CN101845410B - 一株植物内生枯草芽胞杆菌tr21及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株对植物病原真菌具有广谱拮抗能力的枯草芽胞杆菌TR21(后续简称TR21)，具体地说是提供枯草芽胞杆菌TR21(Bacillus subtilisstr.TR21)菌株及其对植物病原真菌的生长抑制作用。本发明提供的枯草芽胞杆菌TR21菌株(Bacillis subtilis str.TR21)，已于2010年1月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武昌珞珈山武汉大学校内中国典型培养物保藏中心；保藏号为CCTCC No：M 2010019。本发明提供的上述菌株通过获得的16S rDNA、gyrA和gyrB基因片段，并在NCBI上通过BLAST搜索和比对后被证明是一种新的枯草芽胞杆菌菌株，能够对多种植物病原真菌具有较好的平板拮抗活性，尤其对各种尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、交链孢霉等土传维管束病害具有很好的拮抗能力，并在田间表现出良好的防治效果。

Description

一株植物内生枯草芽胞杆菌TR21及其应用

技术领域

本发明涉及一株对植物病原真菌具有广谱拮抗能力的枯草芽胞杆菌TR21(后续简称TR21)，具体地说是提供枯草芽胞杆菌TR21(Bacillus subtilis str.TR21)菌株(CCTCC No：M 2010019)及其对植物病原真菌的生长抑制作用，尤其在香蕉枯萎病和西芹黄萎病生物防治方面的能力，它属于生物农药、抗病微生物肥料的范畴。

背景技术

我国水果、蔬菜等园艺作物因病害引起的损失非常严重，根据1984-1986全国园林植物病虫害普查的结果，在1256种园林植物上发现植物病害5508种，平均每种植物上4.4种，蔬菜、花卉、果树等园艺作物的病害发生远比大宗禾谷类农作物严重。据我国农业部全国农业技术推广中心统计，我国农作物每年因病虫草鼠造成大量损失，其中水果、蔬菜损失达25％以上，远远大于粮食(10％)和棉花(15％-20％)。尤其是近年来，随着农村经济的发展和农业产业结构的调整，越来越多的农民从事园艺作物的生产和栽培，由于在有限的土地上长期轮作，土传病害、维管束病害严重影响了农业的健康发展。

随着农业可持续发展战略的实施，人们逐渐重视化学农药的危险和危害，因此，符合环保、健康、高效、安全、环境友好的生物农药成为当前生态农业研究的主题。目前国际上生物农药产品已超过100多种，但90％以上是微生物杀虫剂。有专家预测第二个重要的商业化生物农药将是微生物杀菌剂。

枯草芽胞杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性细菌，可以产生内生芽胞，在土壤和植物的表面普遍存在，同时还是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无害，不污染环境。它生长速度快、营养需求简单，在植物的表面易于存活、定殖和与繁殖，而且生产枯草芽胞杆菌制剂的工艺简单，制剂稳定，施用方面，存储期长，是一种理想的生防微生物。

枯草芽胞杆菌主要通过五种不同途径发挥效果。首先，枯草芽胞杆菌能够在寄主植物上定殖，易有金研究了枯草芽胞杆菌B-001菌株通过自然孔口和伤口入侵寄主植物定殖的问题，穆常青等研究了枯草芽胞杆菌B-332在水稻上的定殖与防治稻瘟病的关系。其次，枯草芽胞杆菌可以通过非核糖体途径产生抗菌物质，如脂肽类抗生素、多肽类抗生素等，如伊枯草菌素家族、表面活性素、芬枯草菌素等以及一些结果未知的环肽抗生素。再次，枯草芽胞杆菌还能够吸附在病原菌的菌丝上，并随着菌丝的生长而生长，产生溶菌物质，造成真菌原生质泄露后，使真菌的细胞壁或细胞膜破裂，致使细胞出现穿孔、畸形等现象。林福呈从甘蔗根围分离的枯草芽孢杆菌S9对立枯丝核菌产生溶菌作用，高学文等对枯草芽孢杆菌B2菌株产生的胞外物质进行了分离纯化，获得的抗菌物质可以使小麦赤霉病菌的分生孢子发生畸变从而抑制其萌发。再次，枯草芽胞杆菌可以通过诱导植物产生系统抗性来发挥作用，李德全等对枯草芽胞杆菌Bs-916进行诱变，并发现Bs-916及其突变株分泌的活性物质对水稻具有诱导抗性作用，使得水稻体内过氧化物酶等抗病酶活增强。再次，枯草芽胞杆菌可以通过促进植物生长来达到抗病的作用，如蔡学清等发现植物内生枯草芽胞杆菌BS-2对小白菜具有促生作用，并表现出抗病能力。

根据姜莉莉等的综述，美国已有4株枯草芽胞杆菌生防菌株(QST713、MB1600、GB03和FZB24)得到EPA商品化或有限商品化生产应用许可。其中QST713商品名Serenade得到食用作物病害应用的审批和认可，通过叶面施用能够防治蔬菜、樱桃、番茄、葡萄和胡桃多种作物的白粉病、烂根病、霜霉病、疫病、灰霉病等细菌和真菌引起的病害。GB03商品名Kodiak，可直接施用于土壤或者拌种用于预防棉花、豆类和花生等由镰刀菌、曲霉菌、链格孢属和丝核菌属所引起的根部和种子的真菌病害。MB1600商品名Subtilex，用于防治灰霉病、白粉病及由丝核菌属、镰刀菌属、曲霉属引起的叶部和根部病害，FZB24商品名TaegroTM，施用于温室或室内栽培树苗、灌木和装饰植物根部可防治镰刀菌和丝核菌引起的根腐病和枯萎病，也可以用于防治番茄晚疫病、灰霉病、小麦白粉病和植物轮枝菌，还可以作为增产促生剂。我国现已开发成功并投入使用的枯草芽胞杆菌商品制剂有百抗、麦丰宁、纹曲宁、亚宝等。百抗的有效成分是枯草芽孢杆菌B908，作用机制是营养竞争、位点占领，对烟草、三七、花卉、小麦、白菜等易患土壤病害的作物具有很好的防治效果，对水稻纹枯病的防治效果达70％以上。麦丰宁是利用枯草芽胞杆菌B3菌株制成的活体生物杀菌剂，其防病机制主要产生抗菌物质。

在利用枯草芽胞杆菌防治香蕉枯萎病方面也有相关的工作开展，但仍然处于菌株筛选、鉴定和室内平板拮抗活性测定，少数开展了盆栽实验，还没有大田试验的报道。孙正祥和王振中从香蕉根际土壤中分离筛选出一株对香蕉枯萎病有防治效果的地衣芽孢杆菌C4，在温室中表现出良好的防效。殷晓敏等从香蕉假茎内分离获得一株编号为B215的枯草芽胞杆菌，在平板上对香蕉枯萎病和其它的几种香蕉病原菌菌丝生长和孢子萌发具有抑制效果。付业勤等对香蕉内生枯草芽胞杆菌BEB2在不同温度、pH值和培养基下发酵液对香蕉枯萎病生长的抑制能力，并在人工接种的条件下，研究了2个月内BEB2对香蕉枯萎病4号生理小种的盆栽防效，先接种BEB2的防效达到98％。孙正祥等从香蕉根际土壤中分离获得一株枯草芽胞杆菌S-1，对包括香蕉枯萎病、番茄枯萎病等一批病原真菌具有广谱拮抗活性，并且测定该菌株最适的pH值为7.0～8.0，最适的培养温度26～30℃，最适的培养基为PYTG或PDA。黄小光等测定了枯草芽胞杆菌、荧光假单胞菌等生防菌对香蕉枯萎病菌菌丝的抑制效果。杨秀娟等利用利福平抗性芽胞杆菌T2WF和W10菌株开展了芽胞杆菌在香蕉体内和根际定殖的研究。在上述所有涉及香蕉枯萎病生物防治的枯草芽胞杆菌菌株中，尚无菌株开展了大田防治试验，并缺乏大田防治试验的防效。

另外，枯草芽胞杆菌能够产生各种酶类、抗生素、表面活性剂，被广泛应用与商业、工业生产和农业生产中(Fritze，2004)，在植物病害生物防治中也应用广泛(赵达等，2007；姜莉莉等，2009)。枯草芽胞杆菌组的种类包括Bacillus subtilis subsp.subtilis(Smithet al.，1964；Nakamura et al.，1999)，B.lichenifromis(Skerman et al.，1980)，B.atrophaeus(Nakamura，1989)，B.mojavensis(Robert et al.，1994)，B.vallismortis(Roberts et al.，1996)，B.subtilis subsp.spizizenii(Nakamura et al.，1999)，B.sonorensis(Palmisano et al.，2001)，B.subtilis subsp.inaquosorum(Rooney et al.，2009)，这些种类的亲缘关系很近，可以通过脂肪酸组成分析、DNA-DNA杂交分析以及限制性酶切分析区分开来，但很难通过表型特征分析区分开来(Fritze，2004，Wang，et al.，2007)，虽然16S rDNA/RNA基因序列广泛应用于细菌鉴定或构建细菌的系统进化关系，但在亲缘关系很近的分类类群间，由于序列间的相似度太高而失效(Christensen et al.，1998)，16S rDNA序列不能有效区分枯草芽孢杆菌组的菌种。

