CN117136968B - 一种复合型微生物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种复合型微生物组合物及其应用。本发明提供的复合型微生物组合物含有哈茨木霉、拜赖青霉和平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)三种微生物，充分利用了各菌株的特性。利用所述复合型微生物组合物可制备成干粉型种衣剂和悬浮型种衣剂，所述种衣剂制备简单、使用方便，能够将三种微生物有效定殖于种子中，维持各菌株其活性和稳定性；且还可以与多种化药种衣剂使用，对于有效抑制植物病害(特别是基腐病和大斑病)、抑制植物虫害，并促进植物生长具有显著的作用，具有重要的应用前景和经济价值。

Description

一种复合型微生物组合物及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种微生物组合物，具体涉及一种复合型微生物组合物及其应用。
背景技术
种子包衣是经特定工艺流程将外源材料包覆于种子表面，按一定比例将含有杀虫剂、杀菌剂、复合肥料、微量元素、植物生长调节剂、缓释剂和成膜剂等多种成分的种衣剂均匀包覆在种子表面，形成一层光滑、牢固的药膜。生物种衣剂随种子进入土壤，种衣剂只吸水不溶解，并通过种子表面成膜剂空间网状结构中的孔道，将其所携带的菌剂等种衣物质向根部缓慢释放，随种子发芽及幼苗生长而转运至植株的各部分，从而使生物菌剂能持续发挥作用。生物种衣剂不仅为种子和幼苗提供充足的养分和保护，还能提高种子发芽率，改进种苗质量，增强种苗的抗逆性，能起到杀虫、防病和促生等作用。而复配的菌剂，由于不同微生物之间存在互生、共生、寄生、拮抗等多种相互关系，要将不同的微生物菌株，尤其是菌种差别较大的菌株复配成菌剂，既要考虑种衣剂剂型、成分等使其适用于不同菌株的特性，又要重点考虑各菌株之间的互作关系，以保证菌株复配在一起的活性、稳定性和在种子和植株上的定殖能力。
微生物种衣剂的成功开发依赖于几个关键技术：具有功能的菌株、好的剂型保证菌株的活性及稳定性、好的菌株搭配、一定广度的化药兼容性以保证其能在土壤环境或植物根部定植等，从而达到具有抗病、防治地下害虫、调节和补充植株营养等多种功效。现有的种衣剂有效成分不同，有的是单剂，有的是复配制剂。不同的有效成分防治对象也不同，但主要都防治植物生育期的病虫害。对于剂型来说，干粉剂型使用时需要水溶操作，尤其和化药复配使用时，通常给使用者带来操作不便的缺陷，悬浮剂型中由于含有水，多数菌在该剂型中难以存活，仅有少数菌能在该剂型中稳定地存活；因此实际的菌剂产品中，悬浮剂型的推广使用极大地受到限制；复合型微生物菌剂还需要额外考虑菌种差异较大的互作关系，兼具可制备成干粉种衣剂和悬浮种衣剂等不同剂型的复合微生物菌剂可以拓宽市场中产品的使用形式，因此，挑选得到的复合型微生物菌剂既可以制备成干粉剂型种衣剂又同时可以制备成悬浮剂型种衣剂是具有重要的市场价值和使用前景。
木霉菌Trichoderma是自然界广泛分布的生防真菌，主要用于防治各类植物的土传病害以及部分叶部和穗部病害。木霉菌不仅能防病还具有促进植物生长、提高营养利用效率增强植物抗逆性和修复农化污染环境等功能(Harman G E etal.2006)。青霉菌Penicillium广泛存在于自然界中，具有生长繁殖快、产孢能力强的优点，其生长原料来源广、价格低廉，更利于工业化生产，是生物防治农作物病原真菌的主要菌种(张楠楠等，2017)。绿僵菌Metarhizium是一类重要的虫生真菌，全世界约有200多种害虫能被这种真菌感染致死。已经报道的通过室内分离得到的具有毒力的绿僵菌菌株很多，但是在田间实际应用的防治效果很差，致使能通过登记的绿僵菌商品制剂屈指可数，且产品仅集中在金龟子绿僵菌，对于其他绿僵菌，能够真正大面积推广的，且应用于田间害虫并且具有良好防效的绿僵菌商品制剂更为罕见。田间环境复杂，造成绿僵菌防效低且不稳定；如果需要大规模用于田间，需要产孢快且产孢量大的特定菌株；而已经报道的平沙绿僵菌菌株30°下培养48h孢子萌发率最高仅仅达到48％；而平沙绿僵菌菌株WP08菌株在SDA培养基上产孢量为0,在PPDA培养基上第14天为2.48±0.36×107孢子/cm2；PDA培养基上第14天为1.72±1.128×107孢子/cm2。
本发明旨在发明一种能够有效发挥这三种菌株的作用，有效用于植物病虫害防治，并促进植物生长、提升作物产量和产品品质的复合型种衣剂。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种能够同时有效发挥木霉菌、拜赖青霉和平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)的作用，用于植物病虫害防治，并促进植物生长、提高作物产量和产品品质、对化药具有强兼容性的复合型微生物组合物。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种复合型微生物组合物，包含微生物和农业上或园艺上可接受的载剂，所述微生物包括平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)，所述平沙绿僵菌保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏时间为2020年12月1日，保藏编号为GDMCC NO.61333；
优选地，所述微生物还包括：哈茨木霉、拜赖青霉；所述哈茨木霉保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年5月21日，保藏编号为CGMCCNo.15679；所述拜赖青霉保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年7月12日，保藏编号为CGMCC NO.12767；
优选地，所述农业上可接受的载剂包括一种或多种稳定剂、一种或多种分散剂、一种或多种湿润剂、一种或多种着色剂、一种或多种水性溶剂、一种或多种非水性共溶剂和/或一种或多种成膜剂；
优选地，所述农业或园艺上可接受的载剂可改善菌株在种子上的涂布性。
本发明选用的平沙绿僵菌菌株产孢快且产孢量大，经过实验表明，该菌株可用于大田作物。
本发明使用的三种微生物菌株哈茨木霉、拜赖青霉和平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)具有合成IAA和分泌铁载体的能力，能促进植物生长、提升作物产品和产品品质；具有生防潜力：对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)都具有一定的抑制作用，可有效用于防治由相关病菌引起的植物病害；具有杀虫活性、能有效杀灭玉米螟等害虫；对多种化药具有强兼容性，能直接与多种化药种衣剂配合使用或施用于化药残留比较严重的土壤环境发挥其功效。通过将这三者微生物与上述其他组分按质量分数混合制备得到用于种子包衣的复合型微生物种衣剂，所述种衣剂为干粉剂，该剂型和配方下的三菌株间具有理想且稳定的互作关系，能够有效提升各微生物的活性及稳定性，使其能有效定植于种子和植株根部，可有效用于植物病虫害的防治、促进植物生长、提升作物产量和产品品质等方面。且其对化药的强兼容性使其能适用于化药残留严重的土壤中，改善土壤环境、或与化药配合使用达到减少化药使用量、防治病虫害、促生、增产增收的目的。
作为本发明的优选实施方式，所述包括哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌，所述哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)的质量比例为1：1：1。
作为本发明的优选实施方式，所述微生物为所述微生物的孢子粉。
作为本发明的优选实施方式，所述复合型微生物组合物中，哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)真菌孢子粉的浓度分别至少为20亿CFU/mg或20亿CFU/mL。
