CN115141785B - 一种枯草芽孢杆菌及其在甘蓝种植中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtili，于2022年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24484。该菌株耐旱、繁殖生长快、在土壤和植株中定殖能力强，发酵液活性物质种类丰富，通过破坏病原菌细胞壁和细胞膜稳定性、降低对宿主植物的浸染能力，达到抑菌目的。BAS‑1692菌液对甘蓝多种病原菌有抑制活性，对其引发甘蓝病害防效好，且具有促生和催芽效果。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在甘蓝种植中的应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，涉及一种枯草芽孢杆菌及其在甘蓝种植中的应用。

背景技术

结球甘蓝（Brassica oleracea var.capitata L.，简称甘蓝）属于十字花科芸薹属甘蓝种，是我国蔬菜栽培面积较大的一种十字花科蔬菜，也是甘肃高原夏菜的主栽特色蔬菜之一，在国内外市场需求量巨大。市场需求导致人们为追求产量，常年连作、过量施肥、大量应用化学农药等非合理种植技术，导致土壤环境恶化，灰霉病、枯萎病、根腐病、褐腐病、黑腐病、菌核病、黑胫病、线虫和地下害虫等病虫害发生严重，平均减产在30%～50%，产品品质下降，严重影响了当地高原夏菜产业的可持续发展。目前当地主要通过栽种抗病品种来对抗上述病虫害，但是大部分抗病品种存在口感较差，影响经济收益，另外抗病品种连种连茬几次其抗病能力也下降，防控稳定性不足。因此，寻求新的防控技术势在必行。本发明针对甘蓝枯萎病、根腐病、褐腐病、黑腐病、黑胫病等影响产品产量和品质的多发病害，从甘蓝发病植株选育高效、广谱、抗逆、定殖能力强的生防菌种，为特色高原夏菜甘蓝连作病害防控提供新的防控途径。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌具有耐旱、繁殖生长快、在甘蓝及其根围土壤定殖能力强，通过破坏病原菌细胞壁和细胞膜稳定性、降低对宿主植物的浸染能力，达到抑菌防病的目的。

上述枯草芽孢杆菌是2022年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCC No.24484。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是从甘肃省榆中县高敦营村枯萎病危害的甘蓝植株中分离优选得到的菌株BAS-1692，经过形态观察、生理生化鉴定和16S r DNA分子鉴定最终确定该菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis在分离纯化过程中采用的分离纯化培养基配方为：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 3 g，牛肉膏3 g，酵母膏3 g MnSO₄·H₂O 0.005g，琼脂粉 适量,蒸馏水1000 mL，pH 7.0。该分离纯化培养基有利于枯草芽孢杆菌富集，提高其分离纯化效率。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis耐旱，能耐受模拟环境的重度干旱，即PGE6000浓度为150～270g/L均能生长繁殖。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis发酵液制备时的发酵培养基配方为牛肉膏8 g、酵母膏3g、葡萄糖10g、蒸馏水容至1000 mL，pH7.0。该发酵培养基促进枯草芽孢杆菌生长繁殖，培养48h其发酵液含菌量大于10¹²cfu/ml，抑菌活性显著提高。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis繁殖速度快，发酵培养20小时发酵液活菌数即可达到10⁹cfu/ml以上，最大发酵菌数可达10¹²cfu/ml以上；其在植物根茎叶及其根围土壤能稳定定殖且定殖能力强，定殖菌数在10³cfu/ml～10⁵cfu/ml ，其中在根围土壤中定殖数最大，30天内保持10⁵cfu/ml以上，其次为根、叶和茎，20天内保持10³cfu/ml以上。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的抑菌机理：抑制病原真菌菌丝生长和孢子萌发；通过影响病原真菌细胞壁几丁质酶及相关保护酶合成和促进病原菌细胞脂质过氧化反应、破坏病原菌细胞壁和细胞膜稳定性，使菌体细胞原生质外泄而致死；抑制病原菌真菌细胞壁降解酶活性、降低对宿主植物的浸染能力，达到抑菌目的。

所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的发酵液活性物质种类丰富，特有吲哚酸类、细胞分裂素、植物激素、糖和各类氨基酸等促进植物生长发育的物质，环氧十八烷酸、衣康酸、丝衣霉酸、苯那普拉利、羟苯基卡维地洛、羟基呋喃丹、呋喃酮、甲基呋喃醛和亚硝基噻唑烷羧酸等抑菌物质。

