CN109207392A - 一株巨大芽孢杆菌及其在防治西洋参根腐病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株巨大芽孢杆菌及其在防治西洋参根腐病中的应用。该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)Yt2001，保藏编号为CGMCC No.14673。实验表明，本发明的巨大芽孢杆菌菌株Yt2001具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强、防治西洋参根腐病效果好，在西洋参根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该巨大芽孢杆菌菌株Yt2001制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或生物肥料，防治西洋参根腐病的防治效果高达80％以上。

Description

一株巨大芽孢杆菌及其在防治西洋参根腐病中的应用

技术领域

本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株巨大芽孢杆菌及其在防治西洋参根腐病中的应用，以及采用该巨大芽孢杆菌制备的生物防治制剂。

背景技术

西洋参根腐病是由真菌半知菌亚门镰孢菌属引起的植物病害，属于土传病害，主要通过土壤内水分、地下昆虫和线虫传播。根腐病主要危害幼苗根部和根茎部(地表以下茎部)，病情严重时，主根可烂掉1/3-1/2。腐烂的参根呈黑褐色湿腐状，后期糟朽状，仅存中空的根皮。被害参苗地上部初期无明显症状，中后期叶片退绿变黄、萎蔫死亡。

西洋参根腐病给参户造成巨大的经济损失。对于西洋参根腐病的防治，常规采用的方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。化学防治使用药剂如“恶霉灵”、“叶枯唑”等，但药效时间短、使用量大，易造成农药残留，环境污染等问题；同时，化学农药的长期使用，使得病原菌对其产生抗药性，导致防效下降甚至失败。抗病品种研发周期长，投入大，推广慢,可能影响西洋参的品质。生物防治主要是利用有益的微生物，通过生物间的竞争作用、抗菌作用、重寄生作用、交叉保护作用及诱发抗病性等来抑制某些病原菌的活性和活动，具有无毒、无污染、不产生抗药性、高效的优点，表现出广阔的应用前景。

芽孢杆菌是一种广泛分布于各种不同生活环境中的腐生细菌，是一群好氧兼厌氧的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称，可以产生内生耐热抗逆的芽孢。芽孢不仅对热有抗逆性，还对紫外线、电磁辐射及一些化学药品有很强的抗逆性，它可以忍受各种不良环境。由于具有如此强的抗逆性，使得它有利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、定殖与繁殖。由于它们生长快、营养简单、能够形成具有较强抗逆性能力的芽孢，在产品开发中较非芽孢杆菌有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目。芽孢杆菌属下的巨大芽孢杆菌是一种抑菌谱较广的生防菌，对不同植物的真菌和细菌病害具有防治作用，如烟草灰霉病、水稻枯瘟病、香蕉灰斑病等，其中，对真菌病原菌的抑制能力强于细菌病原菌的抑制。巨大芽孢杆菌通过在生长发育过程中产生多种拮抗性或竞争性的代谢产物，以直接或间接方式阻碍或杀死病原菌，具有高效、低残留、与环境友好等优点。

发明内容

本发明的目的是提供一株用于高效防治西洋参根腐病的新的芽孢杆菌——巨大芽孢杆菌菌株Yt2001。本发明的菌株具有生长速度快、产孢量大、防治效果好、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。

本发明所提供的菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)Yt2001，是从山东省威海市文登区侯家镇江山泊村参田中分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.14673。

本发明巨大芽孢杆菌(Bacillus magaterium)菌株Yt2001的培养方法或繁殖方法包括：

(1)普通培养保存采用LB培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；

(2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；

(3)种子液培养基配方：按质量百分比计，豆饼粉3.00％，玉米粉4.00％，葡萄糖0.40％，鱼粉0.50％，磷酸二氢钾0.03％，轻质碳酸钙1.20％，硫酸铵0.30％，氯化钠0.10％，剩余为水，pH调至7.0-7.2，培养温度28℃，培养时间30h。

(4)大量发酵培养基配方：同(3)中种子液培养基配方。

本发明还公开了一种包括所述的巨大芽孢杆菌菌株Yt2001的生物防治制剂。

本发明所述的生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备巨大芽孢杆菌菌株Yt2001的种子液：将巨大芽孢杆菌菌株Yt2001从试管斜面中挑取少量细菌，移至种子液培养基中，26～30℃下摇床振荡培养28～32h，此为种子液；

