CN111718881B - 一种暹罗芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种暹罗芽孢杆菌及其应用。所述暹罗芽孢杆菌为Bacillus siamensis LRM10‑3D，于2019年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019848。所述菌株抑菌能力强，对肠道常见致病菌具有较强的抑制活性，尤其对致泻大肠埃希氏菌具有显著的抑制作用；并且所述菌株在经紫外线、高温、弱酸以及金属离子干扰处理后，仍具有较强的抑菌活性。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种暹罗芽孢杆菌及其应用。
技术背景
内生菌是指在其生活过程的部分阶段或全部阶段生活在健康宿主植物的组织，器官或细胞间隙内且不会导致该植物体出现明显受感染症状的一类微生物群体，是一类生长于活体植物组织中的特殊微生物，在植物中普遍存在。植物体和其体内的内生菌的协同同化关系使得内生菌能够产生一些具有独特作用(例如，抗肿瘤，抗菌，抗氧化等)的活性物质，这些活性物质的作用与其寄主植物中的某些物质作用相同或相似而被称为植物源活性成分。因此从内生菌中筛选活性高的菌株为寻找新型生物活性物质及开发具有应用功能的微生物菌剂开辟了一条新的道路。
目前已经从植物中分离获得的内生菌种类众多，其中文献(黄精内生菌枯草芽胞杆菌HJ-2的抑菌活性研究，《农业生物科技学报》，翟大才等，2019,27(09),1664-1672)公开了一种黄精内生菌枯草芽胞杆菌HJ-2，该菌株对大肠杆菌具有一定的抑制作用；专利CN101225430A公开了从川黄檗茎(PE-S11)和金荞麦根(FE-R9)中分离获得的内生真菌对大肠杆菌具有一定的抑制作用，但是，上述内生菌均只对大肠杆菌由一定的抑制作用，且抑菌效果一般，酸碱稳定性差。
而暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)是2010年报道的一个新种，首次分离自泰国腌制的螃蟹中。截至目前属于该种的菌株报道仍然不多，据报道，暹罗芽孢杆菌模式菌株KCTC13613T能抑制立枯丝核菌和藤黄微球菌(J Bacteriol 2012,194(15):4148-4149)；暹罗芽孢杆菌L13的发酵液制备微生物海藻肥，具有对烟草花叶病病毒的消毒作用以及绿豆的促生长作用(CN201310165929.5)；暹罗芽孢杆菌LYLB4能防治梨轮纹病和软腐病(CN201610048328.X)；暹罗芽孢杆菌FC12-05能拮抗番茄疫霉根腐病菌(西北农林科技大学学报2012,40:107-114)；或者暹罗芽孢杆菌与其他芽孢杆菌复合制成微生物复合肥制剂(CN201610718598.7)。但是暹罗芽孢杆菌对其他作物和病菌的防治和促生作用仍需不断发掘。
黑果枸杞(Lyciumruthenicum Murr.)是一种茄科，枸杞属的多年生灌木，主要分布在我国西北地区的新疆，宁夏，西藏等地，除此外在中亚、高加索和欧洲等地区也有分布。黑果枸杞在不同地区的名字也有所不同，例如在内蒙古地区的名字为“乔诺英—哈尔马格”，而在西藏的藏医口中则被称为“旁玛”，而据藏医学的经典《晶珠本草》记载，旁玛味甘，性平，具有明目养肝、益精补肾，清心热等功效。黑果枸杞一经发现就因其丰富多样的有效成分和极高的营养价值而受到人们的追捧。除了以上医学经典中的记载的功效外，现代医学的研究表明，黑果枸杞作为药品对于老年人常见的心脏病，高血压以及女性月经不调，牙龈出血等疾病都有较好的治疗效果。因此，以黑果枸杞为分离源，进行内生细菌的分离并鉴定分离菌株，对于挖掘新的微生物菌种资源应用于新型复合微生物菌剂的开发具有重要意义。
本发明从黑果枸杞中分离获得了一种暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D，该菌株的发酵液对食源性致病菌具有较好的抑菌效果，尤其对于致泻大肠埃希氏菌具有较好的抑菌效果，并且该菌株的抑菌活性具有一定的高温稳定性、紫外稳定性、酸碱稳定性，且基本不受金属的干扰，为新型抗菌物质的开发提供了一条新途径。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种暹罗芽孢杆菌Bacillussiamensis LRM10-3D，所述暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D于2019年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019848；于2019年11月6日鉴定状态为存活；保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，邮编为430072，联系电话为(027)68754052。
