CN116064319A - 一种拮抗甜菜病害的暹罗芽胞杆菌b17及其在幼苗促生中的应用 - Google Patents

Abstract

一种拮抗甜菜病原物的暹罗芽胞杆菌B17菌株，不仅对引起甜菜褐斑病的甜菜尾孢菌有抑制作用，抑菌率达到52.55％，且能够拮抗引起甜菜立枯病的立枯丝核菌，抑菌率达到68.24％；同时，所提供的B17菌株对甜菜种子萌发和幼苗生长均具有显著的促进作用，并表明拮抗菌株B17具有良好的生防潜能，可用于开发具有促生抗病作用的生防菌剂。

Description

一种拮抗甜菜病害的暹罗芽胞杆菌B17及其在幼苗促生中的应用

技术领域

本发明涉及微生物防治技术领域，具体涉及一种拮抗甜菜病害的暹罗芽胞杆菌B17及其在幼苗促生中的应用。

背景技术

甜菜生产中，因真菌、细菌以及病毒等引起的各类病害危害甜菜的叶片、根茎交界部，以及膨大的产量器官，造成叶片枯斑、秧苗萎蔫和枯死、根茎腐烂、大青头、丛根、糠心，严重制约着其产量和含糖量的提高，这其中各类种传和土传病害尤为严重。例如由甜菜尾孢菌引起的甜菜褐斑病是潜在的种传病害，也是甜菜中最普遍、致病性最强的叶部真菌病害。植株染病后初生圆形斑点，中心灰白色，边缘紫色，后病斑逐渐扩展破坏甜菜叶片，从而影响光合作用，导致甜菜产量和含糖量的降低。由立枯丝核菌引起的甜菜立枯病是甜菜苗期重要的土传病害，植株经病原菌侵染后首先开始出现水浸状病斑，可以扩展环绕茎一周，导致甜菜幼苗萎蔫，严重时造成整株幼苗死亡。

对于甜菜的种传和土传病害，运用种子包衣技术将杀菌剂、杀虫剂等覆于种子表面制成丸粒化种子是一种效果显著的防治方式。目前甜菜实际生产中所应用的种子均为甜菜丸粒种，且95％以上均由国外进口，过分依赖国外丸粒种，导致目前国内现有已登记的甜菜种子处理剂的特异性、针对性和创新性较差，同时过度依赖化学药剂还会带来环境污染和食品安全问题，同时造成土壤板结，农药残留、有益微生态体系的破坏等不良影响。

相比于传统常用的化学防治药剂，生物制剂因对环境影响小且对病原物特异性强而备受关注。早在1939年，Beresova等就发现可以利用细菌的拮抗作用来防治作物中的真菌病害；Kloepper等在1978年对萝卜根际细菌的研究中首次使用了植物生长促生菌(PlantGrowth Promoting Rhizobacteria,PGPR)一词。芽胞杆菌(Bacillus)作为自然界广泛存在的细菌，也是生防资源开发的热点之一，在实际的大田生产中常作为生物制剂或与杀菌剂复配发挥生物-化学协同作用共同防治植物病害。

因此利用拮抗菌为甜菜病害生物防治提供新的菌株资源具有良好的应用前景。从甜菜种子上分离得到的天然拮抗菌与甜菜种子共生，相比从其他植物中分离得的生防菌更能适应宿主植株及其生长发育的环境条件，对这些拮抗菌进行促生功能的鉴定，并进一步开发新的生防菌剂，将为甜菜种子实现生物-化学协同的丸粒化提供理论依据，为后续深入研究甜菜病害的防控提供关键技术要点支持。但是，目前还没有见到涉及利用拮抗菌为甜菜病害生物防治提供新的菌株资源的报道。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，通过本发明的发明人研究确认并培养出，一株拮抗甜菜病害的杆菌，该菌株，不仅能拮抗甜菜尾孢菌(甜菜种传病原菌)和立枯丝核菌(甜菜土传病原菌)，而且对甜菜种子萌发和幼苗生长具有一定的促进作用。

具体的说，为实现上述目的，本发明的第一方面，是提供一株甜菜病害拮抗菌株，该拮抗菌株为暹罗芽胞杆菌，拉丁名为Bacillus siamensis，分离自甜菜种子外部，于2022年3月20日，保存于中国农业大学种子病理学与杀菌剂药理学实验室，菌株保藏号为：SHCXJ17202203。