Chun and Bae(2000)用编码DNA促旋酶(gyrase)A亚基的基因gyrA分析了枯草芽胞杆菌和相近种类的进化关系，发现基于gyrA基因部分序列的系统进化分析，可以区分枯草芽胞杆菌组中的近缘种。Rooney等(2009)测定了大量枯草芽孢杆菌菌株的gyrA基因序列，并利用gyrA基因细致的研究了枯草芽孢杆菌种间的复杂性，发现枯草芽胞杆菌的不同菌株存在很大的差异，可以基于gyrA分成不同的群，并根据gyrA基因开展的系统进化分析，发现和描述了枯草芽孢杆菌的一个新的亚种B.subtilis subsp.inaquosorum，到2009年为止，枯草芽胞杆菌以确定了3个亚种。

gyrB基因的分子进化速率大于16S rRNA基因，因而gyrB基因也非常适合近缘种的鉴定，目前已经在假单胞菌属Pseudomonas(Yamamoto&Harayama，1998)、不动杆菌属Acinetobacter(Yamomoto&Harayama，1996；Yamamoto et al.，1999)、分枝杆菌属Mycobacterium(Kasai et al.，2000；Niemann et al.，2000)、沙门氏菌属Salmonella、志贺氏菌属Shigella、大肠杆菌Escherichia coli(Fukushima et al.，2002)、气单胞菌属Aeromonas(

et al.，2003；侯晓丽等，2006)、拟诺卡氏菌属Nocardiopsis(杨玲玲等，2007)、炭疽杆菌-蜡状芽胞杆菌-苏云金芽胞杆菌组B.anthracis-cereus-thuringiensisgroup(La Duc et al.，2004)、枯草芽胞杆菌组B.subtilis group(Wang et al.，2007)，B.amyloliquefaciens近缘种B.velezensis(wang et al.，2008)的鉴定上使用了gyrB基因。国内已有研究者就gyrB基因在鉴别细菌近缘种的应用方面开展了综述研究(李献梅等，2008；郝云婕和韩素贞，2008)。为了准确鉴定本专利菌株，并获得更为丰富的信息用于保护本菌株，本专利还对TR21的16S rDNA、gyrA、gyrB基因序列进行了测定和分析，并利用Biolog和API微生物鉴定系统进行了鉴定，获得了丰富的菌株生理生化和分子标签。

发明内容

本发明的目的在于提供一株植物内生枯草芽胞杆菌。

本发明提供的枯草芽胞杆菌TR21菌株(Bacillis subtilis str.TR21)，已于2010年1月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武昌珞珈山武汉大学校内中国典型培养物保藏中心；保藏号为CCTCC No：M 2010019。

该菌株分离自珠海市农业科学研究中心种植的双色石斛兰叶片(Dendrobiumchrysopterum)，为革兰氏阳性菌，菌体杆状，产生芽胞，生长需要氧气，接触酶、氧化酶试验阳性，能在0.001％的溶菌酶存在下生长，具有水解淀粉、酪蛋白、尿素、吐温80的能力，能够利用柠檬酸盐，具有糖酵解能力、硝酸盐还原能力，具有产硫化氢能力，不产生苯丙氨酸脱氨酶，V.P反应阴性，不能利用苹果酸和甘氨酸，不能利用阿拉伯糖产酸，不能利用酪氨酸，不能产生二羟基丙酮，不能在50℃生长，10℃不能生长。在3％到10％的NaCl存在时均能生长，生长pH范围较广，pH5.0～pH9.0均能生长，最佳生长pH值为6.0，最佳氮源为酵母浸提物，最佳碳源为葡萄糖，在NA培养基上，老龄菌落颜色金黄色、表面光滑较粘稠、有时会出现褶皱，在PDA上，菌落初期表现出浓状，后期变成干燥皱缩，菌落呈现出明显的扩展能力。TR21可以分泌抗菌蛋白和脂肽以抑制植物病原菌的生长，并能够通过根系的伤口入侵到香蕉体内，定殖到香蕉的球茎和根系，并在香蕉根际的土壤中形成一定的种群。

本发明的另一目的在于提供该菌株在用于抑制植物病原菌方面的用途，特别是防治由尖孢镰刀菌引起香蕉和西芹病害方面的用途。

本发明提供的上述菌株通过获得的16S rDNA、gyrA和gyrB基因片段，并在NCBI上通过BLAST搜索和比对后被证明是一种新的枯草芽胞杆菌菌株，能够对多种植物病原真菌具有较好的平板拮抗活性，尤其对各种尖孢镰刀菌、立枯丝核菌、交链孢霉等土传维管束病害具有很好的拮抗能力，并在田间表现出良好的防治效果；在珠海斗门小赤坎村和井岸鸡嘴村开展防治巴西蕉枯萎病、皇帝蕉枯萎病和农科1号抗性香蕉枯萎病的大田试验，对巴西蕉枯萎病2年综合防效达到64.57％，喷施叶腋对农科1号抗性蕉的防效达到85％，对皇帝蕉的防效达到82.09％。发酵液稀释100倍泼洒对西芹黄萎病的防治效果达到60.45％。

附图说明

图1TR21生长曲线；

图2不同氮源对TR21生长的影响；

图3不同碳源对TR21生长的影响；

图4不同pH对TR21生长的影响；

图5菌株TR21的基因组DNA；

图6菌株TR21的16S rDNA、gyrA和gyrB基因PCR扩增结果；

图7基于gyrA基因序列的菌株TR21与相关菌株的系统发育树；

图8基于gyrB基因序列的菌株TR21与相关菌株的系统发育树；

图9TR21发酵上清不同饱和度硫酸铵沉淀蛋白对香蕉枯萎病病原菌FOC-zh(鸡)菌株菌丝生长的抑制作用；

图10TR21发酵上清不同饱和度硫酸铵沉淀蛋白对香蕉枯萎病病原菌FOC-zh(廖)菌株菌丝生长的抑制作用；

图11TR21产生抗菌脂肽粗提物对香蕉枯萎病病原菌FOC-zh(鸡)菌株菌丝生长的抑制作用；

图12TR21产生抗菌脂肽粗提物对香蕉枯萎病病原菌FOC-zh(廖)菌株菌丝生长的抑制作用；

图13TR21产生抗生素标记TR21在香蕉体内的定殖情况；

图14TR21产生抗生素标记TR21在香蕉根际的定殖情况。

具体实施方式

实施例1：TR21的分离纯化、理化性质研究和鉴定

(一)TR21的分离、纯化和保藏

在珠海市农业科学研究中心兰花生产基地的温室中，采集健康的双色石斛叶片，自来水冲洗干净，晾干后75％酒精处理1min，再用5％的NaOCl处理5min，无菌水漂洗4次；晾干后，用无菌剪刀和镊子将叶片剪成0.2cm×0.5cm左右的组织块，铺于含放线菌酮50μg/ml的NA(牛肉膏蛋白胨培养基)平板上；28℃恒温培养，每天观察，一旦发现有菌从切口长出即挑出，于新的NA平板纯化培养，并以菌液形式用20％甘油保存于-20℃及-80℃。再取第4次漂洗的无菌水200μl涂于NA平板，做3个重复，同等条件培养，观察是否长菌。一旦发现无菌水涂的平板长菌，则分离平板上分离到的相应菌株视为非内生菌而放弃。

(二)TR21的理化性质测定

试验方法及所需培养基：

(1)NA培养基(用于培养细菌)：牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡萄糖2.5g，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。

(2)需氧性试验(用于细菌鉴定)：在厌氧罐中进行，培养基为NA平板；在无氧的情况下，挑取新鲜培养的待测菌在NA平板中划线，37℃培养；不生长则为阴性，反之为阳性。测试结果见表1，下同。

(3)氧化酶试验(用于细菌鉴定)：购买氧化酶试纸，挑取新鲜培养的待测菌菌苔，涂抹在试纸上；在10s内涂抹的菌苔出现红色者为阳性，10s～60s出现红色者为延迟反应，不出现红色或者60s以上出现红色者均为阴性。

(4)接触酶试验(用于细菌鉴定)：配制3％～10％过氧化氢，挑取新鲜培养的待测菌一小环涂抹于已滴有过氧化氢溶液的玻璃片上；如有气泡产生则为阳性，反之为阴性。

(5)V.P试验(用于细菌鉴定)：培养基配方为蛋白胨5g、葡萄糖5g、磷酸氢二钾5g、水1000ml，pH7.0～7.2，每管分装4ml～5ml，115℃灭菌30min；接种待测菌于该培养液中37℃振荡培养24h后，取培养液和40％氢氧化钠等量相混，加少许肌酸，10min后如培养液出现红色则为阳性(有时需要放置更长时间才出现红色反应)，反之为阴性。

