CN109182142A - 皮落青霉及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物生物技术领域，涉及一株液体发酵生产Lovastatin的皮落青霉(P.crustosum)Pc‑46菌株、用途和发酵生产方法。具体而言，本发明公开了皮落青霉Pc‑46 Penicillium crustosum Pc‑46，其保藏号为：CCTCC NO:M 2018343。本发明还同时公开了上述皮落青霉(P.crustosum)Pc‑46的用途：用于制备洛伐他汀；Lovastatin产量可达155mg/L～158mg/L左右。
Description
技术领域
本发明属于微生物生物技术领域，涉及一株液体发酵生产Lovastatin的皮落青霉(P.crustosum)Pc-46菌株、用途和发酵生产方法。
背景技术
青霉属(Penicillium)真菌是我国重要的工业微生物资源，广泛分布于土壤、植被、空气、食品等生境中。1928年，英国的Fleming从青霉中发现了青霉素，彻底改变了治疗细菌性疾病的医疗方法，也将青霉属(Penicillium)真菌带入了人们的视野中。1976年，日本学者远滕章(Akira Endo)教授在青霉的发酵产物中发现了首个他汀类物质，自此掀起了他汀类物质的研究热潮。洛伐他汀(Lovastatin)是各国公认的降低胆固醇的理想药剂，具有高效、低毒、安全的特点，它能选择性抑制羟甲基戊二酸辅酶A(HMG-CoA)还原酶活性，并阻断胆固醇生物合成，近年来在临床治疗方面应用十分广泛。青霉属(Penicillium)真菌中已报道了1200种以上不同的活性代谢产物，并在各个领域受到广泛的应用。李德海等从南极普利兹湾深海海域分离的皮落青霉(P.crustosum)PRB-2中生产出结构新颖的吲哚生物碱类化合物，对H1N1流感病毒有良好的抑制作用。王佳宁等从松节藻内生真菌皮落青霉(P.crustosum)EN-311菌株中分离得到8个萜类化合物，3个为新化合物；其中2个萜类化合物具有较好的卤虫致死活性。徐蕊等从红树林根际土壤分离的简青霉(P.simplicissimum)MA-332发酵产物中分离鉴定了9个新单体化合物，包括3个异香豆素类化合物，1个吉玛琓型倍半萜化合物和1个天然产物。
青霉属(Penicillium)真菌的菌落表面通常呈现不同程度的绿色或蓝色，质地大体可分为绒状、絮状、绳状和粉末状四种类型。气生菌丝体通常白色，菌丝有横隔；分生孢子梗有横隔，基部无足细胞，顶端不形成膨大的顶囊；分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，称为帚状体；帚状体包括副枝、类副枝、梗基和瓶梗四个部分；分生孢子通常很小，单细胞，形状有球形、椭圆形、卵形、圆柱形等。
洛伐他汀(Lovastatin)，是各国公认的降低胆固醇的理想药剂，至今为止，他汀类药物已占据调血脂市场1/3之多。目前我国多采用红曲霉发酵提取Lovastatin。由于红曲霉缓慢的生长速度和较少的产孢量，Lovastatin的产量难以大幅度提高。因此选育出高产Lovastatin的新菌株，并建立相应的高产Lovastatin发酵工艺显得尤为迫切。
参考文献
王佳宁.海藻内生真菌杂色曲霉EN-298和皮落青霉EN-311化学成分研究[D].中国科学院大学，2015；
徐蕊.温特曲霉中抗肿瘤四降二萜培养条件优化及海洋来源真菌简青霉次级代谢产物研究[D].中国科学院大学，2016；
李德海，于桂洪，朱天骄，顾谦群，车茜，王伟.一种吲哚生物碱类化合物及其制备方法和用途[P].申请号：CN201510959923.4，中国海洋大学，2015。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株能产生Lovastatin的皮落青霉(P.crustosum)Pc-46菌株及洛伐他汀发酵生产的方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种皮落青霉(P.crustosum)Pc-46，为皮落青霉Pc-46Penicillium crustosum Pc-46，其保藏号为：CCTCC NO:M 2018343。
本发明还同时提供了上述皮落青霉(P.crustosum)Pc-46的用途：用于制备Lovastatin(即，用于发酵生产Lovastatin)。
本发明还同时提供了洛伐他汀的发酵生产法：将皮落青霉(P.crustosum)Pc-46的种子液(二级种子液)按照1:5的体积比接入至发酵培养液中，于28℃发酵培养80h～100h。
本发明的保藏信息如下：
皮落青霉(P.crustosum)Pc-46，保藏名称：皮落青霉Pc-46Penicilliumcrustosum Pc-46，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2018343，保藏时间2018年06月04日。
针对市场上Lovastatin需求日益增长，生产Lovastatin优良工业菌株缺乏等问题，设计开发了本发明。