本发明的另一目的在于提供一种暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D用于生产抑制肠道致病菌药物的应用。
优选地，所述肠道致病菌包括致泻大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、血清型肠炎沙门氏菌、英诺克李斯特菌、金黄色葡萄球菌。
本发明的另一目的在于提供一种暹罗芽孢杆菌发酵液的制备方法，所述方法为：将暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D接种于PDB培养基中，37℃培养4-72h，离心，收集上清液，即得。
本发明的另一目的在于提供一种上述方法制备获得的暹罗芽孢杆菌发酵液。
本发明的另一目的在于提供一种暹罗芽孢杆菌发酵液在制备抑制肠道致病菌药物中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种暹罗芽孢杆菌发酵液在制备抑制肠道致病菌药物组合物中的应用。
优选地，所述肠道致病菌包括致泻大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、血清型肠炎沙门氏菌、英诺克李斯特菌、金黄色葡萄球菌。
本发明的有益效果是：
①本发明提供的暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D具有一定的抑菌活性，对致泻大肠埃希氏菌、出血性大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、血清型肠炎沙门氏菌、英诺克李斯特菌、金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用；
②本发明提供的暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D对致泻大肠埃希氏菌具较好的抑菌活性，抑菌圈高达22mm(不包括牛津杯的直径)；
③本发明提供的暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的热稳定性良好，在90℃处理3h后仍具有一定的抑菌活性；
④本发明提供的暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的紫外稳定性良好，在紫外灯下连续照射8h后仍具有一定的抑菌活性；
⑤本发明提供的暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的酸碱稳定性良好，在pH2-10的酸性或碱性环境下仍具有较强的抑菌活性；
⑥本发明提供的暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的抑菌活性不受金属离子的干扰，在金属离子的干扰下，仍具有较强的抑菌活性。
附图说明
图1黑果枸杞内生菌抑菌活性筛选结果；
图2暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D系统发育树；
图3暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的生长曲线；
图4暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的发酵液抑菌活性变化趋势；
图5暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的紫外稳定性；
图6暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的pH稳定性；
图7暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D发酵液薄层层析图；
图8薄层层析条带的牛津杯抑菌效果图；
图9暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D碳源优化图；