(6)最高和最低生长温度试验(用于细菌鉴定)：最高生长温度(设置55℃、50℃)试验采用NA液体培养，挑取待测菌的新鲜液体培养物一小环转入NA培养液中，分别置于55℃、50℃水浴摇床振荡培养，观察生长情况，另设置37℃培养为对照；如果在该温度中连续3次移种生长，则认为在此温度中能够生长，为阳性，反之为阴性。最低生长温度(设置10℃、15℃)试验采用NA固体平板培养，挑取待测菌的新鲜液体培养物一小环在NA平板中划线，然后分别置于10℃、15℃培养箱中，观察生长情况，另设置37℃培养为对照；能生长则为阳性，反之为阴性。

(7)对溶菌酶抗性试验(用于细菌鉴定)：在100ml的三角瓶中，放入60ml～65ml无菌的0.01mol/L HCL，加入0.1g溶菌酶，瓶上塞无菌棉花，在小火上煮沸20min，冷却至室温后，用无菌的0.01mol/L HCL补足液体体积至100ml即为溶菌酶液；取1ml溶菌酶液与99ml无菌的NA培养液混合，分装于无菌试管，每管2.5ml，在含有0.001％溶菌酶NA培养液试管及无溶菌酶的NA培养液试管对照管中，各接种1环菌液，37℃培养5d～7

d；能生长则为阳性，反之为阴性。

(8)能否在pH5.7的培养液中生长试验(用于细菌鉴定)：取待测菌液一环，接种于pH5.7的NA培养液中，同时接种普通NA培养液(pH7.2)作对照，37℃培养1d～3d后观察生长情况；能生长则为阳性，反之为阴性。

(9)耐盐和需盐试验(用于细菌鉴定)：在NA培养液中加入NaCl，使NaCl终浓度分别为3％、5％、7％和10％，取待测菌液一环，接种于上述培养基中，37℃培养，观察生长情况；能生长则为阳性，反之为阴性。

(10)产酸试验(用于细菌鉴定)：需要测试的糖和醇包括葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇和半乳糖；培养基配方为磷酸氢二铵1.0g、氯化钾0.2g、硫酸镁0.2g、酵母膏0.2g、糖或醇类10.0g、溴百里酚蓝1％水溶液3ml、蒸馏水1000ml，pH7.0～7.2，试管分装，112℃灭菌30min；挑取新鲜培养的待测菌，穿刺接种4支试管，其中2支用灭菌的凡士林石蜡油封盖，约0.5cm～1.0cm厚，以隔绝空气为闭管；另2支不封凡士林石蜡油为开管；同时以不接种的闭管和开管做对照；37℃培养1d、2d、3d、7d、14d后观察结果；培养基颜色变为黄色者为阳性，反之为阴性，其中只有开管产酸变黄者为氧化型产酸，开管和闭管均产酸变黄者为发酵型产酸。

(11)淀粉水解试验(用于细菌鉴定)：在配制NA固体培养基的同时，加入可溶性淀粉，使其终浓度为0.2％，121℃灭菌20min，倒平板备用；挑取新鲜培养的待测菌点接于上述平板中，37℃培养2d～5d，形成明显菌落后，在平板上滴加碘液，平板即呈蓝黑色，菌落周围如有不变色透明圈，则表示淀粉水解，为阳性，仍为蓝黑色则为阴性。

(12)柠檬酸盐利用实验(用于细菌鉴定)：培养基配方为氯化钠1g、7水合硫酸镁0.2g、磷酸二氢铵0.5g、柠檬酸钠2g、蒸馏水1000ml、0.04％酚红液20ml，121℃灭菌20min，倒平板备用；挑取新鲜培养的待测菌于上述平板中划线，37℃培养3d～7d，如果培养基为碱性(指示剂变蓝色或桃红色)则为阳性，反之为阴性。

(13)丙酸盐利用实验(用于细菌鉴定)：培养基配方为氯化钠1g、7水合硫酸镁0.2g、磷酸二氢铵0.5g、丙酸钠2g、蒸馏水1000ml、0.04％酚红液20ml，121℃灭菌20min，倒平板备用；挑取新鲜培养的待测菌于上述平板中划线，37℃培养3d～7d，如果培养基为碱性(指示剂变蓝色或桃红色)则为阳性，反之为阴性。

(14)硝酸盐被还原为亚硝酸盐试验(用于细菌鉴定)：NA培养液中加入硝酸钾1g即为硝酸盐液体培养基，pH7.0～7.6，每管分装4ml～5ml，121℃灭菌20min备用；另外配制格里斯氏试剂A液和B液，A液为对氨基苯磺酸0.5g、稀醋酸(10％左右)150ml，B液为a-萘胺0.1g、蒸馏水20ml、稀醋酸(10％左右)150ml；二苯胺试剂为二苯胺0.5g溶于100ml浓硫酸中，用20ml蒸馏水稀释；将待测菌接种于硝酸盐液体培养基中，37℃振荡培养1d、3d、5d，另留两管不接种作对照；取2支干净的空试管，分别倒入少许培养1d、3d、5d的培养液，再各加一滴A液和B液，对照管也作同样处理；如果溶液变为粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色等则表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性，如无红色出现，则可加1、2滴二苯胺试剂，如溶液呈蓝色，则表示培养液中仍有硝酸盐，且又无亚硝酸盐反应，则表示无硝酸盐还原作用，为阴性；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐已还原为其它物质，故仍应判断为硝酸盐还原阳性。

(15)产吲哚试验(用于细菌鉴定)：配制1％胰胨水溶液，pH7.2～7.6，试管分装，115℃灭菌30min；另配制如下试剂——对二甲基氨基苯甲醛8g、95％乙醇760ml、浓盐酸160ml；挑取待测菌于上述培养液中振荡培养1d、2d、4d、7d后，沿试管壁缓缓加入3ml～5ml上述试剂于培养液表面，在液层界面出现红色，即为阳性，反之为阴性。

(16)产硫化氢试验(用于细菌鉴定)：培养基配方为蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏10g、半胱氨酸0.5g、蒸馏水1000ml，pH7.0～7.4，试管分装，112℃灭菌30min。另将普通滤纸剪成0.5cm～1cm宽，长度根据试管与培养液高度而定；用5％～10％的醋酸铅将纸条浸透，然后用烘箱烘干，放于培养皿中灭菌备用。挑去新鲜培养的待测菌接种于上述培养液中，然后用无菌镊子夹取1条醋酸铅纸条并用棉塞塞紧，使其悬挂于管中，37℃静置培养，分别在3d、7d、14d后观察。纸条变黑色则为阳性，不变色则为阴性。

(17)产二羟基丙酮试验(用于细菌鉴定)：培养基配方为甘油10.0ml、酵母膏1.0g、蛋白胨0.5g、碳酸钙0.3g、磷酸二氢钾0.3g、琼脂粉1.8g，pH5.5～6.0，121℃灭菌15min，倒平板备用；另配制显色液——二苯胺2g、乙酸200ml、浓硫酸20ml。挑去新鲜培养的待测菌，在上述平板中划线，37℃培养10d后，倒入显色液，以覆盖菌落为宜，2h内检查，如在菌落周围出现红色晕圈则为阳性，反之为阴性。

(18)苯丙氨酸脱氨酶试验(用于细菌鉴定)：培养基配方为酵母膏3g、氯化钠5g、磷酸氢二钠1g、DL-苯丙氨酸2g、琼脂12g、蒸馏水1000ml，pH7.0，试管分装，121℃灭菌10min后摆成斜面；另配制10％(W/V)的三氯化铁溶液。挑取新鲜培养的待测菌在上述培养基斜面中划线，37℃培养4h或8h～24h，然后将4～～5滴三氯化铁溶液到生长菌的斜面上，当斜面上冷凝水中产生绿色时即表明形成苯丙酮酸，为阳性，反之为阴性。

(19)酪蛋白水解试验(用于细菌鉴定)：取5g脱脂奶粉、1.5g琼脂分别溶于50ml蒸馏水中，121℃灭菌20min；待两种液体冷却至45℃～50℃后，互相混均匀并倒平板；平板倒置过夜以使平板表面水分干燥，然后点接新鲜培养的待测菌，37℃培养1d、3d、5d后，观察菌落周围是否出现透明圈，如出现透明圈则为阳性，反之为阴性。

(20)酪氨酸水解试验(用于细菌鉴定)：将L-酪氨酸0.5g悬浮于10ml蒸馏水中，112.6℃灭菌20min，然后与100ml无菌的NA固体培养基混合，倒平板，待凝固后，将测试菌接种于平皿上，37℃培养7d～14d，记录酪氨酸结晶是否被水解而变透明，如变透明则为阳性，反之为阴性。