本发明所涉及的青霉Pc-46菌株筛选自土壤。依据形态特征和rDNA ITS基因序列分析，鉴定为皮落青霉(P.crustosum)。
皮落青霉(P.crustosum)Pc-46菌株可用于发酵生产Lovastatin。用接种针挑取少量菌丝，转接于PDA培养基平板上，活化培养3d；取2个菌饼(直径6mm)接种于一级种子培养液中，摇床培养3d，制得一级种子液；在二级种子培养液中，按10％加入一级种子液，200r/min摇床培养2d成二级种子液；在5L发酵罐发酵培养液中按20％接入二级种子液，发酵时间为80h～100h；发酵培养结束后，取发酵液1mL，加甲醇4mL(按1:4的比例)，超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，高效液相(HPLC)法检测Lovastatin产量，可达155mg/L～158mg/L；用液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术分离鉴定皮落青霉(P.crustosum)Pc-46发酵液中的Lovastatin结构、分子量等。
本发明利用丰富的青霉属(Penicillium)真菌资源，筛选到1株高产Lovastatin的皮落青霉(P.crustosum)Pc-46菌株，该菌株具有高产Lovastatin、产孢量大、培养简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.0～5.5，培养温度为28℃条件下，青霉Pc-46菌株5L发酵罐液体发酵80h～100h，Lovastatin产量可达155mg/L～158mg/L左右。产生Lovastatin的皮落青霉目前还未见有报道，本发明丰富了生产Lovastatin的菌种。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为皮落青霉(P.crustosum)Pc-46菌株的菌落形态图；
A和A1：PDA正面和背面；B和B1：CYA正面和背面；C和C1：CA正面和背面；
图2为皮落青霉(P.crustosum)Pc-46菌株的显微形态图；
A：菌丝和分生孢子头(200X)，B：分生孢子头(400X)，C：分生孢子(400X)；
图3为皮落青霉(P.crustosum)Pc-46菌株ITS rDNA基因序列(560bp)；
图4为基于6株青霉ITS rDNA基因序列建立的皮落青霉(P.crustosum)Pc-46菌株系统发育树；
图5为Lovastatin标准品和青霉菌株发酵液(1～6)TLC法检测结果对比图；
图6为皮落青霉(P.crustosum)Pc-46菌株在发酵罐中Lovastatin产量随发酵时间变化曲线；
图7为Lovastatin标准品(A、C)与皮落青霉(P.crustosum)Pc-46菌株发酵液(B、D)的HPLC-MS检测结果。
A、C对应的分别是Lovastatin标准品的高效液相色谱图和质谱图；
B、D对应的分别是Pc-46菌株发酵液的高效液相色谱图和质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、产生洛伐他汀皮落青霉(Penicillium crustosum)Pc-46菌株的分离、筛选和鉴定
1、培养基
(1)PDA培养基：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2.0％，pH 5.5～6.0。用于青霉菌株的分离纯化和鉴定。
(2)种子培养液：马铃薯20％、葡萄糖2％，牛肉膏0.5％，pH 5.0～5.5。用于青霉各菌株一级种子培养。
(3)发酵培养液：马铃薯20％、葡萄糖2％、甘油1％、牛肉膏0.5％，pH 5.0～5.5。用于青霉各菌株发酵培养，筛选高产Lovastatin的菌株。
2、实验方法
2.1青霉菌株的分离纯化
(1)土壤中青霉菌株的分离纯化方法：取土样1g加入99mL无菌水中，120r/min摇床上振荡30min。上清液进行梯度稀释(10-2～10-8)，选择合适的稀释度(10-6)，取100μL均匀涂布于PDA培养基上，28℃恒温箱培养约36h。挑取单菌落边缘菌丝转接另到PDA培养基上培养3d(培养条件同上)产生孢子后，显微镜观察具有青霉的典型特征，挑取少许边缘菌丝进一步纯化，得青霉纯菌株。
(2)从食品、水果、有机质等表面分离纯化方法：从水果等表面挑取少量菌丝接入PDA培养基平板上，28℃培养24h，待白色绒毛状菌丝长出后，取少许菌丝转接于另一PDA培养基平板上继续培养3d产生孢子后，显微镜观察具有青霉的典型特征，挑取少许边缘菌丝进一步纯化，得青霉纯菌株。
将纯化的青霉菌株编号保存于25％甘油中，置于4℃冰箱备用。
2.2青霉菌株发酵液的制备
将保存的青霉各菌株转接至PDA培养基上，于28℃恒温培养箱中培养3d，活化菌株。用打孔器取2个菌饼(直径6mm)接种于装有50mL种子培养液的100mL锥形瓶中(50mL/100mL)，28℃，180rpm培养48h作为一级种子液。转接3mL一级种子液到发酵培养液(100mL/250mL)中，28℃、180rpm培养5d，即得到青霉菌株发酵液。