图10暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D氮源优化图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。
在本发明的下述实施例中所用菌株来源如下：
实验菌株：暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D，于2019年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019848；于2019年11月6日鉴定状态为存活，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，邮编430072，联系电话为(027)68754052。
肠道致病性大肠埃希氏菌Escherichia coli(EPEC)O127:K63(CICC 10411)、出血性大肠埃希氏菌E.coli(EHEC)O157:H7(CICC 21530)、肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhimurium(CICC 10420)、单核细胞增生李斯特氏菌Listeria monocytogenes(CGMCC 1.9136)、肠沙门氏菌肠亚种Salmonellaenterica subsp.Enterica(CGMCC 1.10754)、英诺克李斯特菌(CGMCC1.2990)和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus(CICC 21600)均购自中国工业微生物菌种保存管理中心。
PDB培养基：即马铃薯葡萄糖培养液(PDB)，马铃薯200g/L、蔗糖(葡萄糖)20g/L，蒸馏水1000mL，pH自然。
其他实验材料和仪器如无特殊说明，均可通过商业途径购买。
实施例1暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的分离鉴定
1.1内生菌的分离纯化
样品采集：以从新疆呼图壁县采集的野生黑果枸杞为样品，将新收集黑果枸杞的茎，叶子，根，果实用干净的保鲜袋装好，回实验室后用自来水冲洗洁净并用无菌的剪刀剪成2～3cm大小的小段，放入无菌广口瓶中；
消毒处理：先用无菌水轻轻冲洗2次，冲洗过后用75％乙醇溶液进行消毒，再用无菌水轻轻冲洗植物样品3次，之后用2％的次氯酸钠溶液进行消毒，最后用无菌水轻洗4次；
分离：在超净工作台上将上述消毒好的黑果枸杞的根，茎，叶子和果实等用无菌镊子放入到无菌的培养皿中，将黑果枸杞的根部和茎部用无菌剪刀将两端和韧皮部剪去，将其表皮轻轻剥离，并用无菌手术刀竖向切取其中间部位用无菌剪刀裁剪成50mm×50mm大小；黑果枸杞的果实用无菌镊子夹破之后，将其表皮和籽剥离分开备用；黑果枸杞的叶子用无菌手术刀竖向切取其中间部位用无菌剪刀裁剪成50mm×50mm大小；将上述处理好的各部位材料分别放入到配好的细菌和真菌的分离培养基中进行培养(培养条件细菌37℃，真菌28℃)并做好标记，将上述表面消毒过的黑果枸杞的各部位样品用无菌镊子在上述培养基中反复涂布2-3min，用移液枪吸取150μL最后一次冲洗材料的冲洗液，用无菌棉签或涂布棒均匀的涂布到两种培养基上，放入恒温培养箱中培养，检测是否有菌生长(培养条件同上)；
纯化：对于上述放入恒温培养箱中的分离培养基，每天观察两次。若发现有真菌菌丝或细菌从中长出要及时用灭菌的接种针或接种环轻轻挑取外观特征不同的细菌菌落或真菌菌丝并转移到新配好的细菌或真菌分离培养基上，做好编号，分离出的菌也要每天观察1-2次，若发现有新菌长出要及时分离，直到纯化完全。通过以上的分离纯化实验最终从野生黑果枸杞中分离出29株内生菌，将内生菌放于甘油保藏管中，于-20℃冰箱保存。
通过以上的分离纯化实验最终从野生黑果枸杞中分离出29株内生菌，其中内生细菌18株：HNX-1，HNX-2，HNX-3，HNX-4，HNX-5，HNX-6,HNX-7,HNX-8，HNX-9，HNX-10，HNX-11，HNX-12，HNX-13，HNX-14，HNX-15，HNX-16，HNX-17，HNX-18；内生真菌11株：HNZ-1，HNZ-2，HNZ-3，HNZ-4，HNZ-5，HNZ-6，HNZ-7，HNZ-8，HNZ-9，HNZ-10，HNZ-11。
1.2产抑菌活性物质内生菌的筛选：
