CN106047713B - 一株嗜松篮状菌菌株Li-93及其应用 - Google Patents
一株嗜松篮状菌菌株Li-93及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li‑93,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC No.11765。本发明还提供一种用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的制品,该制品的活性成分为嗜松篮状菌Li‑93。本发明还提供一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法。利用上述制品和方法制备GAMG时,具有产物单一,无副产物生成的特点,在常规条件下制备GAMG得率为96%左右,高于现有水平,因此本发明为制备GAMG提供了一种简单有效的产品及方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一株产β-葡萄糖醛酸苷酶的嗜松篮状菌菌株及其应用。
背景技术
甘草酸(Glycyrrhizin,GL)是甘草(Glycyrrhiza uralensis)的主要有效成分之一,是一种三萜皂苷类化合物,可作为天然的甜味剂,具有消炎、抗癌,抗肿瘤、保肝护肝及增强细胞免疫调节的功效,此外还具有良好的美白作用,结合其消炎的功能,能起到润肤和清除自由基等多种功效,因此也被广泛应用于化妆品领域。但是由于甘草酸极性较强,不易透过细胞膜进入细胞内发挥药理作用,不仅限制其功能的发挥,也造成药物的浪费。单葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide,GAMG)是甘草酸最外侧糖苷键裂解后,水解去除一分子葡萄糖醛酸后生成的产物,在保留甘草酸功效的同时因其具有极性适中,易于透过细胞膜,生物利用度高,且具有更高的甜度,更好的生物安全性等优点被认为是甘草酸良好的替代品。
全细胞催化是指利用完整的生物机体作为催化剂进行底物催化与转化,其本质是利用细胞中的酶进行催化,但是相比于酶催化法,免去了酶的提取与纯化过程,制备更简单,生产成本更低。本领域生产GAMG的方法有很多种,其中利用微生物细胞催化底物转化是一种有效的手段。发明专利申请201410088328.3利用分离到的一株产紫青霉Penicilliumpurpurogenum Li-3,经固定化细胞处理后可连续转化生产GAMG,采用不同处理条件,制备GAMG的得率分别为8.5%、16.9%和34%。但是,如此低的得率对后续提取和纯化GAMG产生负担,而且造成底物的浪费,难以满足低成本,规模化的生产要求。因此,本领域亟需筛选一种用于制备GAMG且产率高的新菌株。
发明内容
本发明基于本领域上述不足和需求,提供一株分离所得的嗜松篮状菌菌株(Talaromycespinophilum)Li-93,该菌株可用于制备GAMG,且GAMG产率较高。
本发明的技术方案如下:
一株嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li-93,其保藏编号为:CGMCCNo.11765。
用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品,其特征在于,所述制品的活性成分包括所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品,其特征在于,所述制品的活性成分是所述的 嗜松篮状菌菌株Li-93。
所述制品还包括用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的常规成分和/或用于培养所述的嗜松篮状菌菌株Li-93的培养基成分。
一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品的制备方法,其特征在于,采用所述的嗜松篮状菌菌株Li-93作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一;和/或
在标有制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸用途的包装盒内放置有所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法,其特征在于,在制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的过程中添加和/或使用所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的菌剂,其特征在于,所述菌剂的活性成分包括所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的菌剂,其特征在于,所述菌剂的活性成分是所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
所述菌剂,还包括用于制备菌剂的常规成分。
所述的嗜松篮状菌菌株Li-93在制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸方面的应用。
本发明从新疆甘草种植地土壤中分离到一株丝状真菌,经ITS测序、序列比对、菌落及菌体形态学鉴定,确定该菌株为一株嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilus),其被命名为嗜松篮状菌Li-93。
本发明对上述嗜松篮状菌Li-93在制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的效果方面进行了验证,发现:该菌可定向将甘草酸或其盐转化生成GAMG,而无副产物GA的生成,在常规条件下制备GAMG得率为96%左右,高于现有技术水平。
由此可见,本发明提供的嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilus)菌株Li-93能较为高效地制备GAMG,且该菌生长条件要求不高、获取容易、成本低廉,为本领域制备GAMG提供了一种简单有效的产品和方法。
所述嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li-93已送保藏,其保藏信息如下:
菌种保藏名称:Li-93
保藏号:CGMCC No.11765
分类命名:嗜松篮状菌
拉丁名:Talaromyces pinophilum
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期:2015年11月30日
附图说明
图1是嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)Li-93光学显微镜图;
图2是嗜松篮状菌转化甘草酸单铵盐生成单葡萄糖醛酸基干草次酸(GAMG)的高效液相色谱分析图,1:甘草次酸(GA)的标准品;2:GAMG的标准品;3:转化前;4转化后。
具体实施方式:
下面结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1中用到的新疆甘草种植地土壤采集自中国新疆塔城额敏县甘草种植地。
实施例中用到的甘草酸单铵盐的纯度为75%,均购自新疆天山制药厂。
以下实施例中用到的培养基分述如下:
筛选平板:甘草酸单铵盐3g/L,NaNO3 3g/L,K2HPO4 1g/L,KCl 1g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,Fe2SO4·7H2O 0.01g/L,pH 5.0,琼脂30g/L。
查氏酵母膏琼脂培养基(CYA):NaNO3 3g/L,K2HPO4 1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,KCl0.5g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,蔗糖20g/L,酵母粉提取物5g/L,琼脂20g/L,自然pH。
麦芽汁琼脂培养基(MEA):麦芽提取物20g/L,葡萄糖20g/L,多聚蛋白胨1g/L,琼脂20g/L,自然pH。
燕麦琼脂培养基(OA)制备方法如下:
取30g燕麦加水至1000mL,煮沸1小时后纱布过滤,取滤液加水补足至1000mL,加入20g琼脂,121℃高温灭菌20min。
马铃薯葡萄糖液(固)体培养基制备方法如下:
称取去皮马铃薯200g,加水800mL,煮沸30分钟左右,纱布过滤,向滤液中加入20g葡萄糖、溶解后补足水至1000mL,若是需要制成固体培养基,则向其中再添加20g琼脂,自然pH,121℃高温灭菌15min。