2.3产生Lovastatin青霉菌株薄层层析(TLC)法初筛
青霉菌株发酵液超声破壁(功率200w、时间30min)，取1.5mL于离心管中，8 000rpm离心10min，取上清液500μL加100μL乙酸乙酯振荡萃取，取上层液为待测样品，毛细吸管吸取1/4管样品点5次于硅胶板上；Lovastatin标准品为对照，乙酸乙酯作展开剂，展开至15cm，晾干，紫外灯(波长254nm)观察斑点并拍照。选取曲霉菌株发酵液与标准品Lovastatin相同位置条带较明显的菌株进行HPLC法定量检测复筛。
2.4产生Lovastatin青霉菌株高效液相(HPLC)法复筛
取发酵液0.4mL于2mL离心管中，加入1.6mL的甲醇，25Hz超声波30min，50℃水浴2h，间歇振荡3～4次，8 000r/min离心10min，取上清液用0.45μm有机膜过滤到另一2mL离心管中，HPLC法测定滤液中的Lovastatin含量。HPLC检测的色谱条件：Agilent 5 TC-C18(2)250×4.6mm液相色谱柱；乙腈为色谱纯，磷酸为优级纯，检测波长λ＝237nm，柱温28℃，流速1mL/min，进样量20μL。绘制标准曲线并计算青霉各菌株发酵液中Lovastatin的含量。挑选Lovastatin含量最高的菌株作为目的菌株。
2.5目的菌株的鉴定
挑取少量目的菌株菌丝，转接于PDA培养基平板中，28℃活化培养3d；取平皿中1菌饼(直径6mm)接种于新的PDA培养基平板上，28℃，培养5d，显微镜观察目的菌株的菌丝、分生孢子梗、分生孢子等的形态特征，并拍照。提取目的菌株的基因组DNA，扩增rDNA ITS基因序列，送上海生物工程公司测序。
3实验结果
3.1产生Lovastatin青霉菌株的筛选
通过分离纯化从浙江省各地不同生境收集的样品(食品、土壤、水果、有机质等)中共获126株青霉纯菌株。
用薄层层析(TLC)法和高效液相(HPLC)法对126株青霉纯菌株发酵液进行Lovastatin产量检测，结果表明不同青霉菌株Lovastatin产量存在显著差异。经筛选获1株Lovastatin产量较高的编号为Pc-46菌株，Lovastatin产量为59.2mg/L，Pc-46菌株分离自土壤。
3.2青霉Pc-46菌株的鉴定结果
(1)青霉Pc-46菌株的菌落和显微形态特征
PDA培养基上28℃培养3d形成较典型的菌落，6d菌落表面粉末状，分生孢子结构大量产生，菌落正面墨绿色，背面黄褐色(图1A)。
CYA培养基上28℃培养7d，直径35～40mm，菌落正面黄绿色，菌丝体白色或微黄色，有同心纹环；质地绒状兼粉末状；分生孢子结构大量产生，分生孢子面黄绿色；背面橘褐色(图1B)。
CA培养基上28℃培养7d，直径25～30mm，菌落蓝绿色，菌丝体白色；中心有脐状突起，周围有同心纹环；质地绒状，边缘面上兼有粉末状或颗粒状；分生孢子结构大量产生且易脱落；背面黄褐色(图1C)。
显微镜观察菌丝细胞丝状交织，有分隔(图2A)；分生孢子梗直立，帚状枝三轮生、不对称，彼此通常紧贴，瓶梗每轮5-8个，瓶状，梗颈短(图2B)；分生孢子呈球形或近球形(图2C)。
(2)青霉Pc-46菌株的ITS rDNA基因序列和进化树
ITS rDNA基因序列分析结果表明，其长度为560bp(图3)，与皮落青霉(P.crustosum)的进化距离最近(图4)。
(3)青霉Pc-46菌株的鉴定结果
根据青霉Pc-46菌株的形态特征，结合青霉属(Penicillium)分种检索表，将Pc-46菌株鉴定为皮落青霉(P.crustosum)。
对皮落青霉(P.crustosum)Pc-46进行了保藏，保藏名称：皮落青霉Pc-46Penicillium crustosum Pc-46，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M 2018343，保藏时间2018年06月04日。
实施例2、皮落青霉(P.crustosum)Pc-46菌株发酵生产Lovastatin方法和Lovastatin的鉴定
1菌株：皮落青霉(P.crustosum)Pc-46菌株。
2培养基
(1)PDA培养基：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2.0％，pH 5.0～5.5。用于青霉Pc-46菌株的活化培养。
(2)PD一级种子培养液：马铃薯20％、葡萄糖2％，pH 5.0～5.5。用于青霉Pc-46菌株的一级种子培养。
(3)二级种子培养液：马铃薯20％、葡萄糖2％、甘油1％、蛋白胨0.5％、牛肉膏0.5％，pH 5.0～5.5。用于青霉Pc-46菌株的二级种子培养。
(4)发酵培养液：葡萄糖12％、甘油4％、蛋白胨1％、牛肉膏0.5％、MgSO4·7H2O0.1％、NaCl 0.2％、KH2PO4 0.1％、水1L，pH 5.0～5.5。用于青霉Pc-46菌株发酵生产Lovastatin。
3实验方法
3.1青霉Pc-46菌株的培养