目标指示菌的活化：将装有内生菌的甘油保藏管从-20℃冰箱保取出，放于室温的无菌环境下解冻，用无菌枪头从甘油保藏管中吸取50μL菌液于新配置的LB固体培养基上，用无菌接种针划线，菌落长出后，挑选一株健康菌落用接种环轻轻挑起接种到预先配置的LB液体培养基，放入37℃的摇床中过夜培养，摇床转速180r。
琼脂扩散法检测黑果枸杞内生菌抑菌活性：将实验用牛津杯(90个)，镊子，培养皿等进行灭菌；以致泻大肠埃希氏菌CICC10411为目标指示菌，将致泻大肠埃希氏菌CICC10411培养至对数期，调整其菌体浓度为108CFU/mL，找到相应的稀释倍数；每个培养皿放置4个牛津杯，以备后续实验使用；按菌液与培养基比例1：100将稀释好的致泻大肠埃希氏菌菌液加入到培养基中，充分混合，使得培养基中菌体浓度为106CFU/mL，然后将混合好的混合培养基倒入加有牛津杯的培养皿中，每个培养皿加15-20mL的混合培养基；待平板凝固后，用无菌镊子将培养皿中的牛津杯依次取出，分别准确吸取180μL上述内生菌的发酵液加入到三个牛津杯孔中，并将相同体积的无菌水加入到剩余的一个孔中，做空白对照；加样结束后，放入4℃冰箱中扩散2-3h(让处理液充分扩散到琼脂上)，然后取出放入37℃恒温培养箱中培养18-20h；根据抑菌圈直径大小表示抑菌活性大小，其中牛津杯内径为8mm。
以大肠杆菌为指示菌的抑菌活性检测培养基在37℃恒温培养箱中培养18～20h取出，观察其抑菌圈生成情况。通过对各内生菌的抑菌圈直径进行测量(不含牛津杯的内径)，结果如图1所示，从野生黑果枸杞中分离的29株内生菌有22株菌有抑菌活性，其中内生细菌13株，内生真菌9株。而内生细菌中编号为HNX-3，HNX-16，HNX-2，HNX-18和HNX-9的菌株无抑菌活性；内生真菌中编号为HNZ-2和HNZ-6的菌株没有抑菌活性；29株菌中编号为HNX-7和HNX-6的菌株抑菌活性较高，其中编号为HNX-7菌株的抑菌活性最高的，抑菌圈直径达到22mm。
1.3产抑菌活性物质内生菌的鉴定与保藏
内生菌DNA的提取：选取从黑枸杞果实中分离得到的抑菌活性最好的一株内生菌HNX-7采用CTAB法提取该菌的总DNA；
16S rDNA的PCR扩增反应：
反应体系：预混液mix，12.5μL；上游引物(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1μL；下游引物(1492R：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’)，1μL；ddH2O，8.5μL；DNA上清液，2μL。
反应条件：95℃预变性5分钟；35次循环；95℃变性30秒；58℃复性40秒；72℃延伸1分钟；72℃延伸10分钟。
测序并比对：将收集好的PCR扩增产物送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，测序完成后提交NCBI进行同源比对。
经测序得到长度为1397bp的16S rDNA片段，在GenBank中的注册登记号为LRM10-3D MT645306，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
与NCBI的部分菌株的16S rDNA序列进行比对，得到系统发育树如图2所示，结果如表1所示。由图2和表1可知，该菌株HNX-7与暹罗芽孢杆菌的序列高度相似，相似度达100％，将该菌株HNX-7鉴定并命名为暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D，于2019年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019848；于2019年11月6日鉴定状态为存活；保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，邮编430072，联系电话(027)68754833。
表1菌株LRM10-3D的16S rDNA测序结果
实施例2暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D活性研究
2.1暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D生长曲线的测定
用三角瓶配置2瓶100mL的PDB培养基，一瓶不接内生菌，作为空白对照；另一瓶从固体斜面上接入1-2环暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D(登记好接菌时间)，将接好的液体培养基放入37℃摇床上进行培养，摇床转速180r/min，每隔4h精准取样200μL于酶标板上，每次做3个重复，并测量对照培养基空白值。整理以上测量数据绘制生长曲线。