制备成悬浮剂时，所述哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌真菌孢子粉的浓度分别至少为20亿CFU/mL；制备成干粉剂时，所述哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌真菌孢子粉的浓度分别至少为20亿CFU/g。
作为本发明的优选实施方式，所述组合包括以下质量百分含量的组分：15～18％微生物孢子粉、8～10％分散剂、5～8％湿润剂、18～20％着色剂、3～5％成膜剂、42％～45％一种或多种其他载剂；
优选地，所述组合物包括以下质量百分含量的组分：10％分散剂、5％拉开粉、20％着色剂、3％聚乙烯醇、13％改性淀粉、32％糖粉以及17％微生物孢子粉。
进一步地，分散剂优选为Dispersol BB4，拉开粉优选为拉开粉BX，着色剂优选为天然着色剂，改性淀粉优选为玉米改性淀粉。
作为本发明的优选实施方式，所述组合物还包括化药种衣剂；优选地，所述化药种衣剂占所述组合物质量比的至少50％；优选地，所述化药种衣剂为精甲霜灵、咯菌腈、噻虫嗪和戊唑醇中的至少一种。
经测试，本发明的复合型微生物种衣剂与多种化药种衣剂复配使用不会影响本发明复合型微生物种衣剂中的微生物活性。
作为本发明的优选实施方式，所述组合物还包括杀虫剂、植物营养素、肥料、除草剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀昆虫剂、杀螨剂、杀腹足动物剂中的一种或多种。
所述哈茨木霉、所述拜赖青霉和所述平沙绿僵菌复配后可提升所述平沙绿僵菌的杀虫功效。
本发明还提供了所述组合物的使用方法，将所述的组合物施加或涂布于所述植物部位或植物种子的外表面的至少一部分上；优选地，本发明所涉及的作物包括：大田作物、马铃薯、胡萝卜、叶菜类、茄果类蔬菜、草莓、葡萄、柑橘、香蕉、猕猴桃、火龙果、番茄、辣椒、豆类、大姜、三七、人参等根茎类作物；所述种子为玉米种子。
本发明还要求保护所述方法制备得到的植物产品；优选地，所述产品为种子。
本发明还要求保护一种增加作物或植物抗病性的方法，该方法包括如下步骤：(a)种植植物部位或种子，将所述组合物至少部分地涂布所述植物部位或种子；且(b)所述微生物菌株促进所述植物部位或种子生长。
作为本发明所述平沙绿僵菌或所述组合物的一种用途，所述平沙绿僵菌或所述组合物用于制备种子包衣剂或杀虫剂。
作为本发明所述平沙绿僵菌或所述组合物的另一种用途，所述平沙绿僵菌或所述组合物用于改善作物或植物性状；优选为，减轻或防治或改善植物病害严重程度或病害症状；
优选地，所述作物或植物为玉米；
优选地，所述作物或植物具有以下改善的性状中的一种或多种：产量增加，每株植物的种子重量增加，种子数量增加，出苗率增加，产量增长率增加，穗重增加，百粒重增加，行粒数增加，促进作物成熟更快、真菌病害引起的症状减轻、害虫引起的症状减轻；
优选地，所述真菌病害包括禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、凸脐孺孢菌(Exserohilum turcium)至少一种引起的病害；
优选地，所述真菌病害包括：玉米大斑病，玉米茎基腐病中的至少一种；
优选地，所述害虫包括玉米螟、线虫、昆虫、大虫、小虫、腹足动物中的至少一种。
优选地，所述病原菌选自：病原菌选自炭疽菌(Colletotrichum capsici)灰霉菌(Botrytis cinerea)，青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)、疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)、花生白绢病菌(Sclerotium rolfsii)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomycescritici)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)、苹果炭疽病菌(Glomerellacingulata)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolan)、稻瘟病菌(Pyriculariagrisea)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌(Bipolariamaydis)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、烟草疫霉病菌(Phytophthoranicotianae)、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonassyringae)、水稻白叶枯病菌(Xanthomonascampestris)、白菜软腐病菌(Erwiniacarotorora)、核桃黑斑病菌(Xanthomonascampestris)和/或魔芋软腐病菌(Erwiniacarotovora)、草莓灰霉病菌(Botrytis cirerea)、马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、玉米小斑病菌(Bipolariamaydis)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、茄子黄萎病菌(Verticilliumdahliae)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、烟草疫霉病菌(Phytophthoranicotianae)，或其任意组合。
在某些实施方案中，所述植物选自茄科，禾本科，豆科，葫芦科，十字花科，菊科，伞形花科，兰科。
在某些实施方案中，所述植物具有选自下列的一项或多项特征：
(1)所述茄科植物选自番茄，辣椒，马铃薯，茄子，或其任意组合；
(2)所述禾本科植物选自玉米，小麦，水稻，高粱，或其任意组合；
(3)所述豆科植物选自大豆，花生，或其任意组合；
(4)所述葫芦科植物选自黄瓜，冬瓜，南瓜，苦瓜，丝瓜，西瓜，罗汉果，或其任意组合；
(5)所述十字花科植物选自白菜，油菜，甘蓝，萝卜，花椰菜，或其任意组合；
(6)所述兰科植物选自兰花。
本发明还提供了所述组合物的制备方法，包括如下步骤：将各组分按配比混合。
本发明提供了一种含有哈茨木霉、拜赖青霉和平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)三种微生物的干粉型和悬浮剂型复合型微生物组合物，三种微生物在该剂型和配方下具有理想且稳定的互作关系，以促进其活性和稳定性，使其在充分发挥各自功能的前提下还能产生协同增效的效果。所述种衣剂制备简单、使用方便、剂型和效果稳定、且还可以单独使用或与多种化药种衣剂配合使用，发挥多种用途：首先，三种微生物能有效定殖于种子和植物根部，能够促使植物根长、根多、茎粗，叶绿素增加，使作物籽多粒饱、穗大角大或果多果大，以达到提升质量和产量目的；其次，能有效抑制植物病害(特别是基腐病和大斑病)、抑制植物虫害如玉米螟等，具有重要的应用前景和经济价值。
附图说明
图1为不同菌株的载铁分泌测试结果；其中，P.b为拜赖青霉，T.h为哈茨木霉，M.p为平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)。
图2为温室盆栽试验测试不同包衣处理的玉米种子的栽培结果。
图3为玉米田间试验测试不同包衣处理的玉米种子的生长情况。
图4为不同菌株对禾谷镰刀菌的平板对峙测试结果；其中，F.g为禾谷镰刀菌，P.b为拜赖青霉，T.h为哈茨木霉，M.p为平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)。