本发明所述菌株的16S rRNA的核苷酸序列见SEQ ID NO：1。

本发明的拮抗菌株在LB平板上生长24h后，单菌落形态不规则，乳白色，不透明；中心凹陷，四周凸起，边缘大面积皱褶且呈不规则扩展，有刺激性气味产生。

优选的，所述LB平板的固体培养基包括：胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠和琼脂粉。

优选的，所述菌株能够拮抗甜菜尾孢菌和立枯丝核菌，其抑菌率分别为52.55％和68.24％。

本发明提供了一株拮抗菌株B17，该菌株的发酵液具有促进甜菜种子萌发和幼苗生长的作用，试验过程中，拮抗菌株B17发酵液处理的甜菜种子发芽率及幼苗在株高、鲜重等方面较对照组均有显著提高。

本发明的还提供了上述促生发酵液的制备方法，包括以下步骤：将上述菌株接种于LB液体培养基中，培养时间为26h，接种量1％，装液量20/50mL，摇床转速160r/min，培养温度28℃。

综上所述，本发明提供的拮抗菌株B17具有良好的生防潜能，可开发具有促生作用的生防菌剂。

附图说明

图1拮抗菌株B17对甜菜尾孢菌和立枯丝核菌的离体抑制作用。

图2拮抗菌株B17单菌落平板培养性状。

图3拮抗菌株B17基于16SrRNA基因序列构建的系统进化树。

图4拮抗菌株B17的生长曲线。

图5拮抗菌株B17对甜菜种子萌发的促生效果。

图6拮抗菌株B17对甜菜幼苗的促生效果。

图7拮抗菌株B17对甜菜幼苗(鲜重)的促生效果。

图8为拮抗菌株B17对甜菜幼苗(株高、叶长和叶宽)的促生效果。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所使用的材料和装置，如无特殊说明，均为市售。

本发明提供了一株暹罗芽胞杆菌B17菌株，所述菌株分离自甜菜种子外部，保存于中国农业大学种子病理学与杀菌剂药理学实验室。

本发明所述拮抗菌株B17优选具有以下性质：

1)菌落形态不规则，乳白色；中心凹陷，四周隆起，边缘大面积皱褶且呈不规则扩展；

2)置于LB液体培养基静止培养时能够形成生物膜；

3)挑取单菌落于LB液体培养基中培养，延迟期在0-5h；对数增长期在5-12h，之后缓慢增长，于24h后进入稳定期；

4)拮抗菌株B17 16S rDNA的核苷酸序列见SEQ ID NO：1。

本发明提供的B17菌株能产生抑菌物质，不仅对引起甜菜种传病害-甜菜褐斑病的甜菜尾孢菌有抑制作用，抑菌率为52.55％，而且对引起甜菜土传病害-甜菜立枯病的立枯丝核菌同样有抑制作用，抑菌率达到68.24％；此外，本发明提供的拮抗菌株B17还能够促进甜菜种子的萌发和幼苗的生长。

具体实施例如下：

1供试材料

1.1供试菌株

1)潜在生防因子：菌株B17分离自甜菜种子外部，保存于中国农业大学种子病理学与杀菌剂药理学实验室。

2)生测模型：分离自甜菜植株中的甜菜尾孢菌(Cercospora beticola)由中国农业大学植物保护学院韩成贵老师课题组馈赠；分离自甜菜植株中的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)由中国农业大学植物保护学院吴学宏老师课题组馈赠。

1.2供试培养基

LB培养基和PDA培养基，培养基具体成分见表1。

表1供试培养基

2芽胞杆菌的分离

拮抗菌株B17分离自甜菜种子(品种：SS1532；来源：新疆)外部。

从各品种不同处理形式的甜菜种子中随机选取100粒置于震荡袋中，加入50mL磷酸盐吐温(PBS-Tween,PBST)缓冲液(pH 7.4)，利用拍打机拍打震荡10min，充分洗涤种子表面细菌；过滤洗涤液，8000r/min转速离心10min，弃上清留沉淀；加入1mL PBST缓冲液涡旋，进行1倍、10倍、100倍和1000倍梯度稀释；各吸取100μL涂布LB平板，每个浓度重复4次，吸取100μL PBST缓冲液涂布作为空白对照；封口倒置放入28℃培养箱培养。