本发明的第二个目的是提供上述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis在甘蓝种植中的应用，该枯草芽孢杆菌的菌液对灰葡萄孢、尖镰孢菌、腐皮镰刀菌、立枯丝核菌 、致病假单胞菌、盘核菌、黑胫茎点霉等病原菌有很强的抑制活性；能有效防控上述病原菌引发的甘蓝灰霉病、枯萎病、根腐病、褐腐病、黑腐病、菌核病和黑胫病等病害，平均防治效果在88%～98%，对病原真菌引发的土传病害的防治效果与对照农药在0.05水平上不存在显著性差异；其还具备较强促生作用，试验结果显示其能有效促进种子萌发、植物生长和根系分化，种子萌发率和各生长指标增长率在17.07%～80.90%，提质增效显著。

附图说明

图1为本发明枯草芽胞杆菌BAS-1692菌落形态

图2为本发明枯草芽胞杆菌BAS-1692发酵液处理的尖孢镰刀菌菌丝形态；

图3为未用枯草芽胞杆菌BAS-1692发酵液处理的尖孢镰刀菌菌丝形态；

图4为本发明枯草芽胞杆菌BAS-1692对真菌细胞壁降解酶的影响；

图5为本发明枯草芽胞杆菌BAS-1692发酵上清液对病原真菌细胞壁几丁质的影响；

图6为本发明枯草芽胞杆菌BAS-1692发酵上清液对病原菌细胞丙二醛含量的影响；

图7为本发明枯草芽胞杆菌BAS-1692的抑菌谱；

图中病原菌依次为尖孢镰刀菌、灰葡萄孢、立枯丝核菌、腐皮镰刀菌、盘核菌、黑基茎点霉、致病假单胞菌；

图8为本发明枯草芽胞杆菌BAS-1692耐旱能力的测定；

图9为本发明枯草芽胞杆菌BAS-1692 发酵生长曲线；

图10为本发明枯草芽胞杆菌BAS-1692 在黄瓜幼苗及根围土壤的定殖动态。

具体实施方式

一、拮抗菌株的分离、纯化和分类鉴定

1、菌株的分离、纯化

1.1 主要培养基

LB 培养基、NA培养基、PDA培养基，均为现有常规配方。

分离纯化培养基配方为：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 3 g，牛肉膏3 g，酵母膏3g MnSO₄·H₂O 0.005g，琼脂粉 适量,蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

菌株分离纯化

选取榆中高敦营村夏茬多年连作甘蓝地，且有部分甘蓝枯萎病已发病。采集发病的甘蓝叶片（部分发病部分健康）放入无菌袋中冷藏保存带回实验室立即进行目标菌分离。取出病叶5-7片用流水轻轻清洗干净，再在流水下冲洗2h。转入超净工作台剪取病健交界处的叶片组织（宽5mm），用75%的酒精漂洗1 min、无菌水漂洗3次、3% NaClO浸泡30s、无菌水漂洗3次、75%的酒精漂洗15s、无菌水漂洗5次完成表面消毒。然后用无菌滤纸将组织表面水分吸干，用灭菌剪刀剪成约0.5cm小块并研磨成浆状，无菌水稀释 10 倍后取0.2ml涂布于分离纯化培养基上，倒置，28℃恒温培养 24h～72h。待培养基上长出可见菌落时，及时挑取特征相异的细菌菌落，28℃下继续进行多次划线纯培养，直至平板上菌落形态单一为止。编号，保藏，备用。

高拮抗菌株筛选

采用琼脂扩散法。将致病型尖刀镰刀菌接种于PDA上活化，加适量无菌水洗脱做成1×10⁸cfu/ml病原菌菌悬液。在无菌PDA平板上加200µl病原菌菌悬液涂抹均匀，室温干燥5 min，在带菌平板中央放置牛津杯，每个牛津杯中注入1.1中分离纯化的菌株发酵液或菌株发酵上清液100μL，以无菌水为对照。每种菌株发酵液或菌株发酵上清液各做 4 个重复。28℃培养7d后观察是否有抑菌圈并测定抑菌直径，判断是否有抑菌作用及其抑菌能力强弱。病原菌换成致病假单胞菌，接种培养基换成NA培养基，其余不变。

表1：高拮抗菌株筛选结果

注释：表中列出的是拮抗活性最强的前五株1.1.2中分离纯化获得菌；表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。

依据表1结果选取拮抗活性最高的菌株1692做进一步分类鉴定。

高拮抗活性菌株1692分类鉴定

1.4.1形态学鉴定

用接种环挑取新鲜菌株1692接于NA培养基中，将其放置于28℃恒温培养箱中培养48h后进行观察菌落形态，并在显微镜下观察菌体的形状、芽孢的有无。

1.4.2生理生化测定

参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对接触酶反应、淀粉水解、MR试验、麦芽糖、乳糖、D-葡萄糖和硝酸盐等生理生化指标进行观测。