(21)尿素分解试验(用于细菌鉴定)：培养基配方为蛋白胨1g、氯化钠5g、葡萄糖1g、磷酸二氢钾2g、0.2％酚红水溶液6ml、琼脂20g、蒸馏水1000ml，pH6.8～6.9，试管分装，115℃灭菌30min，此时培养基呈橘黄色或微带粉红色；冷却至50℃左右，加入过滤除菌的20％尿素溶液，使其终浓度为2％，摆成斜面。挑取新鲜培养的待测菌在斜面上划线，37℃培养，培养基呈桃红色者为阳性，培养基颜色不变者为阴性(阴性结果要观察4d)。

(22)土温80降解试验(用于细菌鉴定)：培养基配方为蛋白胨10g、氯化钠5g、7水合氯化钙0.1g、琼脂9g、蒸馏水1000ml，pH7.4，121℃灭菌20min；待培养基温度冷却至45℃左右，加入土温80至其终浓度为1％，然后倒平板；挑取新鲜培养的待测菌，在上述平板中划线，37℃培养7d，每天观察，如菌落周围有模糊晕圈则为阳性，反之为阴性。

(23)TR21生长曲线的测定：将NA培养液装于三角瓶中，装载量为40％，灭菌后，接种0.1％的TR21新鲜种子液，37℃、180r/m振荡培养12h、24h、36h、48h、72h后采集TR21培养液，蒸馏水稀释10倍后测OD₆₀₀，设置五个重复，每个重复每个时间段测三次，计算平均OD₆₀₀，已培养时间(h)为横坐标，OD₆₀₀为纵坐标绘制生长曲线。参见附图1。

(24)TR21对不同氮源的利用：基础培养基配方为磷酸二氢钾1.36g、二水氯化钙0.005g、磷酸氢二钠2.13g、葡萄糖10g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸亚铁0.0005g、水1000ml，分别加入各种氮源，116℃灭菌30min(等灭菌完后，二水氯化钙单独溶解并无菌过滤后再加入)，牛肉膏、蛋白胨、酵母浸提粉、酪蛋白、硝酸钾、氯化铵，加入量为2％；灭菌后接种0.1％的TR21新鲜种子液，37℃、180r/m振荡培养24h后，蒸馏水稀释培养液5倍后测OD₆₀₀，每种碳源设置3个重复，每个重复测三次，计算平均OD₆₀₀。结果参见附图2，其中图上不同的大写字母表示方差分析和多重比较差异极显著，P＜0.01，下同。

(25)TR21对不同碳源的利用：基础培养基配方为硫酸铵2.0g、七水硫酸镁0.2g、磷酸二氢钠0.5g、二水氯化钙0.1g、磷酸氢二钾0.5g，水1000ml，分别加入各种碳源，116℃灭菌30min(等灭菌完后，二水氯化钙单独溶解并无菌过滤后再加入)，供试碳源果糖、葡萄糖、蔗糖、甘氨酸、甘露醇、精氨酸、苹果酸，加入量为2％；灭菌后接种0.1％的TR21新鲜种子液，37℃、180r/m振荡培养24h后，测培养液OD₆₀₀，每种碳源设置3个重复，每个重复测三次，计算平均OD₆₀₀。结果参见附图3。

(26)pH对TR21生长的影响：用盐酸和氢氧化钠将NA培养液pH值分别调为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，常规灭菌后，上述NA培养液的pH值分别变为4.15、5.13、6.11、7.23、7.83、8.30、8.65、8.99、9.29、9.56、9.78，接种0.1％的TR21新鲜种子液，37℃、180r/m振荡培养24h后，蒸馏水稀释培养液5倍后测OD₆₀₀，每种pH设置3个重复，每个重复测三次，计算平均OD₆₀₀。结果参见附图4。

表1TR21生理生化特征

厌氧生长	-	最高生长温度(50℃不长)	-	硝酸盐还原亚硝酸盐	+
						pH5.7生长	+	最低生长温度(10℃不长)	-	苯丙氨酸脱氨酶	-
3％NaCl生长	+	葡萄糖产酸	+	产吲哚	-
						5％NaCl生长	+	阿拉伯糖产酸	-	产硫化氢	+
7％NaCl生长	+	木糖	+	产二羟基丙酮	-
						10％NaCl生长	+	甘露醇	+	酪蛋白水解	+
0.001％溶菌酶生长	+	半乳糖	+	酪氨酸水解	-
						接触酶	+	淀粉水解	+	尿素分解	+
氧化酶	+	柠檬酸盐利用	+	吐温80水解	+
						V.P.实验	-	丙酸盐利用	-

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性。

(三)利用Biolog微生物鉴定系统鉴定的结果

本申请对TR21菌株进行了Biolog鉴定，样品送往广东省微生物分析检测中心鉴定。Biolog未能给出准确的鉴定结果，但提供了详细的有关菌株碳源利用的资料，结果参见表2。

表2、Biolog鉴定系统提供的TR21菌株代谢能力

底物

代谢

底物

代谢

底物

代谢

底物

代谢

水

-

α-D-乳糖

+

D-塔格糖

+

L-丙氨酰胺

+

α-环式糊精

-

乳果糖

+

D-海藻糖

+

D-丙氨酸

+

β-环式糊精

-

麦芽糖

-

松二糖

+

L-丙氨酸

+

糊精

-

麦芽三糖

+

D-阿洛酮糖

L-丙氨酰-甘氨酸

-

糖原

-

D-甘露醇

+

D-木糖

+

L-天冬酰胺

+

菊糖

-

D-甘露糖

+

乙酸

-

L-谷氨酸

+

甘露聚糖

-

D-松三糖

+

α-羟基丁酸

-

甘氨酰基-谷氨酸

-

吐温40

+

D-蜜二糖

+

β-羟基丁酸

-

L-焦谷氨酸

-

吐温80

+

α-甲基-D-半乳糖苷

-

γ-羟基丁酸

-

L-丝氨酸

+

N-乙酰基-D-葡萄糖胺

-

β-甲基-D-半乳糖苷

-

p-羟基-苯乙酸

-

丁二胺

-

N-乙酰基-β-D-甘露糖胺

-

3-甲基-葡萄糖

-

α-酮戊二酸

-

2，3-丁二醇

+

苦杏仁苷

-

α-甲基-葡萄糖苷

+

α-Ketovaleric acid

+

甘油

+

L-阿拉伯糖

+

β-甲基-葡萄糖苷

+

乳酰胺

+

腺苷

+

D-阿拉伯糖醇

-

α-甲基-甘露糖苷

-

D-乳酸甲基酯

-

2-脱氧腺苷

+

熊果苷

+

帕拉金糖

+

L-乳酸

+

肌苷

-

D-纤维二糖

+

D-阿洛酮糖

+

D-苹果酸

-

胸腺嘧啶

+

D-果糖

+

D-棉子糖

+

L-苹果酸

+

尿核苷

-

L-海藻糖

-

L-鼠李糖

-

丙酮酸甲基酯

-

腺苷-5‘单磷酸

+

D-半乳糖

+

D-核糖

+

琥珀酸单甲基酯

-

胸腺嘧啶-5’-单磷酸

+

D-半乳糖醛酸

+

水杨苷

+

丙酸

+

尿核苷-5‘-单磷酸

-

龙胆二糖

+

景天庚酮聚糖

-

丙酮酸

+

D-6磷酸果糖

+

D-葡萄糖酸

+

D-山梨醇

+

琥珀酸氨酸

-

1-磷酸-α-D-葡萄糖

+

α-D-葡萄糖

+

水苏四糖

-

琥珀酸

-

6-磷酸-D-葡萄糖

+

m-肌醇

+

蔗糖

-

N-甲基-L谷氨酸

+

D-L-α-甘油磷酸酯

+

注：“+”表示具有代谢能力，“-”表示不具代谢能力，下同。

(四)利用API微生物鉴定系统鉴定的结果

法国API鉴定系统是世界范围内应用最广，已被微生物学家所公认，本申请还对TR21菌株进行了API生化鉴定，样品送往广东省微生物分析检测中心鉴定。API鉴定给出的结果为TR21菌株对48种碳源利用情况与枯草芽胞杆菌的符合率达到90.3％。菌株碳源利用的结果参见表3。