3拮抗菌的初步筛选

3.1菌悬液的制备

挑取单菌落转接至2mL LB液体培养基内，28℃160r/min过夜摇培得到细菌发酵液。

3.2芽胞杆菌对甜菜尾孢菌平板拮抗活性的测定

将供试甜菜尾孢菌和立枯丝核菌菌株接种于PDA平板中央，25℃黑暗倒置培养，待菌落长至硬币大小时备用；

吸取细菌发酵液2μL，滴于菌落位置四方等距离20mm处，置于超净工作台中自然风干，同时设置滴加等量ddH₂O的接有病原菌菌落的PDA培养基作为阴性对照，于28℃黑暗条件下倒置培养4-6d，采用十字交叉法测量病原真菌菌落的直径，计算相对抑制率。

相对抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100

结果：芽胞杆菌与甜菜尾孢菌(C.beticola)和立枯丝核菌(R.solani)的室内平板对峙试验中，菌株B17对两株病原菌均表现有抑制效果，其相对抑制率见表2，B17菌株对C.beticola的抑制率为52.55％，对R.solani的抑制率为68.24％。

表2菌株B17对C.beticola和R.solani的相对抑制率

4拮抗菌的鉴定

4.1形态学鉴定

将拮抗菌B17接种于LB培养基上培养，参照《常见细菌系统鉴定手册》，观察其在LB平板上的形状、大小、颜色以及生长情况。

4.2分子生物学鉴定

挑取菌株单菌落接种于LB平板上，培养2-3d后，挑取单菌落于200μL PCR管中，加入30μL ddH₂O吸打混匀，简易提取细菌总DNA，使用细菌鉴定16S rRNA通用引物对27F/1492R进行PCR扩增并测序，反应体积为20μL，包括10μL 2×Taq PCR Master Mix，正反向引物各0.5μL(10μmol·L^-1)，1μL DNA和8μL ddH₂O；PCR反应程序：95℃预变性5min，35个循环(95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸60s)，72℃终延伸10min。扩增完成后利用1％琼脂糖凝胶电泳确定目标条带，送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序；登录NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，将获得的序列利用BLAST进行同源性比对，利用MEGA 11.0软件构建进化树，分析聚类结果，进一步对生防菌株进行鉴定，确定分类地位。

结果：

菌株B17的形态特征(图2)：菌株B17在LB平板上生长24h后，单菌落大小不一，形态不规则，颜色为不透明的乳白色；菌落干燥，中心凹陷，四周凸起，边缘大面积皱褶且呈不规则扩展，有刺激性气味产生。

分子生物学鉴定：拮抗菌株B17基于16S rRNA扩增，PCR产物测序后得到长度为1447bp的16S rRNA序列，测序结果如SEQ ID NO：1所示：

ATCGAGGCGTGCTATAATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGGACAGAT

使用邻接法构建系统发育树(图3)进行分子生物学层面的鉴定，菌株B17与暹罗芽胞杆菌(B.siamensis)聚为一支。

综合拮抗菌株B17的菌落形态特征及系统进化树分析，将该菌株鉴定为暹罗芽胞杆菌(B.siamensis)。

5拮抗菌B17对甜菜种子萌发以及幼苗生长促生效果的测定

5.1生长曲线的测定

将拮抗菌B17菌株接入LB平板，28℃培养2d后，挑取单菌落接种于20mL LB液体培养基中，28℃，160r/min，摇培12h，运用分光光度计将所有菌液OD值调整至0.3，梯度稀释至0.03、0.003、0.0003，备用；向蜂窝板中分装200μL OD值0.0003的菌液，重复3次，同时设置添加相同体积LB液体培养基的阴性对照；利用生长曲线测定仪测定菌液吸光值(600nm波长)，每30min测定一次，连续测定3d，测定过程中持续震荡蜂窝板。根据生长曲线结果，确定摇培时间，选择稳定期的生防菌发酵液作为促生试验的菌液。