用接种针挑少量Pc-46菌株菌丝，转接于PDA培养基平板中，28℃活化培养3d；取平皿中2个菌饼(直径6mm)接种于PD一级种子培养液(100mL三角瓶装50mL培养液)中，28℃、180r/min摇床培养3d，制得一级种子液；在二级种子培养液中，按10％(体积％)接入一级种子液(即，一级种子液：二级种子培养液＝1:9的体积比)，28℃、180r/min摇床培养2d成二级种子液；在5L发酵罐发酵培养液中按20％接入二级种子液于28℃进行发酵培养。
3.2 Pc-46菌株发酵过程中Lovastatin产量分析
每隔4h取发酵液1mL(设3次重复)，加甲醇4mL(按1:4的体积比例)，超声(功率200w)处理30min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，以发酵时间为横坐标，Pc-46菌株发酵液中Lovastatin产量为纵坐标，绘制Pc-46菌株Lovastatin产量随发酵时间的变化曲线。
3.3青霉Pc-46菌株发酵液中Lovastatin的鉴定
用液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术分离检测青霉Pc-46发酵液中的Lovastatin结构、分子量等，鉴定青霉Pc-46菌株发酵液中Lovastatin。
4实验结果
4.1青霉Pc-46菌株发酵液中Lovastatin产量随发酵时间变化曲线
每隔4h取样用HPLC法测定Pc-46菌株发酵液Lovastatin产量，Lovastatin产量随发酵时间的变化曲线见图6，发酵至80h～100h后，发酵液中Lovastatin产量基本稳定，最大值为155mg/L～158mg/L。
4.2青霉Pc-46菌株发酵液中Lovastatin的鉴定
用液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用技术分离检测发酵液中的Lovastatin，Lovastatin标准品与发酵液的色谱图与一级质谱图见图7。结果表明分离物结构、分子量与Lovastatin准品一致，分子式为C24H36O5，分子量为404.45。
对比实验、将如表1所述的菌株按照实施例2所述方法进行实验，测定发酵液中Lovastatin的最大含量，所得结果与本发明的对比如表1所述。
表1
注：/，代表无法检测到含量。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江师范大学
<120> 皮落青霉及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 560
<212> DNA
<213> 皮落青霉(Penicillium crustosum )
<400> 1
ggctaggacg aggctctggg tcacctccca cccgtgttta ttttaccttg ttgcttcggc 60
gggcccgcct taactggccg ccggggggct tacgcccccg ggcccgcgcc cgccgaagac 120
accctcgaac tctgtctgaa gattgaagtc tgagtgaaaa tataaattat ttaaaacttt 180
caacaacgga tctcttggtt ccggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gatacgtaat 240
gtgaattgca aattcagtga atcatcgagt ctttgaacgc acattgcgcc ccctggtatt 300
ccggggggca tgcctgtccg agcgtcattg ctgccctcaa gcccggcttg tgtgttgggc 360
cccgtccccc gatctccggg ggacgggccc gaaaggcagc ggcggcaccg cgtccggtcc 420
tcgagcgtat ggggctttgt cacccgctct gtaggcccgg ccggcgcttg ccgatcaacc 480
caaattttta tccaggttga cctcggatca ggtagggata cccgctgaac ttaagcatat 540
caataagcgg aaaaaaaccg 560
Claims (3)
1.皮落青霉(P.crustosum)Pc-46，其特征在于：为皮落青霉Pc-46 Penicilliumcrustosum Pc-46，其保藏号为：CCTCC NO:M 2018343。
2.如权利要求1所述的皮落青霉(P.crustosum)Pc-46的用途，其特征在于：用于制备洛伐他汀。
3.洛伐他汀的发酵生产法，其特征在于：
将皮落青霉(P.crustosum)Pc-46的种子液按照1:5的体积比接入至发酵培养液中，于28℃发酵培养80h～100h。
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