CN110684669B - 一株壳青霉及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株壳青霉及其应用。一株壳青霉，分类命名为Penicillium crustosum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.16269，保藏日期为2018年9月6日。上述的壳青霉用于土壤治理。上述的壳青霉还可以用于农业领域中的生物防治。本发明公开的一株壳青霉及其应用具有以下有益效果：1、改良土壤形状，将难以利用的磷转化为可利用的磷；2、具有生防效果，能抑制病原菌的生成。

Description

一株壳青霉及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株壳青霉及其应用。

背景技术

植物病害的生防菌株大多是从土壤以及植物的根际或体表分离的真菌和细菌，其来源较为单一，易受外界自然环境的影响。如果环境有变化，易直接影响其定殖能力，在面对不同的有害病菌的时候效果起伏很大，对多数疫病难以起到防治作用，严重限制了其应用范围。

解磷菌(Phosphate-solubilizing microorganism,PSM)是存在于土壤中一类微生物群体，能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的有效磷形态，对改善土壤环境，促进植物生长，以及维护和改善农业生态以及自然界中的磷素循环有着重要的作用。

农作物生长，需要综合考虑营养因素与病虫害因素等各种外部因素，现有技术多将微生物菌株的解磷功效与生物防治功效分开，因此探索发掘新型微生物菌株，开发其既能有效降解土壤中的难利用的磷，又能对常见的植物病原菌有一定的防治作用的新型微生物菌株，是一项尤为重要的工作。

现有的专利及其他公开技术中，对壳青霉的报道很少，未见其有在植物促生长、土壤治理以及生物防治领域有过相关的报道。

发明内容

发明目的：本发明针对上述现有技术存在的问题做出改进，即本发明的第一个目的在于公开了一株壳青霉。本发明的第二个目的在于公开上述壳青霉的应用。

为了实现上述第一个目的，本发明所采用的技术方案如下：

一株壳青霉，分类命名为Penicillium crustosum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.16269，保藏日期为2018年9月6日。

为了实现上述的第二个目的，本发明所采用的的技术方案如下：

上述的壳青霉用于土壤治理。

进一步地，上述的壳青霉具有较好的解磷效果，能够分解难溶的有机磷与无机磷。

上述的壳青霉用于农业领域中的生物防治。其对常见的植物病原菌具有良好的抑制作用。

上述的壳青霉用于制备生物种衣剂。

进一步地，制备生物种衣剂包括以下步骤：

(1)制备壳青霉的孢子悬浮液；

(2)在噻虫嗪种衣剂中加入30wt％的步骤(1)得到的孢子悬浮液，振荡混匀得到微生物种衣剂。

更进一步地，步骤(1)的孢子悬浮液中活菌的数量≥1×10⁸cfu/mL。

有益效果：本发明公开的一株壳青霉及其应用具有以下有益效果：

1、改良土壤形状，将难以利用的磷转化为可利用的磷；

2、具有生防效果，能抑制病原菌的生成。

附图说明

图1为本发明的壳青霉在显微镜下的形态图。

图2为本发明在解磷固体培养基上的解磷效果图。

图3为本发明的在无机磷液体培养基NBRIP中7天的解磷量变化图。

图4为本发明对病原菌F.g的拮抗效果图

图5为本发明对病原菌R.s的拮抗效果图

图6为本发明对病原菌LC11387的拮抗效果图

图7为本发明对玉米包衣后对玉米的生长影响示意图。

具体实施方式：

下面对本发明的具体实施方式详细说明。

一、菌株的分离与筛选

分离来源：2017年4月25日采集的四川广元市旺苍县(32°14′46.09″，106°3′49.26″)的小麦根部土壤中分离。

本发明的壳青霉(Penicillium crustosum)，内部编号MN17177，分离于2017年4月25日采集四川广元市旺苍县(32°14′46.09″，106°3′49.26″)的小麦根部土壤，采用稀释平板涂布法将样品涂板于有机磷固体培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，酵母浸粉0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H2O 0.03g，Ca₃(PO4)₂ 1.0g，MgSO40.3g，卵磷脂0.2g，琼脂15.0-20.0g，加超纯水定容至1L，用3M Na₂HPO₄和5M HCl调节pH至7.0)上进行分离筛选获得。

分离方法为：称取5g样品土壤于50mL无菌离心管中，加入45mL无菌水，涡旋振荡2～3min，使土壤颗粒均匀分散于无菌水中，得到稀释10倍(10^-1)的土壤悬浮液，室温放置25min。吸取5mL悬浮液(吸取前要混匀)于装有45mL灭菌水的离心管中，得到稀释10^-2的悬浮液，将得到的10^-2的土壤悬浮液充分摇匀，如上继续稀释到10^-3-10^-4，取其10^-3，10^-4进行平板涂布，每个梯度涂布三个平行，28℃，2-4d，观察平板是否有出现解磷圈，挑选出有解磷圈的菌株保存，进行下一步复筛工作。

