐缓冲液(20mM pH7.0)的配制方法为：磷酸氢二钠4.94g，磷酸二氢钠0.97g，1000mL水。

所述透析的方法为：将上述盐析后粗蛋白（复溶后的磷酸盐缓冲液）装入3500Da透析袋，4℃下透析48h，期间更换磷酸盐缓冲液（20mM pH7.0）4-5次，以除去杂蛋白。

所述提取枯草芽孢杆菌LPL-NM45抗菌产物的方法中，透析结束后定性测定分析透析袋中溶液的抗菌活性。

本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌LPL-NM45及其抗菌产物在玉米储藏中的防霉应用。

本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌LPL-NM45在抑制玉米霉菌中的应用。

本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌LPL-NM45的抗菌产物在抑制玉米霉菌中的应用。

枯草芽孢杆菌LPL-NM45产生的抗菌产物按0.1%～0.3%质量比（w/w）的含量喷洒于玉米表面，优选为0.3%质量比（w/w），可以有效地抑制高水分玉米储藏过程的霉菌生长，保障粮食安全。

所述枯草芽孢杆菌LPL-NM45及其抗菌产物具有较高的抑菌活性，对三株受试玉米霉菌黑曲霉(Aspergillus niger)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)具有抑制作用。

本发明还提供了枯草芽孢杆菌LPL-NM45的抗菌产物在制备粮食防霉剂中的应用。所述粮食优选为玉米。

本发明的枯草芽孢杆菌LPL-NM45及其抗菌产物具有如下有益效果：

枯草芽孢杆菌LPL-NM45及其抗菌产物对储粮（尤其是玉米）霉菌的生长及孢子的萌发有强烈的抑制作用，在相同喷洒剂量下，较粮食中使用的常规化学防腐剂能更有效地抑制高水分玉米储藏过程的霉菌生长，保障粮食安全，具有作为粮食防霉剂应用的良好前景。本发明将为新型天然粮食防霉剂的开发应用提供技术支持，保障和提高粮食品质。

附图说明

图1为芽孢杆菌LPL-NM45的上清发酵液对黑曲霉的抑菌效果图；其中，CK为对照。

图2为芽孢杆菌LPL-NM45的上清发酵液对串珠镰刀菌的抑菌效果图；其中，CK为对照。

图3为芽孢杆菌LPL-NM45的上清发酵液对草酸青霉的抑菌效果图；其中，CK为对照。

图4为枯草芽孢杆菌LPL-NM45的菌落形态图；

图5为枯草芽孢杆菌LPL-NM45的显微观察图；

图6为枯草芽孢杆菌LPL-NM45所在的系统发育树；其中，Bacillus pumilus EF178456为短小芽孢杆菌EF178456；Bacilluspolyfermenticus DQ659145为一种新型芽孢杆菌；Bacillus licheniformisAY94753为地衣芽孢杆菌AY94753；Bacillus amyloliquefaciensGQ903336为解淀粉芽孢杆菌GQ903336；Bacillus subtilis EU346662为枯草芽孢杆菌EU346662；Bacillus sonorensis HM191249为一种新型芽孢杆菌；Bacillus alcalophilus FJ937916为嗜碱芽孢杆菌FJ937916；Bacillus thuringiensis HM770098为苏云金芽孢杆菌HM770098；Bacillus cereus HM636917为蜡样芽孢杆菌HM636917；Bacillus firmusFJ950623为坚强芽孢杆菌FJ950623；Bacillus megaterium HM480350为巨大芽孢杆菌HM480350；Bacillus circulans EU373365为环状芽孢杆菌EU373365；Bacillus coagulans HM538423为凝结芽孢杆菌HM538423。

图7为储藏过程中玉米霉菌总数的变化图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

如未特别指明，本发明所述浓度均为质量浓度。

样品玉米采集于延庆粮库；

黑曲霉、草酸青霉、串珠镰刀菌从玉米样品中分离得到。

蛋白胨、氯化钠、酵母膏、硫酸铵、双乙酸钠、山梨酸钾等试剂购于北京蓝弋化工产品有限责任公司；

TIANamp Bacteria DNA kit购于天根生化科技（北京）有限公司。

实施例1抗霉菌枯草芽孢杆菌LPL-NM45的筛选

1、黑曲霉、草酸青霉、串珠镰刀菌分离

从玉米样品中分离黑曲霉、草酸青霉、串珠镰刀菌。分离方法：称取25g玉米样品，加入到225mL灭菌生理盐水中，充分振荡，配成孢子悬浮液，用无菌生理盐水梯度稀释10-1000倍后吸取0.1mL到培养皿中，然后倒入冷却到45℃的PDA培养基，28℃下培养3-5d，挑取单菌落平板划线纯化，并进行鉴定，分离出黑曲霉、草酸青霉、串珠镰刀菌。