1.4.3 16S rDNA序列分析

细菌DNA提取采用蛋白酶-SDS法制备，扩增引物:27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3',1492R:5'- TACGGYTACCTTGTTACG

ACTT-3'，由上海美吉生物医药科技有限公司完成测序及同源性分析。

1.4.4鉴定结果

菌株1692菌落近圆形，白色，表面干燥无光泽，中央隆起，边缘不整齐（见图 1）。革兰氏染色呈阳性，杆状、端生或中生芽孢。接触酶反应、葡萄糖发酵、硝酸盐还原、乳糖、麦芽糖发酵、明胶液化和MR试验均为阳性，淀粉水解、酯酶反应、蛋白酯酶反应、甘露醇水解和蔗糖发酵均为阴性。菌株16S r DNA 序列通过与NCBI数据比对分析和多株枯草芽孢杆菌的同源性均在100％。综合形态学特征、生理生化特征和 16S rDNA分子鉴定结果，菌株1692为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis），终编号BAC-1692。

二、特性及效果试验：

1 枯草芽孢杆菌BAS-1692发酵液制备方法：

将菌株BAS-1692的10⁸cfu/ml菌悬液以7%接种量接于发酵培养基中，28±1℃、150转∕分恒温震荡培养48h，即得枯草芽孢杆菌BAS-1692发酵液。

上述发酵培养基配方为牛肉膏8 g、酵母膏3g、葡萄糖10g、蒸馏水容至1000 mL，pH7.0。

枯草芽孢杆菌BAS-1692的抑菌机理。

菌株BAS-1692发酵液对病原菌菌丝生长的影响

采用菌丝生长速率法。将无菌PDA培养液与菌株BAS-1692发酵液以8:1的比例混匀倒平板，再将尖刀廉孢菌的菌饼（直径0.5cm）置于培养基中央，26±1℃培养10d，以不混合发酵液的平板做对照。测病原菌菌饼直径并计算抑制率。

抑制率% ＝ （对照菌饼直径－处理菌饼直径）/ 对照菌饼直径

表2：菌株BAS-1692发酵液对病原菌菌丝生长的影响

注释：表中同行小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。

表2结果显示，菌株BAS-1692发酵液强烈抑制病原菌菌丝生长，抑制率为91.24%，与同种菌株在0.05水平上存在显著性差异。

菌株BAS-1692发酵液对病原菌孢子萌发的影响

取50 µL的尖刀廉孢菌孢子悬液(108 cfu﹒mL^-1)加于凹玻片中央，再加入50µL菌株BAS-1692发酵液，以无菌水为对照，每处理重复3次，于28℃黑暗保湿培养72 h后，记录孢子萌发数（孢子形成芽管长度大于孢子1 /2记为萌发），计算孢子萌发率。

孢子萌发率(%)=萌发孢子数 / 总孢子数 ×100

孢子萌发抑制率(%)=(对照孢子萌发率 － 处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100

表3：菌株BAS-1692发酵液对病原菌孢子萌发的影响

注释：表中同行小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。

表3结果显示，菌株BAS-1692发酵液对病原菌孢子萌发有较强抑制作用，孢子萌发抑制率为80.38%，与同种菌株在0.05水平上存在显著性差异。

菌株BAS-1692发酵液对靶标病原菌菌丝形态的影响

采用双层牛津杯法观察生防菌发酵液对尖孢镰刀菌菌丝形态的影响。将PDA加热至融化，取15mL倒入培养皿中，待其凝固后再倒入5 mL融化的PDA，并在培养皿中央位置放置牛津杯，待皿内培养基凝固后，在平板上距皿边缘1 cm的对称位置处接种尖孢镰刀菌菌饼(直径5 mm），在牛津杯中加入100 µL目标生防菌发酵液，对照组加等量无菌蒸馏水。将培养皿正放于恒温培养箱中，26℃培养3-5 d后取出培养皿，将尖孢镰刀菌与抑菌圈交界处的尖孢镰刀菌培养物切下置于载玻片上，利用光学显微镜观察菌丝形态，与对照组进行比较。

从图2和3对比分析可知，菌株BAS-1692发酵液使靶标病原菌菌丝断裂、萎缩、扭曲、纠叠、且顶端生长点膨大，生长停止。

菌株BAS-1692发酵上清液对病原真菌细胞壁的影响。

对病原真菌菌丝细胞壁降解酶活性测定

病原菌粗酶液的制备: 将尖孢镰刀菌用PAD培养基26℃、140rpm活化、培养7d, 无菌环境下培养液经四层灭菌纱布过滤，菌丝于研钵中研磨均匀，用全部发酵滤液充分稀释成菌悬液，４℃、10000r/min离心15min，弃沉淀，上清液即粗酶液，置-20℃冰箱备用。

