CN109988734B - 一种福迪芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

一种福迪芽孢杆菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种福迪芽孢杆菌菌株及其应用，所述的福迪芽孢杆菌菌株分类命名为Bacillus fordii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2018年12月28日，保藏编号：CGMCC No.17047，所述福迪芽孢杆菌属于细菌界，硬壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目、芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。应用为所述的福迪芽孢杆菌菌株在生物防治星油藤根茎腐病中的应用。

Description

一种福迪芽孢杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物分离培养技术领域，具体涉及一种福迪芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术
星油藤种子含有油脂、蛋白质和氨基酸等主要成分。还含有抗氧化剂，维生素A、维生素E和蛋白质，对调整血脂、防肌肤衰老和控制心血管疾病等方面疗效显著，且不含有芥酸和毒素，可大量应用于食物、制药和化妆品等加工产业，被认为是最好的植物油和保健化妆产品材料，在2004、2006和2010年世界食油展览会上荣获奖章，2007年获得“植物脑黄金称号”，开发使用前景广阔。
但2015年初，种植人员在星油藤种植产区发现多年生星油藤植株大量死亡，症状初期表现为植株上部分叶片由绿变黄，悬挂在树枝上，经仔细观察发现，星油藤根基部及根茎部腐烂。后期，植株整株干枯死亡。大田种植中根茎腐病发生严重，常常出现星油藤根茎腐烂和植株死亡，发生面积广，造成损失较为严重，病死株率达到50%~70%，个别种植园甚至达80%。长久以来，人们对于病害的防治，化学农药是最先被人们所考虑，但是，由于化学农药的长期使用，对农业生产造成了潜在危害，化学农药不仅杀灭病原微生物，还杀死了有益微生物，以及破坏生态平衡和损害人类健康。
因此，有必要分离培养出一种防治星油藤根茎腐病，同时对环境、人类无害的生物菌株。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种福迪芽孢杆菌菌株Bacillus fordii；第二目的在于提供所述的福迪芽孢杆菌菌株Bacillus fordii的应用。
除非另有说明外，本发明中所采用的百分数均为体积百分数。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的福迪芽孢杆菌菌株分类命名为Bacillus fordii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2018年12月28日，保藏编号：CGMCC No.17047，所述福迪芽孢杆菌属于细菌界，硬壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目、芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。
本发明所述的福迪芽孢杆菌菌株(Bacillus fordii) Bpg 4，于2018年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,简称 CGMCC。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100080)。其保藏编号为CGMCC No：17047。
所述菌株对星油藤根茎腐病的致病效果好，能够抑制病原菌的生长，而不影响星油藤的品质。
所述菌株采用对峙培养法的第3天即可观察到星油藤根茎腐病病原菌受到抑制，在对峙培养的第5天观察到抑制现象更明显，抑菌圈达到12 mm。
所述菌株采用滤纸片培养法的第3天即可观察到星油藤根茎腐病病原菌受到抑制，在对峙培养的第5天观察到抑制现象更明显，抑菌圈达到11.3mm。
所述菌株是通过下述具体步骤获得的：
A、标本采集：从西双版纳星油藤种植基地采集发病植株和发病地块健康植株及其根际土壤。