2、用LB培养基从不同样品中分离芽孢杆菌

为保证所得菌株的多样性及安全性，所以尽量考虑从相对安全、且可能具有较多芽孢杆菌的食品及生物环境中选取样品。所述样品为新疆烤馕、浓汤宝、猕猴桃、午餐肉、土壤、鸭血、茉莉花茶、养乐多、柠檬、绿茶、咸鸭蛋、红枣干、大曲曲心、大曲曲表、豆腐乳、辣椒酱、橄榄菜、白菜、桃花瓣、蜂蜜、花生糖、东北香肠、纳豆、酱油、葡萄、海滩沙子、荔枝等。

取25g用无菌研钵研碎的上述固体样品或取25mL上述液体样品，加入到225mL无菌生理盐水中，充分震荡，得到样液，80℃水浴10min，样液用无菌生理盐水梯度稀释10-1000倍后吸取0.1mL涂布LB平板，37℃培养36-48小时，挑取单菌落，划线纯化，对已纯化菌株经革兰氏染色后镜检，确认产生芽孢后LB斜面保存，待用。

结果：从上述27种不同的样品中分离得到98株芽孢杆菌。具体结果见表1。

表1芽孢杆菌的来源及数量

3、平板对峙法初步筛选抗霉菌芽孢杆菌

处理组为在PDA平板中央接种直径5mm的霉菌菌饼。用灭菌竹签从LB斜面上挑取上述受试芽孢杆菌点种在距PDA平板中心25mm处，37℃培养8h后，28℃下培养3d，观察拮抗作用是否存在，并测量菌落大小。以单独接种霉菌菌饼的平板作为对照组，按下列公式计算抑菌率：

抑菌率(%)=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径×100%

利用平板对峙法从上述98株菌种筛选出10株对三种霉菌（玉米黑曲霉、草酸青霉、串珠镰刀菌）都有抑制效果的菌株，结果详见表2。

表2芽孢杆菌对霉菌的抑制作用

4、芽孢杆菌发酵液的抑菌性测定

用杯碟法进一步对初筛得到的10株抗霉菌芽孢杆菌的发酵液进行抑菌性测定。将初筛得到的10株抗霉菌芽孢杆菌分别接种于装有30mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，置于恒温振荡器中，37℃下140rpm培养48h。发酵液经10000rpm离心12min取得发酵上清液，采用杯碟法测定各菌株发酵上清液的抑菌活性。

处理组为将直径5mm的霉菌菌饼放置于PDA平板中央，牛津杯放置在距PDA平板中心25mm处。每个牛津杯中加入0.1mL发酵上清液及质量浓度为1%的氯霉素20μL，超净工作台中放置30min左右吹干，28℃培养72h后测量霉菌菌落大小并计算抑菌率，以未接种芽孢杆菌的培养基上清液作为空白对照组，每处理三个重复。

抑菌率(%)=（空白对照组菌落直径-处理组菌落直径）/空白对照组菌落直径×100%

结果发现，芽孢杆菌LPL-NM45的上清发酵液对三种霉菌都有良好的抑菌效果，对黑曲霉、串珠镰刀菌、草酸青霉的抑菌率分别能达到53.2%、60.5%、63.7%。

芽孢杆菌LPL-NM45的上清发酵液对黑曲霉的抑菌效果图如图1所示，芽孢杆菌LPL-NM45的上清发酵液对串珠镰刀菌的抑菌效果图如图2所示，芽孢杆菌LPL-NM45的上清发酵液对草酸青霉的抑菌效果图如图3所示。

实施例2产抑菌物质芽孢杆菌LPL-NM45的鉴定

1、形态学鉴定

挑取少量的目标菌株芽孢杆菌LPL-NM45在LB平板上划线，28℃培养20h，观察单菌落形态、形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色等，继续培养至24h及48h后镜检，记录菌体形态。