结果如图3所示，暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D在培养前8h为调整期，随后进入对数期，大约在36h进入稳定期，44h后细胞增殖放缓，可以看出暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的生长曲线为S形。
2.2培养时间对暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D抑菌活性的影响
从固体斜面上接入1环暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D于含有PDB液体培养基的三角瓶中，装液量100mL/250mL；140r/min，28℃(真菌)摇床培养3d，设一个空白对照，每隔4h从三角瓶中取3mL培养液，离心(8000r 15min)，取上清液放于EP管中，置于-20℃冰箱冷藏。待收集完毕后，以致泻大肠埃希氏菌为指示菌，采用牛津杯法对对经不同时间处理后的发酵液的抑菌活性进行检测。
结果如图4所示，在相同培养条件下，随着培养时间的延长，指示菌的抑菌圈直径不断增加，在44h达到最大，说明随着时间的推移，转化液抑菌活性不断加强，在44h达到最大，抑菌圈直径达到21mm(不含牛津杯的直径)；继续培养，抑菌圈直径开始变小，说明44h为暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的最佳培养时间，抑菌活性最强。
2.3暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D耐温特性
从暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的固体斜面上用接种针或接种环挑取1-2环接种到装有100mL PDB培养基的三角瓶中(液体培养基事先灭菌)。接种好的液体培养基放到温度为37℃(细菌)的摇床中培养36h，将培养完全的菌液分装到无菌的15mL的离心管中，温度为室温，转速8000r/min，离心15min，离心完全后收集上清液得发酵液，备用；将收集好的发酵液取出一部分，分别在80℃和90℃的恒温水浴锅中处理1h，3h和5h，以及用灭菌锅在121℃下处理0.5h，处理完全后放入-20℃冰箱备用；检测不同温度处理后暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的抑菌活性(琼脂扩散法同上)，留同一批次未经加热处理的发酵液为对照，重复3次实验。
结果如表2所示，相较于未经加热处理组，暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensisLRM10-3D发酵液在经过80℃处理2h后，其抑菌圈直径(不含牛津杯的直径)略有下降，但是下降幅度不大，表明其抑菌活性基本无变化；80℃恒温处理3h后，其抑菌圈直径开始有大幅度的下降，但仍具有较强的抑菌活性；当80℃处理时间延长到5h后，该发酵液的抑菌圈直径下降到7.4mm，但仍具有一定的抑菌活性；在90℃恒温水浴下处理3h后，抑菌圈下降到7.0mm，但仍具有一定的抑菌活性。通过以上实验说明，暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensisLRM10-3D的抑菌活性具有较高的热稳定性，在90℃高温处理3h内仍具有一定的抑菌活性。
表2菌株LRM10-3D的热稳定性(不含牛津杯的直径)
2.4暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D耐紫外线特性
分别吸取定量的暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D发酵液于24个1.5mL无色EP管中，在紫外灯下连续照射8h，每隔1h取出3个EP管并做好标记(留三个未经紫外处理的发酵液为对照)。将取出的EP管放入温度为4℃的冰箱中储藏备用，然后通过琼脂扩散法检测其抑菌活性，牛津杯内径为8mm，重复3次实验。