图5为不同菌株对凸脐蠕孢菌的平板对峙测试结果；其中，E.t为凸脐蠕孢菌，P.b为拜赖青霉，T.h为哈茨木霉，M.p为平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)。
图6为不同包衣处理的玉米大斑病防治情况。
图7为本发明复合型微生物种衣剂中各菌株在玉米根系上的定殖情况。
图8为拜赖青霉种衣剂在玉米根系上的定殖情况。
图9为哈茨木霉种衣剂在玉米根系上的定殖情况。
图10为平沙绿僵霉种衣剂在玉米根系上的定殖情况。
图11为各组处理对玉米田间促生实验第52天的实验结果。
图12为平沙绿僵霉在不同温度的生长情况。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明的哈茨木霉相信信息参见CN109022292B，本发明所涉及的哈茨木霉菌株包括了CN109022292B公开的所有信息，本发明的拜赖青霉菌株相关信息参见CN107793263B.本发明所涉及的拜赖青霉包括了CN107793263B公开的所有信息。
对于平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)，本申请筛选出一株产孢快且产孢能力强的平沙绿僵菌。实验方法如下：
(一)平沙绿僵菌的分离、纯化与鉴定
1.1分离、纯化
称土：采集到江西的农业土壤晾干后，将土壤样品过筛去除杂质，称取干土10g装入过滤装置中。
洗土：用自来水洗土10min，使土壤颗粒通过1mm黄铜网和两个聚丙烯过滤器向下流动。收集最底层的土壤微粒，将其放入无菌的50mL离心管中，加入50mL无菌水，涡旋混合器使其悬浮。离心机10000rpm离心6min，倒掉上清，用无菌水清洗，再次离心，反复离心清洗3次。
稀释沉淀：按水/颗粒的20:1(v/v)的比例加入无菌的羧甲基纤维素钠溶液。
涂布：用无菌水稀释10倍的上述沉淀悬浮液，用移液器吸取100μL至PDA(含有氯霉素和盐酸四环素)平板上涂布均匀，平板置于28℃黑暗培养2～7d。
真菌纯化：当培养基上长出单个白色絮状的菌落，用无菌牙签挑取少量菌丝至SDAY平板中继续培养得到纯化菌株。
1.2形态学鉴定
将分离到的绿僵菌接种在SDAY培养基平板上28℃培养10～15天，观察菌落形态特征、产孢结构和孢子形态大小。在培养4～5天时挑取白色菌丝做成制片，在显微镜下观察菌丝及分生孢子形态；产孢后挑取分生孢子做成制片观察分生孢子的大小及形态。
1.3分子生物学鉴定
利用菌株的菌丝体提取基因组DNA，作为基因扩增的模板，对菌株进行多基因扩增及测序。需扩增的基因及引物为：
ITS:ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)
和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)
BenA:Bt1F(5’-GGTCCCTTCGGTCAGCTCTTCC-3’)
和Bt1R(5’-CAGCCATCATGTTCTTAGGGTC-3’)
EF:983F(5’-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3’)
和2218R(5’-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3’)
以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
模板DNA提取：根据BiospinFungus Genomic DNAExtractionKit(BioFlux,BioerTechnology Co.,Ltd.)进行基因组DNA提取。
基因扩增反应体系：在PCR管配制反应体系2XTaq PCR MasterMix 12μL，DMSO 1μL，引物1引物2(10μmol/L)各0.6μL，ddH2O 10.8μL，模板DNA2μL。
基因扩增条件：预变性94℃4min；变性94℃40s，退火55℃40s，延伸72℃1min，变性至延伸进行35个循环；延伸72℃10min，10℃保温5min。PCR后的样品送金唯智测序。
ITS测序结果、BenA测序结果、EF测序结果如下：
ITS：
TNNGNGACTGCGGAGGATCATTAGTGAATTAAACATGCTTGGTGTCTTCGCTTCGGCAAGGCCCTTGCTTAAATCACATCCTAACACCTGTGAACTGTAAGACGTATGATGAGGTCTTTGGCCAAGTCATCGTCTGCCCATTTTTAACAAACAATTAATGTAACAAACGTAGTCTTATTATAACCTAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCTTTGGTATTCCGAAGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAAATATCAACCTTGACTTGGGTTTTGTGCTCTAGTCTTGGCTTGGAATTGGGTGCTTGCCGCTTTTACGAGCGGCTCACCTTAAATATATTAGCTGGATCTGTCTTTGAGACTTGGTTTGACTTGGCGTAATAAGTATTTCGCTAAGGACATTCTTCGGAGTGGCCTCGTTTCTAGGACGCTTGTCCGCTTCCCAATACAAGTTCCACCTCGTGGACATGACTTTTTTATTATCTGGCCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAACCCCGGAAGGGAAA
BenA：
CGTCAGCTCTTCCGTCCCGACAACTTCGTCTTTGGTCAGTCTGGTGCTGGCAACAATTGGGCCAAGGGTCACTACACTGAAGGTGCTGAGCTTGTCGACAATGTCCTTGATGTTGTCCGTCGCGAGGCGGAAGGTTGTGACTGCCTCCAGGGCTTCCAGATCACCCACTCTCTCGGTGGTGGTACCGGTGCTGGTATGGGTACTCTGTTGATCTCCAAGATCCGTGAAGAGTTTCCCGACCGAATGATGGCCACATTCTCCGTCGTTCCCTCTCCCAAGGTTTCCGACACCGTTGTCGAGCCCTACAACGCAACCCTCTCCGTCCATCAGCTCGTTGAGAACTCTGACGAGACTTTCTGCATCGACAATGAGGCTCTGTACGACATCTGCATGCGCACTCTCAAGCTGTCTAACCCTTCGTACGGTGACCTGAACTATCTCGTCTCTGCCGTCATGTCTGGCGTCACCACATGCTTGCGTTTCCCCGGTCAGTTGAACTCTGATCTGCGTAAGCTGGCTGTCAACATGGTCCCCTTCCCTCGTTTGCACTTCTTCATGGTCGGCTTCGCCCCCCTGACCAGCCGTGGTGCTCACTCTTCCGCGCTGTCAGCGTACCTGAGCTCACCCAGCAGATGTTCGACCCTAAG
EF：