表3、API鉴定系统鉴定的TR21代谢能力

底物	代谢能力	底物	代谢能力
				甘油	+	柳醇	+

赤癣醇	-	纤维二糖	+
				D-阿拉伯糖	-	麦芽糖	+
L-阿拉伯糖	+	乳糖	-
				核糖	+	蜜二糖	+
D-木糖	+	蔗糖	+
				L-木糖	-	海藻糖	+
阿东醇	-	菊糖	+
				β-甲基-D-木糖甙	-	松叁糖	-
半乳糖	-	棉子糖	+
				葡萄糖	+	淀粉	+
果糖	+	肝糖	+
				甘露糖	+	木糖醇	-
山梨糖	-	龙胆二糖	+
				鼠李糖	-	D-松二糖	-
卫茅醇	-	D-来苏糖	-
				肌醇	+	D-塔格糖	-
甘露醇	+	D-岩糖	-
				山梨醇	+	L-岩糖	-
α-甲基-D-甘露糖甙	-	D-阿拉伯糖醇	-
				α-甲基-D-葡萄糖甙	+	L-阿拉伯糖醇	-
N-乙酰-葡糖胺	-	葡萄糖酸盐	+
				苦杏仁甙	+	2-酮基-葡萄糖酸盐	-
熊果甙	+	5-酮基-葡萄糖酸盐	-
				七叶灵	+

(五)利用16S rDNA、gyrA基因和gyrB基因开展的菌株鉴定

本申请对TR21开展了16S rDNA基因序列、gyrA基因序列和gyrB基因序列克隆分析和系统发育树构建，通过系统进化分析。TR21的分离、纯化和保藏同本实施例第(一)节。

1菌株DNA的提取

基因组DNA使用TaKaRa公司的MiNiBEST Bacterial Genomic DNA Extraction KitVer.2.0细菌基因组DNA提取试剂盒提取，可以获得理想的基因组DNA。

216S rDNA基因序列PCR扩增

采用细菌通用引物27F(27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1513R：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)进行16S rDNA的PCR扩增。PCR条件：95℃5min，94℃1min，56℃2min，72℃2min，30个循环，72℃10min。

用OMEGA公司凝胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)对扩增片段进行回收，将回收产物连接到pMD19-T载体上，转化E.coli DH5α，挑转化子经菌落PCR检验确定有目的基因插入后，摇菌，保甘油种，送Invitrogen生物工程技术有限公司广州分公司测定目的基因的碱基序列。

3gyrA基因序列PCR扩增

按照Chun and Bae在《Antonie van Leeuwenhoek》杂志第78卷123-127页的报道设计扩增引物f(5‘-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3’)和r(5’-CAAGGTAATGCTCCA GGCATTGCT-3’)，95℃5min，94℃1min，62.3±1℃(优化后)1min，72℃2min，30个循环，72℃10min。

扩增产物的克隆和测序方法同16S rDNA的克隆和测序。4gyrB基因序列PCR扩增

根据Yamamoto和Harayama1995在《Applied Environmental Microbiology》杂志61卷1104-1109页的报道设计简并引物UP-1S和UP-2Sr。

UP-1S：5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA(TC)GC(TCAG)GG(TCAG)GG(TCAG)AA(AG)TT(TC)GA-3’；

UP-2Sr：5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC(AG)TC(TCAG)AC(AG)TC(TCAG)GC(AG)TC(TCAG)GTCAT-3’用于扩增gyrB基因，95℃预变性5min，94℃1min，55℃-62℃退火(优化后)1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃10min。

扩增产物的克隆和测序同16S rDNA的克隆和测序。

5序列的系统发育进化分析

去掉获得基因序列中引物片段，将剩余序列登录NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)进行在线BLAST同源性搜索，选取在《International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology》杂志上公开发表的相似度超过90％的序列进行系统进化分析。其中利用gyrA基因构建系统进化树时，以相似性较低的Bacillus vallismortis NRRL B-14890菌株的gyrA基因序列作为外群。利用gyrB基因构建系统进化树时，以Blast结果中相似性较低的相近种gyrB基因序列作为外群。序列先采用ClustralX 2.0进行多重序列比对，然后用MEGA4.0软件包采用Neighbour-joining法(Kimura’s 2-parameter模型，bootstrap

1000)法构建系统发育树。

616S rDNA、gyrA和gyrB基因序列的克隆结果

利用基因组提取试剂盒获得TR21的基因组DNA，电泳检测基因组DNA分子量大于10000bp(基因组DNA电泳图如图5所示)，利用提取的基因组DNA PCR扩增TR21的16S rDNA，gyrA和gyrB基因(PCR扩增结果如图6所示)，其中gyrA基因1000bp左右，gyrB基因1200bp左右。测序后获得的16S rDNA基因片段长度1544bp，gyrA基因片段长度1025bp，gyrB基因片段长度1259bp。

7基于gyrA基因Blast结果的系统进化分析

如图7所示为基于gyrA基因序列的菌株TR21与相关菌株的系统发育树。根据发育树的结果，发现利用gyrA基因可以准确鉴定TR21为枯草芽胞杆菌，并能够获得TR21与已知种的亲缘关系。以gyrA基因序列比对结果构建的系统发育树，其中B.subtilissubsp.inaquosorum 2个菌株gyrA基因片段序列与TR21相似性较低(94％)，但为了完整显示枯草芽胞杆菌各亚种间的进化关系，仍然选择了这2个公开发表的序列进行分析，发现利用gyrA基因系列构建的系统发育树，能够很好的反应不同枯草芽胞杆菌菌株间的亲缘关系。

8基于gyrB基因Blast结果的系统进化分析

如图8所示为基于gyrB基因序列的菌株TR21与相关菌株的系统发育树。根据发育树的结果，发现利用gyrB基因也可以准确鉴定TR21为枯草芽胞杆菌，以gyrB基因序列比对结果构建系统发育树时，选择了多个基因系列相似性达到90％的不同菌株用作外群。由于枯草芽胞杆菌组中枯草芽胞杆菌已测定gyrB基因的菌株较多，因而gyrB基因能很好的显示TR21和其它菌株间的亲缘关系远近。

实施例2：TR21对不同镰刀菌病原菌的拮抗试验

(一)不同镰刀菌病原菌的分离与纯化

分离来源：在珠海市及周边城市采集典型的香蕉枯萎病、西芹黄萎病、石斛兰叶斑病病组织，进行病原菌分离，用于测试TR21对不同镰刀菌病原菌的拮抗活性。

分离与纯化方法：用清水将病组织清洗干净，吹干，用无菌刀片切取病健交界处的病组织并切成适宜大小，无菌情况下用70％酒精表面消毒30s，再用有效氯为5％的NaOCl处理5min，无菌水漂洗4次，将表面消毒后的病组织用无菌剪刀和镊子剪成0.2cm×0.5cm左右的组织块，吹干病组织块表面水分后置于无菌培养皿中，然后加入少量的PDA(马铃薯葡萄糖琼脂培养基，含300μg/ml的硫酸链霉素)培养基，使培养基与病组织块混合；待培养基凝固后，再加一层上述PDA培养基，培养基凝固后再加一层，形成三层培养基平板。最后将平板置于27℃培养箱中，每天观察，待有菌丝从病组织中长出并穿过三层培养基长至最外层培养基表面时，挑取菌丝于SNA(SpeziellerNahrstoffarmer Agar，镰刀菌保存专用培养基)培养基中扩繁后，再挑取菌丝于SNA斜面培养基，待菌丝长满斜面后置于4℃冰箱中保存。另用PDA平板培养经SNA培养基扩繁后的菌丝，待菌丝长满整个平皿后，加入适量的无菌水，用无菌接种针轻轻刮动菌丝，使菌丝中的孢子脱落，形成孢子悬浮液，吸取该悬浮液与40％甘油按照1∶1的比例混合，保存于-20℃及-80℃。

从香蕉枯萎病组织(分属珠海市及周边城市香蕉种植区的不同香蕉品种)共分离出16株目标镰刀菌、从西芹黄萎病组织分离出1株目标镰刀菌、从石斛兰叶斑病组织分离出1株目标镰刀菌。

回接测定分离菌致病性：严格按照柯赫氏法则(Koch’s Postulate)对上述分离的菌株进行致病性测定。香蕉枯萎病及西芹黄萎病组织分离菌分别以健康无病的香蕉苗(15cm高，4～5片叶)、西芹穴盘苗(5cm～10cm高)作为回接对象；制备分离菌的孢子悬浮液，浓度为10⁶个/ml，然后人工机械损伤香蕉苗和西芹苗根部组织，将伤根处理的香蕉苗和西芹苗分别置于对应分离菌的孢子悬浮液中浸泡30min；最后将接种后的香蕉苗和西芹苗移栽至装有无菌土的花盆中；待植株出现典型发病症状后采集病组织并分离，将分离获得的菌株与出发接种菌株进行比对，从而确定出发菌株是否为病原菌。石斛兰叶斑病组织分离菌以石斛兰(苗龄为1～2个月)健康无病叶片作为回接对象；接种前，叶片均用75％酒精做表面消毒，待酒精挥发完全后再接种；先用无菌软毛刷在叶子表面造成轻微的伤口，再用接种针挑取一小块已在PDA上培养7天的分离菌菌块，反扣于伤口上，套袋保湿24h；供试石斛兰苗置于温室中培养，白天26℃～29℃，相对湿度80～90％左右；待植株出现典型发病症状后采集病组织并分离，将分离获得的菌株与出发接种菌株进行比对，从而确定出发菌株是否为病原菌。