结果如图5所示，随着紫外照射处理时间的延长，抑菌圈的直径呈下降趋势，下降趋势比较缓慢，说明紫外照射虽然能使菌株LRM10-3D的抑菌活性受损，但是连续紫外照射8h后，抑菌圈直径仍达到17.4mm以上，说明暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D具有较好的紫外线稳定性。
2.5暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D耐酸碱特性
取暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的发酵液(pH＝5.65)，用HCL缓冲液以及NaOH缓冲液在pH计上将发酵液的pH分别调至2，4，6，8，10。将调好pH的发酵液放入温度为4℃的冰箱中静置过夜，再用以上同一批次的缓冲液分别配制相同pH值的无菌水溶液作为对照，然后通过琼脂扩散法检测其抑菌活性，重复3次实验。
结果如图6所示，暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D在pH为6左右具有较强的抑菌效果，此时抑菌圈直径大小为22mm，当发酵液的pH低于6或是高于6时，该成分的抑菌能力逐渐下降，但是下降的幅度不大，在pH＝2时其抑菌圈直径仍可以达到17mm，pH＝10时抑菌圈直径为18.4mm。对照组(pH分别为2、4、6、8、10的无菌水液)抑菌圈直径均为0mm。结果表明，暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D在pH2-10之间具有较好的酸碱稳定性，且在pH＝6左右具有做好的抑菌活性。
2.6暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D耐金属离子特性
配置5mol/L的金属离子母液，将金属离子母液于高压灭菌锅中121℃灭菌20min，最后加入到暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的发酵液中使得其浓度为0.05mol/L，本次实验所使用的金属离子盐分别为NaCl、MgCl2、KCl、CaCl2、ZnCl2以及FeCl3。以相同浓度的金属离子盐溶液和未加入金属离子母液的发酵液作为对照，然后通过牛津杯法检测其抑菌活性，检测结果用抑菌圈直径的大小来表示，牛津杯内径为8mm，重复3次实验。
如表3所示，作为对照的金属离子盐水溶液中只有Fe3+和Zn2+具有抑菌活性，其他金属离子盐溶液并没有抑菌活性。而经过金属离子盐溶液处理过的发酵液，其抑菌效果除经Fe3+和Zn2+处理过的具有加强外，其他金属离子对该菌发酵液的抑菌作用并无太大影响，其中经过锌离子处理过的发酵液其抑菌圈直径达到了27.5mm，说明暹罗芽孢杆菌Bacillussiamensis LRM10-3D的抑菌活性基本不受金属离子的干扰。
表3菌株LRM10-3D的金属离子稳定性(不含牛津杯的直径)
实施例3暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D抑菌物质的初步鉴定
3.1薄层法分离样品
3.1.1样品的预处理
分别吸取12mL的暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D发酵液于12个无菌培养皿中。每个培养皿拿去上方皿盖用保鲜膜封口后平放入-20℃冰箱中进行预冻，待发酵液均匀的冰冻在培养皿的底部后，用一洁净的牙签在保鲜膜上均匀插40个左右孔(以便冷冻干燥过程中水分的排出)；将处理好的培养皿放入-80℃冰箱冷冻过夜(至少10h)，冷冻完全后放入真空冷冻干燥机中冻干；待样品完全冻干后，将培养皿用无菌锡箔纸包好放入-20℃冰箱保存。
进行薄层层析之前，应先将冻干的发酵液用2mL 50％的液相级甲醇溶液溶解，并转移到EP管中保存。
3.1.2点样
在距离硅胶板底1.5cm处用铅笔画一条平行于板底的线，用内径小于1mm的管口平整的毛细管以距离硅胶板边缘1cm为始末点划线。
3.1.3展开
待点样干燥后，将硅胶板竖直的放入已经提前放入展开剂的展开缸中，盖上盖子，进行展开。等到展开剂跑到适当高度时，取出硅胶板，画出展开剂的前沿线。展开剂为：乙酸乙酯：甲酸：水＝8：1：1。
3.1.4显色并计算Rf值
待硅胶薄层板上的展开剂干燥完全后，将薄层板放到波长365nm的紫外灯下，喷显色剂显色观察。用尺子量出经展开剂展开的各组分与展开剂的展开距离，并计算各组分的Rf值。
3.1.5条带收集并检测其抑菌活性