GAGGCTGGTATCTCCAAGGATGGCCAGACCCGTGAGCATGCTCTGCTCGCCTACACCCTGGGTGTCAAGCAGCTCATTGTCGCCATCAACAAGATGGACACCACCAAGTGGTCCGAGGCCCGTTACCAGGAAATCATCAAGGAGACTTCCAACTTCATCAAGAAGGTCGGCTACAACCCCAAGACCGTCGCCTTCGTCCCCATCTCCGGTTTCCACGGTGACAACATGCTTCAGGCCTCCACCAACTGCCCCTGGTACAAGGGTTGGGAGAAGGAGACCAAGGCTGGCAAGTCCACCGGCAAGACCCTCCTCGAGGCCATTGACGCCATTGAGCCCCCCAAGCGTCCCACCGACAAGCCCCTCCGTCTTCCCCTCCAGGATGTGTACAAGATCGGCGGTATTGGAACTGTCCCTGTCGGCCGTATCGAGACTGGTGTCCTCAAGCCCGGTATGGTCGTTACCTTTGCTCCCTCCAACGTCACCACTGAAGTCAAGTCCGTGGAAATGCACCACGAGCAGCTTACCGAGGGTGTCCCCGGTGACAACGTTGGTTTCAACGTGAAGAACGTTTCCGTCAAGGAAATCCGCCGTGGTAACGTTGCTGGTGACTCCAAGAACGACCCCCCCATGGGTGCCGCTTCCTTCGATGCCCAGGTCATCGTTCTCAACCACCCCGGCCAGGTCGGTGCTGGTTACGCTCCCGTCCTCGATTGCCACACCGCCCACATTGCCTGCAAGTTCTCTGAGATCAAGGAGAAGATTGACCGACGTACCGGTAAGGCTGTTGAGTCTGCCCCCAAGTTCATCAAGTCTGGTGACTCTGCCATCGTCAAGATGGTTCCCTCCAAGCCTATGTGCGTTGAGGCTTCACCGACTAC
1.4结果
该菌株在SDAY培养基上菌落初期白色，质地绒毛状，成熟时产生橄榄绿色的分生孢子。菌丝有隔；分生孢子单细胞，链状排列，长椭圆形、柱状，大小为(6.50～8.94)μm×(2.18～2.82)μm。
将测序的获得的序列与NCBI基因数据库的绿僵菌菌株序列进行比对。经鉴定该菌株为平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)。
基于多基因(ITS、BenA和EF)建立的系统发育树如图7所示，显示菌株GDMCC 61333为Metarhiziumpingshaense。
保藏信息：平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 61333，保藏时间为2020年12月1日。
(二)平沙绿僵菌产孢能力实验测定：
1.1温度对菌株生长的影响
将培养好的绿僵菌孢子用0.1％Tween80洗下，吸取10μl接种到新的SDAY培养基上，在20℃、25℃、28℃、30℃、35℃五个不同温度下恒温培养，每天测量菌落直径，每组3个重复。结果见图11。
1.2菌落生长速率测定
将培养好的绿僵菌孢子用0.1％Tween80洗下，吸取10μl接种到新的SDAY培养基上，做3个重复，每天定时测定其直径并记录数据，直到菌落长满培养基为止。
1.3产孢量测定
将100μl孢子悬浮液涂布于SDAY上，在28℃条件下培养10～15d后，用打孔器从平板上截取直径8mm的菌片，在超声波破碎仪上将菌片上的分生孢子振动洗入10mL 0.1％Tween80中，用血球计数板计数测定孢子浓度，再换算为每cm2平板上的产孢量。每个平板打3个孔进行孢子含量测定取其平均值,作为1个重复的孢子数。各菌株重复测定3次。
1.4孢子萌发率测定
将培养10～15d的绿僵菌平板用0.1％Tween80洗下孢子，吸取10μl接种到1/4SDAY培养基上，每皿接种3处，置于相同条件的培养箱内培养24h，用400倍的显微镜随机观察，以孢子的芽管长度大于或等于孢子短轴直径为标准，统计孢子萌发数并计算萌发率。
2.结果
温度对菌株生长的影响：从下图可以看出，菌株生长的最适温度为20～30℃，其中在25～28℃时生长最好。
产孢量和孢子萌发率：在SDAY培养基上培养至第14d产孢量就可达0.66×108孢 子/cm2 。产孢量较高。24小时孢子的萌发率可达94％以上。上述均说明该菌株营养要求简单、生长繁殖较快、产孢快，生物学特性良好。
实施例1本发明干粉复合型微生物种衣剂的包衣效果
1、干粉种衣剂与悬浮型种衣剂的制备
(1)按下表1配比配制干粉种衣剂：
配方1：复合型微生物种衣剂包括以下质量百分含量的组分：10％分散剂、5％拉开粉、20％着色剂、3％聚乙烯醇、13％改性淀粉、32％糖粉以及17％微生物复合物。
配方2：复合型微生物种衣剂包括以下质量百分含量的组分：8％分散剂、8％拉开粉、18％着色剂、5％聚乙烯醇、10％改性淀粉、35％糖粉以及16％微生物复合物。
配方3：复合型微生物种衣剂包括以下质量百分含量的组分：9％分散剂、6％拉开粉、19％着色剂、4％聚乙烯醇、11％改性淀粉、33％糖粉以及18％微生物复合物。
配方4：复合型微生物种衣剂包括以下质量百分含量的组分：9％分散剂、7％拉开粉、19％着色剂、4％聚乙烯醇、12％改性淀粉、34％糖粉以及15％微生物复合物。
表1干粉种衣剂配方
表1中干粉种衣剂配方中的微生物可以是单种微生物，也可以是多种微生物的复合物，对应的，配制而成的干粉种衣剂可以是单种微生物种衣剂，也可以是复合型微生物种衣剂。
制备干粉复合型微生物种衣剂时，微生物为哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)的复合物，以真菌孢子粉的形式与种衣剂其他成分混合均匀，配置成干粉型复合型微生物种衣剂，其中哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)真菌孢子粉的终浓度分别为20亿/g，其中复合型微生物种衣剂中哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌(Metarhizium pingshaense)的混合的质量比例为1：1：1。
制备干粉单种微生物种衣剂时，微生物真菌孢子粉的终浓度为20亿CFU/g。
后续测试均以最优配比进行种衣剂制备。
(2)按下表2配比制备悬浮型种衣剂：
表2悬浮型种衣剂配方
表2中悬浮型种衣剂配方中的微生物可以是单种微生物，也可以是多种微生物的复合物，对应的，配制而成的悬浮型种衣剂可以是单种微生物种衣剂，也可以是复合型微生物种衣剂。
制备悬浮型复合型微生物种衣剂时，微生物为哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)的复合物，其以真菌孢子粉的形式按质量比例为1：1：1进行混合，然后将悬浮型种衣剂配方中除真菌孢子粉以外的所有组分先混合配置成悬浮剂，然后将悬浮剂与真菌孢子粉按质量比混合，配制成微生物悬浮型种衣剂，配置而成的悬浮型复合型微生物种衣剂中的哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)真菌孢子粉的终浓度分别为20亿CFU/g。
制备悬浮型单种微生物种衣剂时，微生物真菌孢子粉的终浓度为20亿/g。
后续测试均以最优配比进行种衣剂制备。
2、种子包衣处理及包衣后的菌数稀释涂板
将干粉种衣剂稀释3～5倍，然后以药种比1:80对玉米(郑单958)进行种子处理，搅拌均匀后晾干。各处理取10粒玉米于50mL离心管中，加入20mL无菌吐温水，涡旋机震荡均匀，稀释至10-5。各浓度为：原液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，各浓度取100μL菌悬液于PDA平板上，每个浓度三个重复，用无菌玻璃珠使菌悬液均匀散布在培养基上，晾干后放入28℃恒温培养箱，1d后开始进行观察，统计平板上的菌落数(以平板上菌落数10～150为有效计数范围)，计算玉米表面包衣菌数。
3、包衣处理结果
为测试种衣剂的剂型和配方对微生物的活性、稳定性及在种子上的定植能力的影响，进行了种子包衣处理，不同种衣剂对玉米种子进行包衣处理结果如下表3所示。本申请的复合型微生物种衣剂(干粉和悬浮剂)以10-4浓度范围计算平板上菌落数并计算得到包衣菌数。悬浮种衣剂的拜赖青霉以10-4浓度范围计算平板上菌落并计算得到包衣菌数；哈茨木霉以10-3浓度范围计算平板上菌落数并计算得到包衣菌数；平沙绿僵菌以10-2浓度范围计算平板上菌落数并计算得到包衣菌数。
表3各处理包衣菌数
由表3可见，干粉包衣剂的4个配方包衣后,不管是拜赖青霉、哈茨木霉、平沙绿僵菌的单剂菌数还是复合剂菌数均达到105,且配方1的的单剂和复合剂的菌数均在7×105cfu/粒，相对于其他配方的各菌数均要高，因此配方1是干粉种衣剂的最优配方。由实验可知，本申请的平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)也可以单独制备成干粉型种衣剂和悬浮型种衣剂。
