CN101265451A - 蛇足石杉(Huperzia Serrata (Thunb.)Trev)的一种内生真菌 - Google Patents

蛇足石杉(Huperzia Serrata (Thunb.)Trev)的一种内生真菌 Download PDF

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Abstract

石杉碱甲是我国首创的治疗老年痴呆的生物碱，其疗效显著，且药效持续时间长，无严重不良反应，是国内外上述病症最有效的药物之一。但石杉碱甲生产还是依赖于从蛇足石杉植株中提取，这种生产方法产量很低，生产成本高。本发明主要涉及一种从石杉科植物活体中分离得到的木霉菌D01，保藏在国家知识产权局指定保藏单位，保藏编号为：CGMCC No.1905。该木霉菌可发酵产生石杉碱甲类化合物，提供了石杉碱甲的微生物发酵生产方式，具有良好的应用前景。

Description

蛇足石杉(Huperzia Serrata (Thunb.)Trev)的一种内生真菌
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种其发酵产物含石杉碱甲的微生物。
技术背景
随着社会人口的老龄化，老年性痴呆症发病率相对上升，据统计，当今世界有5000多万老年人患有不同程度的老年性痴呆症。我国60岁以上人口预计道2010年将占总人口的15.7％，痴呆症问题同样是我们所面临的不可回避的问题。因此寻找治疗老年性痴呆病的有效药物已受到各国的高度重视，成为当务之急。近年来，国内外学者在应用天然药物有效成分治疗老年痴呆病方面做了大量基础研究和临床应用研究工作由于脑中胆碱能系统受到了损害，导致突触部位乙酰胆碱含量的下降，从而对病人的学习、记忆能力产生影响。因此，针对提高老年性痴呆病人脑中的乙酰胆碱含量，促进胆碱能神经功能的药物应运而生。石杉碱(huperzine A)为我国首创的可逆性强效乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂.是近年来从石杉属植物蛇足石杉(Huperzia Serrata(Thunb.)Trev)中分离得到的一种新的生物碱对老年性痴呆症，单纯记忆障碍以及重症肌无力症治疗有显著疗效，且药效持续时间长，无严重不良反应，是国内外上述病症最有效的药物，深受关注，在国际上已被列为第二代胆碱酯酶的抑制剂之一。
但石杉碱甲生产还是依赖于从蛇足石杉植株中提取。其缺点是：1.石杉碱甲含量很低。2.生产周期长。3.生产效率低。4.人工栽培困难。5.蛇足石杉植株生长缓慢。6.破坏野生资源及生态环境。7.生产成本高。现在虽有关于蛇足石杉细胞培养及化学合成来生产石杉碱甲的报道，但存在大规模植物细胞细胞培养难度高，生长缓慢，成本高，产量低等缺点；而石杉碱甲结构复杂，化学合成反应步骤多、污染大、条件苛刻、产率极低、毒副作用大、成本高，而无法商业化生产。石杉碱甲用微生物发酵方式获得尚未见任何形式的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种其发酵物具有药用功能的木霉菌。
本发明所述的霉菌命名为木霉属，木霉菌(Trichodermasp.)，编号D01。保藏在国家知识产权局指定保藏单位，保藏编号为：CGMCC No.1905
本发明所述的木霉菌D01系从石杉科植物蛇足石杉(Huperzia Serrata(Thunb.)Trev)植物活体中分离得到的。现保藏在国家知识产权局指定保藏单位保藏，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.1905
本发明所述菌株的固体培养特征：
1.PDA培养基28℃培养4天，菌落直径30mm，7天蔓延整个培养皿。菌丝白色，平长茸状，生长紧密，边缘不齐，背面淡黄色。
2.麦芽汁培养基28℃培养4天，菌落直径30mm，7天蔓延整个培养皿。菌丝白色，生长紧密，边缘不齐，背面淡黄色。
本发明所述木霉菌D01液体发酵培养；
1.培养基PDA。摇床培养时间5-7天。培养温度28℃±2℃。
2.发酵培养特征：培养第一天，菌种有零星的白色菌丝点；培养第二天长满白色菌丝；培养第5-7天发酵液中长满白色菌丝体。
3.木霉菌D01液体发酵5-7天后，对发酵液进行化学提取、分离可得到胆碱酯酶抑制剂-石杉碱甲。
本发明所述的木霉菌D01液体发酵提取工艺为：菌种→种子培养→发酵培养→发酵物提取→分离化合物→石杉碱甲。
上述步骤中，发酵原料为马铃薯培养基(PDA)。
上述的------液态发酵工艺中，发酵条件参数如下：
(1)发酵方式：液态发酵。