将在薄层板上分离出的不同条带于波长365nm的紫外灯照射下划线标出，用洁净的手术刀轻刮下每一条带，并将刮下的条带用50％甲醇溶液溶解后用水系膜过滤。以致泻大肠埃希氏菌标准菌株CICC10411为指示菌，对薄层分离出的每条带进行抑菌活性的检测，方法同上。
结果如图7所示，暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D发酵液中的成分在薄层板上被分出3条明显的条带，将每一条带用50％的甲醇水溶解后用(牛津杯法)测定每条带的抑菌活性。结果如图8所示，在薄层分离出的3条带中只有第2条带具有抑菌活性，第2条带的比移值Rf＝0.6867
3.2细菌素的验证结果
取3.1中收集好的第2条带分离物的甲醇水溶液，用pH计分别调节其pH为胰蛋白酶和胃蛋白酶的最适pH，胰蛋白酶的最适pH7.8～8.5，胃蛋白酶的最适pH为1～2，加入蛋白酶的磷酸盐缓冲液在37℃下反应2h(使各种酶的最终浓度为1mg/mL)，将处理好的酶解液的pH值调整到第2条带分离物的甲醇水溶液的初始PH值(pH＝5.65)，以没有经过以上酶溶液处理的第2条带薄层分离物的甲醇水溶液做对照，然后通过琼脂扩散法检测其抑菌活性，检测结果用抑菌圈直径的大小来表示。
表4细菌素的验证结果(不含牛津杯的直径)
以致泻大肠埃希氏菌标准菌株CICC10411为指示菌，将经过胰蛋白酶和胃蛋白酶处理的第2条带薄层分离物的甲醇水溶液用牛津杯法进行细菌素的验证，以未经蛋白酶处理的薄层分离物的甲醇水溶液作为对照，结果如表4所示，对照组和实验组的抑菌圈直径几近相同，这说明薄层分离出的抑菌物质不是蛋白类物质，即该抑菌成分不是细菌素。
实施例4暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D抑菌谱测定
分别取100μL的指示菌(鼠伤寒沙门氏菌，出血性大肠埃希氏菌，金黄色葡萄球菌，血清型肠炎沙门氏菌，单核细胞增生李斯特氏菌，英诺克李斯特菌)菌液于灭菌的100mL/250mL的LB液体培养基中，37℃，120r/min，18h，后用酶标仪测定，调节其OD值，使之为0.3，按比例稀释，备用。用无菌镊子夹取灭菌过的牛津杯放入无菌的培养皿中，每个平板放置4个牛津杯，均匀放置，标号，备用，当灭菌后的LB营养琼脂培养基冷却至50-60℃时(手能抓住不烫手)，加入稀释好的指示菌，混合均匀，使指示菌的浓度为106CFU/mL，然后缓缓的倒入已放置好牛津杯的培养皿中，每个平板大约倒入30mL培养基(大约为牛津杯的2/3高)。当培养基凝固后，用镊子拔出牛津杯，准确移取200μL暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensisLRM10-3D发酵液加入到每一个孔中，加完液体后，将培养皿转移至4℃的冰箱中放置4h，使得活性物质在培养基中完全扩散，然后再将培养皿在37℃培养箱下培养24h。后测量抑菌圈的直径，用其大小来表示抑菌程度的高低(不算牛津杯的直径)，结果用mm表示。试验重复3次。结果如表5所示。
表5菌株LRM10-3D对不同供试菌种的抑制作用(不含牛津杯的直径)
实施例5暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D碳源氮源条件的优化
5.1碳源条件优化
挑一环暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D放入100mL基础培养基，碳源发酵培养基其它成分不变，碳源分别设为1％的葡萄糖，蔗糖，低聚半乳糖，D-甘露糖，半乳糖，乳糖，果糖，低聚果糖，可溶性淀粉，甘油，大豆低聚糖，低聚异麦芽糖。摇床培养，28℃，2d后离心(8000r，15min)，取上清液放于-20℃冰箱，后进行抑菌试验，方法同实施例5。
结果如图9所示，以葡萄糖作为碳源，抑菌效果最好，致泻大肠埃希氏菌抑菌圈直径可以达到20mm(不含牛津杯的直径)；以蔗糖为碳源，抑菌圈直径达18mm(不含牛津杯的直径)，而甘油、可溶性淀粉、乳糖等作为碳源时暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的抑菌活性较差。
5.2氮源条件优化
挑一环暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D放入100mL基础培养基，氮源发酵培养基其余成分不变，氮源分别设置为2％的蛋白胨，牛肉膏，尿素，硫酸铵，酵母膏以及大豆蛋白胨。28℃，120r/min2d离心，取上清液放于-20℃冰箱，后进行抑菌实验.