菌株BAS-1692发酵上清液对病原菌细胞壁降解酶的影响：量取20mL病原粗酶液于试管中，加入60mLBAS-1692发酵上清液，充分摇匀，置４℃冰箱24h，以未处理的病原粗酶液为对照，测定酶液细胞壁降解酶活性。

采用３,5-二硝基水杨酸（DNS）法，用紫外分光光度计在540nm处测定反应液的OD值。

2.4.1.1 羧甲基纤维素酶（CX）活性的测定:

取0.5 mL粗酶液、1%羧甲基纤维素(CMC) 1 mL混匀，50℃酶解15 min，反应完毕各加2 mL DNS显色剂，沸水浴5 min，冷却后各加入1.5mL的蒸馏水540 nm处比色，测定酶活，对照用灭活的酶液。纤维素酶活性单位为在上述条件下每小时每毫克蛋白催化底物产生1μmol 还原糖所需酶量。

酶活单位(U/mL)=(r ×20×1000)/ v×t

r:样品吸光值通过标准曲线回归方程计算所得葡萄糖浓度((mg/mL);20:水解液体积((mL);

1000:将葡萄糖由mg换算成µg; v:参与反应的酶液体积((mL); t:酶促反应时间((min)

2.4.1.2 多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性的测定:

取0.5 mL粗酶液、0.5 mL pH5.0的0.05 moL/L醋酸-醋酸钠缓冲液、1 mL 0.5%果胶底物，混匀，50℃酶解10 min，反应完毕各加2mL DNS显色剂，沸水浴5min，冷却后各加入1mL的蒸馏水，540 nm处比色测定酶活，对照用灭活的酶液。

酶活单位(U/mL)=(r ×20×1000)/ v×t

r:样品吸光值通过标准曲线回归方程计算所得葡萄糖浓度((mg/mL);20:水解液体积((mL);

1000:将葡萄糖由mg换算成µg; v:参与反应的酶液体积((mL); t:酶促反应时间((min)

2.4.1.3果胶甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性的测定:

取粗酶液0.5 mL. pH 4.8的0.05 moL/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液0.5 mL. 0.5%的果胶酸钠底物1 mL，混匀，于50℃酶解10min，反应完毕各加2 mL的DNS显色剂，沸水浴5min，冷却后各加入3mL蒸馏水，540nm比色测定酶活，对照用灭活的酶液。酶活单位为50℃下每毫克粗酶液每分钟分解底物释放1µg还原糖所需要的酶量(U)。

酶活单位(U/mL)=(r ×20×1000)/ v×t

r:样品吸光值通过标准曲线回归方程计算所得葡萄糖浓度((mg/mL);20:水解液体积((mL);

1000:将葡萄糖由mg换算成µg; v:参与反应的酶液体积((mL); t:酶促反应时间((min)

图4的结果显示，菌株BAS-1692发酵上清液对病原真菌细胞壁降解酶系中羧甲基纤维素酶（CX）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）和果胶甲基半乳糖醛酸酶（PMG）的活性均有显著抑制作用，均比其对照低很多。细胞壁降解酶是病原菌引起植物发病的重要致病因子，其可以分解、软化寄主细胞壁，受到抑制，则侵染植物组织的能力严重下降，致病力降低。

菌株BAS-1692发酵液对病原真菌几丁质的影响

(1) N-乙酰葡萄糖胺标准曲线制作

1 mg/mL N-乙酰葡萄糖胺(NAG)标准液: 准确称取100 mg N-乙酰葡萄糖胺，用蒸馏水定容至100 mL，即为N-乙酰葡萄糖胺标准液。取具塞刻度试管，分别取NAG标准液0,0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 mL，加蒸馏水使各管的总体积为2.0 mL，每管加DNS 1.5mL沸水煮5 min，冷却至室温再加21.5 mL水，摇匀，稀释后各管NAG浓度为0, 8, 12, 16,20, 24, 28 µg/mL,于波长470 nm处测定吸光度。以N-乙酰葡萄糖胺含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。Y=0.0187X-0.0078，r=0.9990 。

(2) 病原菌菌丝N-乙酰葡萄糖胺测定

用直径为10mm打孔器打取培养2d的尖孢镰刀菌菌饼，接入含50 mL PDA培养液的三角瓶中，加入菌株BAS-1692发酵液100ml, 28℃，180 r/min，培养5d后，以不加发酵液的病原菌纯培养为对照。取病原菌菌丝加 0.05 mol/L Tris－HCl 冰浴研磨，10000r/min、4℃离心，取上清液，备用。向洁净的试管中加入上清液2.0 mL，以下操作与N-乙酰葡萄糖胺标准曲线相同，于波长470 nm处测定吸光度OD值。通过标准曲线计算N-乙酰葡萄糖胺含量。几丁质酶活: 以每分钟产生 1 μmol N-乙酰葡萄糖胺所需酶量g表示几丁质酶活性（µg/g）。