悬浮型的包衣剂用于三种菌株同时包衣处理，在种子上的拜赖青霉占明显优势，哈茨木霉和平沙绿僵菌在种子上数量有明显偏低，单剂和复合的菌数水平一致。；悬浮剂与干粉剂包衣处理的菌数相比，干粉剂的包衣种子后的菌数更高。
本发明筛选得到的复合型微生物同时适用于干粉剂型的种衣剂和悬浮剂型的种衣剂，干粉剂型使用时需要水溶操作，尤其和化药复配使用时，通常给使用者带来操作不便的缺陷，悬浮剂型中由于含有水，多数菌在该剂型中难以存活，仅有少数菌能在该剂型中稳定地存活；因此实际的菌剂产品中，悬浮剂型的推广使用极大地受到限制；复合型微生物菌剂还需要额外考虑菌种差异较大的互作关系，兼具可制备成干粉种衣剂和悬浮种衣剂等不同剂型的复合微生物菌剂可以拓宽市场中产品的使用形式，因此，挑选得到的复合型微生物菌剂既可以制备成干粉剂型种衣剂又同时可以制备成悬浮剂型种衣剂是具有重要的市场价值和使用前景。
按表2提供的组分范围内制备复合种衣剂包衣效果与最优比基本一致，能够有效提升三种菌的活性以及稳定性。
实施例2本发明复合型微生物种衣剂促进玉米生长试验
(1)IAA测试
对哈茨木霉、拜赖青霉和平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)的分泌IAA能力进行测试：
将3株菌从甘油管中分别活化至马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。恒温28℃培养，每株菌活化3板，备用。将3株菌接至对应的液体培养基(PDB)，28℃摇床培养。每菌株设3个重复，以空白培养基(不接种菌株的)作为对照。将上述菌株培养液在10,000r/min、4℃下离心10min，取上清液1mL与1mL比色液混匀，在黑暗环境中静置30min后，然后快速利用分光亮度计在530nm波长下进行比色，从而检测其吸亮度大小，根据OD值，利用标准曲线最终计算出IAA含量(杨琦瑶等,2012)。结果如下表。
表4菌株IAA浓度
序号 菌株 OD530 IAA浓度μg/mL
1 哈茨木霉 0.077 1.925
2 平沙绿僵菌 0.029 0.781
3 拜赖青霉 0.06 1.520
由上表可得，哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)都具有合成吲哚乙酸的能力。由实验可知，本申请的平沙绿僵菌(Metarhizium pingshaense)具有促进作物生长的功能。
(2)分泌铁载体能力测试
铁载体是包括细菌和真菌在内的，几乎所有好氧和兼性厌氧的微生物在铁胁迫条件下向环境分泌对Fe3+具有极高亲和力的小分子量铁螯合物，这些化合物协助微生物从环境中获取必需的铁元素。在铁缺乏时，微生物在体内产生特异的铁载体，与Fe3+形成紧密的可溶复合物；同时在革兰氏阴性菌(G-)的细胞外膜上产生受体蛋白，即铁受体蛋白，特异识别Fe3+铁载体并把Fe3+运输到细胞内。现在的一些研究表明，铁载体不仅对微生物的铁营养至关重要，而且它是根际促生细菌(PGPR)抑制土壤病害的重要机制，另外，铁载体还在某些动植物病原菌的致病性等诸多方面起着作用。这些具有铁载体合成能力的微生物通过竞争铁元素，不仅能够改善自身的营养状况，还能够供给植物铁营养或通过与植物病原菌竞争铁营养达到生物防治的作用。由实验可知，本申请的平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)也可以单独制备成生物防治剂，具有抗植物病原菌的功能。
对哈茨木霉、拜赖青霉和平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)的分泌铁载体能力进行测试：
铁饥饿处理：用接种环刮取供试菌株，接种到装有10mLMKB无铁培养基的50mL离心管中，30℃,200rpm振荡培养24～72h。待菌体产生后，1000rpm离心5min，弃上清。将菌体用5mL无菌超纯水10,000rpm离心5min洗涤2次，再用无菌超纯水稀释10倍获得菌悬液。
CAS平板覆盖法：取10μL菌悬液接种于无铁MKB平板，或用接种环划线接种于无铁MKB平板。每个菌株3个重复，置于30℃培养箱中培养2d。2d后，每个平板上都长出明显单菌落，在长出菌落的平板上倒一层CAS培养基，放置1h后观察每个平板的颜色变化，24h后再观察一次，拍照记录。
当生防菌产生铁载体时：产铁载体的生防菌菌落会在铁载体检测平板上出现肉眼可见的晕圈，铁载体晕圈为橙红色晕圈。在进行定性检测时，要对每个铁载体检测板上菌落与平板颜色的变化，包括菌株产生的铁载体晕圈颜色的变化和晕圈增加的大小，进行观察并记录。除了肉眼观察晕圈，还可以通过计算可溶性指数，即晕圈比D/d的大小，以可溶性指数为参考，分析比较生防菌分泌铁载体的能力。各菌的测试结果如下表和图1所示。
表5各菌株铁载体可溶性指数
菌株 可溶性指数
拜赖青霉 1.52
哈茨木霉 1.45
平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense) 1.38
从测试结果上来看(表5，图1)，三株菌都有一定的产生铁载体的能力，对植物具有促生、生防潜力。本申请的平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)也可以单独制备成生物防治剂，和植物/作物生长剂、具有促生和抗植物病原菌的功能。
(3)温室盆栽试验
通过温室盆栽试验，测试不同种衣剂处理的玉米种子生长效果。
选取健康且大小一致的玉米种子(郑单958)进行表面消毒后，随机分为6组，分别用不同的种衣剂进行处理(参考下表6，其中，单种微生物种衣剂有效活菌数>20亿CFU/g；复合为实施例1制备的复合型微生物种衣剂干粉剂，其中有效活菌数>60亿CFU/g；助剂对照为干粉种衣剂种衣剂中的微生物部分用等质量的麦芽糊精替代，其余与复合型微生物种衣剂相同；空白对照为未处理的裸种)：将配置好的种衣剂用水稀释5倍，然后以药种比1:80对玉米进行拌种，充分搅拌，晾干。将玉米种植于花盆中，花盆尺寸(d＝8.3cm,h＝7cm)，3棵/盆，18盆/处理，三个重复。水肥管理：干旱时浇水，中间浇一次0.1％NPK水溶肥。28天后收苗，洗根，测量玉米的株高、茎粗、地上部、地下部干重。结果如下表6和图2。
表6各处理对玉米生长指标影响
注：同列不同字母表示差异达到显著水平(P＜0.05)
由表6和图2可得，各菌剂包衣处理对玉米都有一定的促进生长作用，其中：
哈茨木霉和复合型微生物种衣剂处理的玉米的株高较不处理的裸种和助剂对照有显著性提高，拜赖青霉、平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)处理的玉米株高略高于不处理的裸种和助剂对照组；
平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)处理的玉米茎粗显著高于其他组，其他微生物处理组玉米茎粗略高于不处理的裸种和助剂对照组；
在单株地上干重方面，哈茨木霉、拜赖青霉、绿僵菌都显著高于不处理的裸种和助剂对照组，复合型微生物种衣剂亦略高于不处理的裸种和助剂对照组；
单株地下干重方面，哈茨木霉、拜赖青霉、复合型微生物种衣剂略高于不处理的裸种和助剂对照组，平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)种衣剂显著高于各组。
复合型微生物种衣剂处理的玉米株高较空白对照增长12.17％，茎粗较空白对照增长6.92％，单株干重较空白对照增长14.57％，说明复合型微生物种衣剂具有较好的促生效果。本申请的平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)也可以单独制备成玉米作物的生物防治剂，和植物/作物生长剂、具有促生和抗植物病原菌的功能。
(4)复合型微生物种衣剂对玉米田间促生效果