(2)菌种斜面：试管斜面菌种培养采用马铃薯葡萄糖固体培养基(固体PDA)。
(3)种子培养：种子培养为马铃薯葡萄糖液体培养基(液体PDA)。
马铃薯葡萄糖培养基(PDA)制备：取新鲜马铃薯200克，去皮切成小块，加水1升煮沸30分钟，过滤弃去马铃薯，滤液加水补至1升，加入葡萄糖20克，pH值自然。
上述马铃薯葡萄糖培养基中加入琼脂15克，即为固体PDA培养基。
(4)发酵培养：发酵的培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(液体PDA)，pH值自然。
(5)培养时间：种子摇床培养时间48-72小时，发酵培养时间5-7天。
(6)培养温度：种子摇床培养温度28℃±2℃，发酵培养温度为28℃±2℃。
(7)发酵物提取：发酵完毕，过滤，收集菌体和发酵液。发酵液用有机酸浸提、萃取、反萃取、脱色和重结晶等技术分离得到石杉碱甲。
本发明所述的木霉菌D01是从蛇足石杉活体植物中分离得到的，能够人工发酵产生与寄主植物相同化合物的一株丝状真菌。蛇足石杉主要药用成分之一为石杉碱甲，具有可逆性抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的作用，在国际上已被列为第二代胆碱酯酶的抑制剂之一。本发明是通过蛇足石杉内生真菌的纯培养，以马铃薯培养基(PDA)为原料，采用现代微生物发酵技术，结合化学手段，寻找具有老年性痴呆病药用成分另一类生物资源提供一种新途径。
本发明实施例
在无菌条件下，用接种针挑取少许菌种到已灭好菌的种子液体PDA培养基中，在28℃±2℃下摇床培养72-96小时，即为种子菌。
发酵采用1000毫升玻璃三角瓶，装入配制好的液体PDA培养基400毫升，121℃灭菌30分钟后，取出待冷却至约30℃，在无菌条件下，取种子菌，接种于装有400毫升液体PDA培养基的三角瓶中，接种量为4-8％(V/V)，置于28℃±2℃摇床培养5-7天。发酵期间，注意检查有无染菌现象。
发酵完毕，酸调发酵液至pH值1-3，10-12小时后过滤收集滤液，浓缩至原体积的五分之一，调pH值至9-10，氯仿反复萃取三次，集氯仿液，浓缩氯仿液经反萃取、脱色、结晶重结晶等技术手段分离得到石杉碱甲。
产品鉴定：(1)分离所得产品的溶液在200nm至400nm光谱扫描，在231nm与313nm的波长处有最大吸收。(2)分离所得产品的溶液与石杉碱甲对照品溶液分别点于同一硅胶GF254薄层板上(厚度0.20～0.25mm，10×10cm，用甲醇预展两次，其间干燥10分钟)以环己烷-丙酮-乙醇-浓氨溶液(2∶3∶0.1∶0.3)为展开剂，直立式展开至10cm，晾干，先置紫外光灯(254nm)下检视，再喷以0.3％高锰酸钾水溶液，于4～5分钟内检视，与对照品相同的位置显示相似斑点。
木霉菌D01的18S rDNA序列表
GTAATGAAGTCTGGGTGCAGCAGTAGTATACCGCGAAACT
GCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAATA
CTTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATAC
ATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGTTGTATTTATTAG
ATTAAAAACCAATGCCCCTCGGGGCTCTCTGGTGAATCAT
AATAACTAGTCGAATCGACAGGCCTTGTGCCGGCGATGGC
TCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTC
TTGTCCAAACATGGTGGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGG
CTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACAT
CCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGA
CACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCT
TTTGGGTCTTGTAATCGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTT
AACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTCCAGCAGCC
A
附图说明
附图为木霉菌D01的电镜显微照片(×1000倍)。

Claims (4)