通过上述分离与致病性测定，从不同地区的香蕉枯萎病组织中分离获得16株病原菌(大部分为尖孢镰刀菌古巴专化型，Fusarium oxysporum Schl.f.cubense(E.F.Smith)Snyder et Hansen，FOC)，编号分别为：FOC-zh(连湾)、FOC-zh(鹤州北2号)、FOC-zj(易)、FOC-zh(贺)、FOC-zh(皇)，FOC-zh(新乡)，FOC-zh(廖)，FOC-zh(八一)，FOC-zh(九围1)，FOC-zh(九围2)，FOC-zh(平塘)，FOC-zh(鹤州北1号)，FOC-zh(鸡)，FOC-zh(东)白，香枯4，FOC-ts；从西芹黄萎病组织中分离获得1株病原菌(尖孢镰刀菌西芹专化型，Fusarium oxysproum f.sp.Apii，FOA)；从石斛兰叶斑病组织中分离获得1株病原真菌(Fusarium moniliforme Sheld)，编号为B10b。

(二)TR21对上述真菌的拮抗活性

在PDA平板中央接种直径为5mm的病原菌菌块，距离菌块3cm处点接TR21，28℃恒温培养5d，观察抑菌带有无，并测定大小，设置不接TR21的处理为对照。结果参见表4，抑菌带越大，表示抑菌效果越强。表中抑菌带数据为平均数±标准差。

表4、TR21对不同寄主来源病原真菌镰刀菌(Fusarium spp.)的拮抗活性

实施例3：TR21对其它植物病原真菌的拮抗活性，结果见表5所示。

生测拮抗活性时的方法同实施例2，其中交链孢霉、新月弯孢霉、芒果蒂腐病、西瓜枯萎病等分别为珠海市真绿色技术有限公司赠送的植物病原真菌，立枯丝核菌由广东海洋大学易润华博士赠送的植物病原真菌。抑菌带越大，表示抑菌效果越强。

表5TR21对几种植物病原真菌的平板拮抗活性(单位：mm)

	交链孢霉	新月弯孢霉	芒果蒂腐	西瓜枯萎	立枯丝核菌
						TR21	8.53±1.11	8.87±1.27	6.63±0.80	7.50±0.70	致死

实施例4：TR21对香蕉枯萎病的生物防治研究

(一)对不同香蕉枯萎病菌菌株的拮抗机理

TR21对香蕉枯萎病菌的不同致病菌株具有良好的拮抗效果(见实施例2)，通过显微镜观察，经TR21处理后，不同致病菌株与对照相比，菌丝和分生孢子均发生明显变化，主要变现为：菌丝粗糙、畸形肿胀；孢子畸形，中间膨胀、两端缢缩等。

(二)TR21的拮抗物质提取和对香蕉病原菌的抑制效果测定

用接种环从平板上挑取完整单菌落，接入盛有100ml NB培养基的三角瓶中，180rpm，37℃摇床中培养过夜，即得到种子液，然后按6％接种量加入到300ml新鲜的NB培养基中，180rpm，37℃摇床中培养3d。

抗菌蛋白粗品的制备：将上述发酵液按100ml的量分装到果酱瓶中，并向每瓶中分别加入20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％饱和度的硫酸铵，置于4℃冰箱中静置过夜，10000rpm，4℃离心20min分离得沉淀，然后分别用10ml无菌水溶解，即得到不同饱和度硫酸铵盐析粗制品。

抗菌脂肽粗品的制备：将上述发酵液6000rpm，4℃离心20min除去菌体，将上清按100ml的量分装到果酱瓶中，然后向上清中加入浓盐酸调节到pH＝2.0，4℃冰箱中静置过夜，10000rpm，4℃离心20min分离得沉淀，并用甲醇抽提，真空干燥，用10ml 0.05M的NaHCO3溶解，即得到粗制品。

参照程亮等(注：程亮，肖爱萍，游春平.拮抗细菌对香蕉枯萎病菌的抑菌作用初步研究[J].仲恺农业技术学院学报，2005，18(1)：9-13.)的方法，取制备好的蛋白粗制品、脂肽类粗制品各1ml分别加入冷却至40℃左右的15ml PDA培养基中轻轻摇动，充分混匀后倒入直径为9cm的培养皿中，冷却后于平板中央接种直径为5mm的香蕉枯萎病菌块，置于28℃下培养5d，分别以添加无菌水和0.05M的NaHCO3溶液为对照，每处理4次重复，测量菌落直径，观察抑菌效果并计算抑制率。

结果发现(参见图9和图10)，20％、30％和40％饱和度硫酸铵沉淀的蛋白质具有较好的拮抗活性，但以40％的效果最好。TR21除了产生蛋白类拮抗物质外，其产生的脂肽类物质对香蕉枯萎病病原菌也具有抑制作用，结果参见图11和12。

(三)TR21的抗生素标记筛选和在香蕉苗中的定殖能力测定

1、利福平和硫酸链霉素标记TR21

将配好的NB培养基分装到250ml培养瓶中，灭菌后冷却到50℃左右，分别加入一定量的利福平、氨苄青霉素、硫酸链霉素、氯霉素、四环素、红霉素、潮霉素、新霉素、卡那霉素贮存液至终浓度为5μg/ml，摇匀后，迅速制成抗性平板。取100μl的TR21菌液涂布在不同的抗性平板上，28℃培养3-4d观察结果。每个处理重复三次，以不加抗生素的平板为对照。结果发现TR21菌株对5μg/ml的利福平具天然抗性。

选用利福平、氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、新霉素五种抗生素作为下一步抗性筛选试剂。按6％接种量加入TR21种子液到含有5μg/ml上述抗生素的NB培养基中，28℃振荡培养4d。取200μl涂含相应量的抗生素的NA平板，28℃培养4d。挑取可以生长的突变体菌株，再接入同浓度的培养基中，继代一次后转入10μg/ml利福平的NB培养基中，28℃振荡培养4天。取200μl涂含10μg/ml利福平的NA平板，每处理3个重复。按以上的方法，依次接种在含50、100、150、200、250、300μg/ml上述抗生素的NB培养基中培养。筛选到在含链霉素最高浓度下生长良好的突变菌株，即获得抗300μg/ml硫酸链霉素，且具5μg/ml利福平天然抗性的突变株TR21^*。

2、标记菌株的稳定性测定

将耐药菌株在不含抗生素的NA培养基上连续传代20次后，接种到NB培养基中培养24h，然后涂布NA平板，37℃培养过夜，待长出小菌落后，用灭菌牙签随机挑取100个菌落点接到含300μg/ml链霉素和5μg/ml利福平的NA培养基上，37℃培养2～3d，统计出现的菌落数量，以抗性菌株所占百分比计算标记菌的稳定性。100个点接处都有菌落长出，即标记菌株的稳定性100％。

3、标记菌株的拮抗能力测定

参照程亮等(注：程亮，肖爱萍，游春平.拮抗细菌对香蕉枯萎病菌的抑菌作用初步研究[J].仲恺农业技术学院学报，2005，18(1)：9-13.)的方法，挑取TR21^*在PDA平板一侧沿一直线接种，而在别一侧接入直径为5mm的FOC-zh(廖)菌株菌碟，两者相距3cm，置28℃下培养6d，观察FOC-zh(廖)菌落生长情况，以未标记生防菌TR21为对照，每处理4次重复，结果参见表6。

表6抗性标记与非标记菌株的拮抗能力比较

处理	均值(mm)	标准差	5％显著水平	1％极显著水平
					TR21	7.0833	0.5149	a	A
TR21*	7.1667	0.5774	a	A

4、标记菌株在香蕉体内、根表和根和的定殖规律

选择对5μg/ml利福平具有天然抗性且抗300μg/ml链霉素的枯草芽胞杆菌TR21突变菌株TR21^*用于测定。香蕉组培苗购自广东省农科院，培育至6～7叶，株高30～35cm时待用。供试抗生素则皆购自上海生工。

采用伤根法/灌根法，每株接种浓度为2×108cfu/ml TR21*菌的NB培养液20ml于香蕉根部(种植在非灭菌的腐殖土中)，共处理30株，设无菌水为对照，实验温度22±3℃。分别于接菌后1、3、5、7、9、12、15d随机取5株香蕉苗进行根际土样、根表、根、球茎、假茎和叶片中标记菌的分离。