进一步对本发明的复合型微生物种衣剂样品进行田间测试。试验共分为7组(参考表7)，其中，各微生物种衣剂组分别按1:80(种衣剂：玉米)的重量比例包衣(单种微生物种衣剂有效活菌数>20亿CFU/g)，复合为实施例1复合型微生物种衣剂干粉剂(有效活菌数>60亿CFU/g)，助剂对照为干粉种衣剂中的微生物部分用等质量的麦芽糊精替代，其余与复合型微生物种衣剂相同；化药组为将锐胜、满益佳、益配威和亮穗复合而成的悬浮剂与玉米种子按1:80的重量比例包衣，空白对照为未进行包衣的裸种。
供试玉米品种：聚鑫2号
实验在黑龙江省齐齐哈尔市建华区黎明村(47.374934°N，124.017567°E)进行：2022年7月7日，按常规方式播种，播种深度3～4cm，7月14日出苗，8月1日定苗。采用随机区组排列，3次重复，8垄/小区，垄长9.5m，垄距65cm，小区面积45㎡(5m×9m)，39株/垄，株距24cm，随机区组排列，四周保护行4行，小区不设走道，重复间设50cm走道。在玉米生育期观察种衣剂对玉米影响，观察结果见表7、8和图3。
表7各处理对玉米生育期指标影响
注：同列不同字母表示差异达到显著水平(P＜0.05)
由表7可知，各处理组出苗率差异不明显，都达到80％以上，其中复合型微生物种衣剂出苗率最好为91.27％，较空白对照增加2.5％，较化药增加3.6％。在播种第6天测量株高，复合型微生物种衣剂的株高显著高于空白对照，增加60.52％，较化药增加139.06％。在播种第52天测量，复合型微生物种衣剂的株高略高于空白对照，增加3.3％，较化药增加1.88％。而关于亩产量，微生物复合种衣剂可达每亩703.26kg，其产量高于其他处理组，可见三菌株复配后具有协同增效的作用。本申请的平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)也可以单独制备成生物防治剂，和植物/作物生长剂、能够提高亩产量，提高作物出苗率和产量增长率。本申请的平沙绿僵菌具有促生和抗植物病原菌的功能。
表8各处理对玉米穗指标影响
由表8和图3可知，本发明的复合型种衣剂处理的玉米穗重、百粒重显著高于空白对照，穗长、穗行数和行粒数略高于空白对照，其中穗重增长率为18.83％，穗长增长率为10.71％，穗行数增长率为11.52％，行粒数增长率为15.84％，百粒重增长率为21.32％；复合型种衣剂处理玉米的穗长略高于单独微生物种衣剂的处理且显著高于助剂对照组、化药组和空白对照组，复合型种衣剂处理玉米的行粒数、百粒重都略高于单独微生物种衣剂处理组。
结合图11可知，图11为复合型微生物种衣剂对玉米田间促生实验第52天的实验结果，根据大田实验第52天观察，复合的种衣剂相比单独菌剂，复合的种衣剂在玉米的生长期-水泡期，花丝率先变暗。能够使得玉米作物成熟更快。
总的来说，在玉米田间试验中，除了株高之外，复合型微生物种衣剂在出苗率、产量和玉米穗的整体品质上也都表现出了比单种微生物种衣剂更好的效果。即复合型种衣剂不仅具有促生效果，还能提高作物产量和产品品质。
本申请的平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)也可以单独制备成种衣剂，在出苗率、产量和玉米穗的整体品质上也都表现出了较好的效果，不仅具有促生效果，还能提高作物产量和产品品质。
实施例3玉米茎基腐病的防治测试
(1)对真菌病原禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)的抑制作用
采用平板对峙法，真菌病原禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)接种在Luria-Bertani培养基-琼脂平板中央，待测生防真菌哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)接种在病原菌的一侧或四周，距离病原菌2cm，每株菌三个重复，以只接种病原菌的平板作为对照。28℃培养箱中培养，4～5天之后观察，并计算抑菌率、抑菌带宽度。
抑菌率(％)＝(对照菌落直径(半径)－处理菌落直径(半径))/对照菌落直径(半径)×100％。
测试结果如下表所示。
表9各菌株的抑菌率及抑菌带宽度
菌株 抑菌率(％) 抑菌带(cm)
拜赖青霉 78.67 0.5
哈茨木霉 50.1 0
平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense) 70.5 0.2
从测试结果可见(表9，图4)，三株菌对禾谷镰刀菌都有一定的抑制生长作用，且抑菌效果明显。其中拜赖青霉的抑菌率最高，为78.67％，抑菌带宽度0.5cm，平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)的抑菌率也达到了70％以上，抑菌带宽度0.2cm，哈茨木霉的抑菌率为50.1％。本申请的平沙绿僵菌(Metarhizium pingshaense)也可以单独制备成生物防治剂，能够抑制真菌病原菌，并用于真菌性病害的防治。
(2)玉米茎基腐病的防治测试
将本发明的复合型微生物种衣剂样品进行玉米茎基腐病的室内测试：将禾谷镰刀菌Fusariumgraminearum用PDA培养基培养3～5天，待长满平板后将其打成菌饼(d＝1cm)，接种在CMC培养基中，培养5～8天，用血球计数板将孢子悬浮液调整至105～106cfu/mL，将孢子悬浮液与灭菌土混合，然后将包衣后的玉米种植在花盆中，花盆尺寸(d＝8.3cm,h＝7cm)，3棵/盆，18盆/处理，三个重复。
玉米种子分别按不同的处理进行包衣(各组处理参考表9)，其中，除化药组，其他各组处理与实施例2相同；化药为精甲霜灵·咯菌腈悬浮种衣剂。
每日浇水，保持土壤含水量50～80％。2周后收苗，查看发病情况。结果如表10所示。
表10各处理对玉米茎基腐病防治效果
由表10可知，复合型微生物种衣剂的玉米发病率最低，为29.63％，对玉米茎基腐病的相对防效最好，达到66.67％，化药种衣剂处理的玉米病情指数为22.22％，相对防效为75％。由此可见，本发明的复合型微生物种衣剂对玉米茎基腐病具有显著的防治效果。
本申请的平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)也可以单独制备成种衣剂，能够抑制真菌病原菌，并用于真菌性病害的防治。对玉米茎基腐病具有显著的防治效果。
实施例4玉米大斑病的防治测试
(1)凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)平板对峙试验
采用平板对峙法，真菌病原凸脐蠕孢菌接种在(PDA)培养基-琼脂平板中央，待测生防真菌哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)接种在病原菌的一侧或四周，距离病原菌2cm，每株菌三个重复，以只接种病原菌的平板作为对照。28℃培养箱中培养，4～5天之后观察，并计算抑菌率、抑菌带宽度。
抑菌率(％)＝(对照菌落直径(半径)－处理菌落直径(半径))/对照菌落直径(半径)×100％。
测试结果如下表所示。
表11各菌株对凸脐蠕孢抑菌率及抑菌带宽度
从测试结果上来看(表11，图5)，三株菌对凸脐蠕孢菌都有一定的生长抑制作用，且抑菌效果明显。其中哈茨木霉的抑菌率最高，为81.28％，拜赖青霉的抑菌率也达到了70％以上，抑菌带宽度0.31cm，平沙绿僵菌(Metarhizium pingshaense)抑菌率接近58.68％，抑菌带宽度0.26cm。
本申请的平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)也可以单独制备成生物防治剂、农药制剂，能够抑制真菌性病原菌，并用于真菌性病害的防治。
(2)玉米大斑病防治效果
在实施例2玉米进入乳熟后期进行玉米大斑病调查。