图5结果显示，菌株BAS-1692发酵液使病原真菌细胞壁中的几丁质水解产物N－乙酰葡萄糖胺含量比对照增加几倍。因为几丁质酶是一种广泛存在于微生物中的糖苷酶，可催化水解细胞壁中的几丁质产生N－乙酰葡萄糖胺，从而破坏细胞壁的完整性。说明菌株BAS-1692及其发酵代谢可产生几丁质酶，破坏病原真菌细胞壁结构，使其失去对病原菌丝或孢子细胞的支撑作用导致细胞变形、破裂，生长发育抑制。

菌株BAS-1692发酵上清液对病原菌丙二醛含量的影响

打取5.0mm尖孢镰刀菌饼若干，接入PDA培养液，每100 mL接种10个菌饼，26±1℃,180 r.min^-1振荡培养48 h后，制成菌悬液。将菌悬液以10%接种量接入无菌PDA培养液，相同条件培养48 h后分别加入10%的体积分数的菌株BAS-1692发酵上清液，并设空白对照，继续培养120 h，4层纱布过滤菌丝，用pH7.5的PBS冲洗，滤纸吸去水分，取各处理收集的菌丝3g，加入21 mL0.05 mol.L^-1 pH7.8 PBS, 1.0 g石英砂冰浴研磨至匀浆，4℃、8000r·min^-1离心10 min，取上清液置 -20℃以下备用。取上清液1mL加4 mL 0.5%TBA，沸水浴25 min后迅速于冰水混合物中冷却终止反应，4℃、8000r·min^-1离心10 min，取上清液在600、532和450nm处测定吸光值计算丙二醛含量。病原菌为丁香假单胞菌，在NA培养液，28±1℃培养2d，4℃、10000r·min^-1离心30 min，取菌体研磨，其余同尖孢镰刀菌菌丝体操作。

MDA(µmol·kg^-1)=6.45 (A_{53 2}-A₆₀₀)-0.56 × A₄₅₀

图6的结果显示，菌株BAS-1692发酵上清液能使病原菌细胞中的丙二醛含量显著提高，均为未处理的二倍以上。丙二醛是细胞过氧化的产物，间接反映细胞膜的受损程度。说明菌株BAS-1692发酵上清液显著病原菌（尖孢镰刀菌和丁香假单胞菌）细胞的脂质过氧化水平，破坏了细胞膜结构，导致菌体生长发育受限或死亡。

综合1.1-1.5的试验结果，证明菌株BAS-1692的抑菌机理为：抑制病原真菌菌丝生长和孢子萌发；通过影响病原真菌细胞壁结构及其相关保护酶合成和促进病原菌细胞脂质过氧化反应，破坏病原菌细胞壁和细胞膜结构及其稳定性，使菌体细胞原生质外泄而致死；抑制病原菌真菌细胞壁降解酶活性、降低其对宿主植物的浸染能力，达到抑菌目的。

枯草芽孢杆菌BAS-1692发酵液主要活性物质。

采用甲醇（含同位素标记内标混合物）-超声波提取法，提取枯草芽孢杆菌BAS-1692发酵液发酵液活性物质，送上海阿趣生物科技有限公司进行基于LC-MS和GC-TOF-MS非靶标的代谢组学检测分析。结果见表4。

表4: 枯草芽孢杆菌BAS-1692的发酵液主要活性物质

表4结果显示，枯草芽孢杆菌BAS-1692的发酵液活性物质种类丰富，涉及糖、蛋白、核酸、各种氨基酸、有机杂环类、有机酸类、脂肪酸类、黄酮类等化合物，其中13-OxoODE; 9,10-epoxyoctadecanoic acid; Benazeprilat; cis,cis-Muconic acid;Dihydrojasmonic acid; Estriol-16-Glucuronide; Itaconic acid; Margaritene;Mulberrin; p-Anisic acid; Vanillin; (4-Hydroxybenzoyl)choline; 1,4'-Bipiperidine-1'-carboxylic acid; 4-Hydroxy-2-butenoic acid gamma-lactone; 3-Hydroxy-carbofuran；5-Methyl-2(3H)-furanone; Curzerenone; Mycophenolic acid;Zymonic acid; Maltotriose;Byssochlamic acid; 5'-Hydroxycarvedilol; Abscisicacid; alpha-Zearalenol; Indole; Indoleacetaldehyde;L-Norleucine; 5-Methyl-2-furancarboxaldehyde; L-Arginine; L-Glutamic acid; L-Glutamine; L-Histidine;L-Lysine; L-Phenylalanine; L-Proline; L-Serine; L-Threonine; L-Tyrosine是其特有的发酵液活性物质，这些化合物中有吲哚酸类、细胞分裂素、植物激素、糖和各类氨基酸等促进植物生长发育的物质，还有等环氧十八烷酸、戊二酸、衣康酸、苯那普拉利、丝衣霉酸、羟苯基卡维地洛、羟基呋喃丹、呋喃酮、甲基呋喃醛和亚硝基噻唑烷羧酸等抑菌物质。