B、菌株的分离培养：采用常规组织法分离培养发病地块健康植株根际细菌：用蒸馏水洗净田间发病地块采集的新鲜健康的星油藤根组织表面土壤后，将根部组织切成0.5cm×0.5 cm的组织块，先用0.1%升汞溶液对健康植株组织表面消毒1~5 min，然后用75%酒精深层消毒1 min，无菌水清洗3次，将组织块放置在LB培养基上。28℃黑暗条件下培养。待菌落形成后，用灭菌的接种环挑出典型的单一菌落，在新的LB培养基，用划线法将菌株纯化。4℃冰箱保存。采用稀释平板法分离根际土壤中的细菌：称10 g土样，加至90 ml无菌水的三角瓶中，制成10-1菌悬液，28℃，180 r/min摇床内培养30 min。当土样完全沉淀后，用移液枪吸取10 ml上清液，加至新的90 ml无菌水的三角瓶，摇晃均匀，稀释成10-2浓度的土壤悬浮液，采用相同方法，依次稀释成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、浓度的菌悬液，用移液枪吸取各梯度的菌悬液100µl，分别置于LB培养基上，用无菌涂布器混匀，设置3次重复，28℃培养箱中培养。培养2d后，用接种环挑取形态、色泽、大小不同的单一菌落，用划线法将菌株纯化。
C、菌种保存：将实验获得的生防备用菌株在25℃黑暗中静置培养5天，置于4℃冰箱中冻存；保存培养基为LB培养基；
改良 PDA固态培养基成分以g/L计为：马铃薯160～240 g、葡萄糖10～20 g、琼脂15～20 g、胰蛋白胨5g、酵母粉2g、氯化钠5g、蒸馏水1 L，PH自然。
LB 固体培养基成分以g/L计为：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、琼脂20g、蒸馏水1 L，pH 7.2 ~ 7.5。
步骤A所述的标本采集地为云南省西双版纳傣族自治州。
步骤A所述的标本采自西双版纳星油藤种植基地发病地块健康植株及其根际土壤。
步骤B所述无菌操作台中步骤为，酒精灯下操作，并在酒精灯火焰上灼烧接种针，接种环，在酒精等下操作所有分离步骤。
步骤B所述的灭菌，是将接种针、接种环、无菌水、镊子、空培养基等试验所需材料置于高压蒸汽式灭菌器中，在121℃下灭菌处理30min以上。
步骤B所述的培养条件的优选；25℃黑暗中静置培养5 d。
步骤C所述的保存培养的条件优选；25℃黑暗静置培养5 d。
一种用所述的福迪芽孢杆菌菌株(Bacillus fordii) Bfg 4防治星油藤根茎腐病的方法，包括生防菌株的筛选及生防效果的测定，具体包括以下步骤：
A、生防菌株的筛选：利用十字交叉法对拮抗菌进行初筛。具体操作如下：以尖孢镰刀菌为指示菌，在改良PDA培养基平板中心接种病原菌的琼脂块，然后将分离培养得到的细菌单菌落等距离接种在距离病原菌3 cm处，每皿接种4个菌株，设置5个重复，28℃恒温培养3 d后，观察抑菌圈大小，挑选出拮抗效果最优的菌株。
B、生防效果的测定：为了筛出抑菌活性较强的菌株，采用平板对峙生长法对初筛获得的菌株进行复筛：以尖孢镰刀菌为指示菌，首先用打孔器打取活化的病原菌菌饼，置于平板上，然后，采用点接法接种拮抗菌，两菌相距5 cm，对照组只接种病原菌菌饼，设置3个重复，28℃培养箱中培养，观察病原菌生长情况，测量抑菌带，计算抑菌率，最终筛选出拮抗效果最好的拮抗菌。抑菌率计算公式：抑菌率（%）=（对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径）/对照病原菌菌落直径×100%。
改良PDA固态培养基成分以g/L计为：马铃薯160～240g、葡萄糖10～20g、琼脂15～20g、胰蛋白胨5g、酵母粉2g、氯化钠5g、蒸馏水1 L，PH自然。
本发明的第二目的是这样实现的，所述的福迪芽孢杆菌菌株在生物防治星油藤根茎腐病中的应用。
本发明的有益效果包括以下几个方面。
1、本发明所述菌株对防治星油藤根茎腐病的的效果好，对星油藤的品质没有影响。
2、本发明所述菌株在对峙培养的第3天即可观察到星油藤根茎腐病病原菌受到抑制，在对峙培养的第5天观察到抑制现象更明显。
3、本发明所述菌株易于获得，培养时间短，有利于大规模生产和推广应用。
附图说明
图1为实施例1中福迪芽孢杆菌菌株(Bacillus fordii) Bfg 4在LB培养基上，培养3 d时的菌株菌落形态；A为正面，B为反面；
图2为实施例1中采用平板对峙法的福迪芽孢杆菌菌株(Bacillus fordii) Bfg 4对星油藤根茎腐病病原菌拮抗效果图；A为正面，B为反面；