(2)将步骤(1)制备的种子液在无菌环境下接种到已灭菌的大量发酵培养基中，26～30℃下恒温培养32h～42h；

(3)将步骤(2)培养的发酵液中添加载体(凹凸棒土粉)，然后经喷雾干燥得到巨大芽孢杆菌Yt2001菌粉。

上述巨大芽孢杆菌Yt2001菌粉可以进一步加入农业上常用的助剂如湿润剂、填充剂等制成生物防治制剂。

本发明还提供了上述巨大芽孢杆菌菌株Yt2001或者上述生物防治制剂在防治西洋参根腐病中的用途。

本发明还提供了一种防治西洋参根腐病的方法，包括向具有根腐病的西洋参施用本发明的巨大芽孢杆菌菌株Yt2001或者上述生物防治制剂。

实验表明，本发明的巨大芽孢杆菌菌株Yt2001具有生长速度快、产孢量大、抗逆性强，在西洋参根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该巨大芽孢杆菌菌株制备的生物防治制剂，可以作为生物农药或生物肥料，高效防治西洋参根腐病，是一种极具应用前景的生物防治剂。经试验证明：含巨大芽孢杆菌菌株Yt2001原粉的生物防治制剂对西洋参根腐病的防治效果可达80％以上，效果显著。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

1、巨大芽孢杆菌菌株Yt2001的分离与纯化

本发明的巨大芽孢杆菌菌株Yt2001是从山东省威海市文登区侯家镇江山泊村参田土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：

⑴芽孢杆菌的分离：土样的采集，在山东省威海市文登区侯家镇江山泊村不同参户参田地块，采用5点取样法，分别采集地块四周和中央深度在10-20cm范围内的土壤适量，等量混匀。标明采集地点、时间和采集人。称取1g土样于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL 10^-2、10^-3、10^-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在28℃培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。

⑵西洋参根腐病高效拮抗菌株的筛选

①初筛：采用对峙培养法，制备LB平板，用打孔器在芽孢杆菌、西洋参根腐病边缘打取直径为5mm的菌饼，分别移植在平板相对的两侧中央，28℃恒温培养，逐日观察芽孢杆菌菌株对病原菌的抑制作用。

②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验。

本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治西洋参根腐病的巨大芽孢杆菌菌株Yt2001。实验证明，该巨大芽孢杆菌原粉在防治西洋参根腐病显示出非常高效的防治效果，使其显著增产。因而，本发明的巨大芽孢杆菌是具有广泛应用前景的巨大芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治西洋参根腐病的生物防治制剂。

2、菌株鉴定

(1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，单个或呈短链排列，菌体细胞呈杆状，末端圆，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。

(2)分子生物学特性

该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：

TTCCTTAGGGTTACTCTCCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGTTTTATGGGATTGGCTTGACCTCGCGGTCTTGCAGCCCTTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGTCCCCCGAAGGGGAACGCTCTATCTCTAGAGTTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAAAAAGCCGCCCTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCGCTTTTCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCGCGCTTTTACGCCCAATAATTCCGGATAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACGAGCAGTTACTCTCGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGCCCATCTGTAAGTGATAGCCGAAACCATCTTTCAATCATCTCCCATGAAGGAGAAGATCCTATCCGGTATTAGCTTCGGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTGCCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACGTCATAGAAGCAAGCTTCTAATCAGTTCGCTCGACTGCA。

该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.14673。

实施例2

1、巨大芽孢杆菌菌株Yt2001发酵过程及其生物防治制剂制备过程

种子液培养基配方：按质量百分比计，豆饼粉3.00％，玉米粉4.00％，葡萄糖0.40％，鱼粉0.50％，磷酸二氢钾0.03％，轻质碳酸钙1.20％，硫酸铵0.30％，氯化钠0.10％，剩余为水pH调至7.0-7.2。

大量发酵培养基配方：同种子液培养基配方。

具体过程：

①菌种种子液培养：将巨大芽孢杆菌菌株Yt2001从试管斜面中挑取少量细菌，移至种子液培养基中，28℃摇床振荡培养30h，此为种子液；

②大量发酵培养：将大量发酵培养基物料在发酵罐中灭菌(温度121～124℃，30分钟)在无菌条件下，将培养好的种子液(按接种体积比10％)倒入发酵罐中。培养温度28℃，发酵培养40h。转孢率达80％以上，菌数可达100～110亿/ml。

③发酵结束的发酵液中添加载体(凹凸棒土粉)，混合均匀，与载体的质量比：1:0.05；然后喷雾干燥，进风温度178℃，出风温度170℃；发酵液经离心喷雾到原重量的10％，得到菌粉，其中巨大芽孢杆菌Yt2001含量≥1000亿活菌/g；

④按下述重量比取各原料：步骤③所制巨大芽孢杆菌Yt2001菌粉15％；淀粉8％；葡萄糖10％；十二烷基硫酸钠8％；拉开粉2％；豆粕粉10％；剩余量用凹凸棒土粉填充；上述原料混合均匀，得到防治西洋参根腐病的可湿性粉剂，其中巨大芽孢杆菌Yt2001含量≥150亿活菌/g。