标记菌在香蕉根际土中的定殖与消长动态：取5株香蕉苗的根际土(紧附在根系的土)各1g充分混匀，再从中取1g放人9ml无菌水中涡旋振荡15min，然后加无菌水进行系列稀释，用含有利福平5μg/ml，链霉素300μg/ml，制霉菌素50μg/ml的NA培养基按MPN法测定细菌数量(南京土壤所微生物研究室.土壤微生物研究法[M].北京：科学出版社，1985，54-58.)，每浓度均5个重复，以空白处理(接无菌水)为对照。将平板置37℃下培养3天，统计每皿菌落数，最后计算平均每克根际土(干重)的含菌量，同时检查对照上是否有菌落长出。

标记菌在香蕉根表的定殖与消长动态：将香蕉苗根表的土剥除，每株各取1g根混合，然后从中随机取1g根，并放人10ml无菌水中涡旋振荡15min，所得的水溶液即为母液，然后加无菌水进行系列稀释。其余同上，计算平均每克根(鲜重)的根表含菌量。

标记菌在香蕉体内的定殖与消长动态：分别取香蕉根、球茎、假茎(离球茎上部1cm处)和叶片用清水冲洗后，各取1g先在75％酒精中浸泡1min，根再用5％NaClO表面消毒6min，而球茎、假茎和叶片经5％NaClO表面消毒4min，然后无菌水漂洗4次，滤纸吸干水分后，进行根、球茎、假茎和叶片内标记菌的分离，取消毒后最后一次漂洗液0.1ml涂布NA平板。其余同上，计算平均每克根、球茎、假茎和叶片(鲜重)内标记菌的数量，同时检查最后一次漂洗水和对照上是否有菌落长出。

研究显示，通过伤根或灌根接种，TR21都能够在香蕉根系和假茎中定殖，也能够在香蕉根际土壤中定殖，定殖的能力随时间延长而下降，定殖能力测定结果参见图13和图14。

(四)对香蕉枯萎病的田间防治试验

利用TR21对香蕉枯萎病进行田间生物防治试验，试验地点为珠海市斗门小赤坎村和井岸鸡嘴村香蕉种植地，供试香蕉品种为巴西蕉(香蕉，感病品种)、农科1号(香蕉，抗病品种)、皇帝蕉(香蕉，感病品种)，均为新植苗。TR21使用方式均为NA发酵液40倍稀释液灌根，每株灌4斤稀释液，每月灌一次，叶腋喷施时，采用40倍稀释后，每月喷3次，每次喷50ml左右。

1、TR21灌根处理对巴西蕉香蕉枯萎病的防治试验

试验在小赤坎进行，从2008年3月到2009年9月，跨越2茬，其中第一茬从2008年3月到2008年10月，处理区面积507.7m²，初始蕉苗86株，2008年4月试验开始时因枯萎病发病和冷害导致8.14％的植株死亡，试验实际有效株79株。对照区面积880.1m²，初始蕉苗144株，2008年4月统计的总死亡率为21.53％，试验开始时实际有效处理巴西蕉113株。第一茬的数据表明，至2008年9月收蕉止，对照的发病率为17.22％，TR21灌根处理的发病率为6.33％，防治效果为63.23％。在防治香蕉枯萎病的同时，TR21灌根处理对巴西蕉产量没有影响，对照及TR21灌根处理的植株的香蕉产量均为50斤/株左右。

第一轮试验结束时，到2008年12月调查时，对照在第一轮生长周期的总死亡率超过50％，被农户放弃，因而2009年进行第二轮实验时，处理区以第一轮试验存活的吸芽为对象继续开展灌根，有效株69株，对照区则重新选择，并采用药剂处理。对照区面积1163.9m²，第一年种植巴西蕉212株，因枯萎病和台风等因素导致的死亡率达到56.13％，第二年存活吸芽93株，用70％多菌灵600倍灌根(青岛海澳生化有限公司生产)，每株2000ml，每月一次。数据分析时，以药剂处理的发病率为对照计算防效。至2009年9月开始收蕉止，对照的发病率为38.85％，TR21灌根处理的发病率为10.14％，防治效果为73.90％。在防治香蕉枯萎病的同时，TR21的灌根处理对巴西蕉的产量没有影响，对照及TR21灌根处理的植株的香蕉产量均为64斤/株左右。2轮综合防效估算结果如表7。

表7TR21连续灌根2年的综合防效

	处理蕉总数(株)	枯萎病死亡总数(株)	发病率	综合防效
					TR21处理	148	14	9.46％	64.57％
对照	206	55	26.70％

2、TR21灌根处理对农科1号香蕉枯萎病的防治测试

试验在小赤坎村进行。试验时间从2008年3月到2008年9月，处理区面积454.6m2，种植农科1号89株，2008年4月15日实验开始时调查，确定枯萎病发病率为22.47％，实际用于调查的有效株为69株；对照区面积568.1m2，种植农科1号86株，初始发病率为25.58％，试验时实际存活64株。

至2008年9月收蕉止，对照的发病率为21.88％，TR21灌根处理的发病率为8.70％，防治效果为60.25％。

3、TR21灌根处理对皇帝蕉Musaparadisiacal AA香蕉枯萎病的防治测试

试验在斗门小赤坎村进行。试验时间从2009年2月到2009年9月，皇帝蕉新植蕉苗，套种于第一茬巴西蕉原来死亡的空缺。处理区面积1073.4m²，种植皇帝蕉130株，初始发病率为0％。对照区共设置两个，一个为阴性对照区(即该区不作任何防治措施)，面积42.6m²，种植皇帝42株，初始发病率为0％；另一个为阳性对照区(即该区以进口多菌灵600倍液灌根作为防治措施)，面积982.6m²，种植皇帝119株，初始发病率为0％。每月进行一次数据调查，实行定点定株调查，并拍照记录。

数据表明，至2009年9月开始收蕉止，阴性对照区发病21株，发病率50.00％，阳性对照区发病26株，发病率为21.86％，TR21处理区发病12株，发病率为8.51％；与阴性对照区相比，TR21防治效果为82.09％，而药剂的防效仅为56.30％。

4、TR21叶腋喷施对农科1号枯萎病的防治测试

试验在井岸鸡嘴村进行。从2008年5月开始，开展NA发酵液40倍稀释喷施叶腋防治农科1号枯萎病的研究，农科1号种苗为新植苗。每月喷施3次，每隔10天1次。试验区面积10亩，调查时统计3个区，并设置2个对照区。试验采用随机区组设计，结果方差分析和F检验。

从2008年5月开始，到2009年9月结束，到2009年8月农科1号处理的发病率为6.74％，对照发病率44.93％，差异极显著，防效达到85％。

实施例五：对西芹黄萎病的田间防治试验

2007年12月到1月间在珠海白藤湖无公害蔬菜生产基地开展了TR21发酵液100倍稀释泼洒对西芹黄萎病的防治效果评价，西芹品种为文图拉。通过3次泼洒后，统计的发病率数据显示，对照的总发病率达到10.67％，处理的发病率4.22％，防效达到60.45％。由于发酵液的活菌浓度较低，稀释倍数较大，因而防效偏低，如果提高发酵液活菌数，在相同的施用浓度下，可能会得到更好的防治效果。

序列表

<110>珠海市农业科学研究中心

<120>一株植物内生枯草芽胞杆菌TR21及其应用

<160>9

<210>1

<211>1513bp

<212>16S rDNA序列片段

<213>芽胞杆菌目，芽胞杆菌科，芽胞杆菌属，枯草芽胞杆菌

<220>9bp-1521bp

<223>该序列编码产物为ribosomal RNA-16S

<400>1

        AG AGTTTGATCC TGGCTCAGGA CGAACGCTGG CGGCGTGCCT AATACATGCA 60

AGTCGAGCGG ACAGATGGGA GCTTGCTCCC TGATGTTAGC GGCGGACGGG TGAGTAACAC 120

GTGGGTAACC TGCCTGTAAG ACTGGGATAA CTCCGGGAAA CCGGGGCTAA TACCGGATGG 180

TTGTTTGAAC CGCATGGTTC AAACATAAAA GGTGGCTTCG GCTACCACTT ACAGATGGAC 240

CCGCGGCGCA TTAGCTAGTT GGTGAGGTAA TGGCTCACCA AGGCAACGAT GCGTAGCCGA 300

CCTGAGAGGG TGATCGGCCA CACTGGGACT GAGACACGGC CCAGACTCCT ACGGGAGGCA 360

GCAGTAGGGA ATCTTCCGCA ATGGACGAAA GTCTGACGGA GCAACGCCGC GTGAGTGATG 420

AAGGTTTTCG GATCGTAAAG CTCTGTTGTT AGGGAAGAAC AAGTACCGTT CGAATAGGGC 480

AGTACCTTGA CGGTACCTAA CCAGAAAGCC ACGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA 540

ATACGTAGGT GGCAAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGGGCTCGC AGGCGGTTTC 600