枯草芽孢杆菌BAS-1692菌液主要抑菌谱。

通过扩散法中的抑菌圈法（病原菌为细菌）或平板对峙法（病原菌为真菌）进行枯草芽孢杆菌BAS-1692抑菌谱测定。

平板对峙法。将灰葡萄孢、尖镰孢菌、腐皮镰刀菌、立枯丝核菌、盘核菌、黑胫茎点霉等病原真菌接种于PDA上活化并打取菌饼若干备用。在无菌PDA平板底划“十”字，病原真菌菌饼置于“十”中央，在距离PDA平板“十”中央1.0cm处打直径0.5cm 孔4个，接菌株BAS-1692发酵液各50µl，无菌水为对照平板，试验重复4次，在28℃培养12d后观察是否有抑菌圈及其大小，判断是否有抑菌作用及其抑菌能力强弱。

抑菌圈法：将致病假单胞菌等病原细菌在NA培养基，28℃活化培养2-3 d，斜面中加入5 mL含0.3%吐温80的无菌水，将菌苔刮下置于装有无菌玻璃球的50 mL锥形瓶内，摇床中充分震荡2小时后，稀释至含菌量为1 ×10⁸ cfu/mL ，备用。取200 μL病原菌悬液均匀涂布于NA培养基平板中，在平板中心放入无菌钢圈（直径0.6cm），加入100 μL菌株BAS-1692发酵液，无菌水为空白对照，28℃培养2d，观测抑菌圈有无及其大小，判断枯草芽孢杆菌BAS-1692对其是否有抑菌活性及其强弱。

以上抑菌效果显示（图7），草芽孢杆菌BAS-1692发酵液对灰葡萄孢、尖镰孢菌、腐皮镰刀菌、立枯丝核菌、致病假单胞菌、盘核菌、黑胫茎点霉病原菌有很强抑制活性。5 枯草芽孢杆菌BAS-1692耐旱能力测定

在灭菌后的 100 mL 分离纯化培养基中分别添加经无菌处理过后不同浓度的PEG6000，使 PEG6000 的终浓度为 0、30、60、90、120、150、180、210、240、270g/L。接入6%的枯草芽孢杆菌BAS-1692种子培养液，在28℃，200 r/min 的条件下震荡培养 48h 后，用分离纯化液体纯培养基调零，读取 700 nm 处的 OD 值。PEG6000 的浓度为 0-60 g/L 代表轻度干旱，90-150g/L 代表中度干旱，大于 150 g/L 代表重度干旱。

图8结果显示，枯草芽孢杆菌BAS-1692耐旱能力强， PGE6000浓度小于等于270g/L均能生长繁殖，PGE6000浓度越小 ，生长繁殖越好。PGE6000浓度150g/L～270g/L的重度干旱模拟环境下，处理液OD_700nm值在0.770～0.108，即表示枯草芽孢杆菌BAS-1692也能生长繁殖。

枯草芽孢杆菌BAS-1692活菌的繁殖和定殖能力测定

6.1菌株BAS-1692的生长曲线测定

将菌株BAS-1692和同种菌株1.320的10⁸cfu/ml菌悬液以7%接种量分别接于发酵培养基液中，28±1℃、150转∕分恒温震荡培养，每隔4小时取样，记录发酵液的浓度（菌数），绘出各菌株生长曲线。

实验结果显示（图9），枯草芽孢杆菌BAS-1692在适宜发酵条件下繁殖速度较快，发酵12h菌数即可达到10⁸cfu/ml，20h后菌数可达到10⁹cfu/ml，28h后菌数可达到10¹⁰cfu/ml，发酵36h菌数可达到10¹¹cfu/ml，发酵40h菌数可达到10¹²cfu/ml，发酵48h菌数达到最大值1.25×10¹²cfu/ml。而同属同种的对照菌1.320在发酵28h后菌数才达到10⁸cfu/ml，48h后菌数达到最大值即可达到2.19×10¹⁰cfu/ml。枯草芽孢杆菌BAS-1692对数生长期在发酵12小时开始，比同属同种的菌株1.260繁殖速度快一倍多，且发酵液最大含菌量也高两个数量级。有利于定殖竞争，达到抑制病原菌的目的。