1. 一种从石杉科植物蛇足石杉植物活体中分离得到的木霉菌Trichoderma D01，其特征在于，该菌为于2006年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的木霉菌Trichoderma D01.，其保藏号为CGMCC No.1905。
2. 根据权利要求1所述的木霉菌，其特征在于，该霉菌的18SrDNA序列为：
GTAATGAAGTCTGGGTGCAGCAGTAGTATACCGCGAAACTGCGAATGGCTCATTATATAAGTTATCGTTTATTTGATAATACTTTACTACTTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAATCCCGACTTCGGAAGGGTTGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCCTCGGGGCTCTCTGGTGAATCATAATAACTAGTCGAATCGACAGGCCTTGTGCCGGCGATGGCTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTCTTGTCCAAACATGGTGGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATCGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTCCAGCAGCCA
3. 根据权利要求1所述的木霉菌Trichoderma D01.的工业用途，其特征在于可以发酵产生石杉碱甲或者其它石杉碱类化合物。
4. 根据权利要求1所述的木霉菌Trichoderma D01，其特征在于所述的木霉菌Trichoderma D01的固体培养特征：PDA培养基28℃培养4天，菌落直径30mm，7天蔓延整个培养皿，菌丝白色，长茸状，生长紧密，边缘不齐，背面淡黄色。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102168017A (zh) * 2010-09-29 2011-08-31 湖南农业大学 一种石杉碱甲高产菌及用其发酵生产石杉碱甲的方法
CN102653720A (zh) * 2011-03-02 2012-09-05 华中农业大学 一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌es026
CN101942393B (zh) * 2009-12-30 2012-12-26 朱笃 一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌竹黄菌株
CN102907253A (zh) * 2012-07-02 2013-02-06 恩施清江生物工程有限公司 一种蛇足石杉内生菌及其应用
CN103667070A (zh) * 2013-08-08 2014-03-26 浙江医药高等专科学校 蛇足石杉植物内生真菌及其在制备石杉碱甲中的应用
CN103705548A (zh) * 2014-01-10 2014-04-09 吉首大学 一种活体提取蛇足石杉生物总碱的方法
CN105647819A (zh) * 2016-03-02 2016-06-08 西安医学院 一种具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株及其应用
CN105670940A (zh) * 2016-03-02 2016-06-15 西安医学院 一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株及其应用
CN105670941A (zh) * 2016-03-02 2016-06-15 西安医学院 一种具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株及其应用

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101942393B (zh) * 2009-12-30 2012-12-26 朱笃 一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌竹黄菌株
CN102168017A (zh) * 2010-09-29 2011-08-31 湖南农业大学 一种石杉碱甲高产菌及用其发酵生产石杉碱甲的方法
CN102168017B (zh) * 2010-09-29 2012-07-11 湖南农业大学 一种产石杉碱甲的胶孢炭疽菌及用其发酵生产石杉碱甲的方法
CN102653720A (zh) * 2011-03-02 2012-09-05 华中农业大学 一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌es026
CN102653720B (zh) * 2011-03-02 2013-09-25 华中农业大学 一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌es026
CN102907253A (zh) * 2012-07-02 2013-02-06 恩施清江生物工程有限公司 一种蛇足石杉内生菌及其应用
CN103667070A (zh) * 2013-08-08 2014-03-26 浙江医药高等专科学校 蛇足石杉植物内生真菌及其在制备石杉碱甲中的应用
CN103705548A (zh) * 2014-01-10 2014-04-09 吉首大学 一种活体提取蛇足石杉生物总碱的方法
CN103705548B (zh) * 2014-01-10 2015-11-04 吉首大学 一种活体提取蛇足石杉生物总碱的方法
CN105647819A (zh) * 2016-03-02 2016-06-08 西安医学院 一种具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株及其应用
CN105670940A (zh) * 2016-03-02 2016-06-15 西安医学院 一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株及其应用
CN105670941A (zh) * 2016-03-02 2016-06-15 西安医学院 一种具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株及其应用
CN105647819B (zh) * 2016-03-02 2019-04-23 西安医学院 一种具有治疗阿尔茨海默病功能的真菌菌株及其应用
CN105670940B (zh) * 2016-03-02 2019-04-23 西安医学院 一种高效表达石杉碱甲的真菌菌株及其应用
CN105670941B (zh) * 2016-03-02 2019-04-23 西安医学院 一种具有抑制乙酰胆碱酯酶功能的真菌菌株及其应用

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