本发明所提供的壳青霉MN17177，其具有以下微生物学特性：

a、在YES培养基(酵母提取物2.0g，蔗糖15.0g，琼脂2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，蒸馏水100mL)上25℃生长5d，菌落直径为28-30mm，有褶皱，白色菌丝，中间有大量灰白色孢子，底部呈金黄色。

b、在PDA培养基(购于青岛海博生物北京陆桥技术股份有限公司，其配方为马铃薯粉5.0g，葡萄糖20.0g，氯霉素0.1g，琼脂20.0g)上25℃生长5d，菌落直径为20-23mm，中间产生大量灰色、灰绿和绿色的孢子，孢子直径达17-19mm，菌落底部为橘黄色。

c、在CYA培养基(购于山东拓普生物工程有限公司，其配方为K₂HPO₄ 1g，硝酸钠3g，KCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，酵母膏粉5g，蔗糖30g，琼脂15g)上25℃生长5d，菌落18-20mm，有褶皱，中间孢子为灰色，青色，周边为白色菌丝，菌落底部为淡黄色。

在光学显微镜下观察MN17177：菌丝有横隔，分生孢子梗也有横隔，分生孢子梗产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚状，各顶端的小梗产生链状的分生孢子，分生孢子球形，直径约为10-20μm。菌体形态如图1所示。

利用引物ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)和ITS5(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)对菌株MN17177进行扩增和测序，得到序列长度为563bp，菌株MN17177的rDNA序列如序列表SEQID NO:1所示。通过BLAST将序列与GenBank数据库中序列进行对比，其与壳青霉Penicillium crustosum的相似性为100，鉴定其为壳青霉Penicillium crustosum。

随后，将壳青霉MN17177送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.16269，保藏日期为2018年9月6日。

二、菌株的解磷效果测定

固体培养基：菌株MN17177接种于解有机磷的固体平板上，各三个重复，28℃，5d后观察解磷圈，并记录好解磷圈与菌落直径，检测菌株在固体培养基中的溶解能力。菌株MN17177的菌落直径为3cm，解磷圈直径为3.8cm，其在解磷固体培养基上的解磷效果图如图2所示

在无机磷液体培养基的解磷：将解磷菌MN17177以10⁸cfu/mL浓度接种装有100mL的NBRIP液体培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，酵母浸提物0.4g，Ca₃(PO₄)₂ 2.5g，Fe₃(PO₄)₂·8H₂O 1.5g，AlPO₄1g，pH值7.0-7.5，加超纯水定容至1L。)的250mL三角瓶中，设置三个重复，于28℃的恒温振荡器中150r/min，振荡7d，每天取样2mL，按照行业标准方法NY/T1121.7-2014测定其有效磷含量，以不接菌的NBRIP液体培养基作为对照。MN17177在第2-3天的解磷量达到最高，可达190mg/L，到4天后便保持在约40mg/L，解磷效果见图3。

在有机磷液体培养基的解磷：将解磷菌MN17177以10⁸cfu/mL浓度接种装有100mL的有机磷液体培养基(葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO₄·7H₂O0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，酵母浸提物0.4g，卵磷脂5g，pH值7.0-7.5，加超纯水定容至1L)的250mL三角瓶中，设置三个重复，于28℃的恒温振荡器中150r/min，振荡7d，每天取样2mL，测定其有效磷含量，以不接菌的有机磷液体培养基作为对照。按照行业标准方法NY/T1121.7-2014测定有效磷含量，MN17177在第6天的解磷量达到最高，为31mg/L。

可以看出，菌株MN17177对难溶解的有机磷与无机磷都有溶解效果。

三、菌株对病原菌的拮抗作用

将禾谷镰刀菌Fusarum graminearum(F.g)、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea(LC11387)、立枯丝核病Rhizoctonia solani(R.s)作为病原菌，用PDA培养基，于28℃下培养3～5d，新鲜菌丝用打孔器制成直径为5mm的菌丝块，备用。

将病原菌接种在平板中间，以四周接上MN17177的为实验组(177)，以四周不接菌的为对照组，各菌接种菌饼约5mm直径，重复3次，28℃培养3～5天，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的MN17177对病原菌有无拮抗作用。结果显示：MN17177对病原菌F.g、LC11387、R.s均有不同程度的抑制作用，效果分别见图4、图5和图6，从图4-6可知，菌株MN17177有一定的生防效果。