菌株BAS-1692在甘蓝根、茎、叶及其根围土壤的定殖能力测定

将枯草芽孢杆菌BAS-1692的利福平和卡那霉素双标记菌株接种于含300 μg/ mL利福平和卡那霉素 200 μg/mL的发酵培养基液中, 28±1 ℃、180 r/min振荡培养72 h,稀释浓度至10⁸ cfu/mL, 以 10.0 mL/株 灌根接种于试验标准的甘蓝植株, 5.0 mL/株喷施于植株表面, 以无菌培养液为对照，共处理500株。接种后1、5、10、15、20、25 d 和30 d各取1.0 g的根、茎、叶组织及其根围土壤（取紧密附着于根系的土作为根围土）样品。将处理植株根、茎、叶样品各平均分成两份（0.5 g）, 一份表面用70 %酒精擦洗后，于0.1 %升汞中浸泡1.5 ～ 2.0 min , 再用无菌水洗涤5 次, 晾干后剪碎并加入1mL 无菌水磨碎，另一份直接用5mL无菌水分5次各震荡15min,合并震荡液，备用；将根围土（1.0 g）分散于10mL无菌水中， 200 r/min振荡10min后静置，取上清液稀释成10^－1、10^－２、10^－３、10^－４ 。然后分别取上述各样品溶液200 μl 均匀涂布于含300 μg/ mL利福平和卡那霉素 200 μg/mL的发酵培养培养基平板上,每个处理样品重复3 次, 28±1 ℃ 恒温培养48ｈ后计数。根据每个处理的平均菌落数量，计算每克鲜叶、根、茎及其根围土壤中所含的菌量（ cfu/g ）。

优良的生防菌株广谱、高毒力，还必须能在寄主及其根围占据有利位点而定殖，并且能在与自然界及其根际微生物区系的竞争中增殖存活较长时间，才有可能实现将其开发成生物农药的终极目标。因此，目前在生防微生物的研究中将其在作物及其根围土壤中的定殖能力作为优良生防菌株筛选的重要评价指标。图10显示，菌株BAS-1692在甘蓝根、茎、叶及其根围土壤的都可以稳定定殖，其中在根围土壤中定殖能力最强，从接种1天后至30天,定殖菌数均保持在10⁵cfu/ml，其次在植株根部和叶定殖能力也较强，在接种后的30天内菌数可达10⁴cfu/ml,在茎内定殖能力最弱，菌数基本在10³cfu/ml左右。

、枯草芽孢杆菌BAS-1692促生作用测定

7.1枯草芽孢杆菌BAS-1692发酵液对甘蓝种子萌发的影响

挑选饱满的甘蓝种子，用75%乙醇消毒20分钟，0.5%次氯酸钠消毒1min，最后用无菌水冲洗干净，吸干水分。然后将消毒种子置于 BAS-1692发酵液中浸泡 60min，以无菌水为空白对照，然后取出种子放置在铺有滤纸的无菌培养皿内，滤纸用无菌水浸湿，每皿 20粒，每处理 3 皿，重复三次，每天按时用无菌水补足水分以保持滤纸潮湿，25℃下培养 3 d后统计甘蓝种子的发芽数，计算发芽率。

发芽率%=（发芽数 － 种子总数）×100

7.2枯草芽孢杆菌BAS-1692发酵液对甘蓝幼苗生长的影响

挑选饱满的甘蓝种子，用75%乙醇消毒20分钟，0.5%次氯酸钠消毒1min，最后用无菌水冲洗干净，吸干水分。40℃温水浸泡 60 min 催芽后，播入装有复合基质营养钵中。出苗3天后开始每隔7天按每株10 m L 灌根处理，共处理4次，以无菌水为空白对照，每组处理20 株幼苗，每处理重复4次。试验幼苗置于常温、 12 h/12h 光周期环境下培养，最后一次施药5 d 后测量植株的株高、茎粗、根长、根重、地上部分鲜重等生长指标。株高为根颈部到主茎顶部的距离，茎粗为基部茎秆 5 cm 处的直径。

表4：枯草芽孢杆菌BAS-1692发酵液促生作用

注释: △t为增长率。

表4结果显示，枯草芽孢杆菌BAS-1692发酵液对甘蓝种子萌发和幼苗生长具有很显著促进作用，枯草芽孢杆菌BAS-1692发酵液处理的甘蓝种子发芽率可达94.42%，比未处理的种子发芽增长率17.07%，其促进幼苗长高长粗、根系分化，与未处理甘蓝幼苗相比，株高、茎粗、根长、根重和植株茎叶总重的增长率分别为28.57%、77.40%、80.90%、71.32%和31.25%。