实施例3：田间药效试验

本实施例1提供了含巨大芽孢杆菌菌株Yt2001原粉的生物防治制剂对西洋参根腐病防治效果的相关实验。

1)供试药剂

含巨大芽孢杆菌菌株Yt2001原粉的生物防治制剂，50％菌多灵可湿性粉剂(四川国光农化股份有限公司，市售)；

2)供试作物与防治对象：

供试作物：西洋参(参种购自威海市文登区)；

防治对象：西洋参根腐病。

3)试验地情况、试验设计及安排

试验地设在山东省威海市荣成市上庄镇大李家村西洋参田，往年根腐病发生较重。试验地栽培条件均匀一致。

本试验设含巨大芽孢杆菌菌株Yt2001原粉的生物防治制剂药种比为1:500、1:750、1:1000；50％菌多灵可湿性粉剂1:500；清水作对照共5个处理，重复4次。各小区随机区组排列。施药采用湿拌种，每个小区安排营养钵300个，每钵点3粒参种。

4)试验调查及计算方法

(1)气象条件

施药当日晴，微风，最高气温为22℃，最低气温为19℃，相对湿度为70％。

(2)药效及安全性调查

药效调查：调查总共1次，在出苗后30天进行，记载300个营养钵种西洋参根腐病发病数，计算病株率及防治效果。

(3)药效计算方法

药效下式计算：

5)结果

(1)供试药剂对西洋参根腐病的防治效果

出苗后30天调查病株数，表1结果显示，清水对照的病株率高达29.17％，各个处理的病株率均低于清水对照。含巨大芽孢杆菌菌株Yt2001原粉的生物防治制剂，原粉药种比为1:500、1:750、1:1000处理后的病株率分别为5.14％、5.42％、10.14％，50％菌多灵可湿性粉剂的病株率为7.92％；含巨大芽孢杆菌菌株Yt2001原粉的生物防治制剂各个处理的防治效果分别为82.38％、81.42％、65.24％，其中1:500的防治效果最好，但与1:750的防治效果相差不大。其他处理在P<0.05水平上具有显著性差异，50％菌多灵可湿性粉剂对西洋参根腐病的防治效果为72.85％。含巨大芽孢杆菌菌株Yt2001原粉的生物防治制剂可有效控制西洋参根腐病的危害。

表1各个处理后西洋参根腐病的发病率及防治效果

注：同一行数据后有相同字母表示经Duncan多重比较后差异不显著(P<0.05)。

(2)西洋参安全性调查：经观察，各药剂处理区与对照区相比，西洋参生长正常，无药害产生，说明含巨大芽孢杆菌菌株Yt2001原粉的生物防治制剂在供试浓度对西洋参安全。

因此，从发病率和防治效果来看，含巨大芽孢杆菌菌株Yt2001原粉的生物防治制剂对西洋参根腐病具有较好的防治效果，药种比1：500和药种比1：750的处理，施药后防治效果可达80％以上，明显好于对照药剂，差异显著。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛秾贝尔生物工程有限公司

<120> 一株巨大芽孢杆菌及其在防治西洋参根腐病中的应用

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<212> DNA

<213> 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）Yt2001的16s rDNA基因序列

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gccgtgggct ttcacatcag acttaagaaa ccgcctgcgc gcgcttttac gcccaataat 900

tccggataac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc 960

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ccagtgtggc cgatcaccct ctcaggtcgg ctatgcatcg ttgccttggt gagccgttac 1200

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agcaagcttc taatcagttc gctcgactgc a 1411

Claims (7)

1.巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株Yt2001，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.14673。

2.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株Yt2001在防治西洋参根腐病中的用途。

3.一种生物防治制剂，含有权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株Yt2001。

4.权利要求3所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)制备巨大芽孢杆菌菌株Yt2001的种子液；

(2)将步骤(1)制备的种子液接种到大量发酵培养基中，26～30℃下恒温培养32h-42h；

(3)将步骤(2)培养的发酵液中添加载体，然后经喷雾干燥得到巨大芽孢杆菌Yt2001菌粉，加入助剂制备成生物防治制剂。

5.如权利要求4所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，

所述制备种子液采用的种子液培养基为：按质量百分比计，豆饼粉3.00％，玉米粉4.00％，葡萄糖0.40％，鱼粉0.50％，磷酸二氢钾0.03％，轻质碳酸钙1.20％，硫酸铵0.30％，氯化钠0.10％，剩余为水，pH调至7.0-7.2；

大量发酵培养基：同种子液培养基。

6.权利要求3所述的生物防治制剂在防治西洋参根腐病中的用途。

7.一种防治西洋参根腐病的方法，包括向具有根腐病的西洋参施用权利要求1所述的巨大芽孢杆菌菌株Yt2001或者权利要求3所述的生物防治制剂。