图3为实施例1中采用滤纸片法的福迪芽孢杆菌菌株(Bacillus fordii) Bfg 4对星油藤根茎腐病病原菌拮抗效果图；A为正面，B为反面。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的福迪芽孢杆菌菌株分类命名为Bacillus fordii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2018年12月28日，保藏编号：CGMCC No.17047，所述福迪芽孢杆菌属于细菌界，硬壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目、芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。
本发明所述的福迪芽孢杆菌菌株的应用为所述的福迪芽孢杆菌菌株在生物防治星油藤根茎腐病中的应用。
所述的福迪芽孢杆菌菌株在生物防治星油藤根茎腐病包括菌株活化与扩繁、生防效果测定步骤，具体包括：
A、菌株活化与扩繁：将所述的福迪芽孢杆菌菌株接种到活化及扩繁培养基上，于25~30℃下培养3~5天得到活化与扩繁菌株；
B、生防效果测定：将星油藤根茎腐病病原菌接种到改良PDA培养基上，然后将A步骤制备得到的活化与扩繁菌株也接种到培养基上，在25~30℃下培养5~7天，观察抑菌效果。
所述的活化及扩繁培养基为LB培养基。
所述的生防效果测定是采用平板对峙法和滤纸片法测定。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
——福迪芽孢杆菌(Bacillus fordii) Bfg 4的获得、鉴定与保藏。
（1）福迪芽孢杆菌(Bacillus fordii) Bfg 4的获得与鉴定。
本发明所述的高地芽孢杆菌，是从星油藤发病地块健康植株和发病植株及其根际土壤中分离得到。样品采自云南省西双版纳傣族自治州，在4℃冷藏保存备用。
采用常规组织法分离培养发病地块健康植株根际细菌：用蒸馏水洗净采自发病地块新鲜健康的星油藤根组织表面土壤后，将根部组织切成0.5cm×0.5cm的组织块，先用0.1%升汞溶液对植株组织表面消毒1~5 min，然后用75%酒精深层消毒1min，无菌水清洗3次，将组织块放置在LB培养基上。28℃黑暗条件下培养。待菌落形成后，用灭菌的接种环挑出典型的单一菌落，在新的LB培养基，用划线法将菌株纯化。
采用稀释平板法分离根际土壤中的细菌：称10 g土样，加至90 ml无菌水的三角瓶中，制成10-1菌悬液，28℃，180 r/min摇床内培养30 min。当土样完全沉淀后，用移液枪吸取10ml上清液，加至新的90 ml无菌水的三角瓶，摇晃均匀，稀释成10-2浓度的土壤悬浮液，采用相同方法，依次稀释成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、浓度的菌悬液，用移液枪吸取各梯度的菌悬液100 µl，分别置于LB培养基上，用无菌涂布器混匀，设置3次重复，28℃培养箱中培养。培养2d后，用接种环挑取形态、色泽、大小不同的单一菌落，用划线法将菌株纯化。
PDA固态培养基成分以g/L计优选为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、PH自然。
LB 固体培养基成分以g/L计为：胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、琼脂20g、蒸馏水1 L，pH 7.2 ~ 7.5。
对上述分析的菌株Bfg 4，通过形态学鉴定和分子生物学鉴定，实验结果记录如下：
A、形态特征：菌株Bfg 4的菌落近圆形，黄色，边缘不整齐，无光泽度，菌落不透明，表面湿润。
B、16s rDNA序列分析：对菌株进行16s rDNA序列测定，以菌株Bfg 4的总DNA为模板，在引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）1492R（5'-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3'）的引导下PCR扩增该菌株的16s rDNA，PCR反应体系为：MIX：25µL，模板DNA：1µL，上游引物：1µL，下游引物：1µL，ddH2O：22µL，总体积：50µL。PCR反应程序：95℃：15min、94℃：1min、55℃：1min、72℃：2min30个循环，72℃：8min。
将PCR产物送至生物科技公司测序的ITS序列，经复检，在美国国家技术信息中心（NCBI）中比对，比对结果表明，菌株与福迪芽孢杆菌（Bacillus fordii）16s rDNA序列的相似性达到99%。通过序列比对和形态特征将菌株Bfg 4鉴定为福迪芽孢杆菌（Bacillus fordii）。本发明所述的菌株Bfg 4序列如序列表所示。