、枯草芽孢杆菌BAS-1692对甘蓝病害的防治效果

供试植物准备：挑选籽粒饱满的甘蓝种子用70%的酒精消毒1 min后，再用0.5%的次氯酸钠消毒1 min，无菌水冲洗5～6次，然后用40 ℃的无菌水浸泡2 h，(27±1) ℃恒温、黑暗催芽，待大部分种子出芽后，挑取出芽情况一致的种子，播种。

枯草芽孢杆菌BAS-1692发酵液的制备方法，采用上述二之1节中提供的方法。

病原菌孢子（菌体）悬液制备：分别将致病假单胞菌用LB培养基、28±1℃活化培养48h；将灰葡萄孢、尖镰孢菌、腐皮镰刀菌、立枯丝核菌、盘核菌、黑胫茎点霉等病原菌用PDA培养基，26±1℃活化培养10ｄ～15 d；待生成大量菌体或孢子后，用适量无菌水洗脱，制成含孢（菌）量大于10⁸ cfu·ml^-1的孢子（菌）悬液，备用。

供试药剂: 枯草芽孢杆菌BAS-1692发酵液为试验药剂，50%多菌灵可湿性粉剂800稀释液为阳性对照（真菌），20%噻唑锌悬浮剂800倍液（细菌），清水处理为空白对照。

防治试验：将育苗基质灭菌，接体积重量百分比30%的试验药剂、对照药剂和清水（空白对照）于无菌基质，保温（28±1℃）保湿放置3天。再将各病原菌孢子（菌）悬液按体积重量百分比10%接种于混合基质，保温（26±1℃）保湿下放置12天(真菌）或3天（细菌），装50孔育苗盘，标记。将出芽一致的供试甘蓝种子点种于穴盘中，每种病原菌悬液处理2盘，标记，常规管理，备用。再将试验药剂、对照药剂和无菌清水按30ml/株的量灌根处理，所有处理保温（28±1℃）保湿（75%～80%）管理。共处理3次，前2次每次间隔3天，后1次每次间隔7天。每天观察记录出苗、植株生长和发病（包括未出苗的，未出苗及时调查病因）情况，出苗后35天（空白对照发病率大于10%）统计发病植株及其发病情况，计算防治效果。试验结果见表5。

发病株率(%)=发病株数/调查总株数 ×100

防治效果(%)=(对照区发病株率－处理区发病株率)/对照区发病株率 ×100

表5：枯草芽孢杆菌BAS-1692发酵液对甘蓝多种土传病害的防控效果

注释：表中同行小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）；阳性对照为50%多菌灵可湿性粉剂800稀释液（真菌），20%噻唑锌悬浮剂800倍液（细菌）。

表5结果显示，枯草芽孢杆菌BAS-1692发酵液能有效防控由灰葡萄孢、尖镰孢菌、腐皮镰刀菌、立枯丝核菌、致病假单胞菌、盘核菌、和黑胫茎点霉等等病原菌引发的甘蓝灰霉病、枯萎病、根腐病、褐腐病、黑腐病、菌核病和黑胫病等土传病害，对病原真菌引发的病害防效更好，平均防治效果在90%～98%，与对照农药在0.05水平上均不存在显著性差异，提质增量。对致病假单胞菌引发的细菌性黑腐病防效为88.61%，稍弱一点，与对照农药在0.05水平上存在显著性差异，但可以达到防效目标，遏制病害的进一步蔓延危害。

Claims (8)

1.一株枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌是2022年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号为CGMCCNo.24484。

2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌在分离纯化过程中采用的分离纯化培养基配方为：葡萄糖10 g，蛋白胨10 g，NaCl 3 g，牛肉膏3 g，酵母膏3g， MnSO₄·H₂O 0.005g，琼脂粉 适量,蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0。

3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在甘蓝种植中的应用。

4.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的发酵液在甘蓝种植中的应用。

5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵液制备时的发酵培养基配方为：牛肉膏8 g、酵母膏3g、葡萄糖10g、蒸馏水定容至1000 mL，pH7.0。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵液中有吲哚酸类、细胞分裂素、糖和各类氨基酸促进植物生长发育的物质，和环氧十八烷酸、衣康酸、丝衣霉酸、苯那普拉利、羟苯基卡维地洛、呋喃类和亚硝基噻唑烷羧酸抑菌物质。

7.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌在对灰葡萄孢、尖镰孢菌、腐皮镰刀菌、立枯丝核菌 、致病假单胞菌、盘核菌、黑胫茎点霉中一种或任两种及以上引发的甘蓝灰霉病、枯萎病、根腐病、褐腐病、黑腐病、菌核病和黑胫病病害防控中的应用。

8.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌在甘蓝种子萌发和植株生长中的应用。