调查时目测每份鉴定材料群体的发病状况。调查重点部位为玉米果穗的上方叶片和下方3叶，根据病害症状描述，逐份材料进行调查并记载病情级别。病情分级如下：0级：全株叶片无病斑；0.5级：全株叶片有零星病斑，占叶面积的1％左右；1级：全株叶片有少量病斑，占叶面积的5％-10％；2级：全株叶片有中量病斑，占叶面积的10-25％；3级：植株下部叶片有多量病斑，占叶面积的50％以上，出现大片枯死现象，中上部叶片有中量病斑，占叶面积的10-25％；4级：植株下部叶片病枯，中部叶片有多量病斑，出现大片枯死现象，上部叶片中量病斑；5级：全株基本枯死。
各处理组玉米大斑病调查结果如下表和图6所示。
表12各处理对玉米大斑病防治效果
由表12和图6可知，复合型微生物种衣剂的玉米病情指数指数最低为18.67％，对玉米大斑病的相对防效最好，达到67.43％，化药种衣剂处理的玉米病情指数46.33％，相对防效为19.19％。由此可见，本发明的复合型微生物种衣剂对玉米大斑病具有显著的防治效果。
本申请的平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)也可以单独制备成种衣剂和生物防治剂、农药制剂，能够抑制真菌性病原菌，并用于真菌性病害的防治。对玉米大斑病具有显著的防治效果。
实施例5复合型微生物种衣剂对玉米螟的室内杀虫效果
收集实施例2田间各处理组生长发育状况较为一致的玉米叶片，每小区5点取样，每点3株，每株2叶片。将新鲜叶片放置于直径10cm的玻璃培养皿中，每皿中放入20只初孵、活性大小一致的玉米螟幼虫，3个重复。实验期间保证叶片充足，10d后记录幼虫存活率，计算相对防治效果。
防效(％)＝[1-(处理区药后活虫数×对照区药前活虫数)/(处理区药前活虫数×对照区药后活虫数)]×100％。
各组对玉米螟的室内防治效果入下表。
表13各处理对玉米螟的室内防治效果
结果显示，平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)和微生物复合菌剂对玉米螟的防治有显著效果，微生物复合菌剂略高于平沙绿僵菌(Metarhizium pingshaense)组，对玉米螟的防效可达79.78％。而拜赖青霉、哈茨木霉和助剂三个处理的防效分别为2.25％、1.16％和1.93％，考虑到玉米螟个体之间存在的生命力强弱差异、环境适应能力的差异等因素，可以判定该三个处理对玉米螟没有防治效果。上述结果表明，复合型微生物种衣剂的三菌株复配后，比平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)单独使用具有更好的防效，即该复合型种衣剂具有防治玉米螟的潜力。
本申请的平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)也可以单独制备成杀虫剂和农药制剂，能够抑制田间害虫，如玉米螟。
实施例6复合型微生物种衣剂对玉米害虫的田间杀虫效果
进一步在玉米收获后，调查玉米植株的被害情况，以及玉米害虫存活数量。每小区5点取样，每点抽查20株。结果入下表。
表14各处理下玉米的被害率(％)
田间调查显示，相对于空白对照组，各处理害虫数量减少。结果显示，平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)和微生物复合菌剂对玉米害虫的防治有显著效果，微生物复合菌剂对玉米螟的防效可达69.81％。而拜赖青霉、哈茨木霉和助剂三个处理相对空白对照组的防效分别为9.43％、3.78％和-9.43％，基于跟室内杀虫实验相类似的因素，可以判定该三个处理对玉米害虫没有防治效果。上述结果表明，复合型微生物种衣剂具有防治玉米害虫的潜力，且相对于单独使用平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)，本发明的复合型微生物种衣剂所用的三种菌之间具有协同提高防治玉米虫害的效果。
本申请的平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)也可以单独制备成种衣剂和生物防治剂、农药制剂，能够抑制田间玉米虫害，具有显著的防治效果。
实施例7复合型微生物种衣剂在玉米根部定殖情况
将实施例2中的复合型微生物种衣剂处理的玉米分别在播种第6天(7月13日)、第52天(9月8日)、第98天(10月13日收获时)进行玉米根系的采集，在实验室条件下进行菌株分离鉴定—稀释涂板，测试玉米根系各菌株的定殖情况。试验结果如图7～10所示。
试验结果显示，复合型微生物种衣剂三株菌均能在玉米根系定殖，根系菌株含量在104～106cfu/g根，稳定定殖于玉米根部，在整个生育期持续发挥作用。施用单独微生物种衣剂的玉米根系，其菌株含量与复合型微生物种衣剂含量相当。
实施例8复合型微生物种衣剂与化药复配兼容性
将实施例1中配制的复合型微生物种衣剂与常见的玉米化药种衣剂(精甲霜灵、咯菌腈、噻虫嗪、戊唑醇等)进行1:1复配，通过稀释涂板的方法，计算复配0、2、6、24小时的菌数变化情况，以测试本发明与化学种衣剂的兼容性。结果如下表所示。
表14各菌株在不同化药组合中随着时间的菌株数量变化
试验结果显示，干粉复合型微生物种衣剂内的三株菌与化药精甲霜灵、咯菌腈、噻虫嗪和戊唑醇共存24h后的存活率都在93.31％以上，各菌株活性较高，所以本发明的干粉复合型微生物种衣剂可与以上化药复配使用、或直接施用于存在以上化药残留的土壤环境中并发挥其效果。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (45)

1.一种复合型微生物组合物，其特征在于，包含微生物和农业上或园艺上可接受的载剂，所述微生物包括平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)，所述平沙绿僵菌保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏时间为2020年12月1日，保藏编号为GDMCCNO.61333。
2.一种复合型微生物组合物，其特征在于，包含微生物和农业上或园艺上可接受的载剂，所述微生物包括平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)，所述平沙绿僵菌保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏时间为2020年12月1日，保藏编号为GDMCCNO.61333；
所述微生物还包括：哈茨木霉(Trichodermaharzianum)和拜赖青霉(Penicilliumbilaiae)，所述哈茨木霉保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年5月21日，保藏编号为CGMCCNo.15679；所述拜赖青霉保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年7月12日，保藏编号为CGMCCNO.12767。
3.一种复合型微生物组合物，其特征在于，包含微生物和农业上或园艺上可接受的载剂，所述微生物包括平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)，所述平沙绿僵菌保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏时间为2020年12月1日，保藏编号为GDMCCNO.61333；
所述农业上可接受的载剂包括一种或多种稳定剂、一种或多种分散剂、一种或多种湿润剂、一种或多种着色剂、一种或多种水性溶剂、一种或多种非水性共溶剂和/或一种或多种成膜剂。
4.一种复合型微生物组合物，其特征在于，包含微生物和农业上或园艺上可接受的载剂，所述微生物包括平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)，所述平沙绿僵菌保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏时间为2020年12月1日，保藏编号为GDMCCNO.61333；