结果如图10所示，以硫酸铵为氮源，抑菌效果最好，致泻大肠埃希氏菌抑菌圈直径达20mm(不含牛津杯的直径)；以牛肉膏为氮源，抑菌圈直径达18mm(不含牛津杯的直径)，而酵母膏，蛋白胨，尿素，大豆蛋白胨作为氮源时内生菌的抑菌活性较差。因此，选用硫酸铵作为暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis LRM10-3D的最佳氮源。
以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。
序列表
<110> 石河子大学
<120> 一种暹罗芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1397
<212> DNA
<213> 暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis )
<400> 1
tacctcaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc 60
ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac tagcgattcc agcttcacgc 120
agtcgagttg cagactgcga tccgaactga gaacagattt gtgggattgg cttaacctcg 180
cggtttcgct gccctttgtt ctgtccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg 240
catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt caccttagag 300
tgcccaactg aatgctggca actaagatca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca 360
acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtcactctgc ccccgaaggg 420
gacgtcctat ctctaggatt gtcagaggat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc 480
ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc 540
agtcttgcga ccgtactccc caggcggagt gcttaatgcg ttagctgcag cactaagggg 600
cggaaacccc ctaacactta gcactcatcg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat 660
cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtta cagaccagag agtcgccttc 720
gccactggtg ttcctccaca tctctacgca tttcaccgct acacgtggaa ttccactctc 780
ctcttctgca ctcaagttcc ccagtttcca atgaccctcc ccggttgagc cgggggcttt 840
cacatcagac ttaagaaacc gcctgcgagc cctttacgcc caataattcc ggacaacgct 900
tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt ctggttaggt 960
accgtcaagg tgccgcccta tttgaacggc acttgttctt ccctaacaac agagctttac 1020
gatccgaaaa ccttcatcac tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga 1080
agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg 1140
atcaccctct caggtcggct acgcatcgtt gccttggtga gccgttacct caccaactag 1200
ctaatgcgcc gcgggtccat ctgtaagtgg tagccgaagc caccttttat gtctgaacca 1260
tgcggttcaa acaaccatcc ggtattagcc ccggtttccc ggagttatcc cagtcttaca 1320
ggcaggttac ccacgtgtta ctcacccgtc cgccgctaac atcagggagc aagctcccat 1380
ctgtccgctc gactgca 1397
Claims (9)
1.一种暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）LRM10-3D，所述暹罗芽孢杆菌LRM10-3D于2019年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019848。
2. 如权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌LRM10-3D用于生产抑制肠道致病菌药物的应用，其特征在于，所述肠道致病菌为肠道致病性大肠埃希氏菌（Escherichia coli EPEC）、肠道出血性大肠埃希氏菌（Escherichia coli EHEC）、肠沙门氏菌肠亚种（Salmonella enterica subsp. Enterica）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肠道致病菌为肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium）。
4.一种暹罗芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，所述方法为：将权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌LRM10-3D接种于PDB培养基中，37℃培养4-72h，离心，收集上清液，即得。
5.如权利要求4所述方法制备获得的暹罗芽孢杆菌发酵液。
6. 如权利要求5所述暹罗芽孢杆菌发酵液在制备抑制肠道致病菌药物中的应用，所述肠道致病菌为肠道致病性大肠埃希氏菌（Escherichia coli EPEC）、肠道出血性大肠埃希氏菌（Escherichia coli EHEC）、肠沙门氏菌肠亚种（Salmonella enterica subsp.Enterica）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肠道致病菌为肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium）。
8. 如权利要求5所述暹罗芽孢杆菌发酵液在制备抑制肠道致病菌药物组合物中的应用，所述肠道致病菌为肠道致病性大肠埃希氏菌（Escherichia coli EPEC）、肠道出血性大肠埃希氏菌（Escherichia coli EHEC）、肠沙门氏菌肠亚种（Salmonella enterica subsp.Enterica）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肠道致病菌为肠沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium）。
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2020
- 2020-08-13 CN CN202010814884.XA patent/CN111718881B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110564651A (zh) * | 2019-09-30 | 2019-12-13 | 中国农业科学院烟草研究所 | 一株暹罗芽孢杆菌及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 4株凡纳滨对虾肠道益生菌分离、鉴定及应用研究;郑军荣等;《水产科学》;20190528;第38卷(第03期);320-326 * |
| 海兰褐鸡肠道菌群多样性分析;王海花等;《中国兽医杂志》;20191122;第55卷(第11期);7-11 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111718881A (zh) | 2020-09-29 |
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