（2）福迪芽孢杆菌(Bacillus fordii) Bfg 4的保藏
通过上述鉴定结果，确认菌株为福迪芽孢杆菌(Bacillus fordii)，编号命名为Bfg 4，于2018年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center,简称CGMCC。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100080)。其保藏编号为CGMCC No：17047。
实施例2
——由福迪芽孢杆菌(Bacillus fordii) Bfg 4菌株的筛选。
（1）菌株的筛选
利用十字交叉法对拮抗菌进行筛选。具体操作如下：以尖孢镰刀菌为指示菌，在改良PDA培养基平板中心接种病原菌的琼脂块，然后将分离培养得到的细菌单菌落等距离接种在距离病原菌3 cm处，每皿接种4个菌株，设置5个重复，28℃恒温培养3 d后，观察抑菌圈大小，挑选出拮抗效果最优的菌株。
（2）结果观察。
采取十字交叉法对分离到的菌株进行筛选，结果表明，对星油藤根茎腐病有拮抗作用的菌株有3株。
实施例3
——由福迪芽孢杆菌(Bacillus fordii) Bfg 4菌株的生防效果的测定。
（1）生防效果的测定。
对峙培养法：以尖孢镰刀菌为指示菌，首先用打孔器打取活化的病原菌菌饼，置于平板上，然后，采用点接法接种拮抗菌，两菌相距5 cm，对照组只接种病原菌菌饼，设置3个重复，28℃培养箱中培养，观察病原菌生长情况，测量抑菌带，就算抑菌率，最终筛选出拮抗效果最好的拮抗菌。 抑菌率计算公式：抑菌率（%）=（对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径）/对照病原菌菌落直径×100%
（2）结果观察。
采用平板对峙培养法对筛选得到的菌株进行生防效果测定，3种拮抗细菌对星油藤根腐病病原菌有拮抗活性，且不同拮抗细菌对病菌菌丝的抑制效果具有一定差异。其中Bfg 4菌株的拮抗活性最强，且抑菌圈边界清晰，对星油藤根茎腐病病原菌的抑菌带为12mm，且达到显著性水平。虽然培养时间延长，但抑菌圈始终保持透明，说明改拮抗菌拮抗性能稳定。
实施例4
——由福迪芽孢杆菌(Bacillus fordii) Bfg 4菌株的生防效果的测定。
（1）生防效果的测定。
滤纸片培养法：以尖孢镰刀菌为指示菌，首先准备滤纸片若干，灭菌，用打孔器打取活化的病原菌菌饼，置于平板上，然后将滤纸片放入发酵液中充分浸泡后取出置于平板上，每个皿中放4片滤纸，对照组只接种病原菌菌饼，设置3个重复，28℃培养箱中培养，观察病原菌生长情况，测量抑菌带，计算抑菌率。
（2）结果观察。
采用滤纸片培养法对筛选得到的菌株进行生防效果测定，3种拮抗细菌对星油藤根茎腐病病原菌有拮抗活性，且不同拮抗细菌对病菌菌丝的抑制效果具有一定差异。其中Bfg 4菌株的拮抗活性最强，且抑菌圈边界清晰，对星油藤根茎腐病病原菌的抑菌带为11.3mm，且达到显著性水平。虽然培养时间延长，但抑菌圈始终保持透明，说明改拮抗菌拮抗性能稳定。

Claims (5)

1. 一株福迪芽孢杆菌菌株，其特征在于所述的福迪芽孢杆菌菌株分类命名为Bacillus fordii，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2018年12月28日，保藏编号：CGMCC No.17047，所述福迪芽孢杆菌属于细菌界，硬壁菌门，杆菌纲，芽孢杆菌目、芽孢杆菌科，芽孢杆菌属。
2.一种权利要求1所述的福迪芽孢杆菌菌株的应用，其特征在于所述的福迪芽孢杆菌菌株在生物防治星油藤根茎腐病中的应用。
3.根据权利要求2所述的福迪芽孢杆菌菌株的应用，其特征在于所述的福迪芽孢杆菌菌株在生物防治星油藤根茎腐病包括菌株活化与扩繁、生防效果测定步骤，具体包括：
A、菌株活化与扩繁：将所述的福迪芽孢杆菌菌株接种到活化及扩繁培养基上，于25~30℃下培养3~5天得到活化与扩繁菌株；
B、生防效果测定：将星油藤根茎腐病病原菌接种到改良PDA培养基上，然后将A步骤制备得到的活化与扩繁菌株也接种到培养基上，在25~30℃下培养5~7天，观察抑菌效果。
4.根据权利要求3所述的福迪芽孢杆菌菌株的应用，其特征在于所述的活化及扩繁培养基为LB培养基。
5.根据权利要求3所述的福迪芽孢杆菌菌株的应用，其特征在于所述的生防效果测定是采用平板对峙法和滤纸片法测定。
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