所述微生物还包括：哈茨木霉和拜赖青霉，所述哈茨木霉保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年5月21日，保藏编号为CGMCCNo.15679；所述拜赖青霉保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年7月12日，保藏编号为CGMCCNO.12767；
所述农业上可接受的载剂包括一种或多种稳定剂、一种或多种分散剂、一种或多种湿润剂、一种或多种着色剂、一种或多种水性溶剂、一种或多种非水性共溶剂和/或一种或多种成膜剂。
5.如权利要求2、4所述的组合物，其特征在于，所述微生物包括哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌，所述哈茨木霉、拜赖青霉、平沙绿僵菌(Metarhizium pingshaense)的质量比例为1：1：1。
6.如权利要求1～4任意一项所述的组合物，其特征在于，所述微生物为所述微生物的孢子粉。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述复合型微生物组合物中，哈茨木霉、拜赖青霉和/或平沙绿僵菌(Metarhiziumpingshaense)真菌孢子粉的浓度分别至少为20亿CFU/g或20亿CFU/mL。
8.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合包括以下质量百分含量的组分：15～18％微生物孢子粉、8～10％分散剂、5～8％湿润剂、18～20％着色剂、3～5％成膜剂、42％～45％一种或多种其他载剂。
9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括以下质量百分含量的组分：10％分散剂、5％拉开粉、20％着色剂、3％聚乙烯醇、13％改性淀粉、32％糖粉以及17％微生物孢子粉。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述分散剂为Dispersol BB4，所述拉开粉为拉开粉BX，所述着色剂为天然着色剂，所述改性淀粉为玉米改性淀粉。
11.如权利要求1～4任意一项所述的组合物，其特征在于，还包括化药种衣剂；所述化药种衣剂为精甲霜灵、咯菌腈、噻虫嗪和戊唑醇中的至少一种。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述化药种衣剂占所述组合物质量比的至少50％。
13.如权利要求1～4任意一项所述的组合物，其特征在于，还包括植物营养素、肥料中的至少一种。
14.如权利要求如1～4任一项所述组合物的使用方法，其特征在于，将所述的组合物施加或涂布于所述植物部位或植物种子的外表面的至少一部分上。
15.如权利要求5所述组合物的使用方法，其特征在于，将所述的组合物施加或涂布于所述植物部位或植物种子的外表面的至少一部分上。
16.如权利要求6所述组合物的使用方法，其特征在于，将所述的组合物施加或涂布于所述植物部位或植物种子的外表面的至少一部分上。
17.如权利要求7所述组合物的使用方法，其特征在于，将所述的组合物施加或涂布于所述植物部位或植物种子的外表面的至少一部分上。
18.如权利要求8所述组合物的使用方法，其特征在于，将所述的组合物施加或涂布于所述植物部位或植物种子的外表面的至少一部分上。
19.如权利要求9所述组合物的使用方法，其特征在于，将所述的组合物施加或涂布于所述植物部位或植物种子的外表面的至少一部分上。
20.如权利要求10所述组合物的使用方法，其特征在于，将所述的组合物施加或涂布于所述植物部位或植物种子的外表面的至少一部分上。
21.如权利要求11所述组合物的使用方法，其特征在于，将所述的组合物施加或涂布于所述植物部位或植物种子的外表面的至少一部分上。
22.如权利要求12所述组合物的使用方法，其特征在于，将所述的组合物施加或涂布于所述植物部位或植物种子的外表面的至少一部分上。
23.如权利要求13所述组合物的使用方法，其特征在于，将所述的组合物施加或涂布于所述植物部位或植物种子的外表面的至少一部分上。
24.如权利要求14所述组合物的使用方法，其特征在于，所述植物包括大田作物、叶菜类蔬菜、茄果类蔬菜、豆类、根茎类作物。
25.如权利要求15～23任一项所述组合物的使用方法，其特征在于，所述植物包括大田作物、根茎类作物、茄果类蔬菜、叶菜类蔬菜、豆类。
26.如权利要求24所述组合物的使用方法，其特征在于，所述大田作物包括马铃薯、所述茄果类蔬菜包括番茄、辣椒；所述根茎类作物包括胡萝卜、大姜、三七、人参。
27.如权利要求25所述组合物的使用方法，其特征在于，所述大田作物包括马铃薯、所述茄果类蔬菜包括番茄、辣椒；所述根茎类作物包括胡萝卜、大姜、三七、人参。
28.如权利要求14所述组合物的使用方法，其特征在于，所述植物包括草莓、葡萄、柑橘、香蕉、猕猴桃、火龙果。
29.如权利要求15～23所述组合物的使用方法，其特征在于，所述植物包括草莓、葡萄、柑橘、香蕉、猕猴桃、火龙果。
30.如权利要求14所述组合物的使用方法，其特征在于，所述种子为玉米种子。
31.如权利要求15～23所述组合物的使用方法，其特征在于，所述种子为玉米种子。
32.一种增加作物或植物抗病性的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)种植植物部位或种子，将如权利要求如1～4任一项所述组合物至少部分地涂布所述植物部位或种子；且(b)所述微生物菌株促进所述植物部位或种子生长。
33.一种增加作物或植物抗病性的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)种植植物部位或种子，将如权利要求如5～13任一项所述组合物至少部分地涂布所述植物部位或种子；且(b)所述微生物菌株促进所述植物部位或种子生长。
34.如权利要求1～13任一项所述组合物的用途，其特征在于，所述组合物用于制备种子包衣剂或杀虫剂。
35.如权利要求1～4任一项所述组合物的用途，其特征在于，所述组合物用于改善作物或植物性状。
36.如权利要求5～13任一项所述组合物的用途，其特征在于，所述组合物用于改善作物或植物性状。
37.如权利要求1～4任一项所述组合物的用途，其特征在于，所述组合物用于减轻或防治或改善植物病害严重程度或病害症状。
38.如权利要求5～13任一项所述组合物的用途，其特征在于，所述组合物用于减轻或防治或改善植物病害严重程度或病害症状。
39.如权利要求35所述组合物的用途，其特征在于，所述作物或植物为玉米。
40.如权利要求36所述组合物的用途，其特征在于，所述作物或植物为玉米。
41.如权利要求35所述组合物的用途，其特征在于，所述作物或植物具有以下改善的性状中的一种或多种：产量增加，每株植物的种子重量增加，种子数量增加，出苗率增加，产量增长率增加，穗重增加，百粒重增加，行粒数增加，促进作物成熟更快、真菌病害引起的症状减轻、害虫引起的症状减轻。
42.如权利要求36所述组合物的用途，其特征在于，所述作物或植物具有以下改善的性状中的一种或多种：产量增加，每株植物的种子重量增加，种子数量增加，出苗率增加，产量增长率增加，穗重增加，百粒重增加，行粒数增加，促进作物成熟更快、真菌病害引起的症状减轻、害虫引起的症状减轻。
43.如权利要求41或42所述组合物的用途，其特征在于，所述真菌病害包括禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、凸脐孺孢菌(Exserohilum turcium)至少一种引起的病害。
44.如权利要求41或42所述组合物的用途，其特征在于，所述真菌病害包括：玉米大斑病，玉米茎基腐病中的至少一种；
所述害虫包括玉米螟。
45.如权利要求1～4任一项所述组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将各组分按配比混合。
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