在LB培养基中培养24h后，菌株LPL-NM45菌落形态规则，菌落表面褶皱，边缘整齐，不透明，湿粘，如图4所示。显微镜下，细长杆状，芽孢形状为椭圆形，膨大，近端生，如图5所示。

2、生理生化鉴定

参照《常见细菌系统鉴定手册》，对菌株进行各项生理生化试验，包括：淀粉水解、卵磷脂降解、接触酶、酪氨酸水解、Tween80降解、海藻酸钠降解、柠檬酸盐利用、明胶水解、酵母细胞溶解、V-P试验、甲基红试验、耐盐性试验、丙酸利用、唯一碳源利用试验。

表3菌株LPL-NM45生理生化鉴定结果

菌株LPL-NM45的生理生化鉴定果见表3。根据《常见细菌系统鉴定手册》，推测菌株LPL-NM45为枯草芽孢杆菌。

3、16S rRNA的分子生物学鉴定

（1）DNA提取

采用TIANamp Bacteria DNA kit试剂盒提取菌株LPL-NM45的基因组DNA。

（2）PCR反应扩增及测序

以菌株LPL-NM45的基因组DNA为模板，采用通用引物：

上游引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;

下游引物：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’

进行PCR扩增反应。25μL PCR反应体系包括模板DNA1μL，上下引物(10μmol/L)各1μL，2×Taq PCR Master Mix，用ddH₂O补足至25μL。反应程序为：94℃变性5min；94℃变性30s，47℃引物复性1min、72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。所得PCR产物用琼脂糖凝胶电泳在标准条件下进行检测后送至北京博迈德生物有限公司测序，测序结果经处理后到GenBank中比对。

（3）系统发育树的构建

将测序结果在NCBI中比对初步确定种，从GenBank中获得各已知芽孢杆菌的标准序列，使用Readseqn软件对齐序列，采用MEGA5.01计算序列相似性并作系统发育分析。

将测得的菌株LPL-NM45的序列在Genbank上进行序列同源性比较，使用MEGA5.01软件建立系统发育树，如图6所示。从系统发育树中可知菌株LPL-NM45与枯草芽孢杆菌处于同一发育水平上，亲缘关系最近，这与生理生化鉴定结果一致，由此可进一步说明，菌株LPL-NM45属于枯草芽孢杆菌。

所述抗霉菌芽孢杆菌菌株：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）LPL-NM45，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2013年6月19日，保藏号CGMCC No.7762。

实施例3枯草芽孢杆菌LPL-NM45的抗菌产物对高水分玉米贮藏过程中霉菌的控制作用

1、枯草芽孢杆菌LPL-NM45的抗菌产物对玉米霉菌及其孢子的抑制作用和效果

1.1枯草芽孢杆菌LPL-NM45的抗菌产物的提取

将枯草芽孢杆菌LPL-NM45接种于LB液体培养基中，37℃下140rpm培养48h，得到发酵液，发酵液经10000rpm离心12min取得发酵上清液，向发酵上清液中加入硫酸铵固体粉末至饱和度为65%，4℃，200rmp搅拌1h后，放置4℃冰箱中过夜，10000rpm离心12min，弃上清，沉淀复溶于发酵液体积1/10的磷酸盐缓冲液(25mM pH7.0)中，3.5kDa透析袋透析，透析结束后定性测定分析透析袋中溶液的抗菌活性，然后将透析液冷冻干燥，备用。

所述磷酸盐缓冲液(20mM pH7.0)的配制方法为：磷酸氢二钠4.94g，磷酸二氢钠0.97g，1000mL水。

所述透析的方法为：将上述盐析后粗蛋白（复溶后的磷酸盐缓冲液）装入3500Da透析袋，4℃下透析48h，期间更换磷酸盐缓冲液（20mM pH7.0）4-5次，以除去杂蛋白。

1.2抗菌产物对霉菌生长的影响

处理组为向100mL含有不同浓度(20、60、100μg/mL)抗菌产物的PDB培养基中接种1mL串珠镰刀菌孢子悬浮液(10⁴个/mL)，28℃下振荡培养5d，过滤收集菌丝，烘干称重。空白对照组培养基中不加入抗菌产物。按下列公式计算抑菌率：