5.2拮抗菌对甜菜种子萌发的促生作用测定

将上述拮抗菌挑取单菌落，接种到1mL LB液体培养基中，160r/min过夜摇培，之后吸取200μL菌液接种到20mL LB液体培养基中，在摇床上摇培适宜时间(根据5.1确定)，参考GB/T 3543.4-1995农作物种子检验规程(发芽试验)，选取健康的甜菜种子，利用1％次氯酸钠溶液浸泡消毒5min，无菌水清洗4-6次；在超净工作台中将种子取出，分别浸在拮抗菌菌悬液中4h，用相同体积的LB液体培养基作为阴性对照，每个处理100粒种子，3次重复；浸泡完成后在超净工作台中将种子取出吹干，均匀摆放于培养皿中(直径9cm)，皿中已放有两层润湿的灭菌滤纸，放入25℃培养箱内保湿催芽；7d后调查发芽率，采用t测验(p<0.05)分析差异显著性。

发芽率(％)＝第7d发芽种子数/种子总数×100

5.3拮抗菌对甜菜幼苗生长的促生作用测定

采用盆栽方式，挑选饱满的甜菜种子在28℃恒温培养箱中催芽48h后播种于土壤中；待甜菜苗生长至第二片真叶长出时，每盆留2棵长势一致的甜菜苗；用摇培适宜时间(根据5.1确定)的拮抗菌菌悬液灌根，每株10mL；同时设置空白对照，用LB灌根，每盆10mL，每个处理8株甜菜苗，重复3次；将处理好的甜菜苗放置于培养箱中，定期浇水。培养21d后调查甜菜苗的生长情况，记录株高、叶宽、叶长以及鲜重。采用t测验(p<0.05)分析差异显著性。

结果：

拮抗菌B17生长曲线的测定：利用生长曲线测定仪测定拮抗菌的生长曲线(图4)，B17菌株的延迟期基本在0-5h；对数增长期在5-12h，之后缓慢增长，于24h后进入稳定期。考虑到芽胞杆菌菌株稳定期菌量大，且能稳定地释放抑菌物质，因此确定促生试验的菌液培养时间为26h。

拮抗菌B17对甜菜种子萌发的促生效果：用B17菌株的菌悬液处理甜菜种子，处理后的甜菜种子发芽率见表3，菌株B17处理后的甜菜种子发芽率为89.78％，与对照组之间存在着显著差异(图5)，说明菌株B17能显著性地促进甜菜种子的萌发。

表3拮抗菌B17对甜菜种子萌发的影响

拮抗菌B17对甜菜幼苗生长的促生效果：利用灌根法测定拮抗菌对甜菜幼苗生长的影响，处理21d后的各植株形态见图6。对甜菜幼苗的地上部分生长指标测量统计(图7和图8)，菌株B17处理后的甜菜幼苗4项生长指标(株高、叶长、叶宽和鲜重)均有显著提高，表明菌株B17显著地促进了甜菜幼苗的生长。

Claims (7)

1.一株甜菜病害拮抗菌株，其特征在于：该拮抗菌株为暹罗芽胞杆菌(Bacillussiamensis)，分离自甜菜种子外部，于2022年3月20日保存于中国农业大学种子病理学与杀菌剂药理学实验室，保藏编号为SHC XJ17202203；

所述菌株的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株在LB平板上生长24h后，单菌落形态不规则，乳白色，不透明；中心凹陷，四周凸起，边缘大面积皱褶且呈不均匀扩展。

3.根据权利要求2所述的菌株，所述LB平板的固体培养基，包括：胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠和琼脂粉。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的拮抗菌株，其特征在于，该菌株能够拮抗甜菜尾孢菌和立枯丝核菌。

5.根据权利要求4所述的拮抗菌株，其特征在于，该菌株的生长延迟期在0-5h左右；基本于24h后进入稳定期。

6.根据权利要求4所述的菌株，其特征在于，该菌株的发酵液具有促进甜菜种子萌发和幼苗生长的作用。

7.一种根据权利要求1-6所述的任意一株甜菜病害拮抗菌株的制备方法，所述菌株的发酵液发酵时间为20-26h，接种量0.5-1.5％，摇床转速120-160r/min，培养温度28℃。

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