TTAAGTCTGA TGTGAAAGCC CCCGGCTCAA CCGGGGAGGG TCATTGGAAA CTGGGGAACT 660

TGAGTGCAGA AGAGGAGAGT GGAATTCCAC GTGTAGCGGT GAAATGCGTA GAGATGTGGA 720

GGAACACCAG TGGCGAAGGC GACTCTCTGG TCTGTAACTG ACGCTGAGGA GCGAAAGCGT 780

GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGATGA GTGCTAAGTG 840

TTAGGGGGTT TCCGCCCCTT AGTGCTGCAG CTAACGCATT AAGCACTCCG CCTGGGGAGT 900

ACGGTCGCAA GACTGAAACT CAAAGGAATT GACGGGGGCC CGCACAAGCG GTGGAGCATG 960

TGGTTTAATT CGAAGCAACG CGAAGAACCT TACCAGGTCT TGACATCCTC TGACAATCCT 1020

AGAGATAGGA CGTCCCCTTC GGGGGCAGAG TGACAGGTGG TGCATGGTTG TCGTCAGCTC 1080

GTGTCGTGAG ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGCGCAA CCCTTGATCT TAGTTGCCAG 1140

CATTCAGTTG GGCACTCTAA GGTGACTGCC GGTGACAAAC CGGAGGAAGG TGGGGATGAC 1200

GTCAAATCAT CATGCCCCTT ATGACCTGGG CTACACACGT GCTACAATGG ACAGAACAAA 1260

GGGCAGCGAA ACCGCGAGGT TAAGCCAATC CCACAAATCT GTTCTCAGTT CGGATCGCAG 1320

TCTGCAACTC GACTGCGTGA AGCTGGAATC GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT 1380

GAATACGTTC CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ACGAGAGTTT GTAACACCCG 1440

AAGTCGGTGA GGTAACCTTT TAGGAGCCAG CCGCCGAAGG TGGGACAGAT GATTGGGGTG 1500

AAGTCGTAAC AAGGTAGCCG T 1521

<210>2

<211>1025bp

<212>gyrA基因片段

<213>芽胞杆菌目，芽胞杆菌科，芽胞杆菌属，枯草芽胞杆菌

<220>42bp-1066bp

<223>该基因序列编码产物为DNA促旋酶gyrase的A蛋白(subunitA)

<400>2

                                             CAGTCAGGA AATGCGTACG 60

TCCTTCTTGG ATTATGCAAT GAGCGTTATC GTGTCCCGTG CTCTTCCAGA TGTTCGAGAC 120

GGTTTAAAAC CGGTTCATAG ACGGATTTTG TATGCAATGA ATGATTTAGG CATGACAAGT 180

GACAAGCCTT ATAAAAAATC CGCGCGTATC GTTGGAGAAG TTATCGGGAA ATACCACCCG 240

CACGGTGATT CAGCGGTATA TGAATCCATG GTCAGAATGG CTCAGGATTT CAACTACCGT 300

TATATGCTCG TTGACGGTCA CGGAAACTTC GGTTCTGTTG ACGGAGACTC AGCGGCGGCC 360

ATGCGTTATA CAGAAGCAAG AATGTCTAAA ATCTCAATGG AGATTCTTCG TGACATCACA 420

AAAGACACAA TCGATTACCA GGATAACTAT GACGGGTCAG AAAGAGAACC TGTCGTTATG 480

CCTTCAAGGT TCCCGAATCT GCTCGTGAAC GGTGCTGCCG GCATTGCGGT AGGTATGGCA 540

ACAAACATTC CTCCGCACCA GCTGGGAGAA ATCATTGACG GTGTACTTGC TGTCAGTGAG 600

AATCCGGACA TTACAATTCC AGAGCTTATG GAAGTCATTC CAGGGCCTGA TTTCCCGACC 660

GCGGGTCAAA TCTTGGGACG CAGCGGTATC CGGAAAGCAT ACGAATCAGG CCGAGGCTCT 720

ATCACGATCC GGGCAAAAGC TGAGATCGAA CAAACATCTT CGGGTAAAGA AAGAATTATC 780

GTTACAGAGT TACCTTACCA AGTAAATAAG GCGAAATTAA TTGAGAAAAT TGCAGATCTC 840

GTAAGGGACA AGAAGATAGA GGGTATCACA GATCTGCGTG ATGAGTCAGA TCGTACAGGT 900

ATGAGAATTG TCATTGAAAT CAGACGCGAC GCCAATGCAA ATGTCATCTT AAACAATCTG 960

TACAAACAAA CTGCTCTACA AACATCTTTT GGCATCAACC TGCTTGCACT TGTTGATGGC 1020

CAGCCGAAAG TTTTAACTCT TAAGCAATGC CTGGAGCATT ACCTTG 1066

<210>3

<211>1259bp

<212>gyrB基因片段

<213>芽胞杆菌目，芽胞杆菌科，芽胞杆菌属，枯草芽胞杆菌

<220>280bp-1538bp

<223>该基因序列编码产物为DNA促旋酶B蛋白gyrase(subunit B)

<400>3

                                          G AAGTCATCAT GACCGTTCTG 300

CATGCGGGCG GCAAATTTGA CGGAAGCGGC TATAAAGTAT CCGGAGGATT ACACGGTGTA 360

GGTGCGTCTG TCGTAAACGC ACTATCAACA GAGCTTGATG TGACGGTTCA CCGTGACGGT 420

AAAATTCACC GCCAAACCTA TAAACGCGGA GTTCCGGTTA CAGACCTTGA AATCATTGGC 480

GAAACGGATC ATACAGGAAC GACGACACAT TTTGTCCCGG ACCCTGAAAT TTTCTCAGAA 540

ACAACCGAGT ATGATTACGA TCTGCTTGCT AACCGCGTGC GTGAATTAGC CTTTTTAACA 600

AAGGGTGTAA ACATCACGAT TGAAGATAAA CGTGAAGGAC AAGAGCGCAA AAATGAATAC 660

CATTACGAAG GCGGAATTAA AAGTTATGTA GAGTATTTAA ACCGCTCTAA AGAGGTTGTC 720

CATGAAGAGC CGATTTACAT TGAAGGCGAA AAGGACGGCA TTACGGTTGA AGTGGCTTTG 780

CAATACAATG ACAGCTACAC AAGCAACATT TACTCGTTTA CAAACAACAT TAACACGTAC 840

GAAGGCGGTA CCCATGAAGC TGGCTTCAAA ACGGGCCTGA CTCGTGTTAT CAACGATTAC 900

GCCAGAAAAA AAGGGCTTAT TAAAGAAAAT GATCCAAACC TAAGCGGAGA TGACGTAAGG 960

GAAGGGCTGA CAGCGATTAT TTCAATCAAA CACCCTGATC CGCAGTTTGA GGGCCAAACG 1020

AAAACAAAGC TGGGCAACTC AGAAGCACGG ACGATCACCG ATACGTTATT TTCTACGGCG 1080

ATGGAAACAT TTATGCTGGA AAATCCAGAT GCAGCCAAAA AAATTGTCGA TAAAGGCTTA 1140

ATGGCGGCAA GAGCAAGAAT GGCTGCGAAA AAAGCCTGTG AACTAACACG TCGTAAGAGT 1200

GCTTTGGAAA TTTCAAACCT GCCCGGTAAG TTAGCGGACT GCTCTTCAAA AGATCCGAGC 1260

ATCTCCGAGT TATATATCGT AGAGGGTGAC TCTGCCGGAG GATCTGCTAA ACAAGGACGC 1320

GACAGACATT TCCAAGCCAT TTTGCCGCTT AGAGGTAAAA TCCTAAACGT TGAAAAGGCC 1380

AGACTGGATA AAATTCTTTC TAACAACGAA GTTCGCTCTA TGATCACAGC GCTCGGCACA 1440

GGCATTGGGG AAGACTTCAA CCTTGAGAAA GCCCGTTACC ACAAAGTTGT CATTATGACA 1500

GACGCTGACG TTGATGGCTC GCACATCCGT ACCCTGCT  1538

<210>4

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

<210>5

<211>21bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’

<210>6

<211>24bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

5‘-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3’

<210>7

<211>24bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

5’-CAAGGTAATGCTCCA GGCATTGCT-3’

<210>8

<211>35bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA(TC)GC(TCAG)GG(TCAG)GG(TCAG)AA(AG)TT(TC)GA-3’

<210>9

<211>38bp

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

5’-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC(AG)TC(TCAG)AC(AG)TC(TCAG)GC(AG)TC(TCAG)GTCAT-3’

Claims (3)

1.一株植物内生枯草芽胞杆菌TR21(Bacillus subtilis str.TR21)，于2010年1月20日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC No：M 2010019。

2.根据权利要求1所述的植物内生枯草芽胞杆菌TR21在抑制植物病原真菌方面的应用。

3.根据权利要求1所述的植物内生枯草芽胞杆菌TR21在防治由尖孢镰刀菌引起香蕉枯萎病和西芹黄萎病方面的应用。

Images