抑菌率(%)=（空白对照组菌丝直径-处理组菌丝直径）/空白对照组菌丝直径×100%

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDB)：马铃薯去皮切块，称取200g，加入1000mL蒸馏水，煮沸30min，纱布过滤，加入葡萄糖20g，加蒸馏水补至1000mL，煮沸，121℃下灭菌20min。

不同浓度抗菌产物对霉菌菌丝生长的影响结果如表4所示。

表4不同浓度抗菌产物对霉菌菌丝生长的影响

如表4所示，枯草芽孢杆菌LPL-NM45产生的抗菌产物可以抑制霉菌菌丝的生长。20μg/mL的抑菌浓度即可对霉菌生长产生影响，60μg/mL的抑菌浓度对霉菌的抑制率超过50%，当抗菌产物浓度为100μg/mL时对霉菌的抑制率可达到73.09%。

1.3抗菌产物对霉菌孢子萌发的影响

抗菌产物对串珠镰刀菌孢子萌发的影响试验在凹形载玻片上进行，在凹槽中分别加入90μL含有抗菌产物的PDB培养液，然后加入10μL霉菌孢子悬浮液(10⁴个/mL)。抗菌产物的最终浓度分别为20、60、100μg/mL，空白对照不加入抗菌产物。将载玻片放在28℃下培养，每隔一定时间用显微镜观察，测定孢子萌发率。不同浓度抗菌产物对霉菌孢子萌发的影响如表5所示。

表5不同浓度抗菌产物对霉菌孢子萌发的影响

如表5所示，经抗菌产物处理后，霉菌孢子的萌发发生延滞。对照组在10h时霉菌孢子几乎全部萌发。随着抗菌产物浓度的增大，霉菌孢子萌发的延滞效应越来越显著。24h时，抑菌浓度为100μg/mL的处理组孢子萌发率仍不到70%，同时也表明该抗菌产物仅能延缓孢子的萌发，并不能杀死霉菌孢子。但在孢子萌发后发现经抗菌产物处理的孢子液中出现类似胞质物质的颗粒，这说明抗菌产物对霉菌的抑制更有可能是在孢子萌发后完成的。

2、生物防霉与常用化学防霉手段在日粮储藏中防治效果的比较

设置处理组和空白对照组。其中，各处理组分别采用枯草芽孢杆菌LPL-NM45产生的抗菌产物以及化学防腐剂双乙酸钠、山梨酸钾按0.3%质量比（w/w）的含量喷洒于玉米表面后储藏，空白对照组为采用同体积不加入抗菌产物或化学防腐剂的无菌水调节玉米水分。储藏过程中玉米（含水量16%）霉菌总数的变化如图7所示。

由图7可知，储藏前期霉菌污染并不严重，各处理组与空白对照组的霉菌总数均小于10³个/g，但随着储藏时间的延长，空白对照组以及山梨酸钾处理组中霉菌大量繁殖，在30d时霉菌总数都已远超过10⁵个/g，并出现肉眼可见的霉变特征，双乙酸钠处理组的霉菌总数低于空白对照组，但在储藏30d时也已达到10⁵个/g，而添加有枯草芽孢杆菌LPL-NM45产生的抗菌产物的处理组霉菌总数基本无变化，储藏期间内并未出现明显霉变，说明枯草芽孢杆菌LPL-NM45产生的抗菌产物较粮食中使用的常规化学防腐剂能更有效地抑制高水分玉米储藏过程的霉菌生长，保障粮食安全。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种抗霉菌芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述菌株为枯草芽孢杆菌LPL-NM45，其保藏号为CGMCC No.7762。

2.一种提取权利要求1所述枯草芽孢杆菌LPL-NM45抗菌产物的方法，其特征在于，所述方法为：将枯草芽孢杆菌LPL-NM45接种于LB液体培养基中，37℃下140rpm培养48h，得到发酵液，发酵液经10000rpm离心12min取得发酵上清液，向发酵上清液中加入硫酸铵固体粉末至饱和度为65％，4℃，200rmp搅拌1h后，4℃过夜，10000rpm离心12min，弃上清，沉淀复溶于发酵液体积1/10的磷酸盐缓冲液中，3.5kDa透析袋透析，将透析液冷冻干燥。

3.权利要求1所述抗霉菌芽孢杆菌菌株在玉米储藏中抑制黑曲霉、串珠镰刀菌、草酸青霉中的应用。