二级种子培养基:去皮马铃薯200g,加水800mL,煮沸30分钟左右,纱布过滤,取滤液补足水至1000mL后从中取出250mL,加入8g葡萄糖,溶解后,加水至1000mL,自然pH,121℃高温灭菌15min。
发酵培养基的制备方法如下:
取去皮马铃薯200g,加水800mL,煮沸30分钟左右,纱布过滤,取滤液补足水至1000mL后从中取出200mL,加水至1000mL,pH 5.0,121℃高温灭菌15min。
本发明中GAMG的产率定义为:
实施例1:嗜松篮状菌Li-93的筛选与鉴定
采集新疆甘草种植地土壤10g,置于100mL无菌0.8%NaCl溶液中,充分振荡10min,无菌滤纸过滤,取滤液分别稀释101、102、103、104倍,将各个稀释液涂布于筛选平板上,于28℃培养。每24h观察平板是否长出新的菌落,将新长的菌落进一步划线分离以获得纯种菌株。从中分离到一株丝状真菌,命名Li-93。
对该菌株Li-93的ITS序列进行测序,结果见SEQ ID No.1所示。将序列进行BALST比对,发现该菌与Talaromyces pinophilus NBRC100533T、Talaromyces pinophilus NRRL58691和Talaromyces pinophilum NRRL 6420的TIS序列具有99%以上的同源性。
将该菌孢子分别接于查氏酵母膏琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基、燕麦琼脂培养基,30℃培养5-7天,观察该菌在各种培养基上生长形成的菌落形态。
结果显示:在查氏酵母膏琼脂培养基上于28℃培养7天后,菌落直径约为30mm,菌丝呈绒状、黄色,质地致密,菌落边缘为白色,距离中心点约7mm处形成一圈凹槽,并以此圈凹槽为起点,向外形成1-5条辐射状凹糟,背面为橙红色。在麦芽汁琼脂培养基上于28℃培养7天后,菌落直径约为40mm,菌丝呈厚绒状、质地相对疏松、颜色从外向内依次为白色、黄色和深绿色,中间形成约12mm直径的圆形凸起,背面为橙红色。在燕麦琼脂培养基上于28℃培养7天后,菌落直径约为40mm,菌丝呈絮状,质地疏松,边缘为白色,中间为深绿色,背面无色或局部呈淡橙色。
显微镜下观察:菌丝有隔膜,顶端生有扫帚状的分生孢子头,直立分生孢子梗上有双轮生小梗、对称型,分生孢子呈串排列在小梗顶端、呈球形或近球形,如图1所示。
根据以上结果,鉴定筛选所得菌株为嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilus),被命名为Li-93。同时将该菌株Li-93送保藏,并作为本发明请求保护的菌株,其保藏号为CGMCC No.11765。
实施例2、采用本发明所述嗜松篮状菌菌株Li-93制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸
将嗜松篮状菌Li-93接于斜面马铃薯葡萄糖固体培养基上,于30℃培养3天。取斜面上的孢子接种至马铃薯葡萄糖液体培养基上,于30℃、200rpm的摇床上培养48h,然后以体积比5%的接种量接于二级种子培养基中,30℃、200rpm的摇床上培养24h,得到二级种子液。将二级种子液,以体积比10%的接种量接于发酵培养基中,30℃、200rpm摇床上培养12h后,向其中加入甘草酸单铵盐使其终浓度达到5g/L,于30℃、200rpm摇床上反应。每6h取样,采用高效液相色谱检测甘草酸单铵盐的消耗量和GAMG的生成量,结果显示24h后,甘草酸单铵盐转化完毕,GAMG再无明显增加,如图2所示。经计算,GAMG的产率达到96.31%。
实施例3、本发明所述用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品
本实施例提供一种用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品,该制品的活性成分包括实施例1分离得到的嗜松篮状菌菌株Li-93;和/或,
该制品的活性成分是实施例1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
基于本实施例的所述用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品,还包括用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的常规成分和/或用于培养所述的嗜松篮状菌菌株Li-93的培养基成分。
本实施例还提供上述制品的制备方法,包括如下步骤:采用实施例1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一;和/或
在标有制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸用途的包装盒内放置有实施例1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
实施例4、本发明所述用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的菌剂
本实施例提供一种用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的菌剂,特征是,所述菌剂的活性成分包括实施例1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93;和/或
所述菌剂的活性成分是实施例1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
所述菌剂还包括用于制备菌剂的常规成分。
Claims (10)
1.一株嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li-93,其保藏编号为:CGMCC No:11765。
2.用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品,其特征在于,所述制品的活性成分包括权利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
3.用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品,其特征在于,所述制品的活性成分是权利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
4.根据权利要求2或3所述的制品,其特征在于,所述制品还包括用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的常规成分和/或用于培养所述的嗜松篮状菌菌株Li-93的培养基成分。
5.一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品的制备方法,其特征在于,采用权利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一;和/或,
在标有制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸用途的包装盒内放置有权利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
6.一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法,其特征在于,在制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的过程中添加和/或使用权利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
7.用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的菌剂,其特征在于,所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
8.用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的菌剂,其特征在于,所述菌剂的活性成分是权利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93。
9.根据权利要求7或8的菌剂,其特征在于,还包括用于制备菌剂的常规成分。
10.权利要求1所述的嗜松篮状菌菌株Li-93在制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸方面的应用。
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