5、MN17177的应用

制备孢子悬浮液

将壳青霉MN17177的真菌菌株接种于PDA平板上，待菌株产大量的孢子，用接种环刮取菌株孢子于装有1mL吐温水的EP管中，用振荡仪振荡1～2min，得到孢子悬浮液。将孢子悬浮液转接到有大米固体基质(30g大米、30％水分、灭菌121℃、40min)的发酵袋中进行发酵。发酵5-7d，待发酵袋中产满孢子时，用5mL的枪往发酵袋中加50mL的1％浓度的吐温水，用手搓揉，使孢子更多的溶于吐温水中，得到孢子悬浮液，通过稀释涂板计数法，确定孢子浓度。

制备生物种衣剂

在噻虫嗪种衣剂(购于深圳诺普信农化股份有限公司)中加入30wt％的1×10⁸cfu/mL浓度的MN17177孢子悬浮液，振荡混匀得到微生物种衣剂。

种子处理

将大小、质地差不多的玉米种子以80：1(种衣剂与种子重量比)的量加入到生物种衣剂中，振荡使菌株能够均匀吸附于种子上，种子上有1×10³cfu/mL～1×10⁶cfu/mL的菌数。

菌株MN17177对植株的促生及解磷效果测定

将相同质量的灭菌土(土壤过10目筛，121℃，灭菌1h，加0.5％的Ca₃(PO₄)₂)装在育苗盘里。以包衣菌株MN17177的玉米种子为实验组(MN17177)，以菌株CGMCC NO.12767(专利公开号CN107793263A)为阳性对照(Positive control)，以无菌包衣的玉米种子为负对照组(Blank)，以不包衣的玉米种子为空白对照组(CK)，每组3个重复，每个重复播种18颗，即每个组共处理54颗进行盆栽实验，常规管理。生长18d后收获，测定单个植株株高、茎长、根重及干重。

盆栽实验结果：从数据可知，实验组的玉米生物量均明显的高于对照组(CK及Blank)玉米(玉米的盆栽实验的对照图如图7)，特别是根系，MN17177组的根鲜重比空白对照(CK)组增加了30.61％，比负对照组的增加了48.37％，比阳性对照组的增加了19.34％；MN17177组的根的干重比空白对照组增加了22.17％，比负对照组的增加了28.38％，比阳性对照组的增加了17.81％；MN17177组株高比空白对照组增加了7.53％，比负对照组的增加了5.56％，比阳性对照组的增加了5.32％；MN17177组干全重比空白对照组增加了23.03％，比负对照组的增加了22.82％，比阳性对照组的增加了17.89％。

由此可知，菌株MN17177对植物的根系有很大的促进作用，且提高植物的营养吸收，促进植物生长；菌株MN17177包衣玉米对玉米苗期生长的生物量影响见下表。

表1菌株MN17177对玉米苗期生长的生物量影响

上面对本发明的实施方式做了详细说明。但是本发明并不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (9)

1.一株壳青霉，其特征在于，分类命名为Penicilliumcrustosum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.16269，保藏日期为2018年9月6日。

2.根据权利要求1所述的壳青霉的应用，所述的壳青霉用于土壤治理。

3.根据权利要求1所述的壳青霉在解磷中的应用，其特征在于，所述的壳青霉能够分解难溶的有机磷与无机磷。

4.根据权利要求1所述的壳青霉的应用，其特征在于：所述的壳青霉用于农业领域中的生物防治。

5.根据权利要求4所述的壳青霉的应用，其特征在于：所述的壳青霉能够抑制植物病原菌，所属植物病原菌包括以下至少一种：禾谷镰刀菌Fusarumgraminearum、番茄灰霉病菌Botrytiscinerea、立枯丝核病Rhizoctoniasolani。

6.根据权利要求1所述的壳青霉的应用，其特征在于，所述的壳青霉用于制备生物种衣剂。

7.根据权利要求1所述的壳青霉的应用，所述的壳青霉用于以下至少两项的用途：a.土壤治理、b.分解难溶的有机磷与无机磷、c.农业领域中的生物防治、d.制备生物种衣剂。

8.根据权利要求6所述的壳青霉的应用，其特征在于，制备生物种衣剂包括以下步骤：

(1)制备壳青霉的孢子悬浮液；

(2)在噻虫嗪种衣剂中加入30wt％的步骤(1)得到的孢子悬浮液，振荡混匀得到微生物种衣剂。

9.根据权利要求8所述的壳青霉的应用，其特征在于，步骤(1)的孢子悬浮液中活菌的数量≥1×10⁸cfu/mL。

Images