CN100415870C - 涅氏短状杆菌新菌株及其所产酶的制备方法 - Google Patents
涅氏短状杆菌新菌株及其所产酶的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100415870C CN100415870C CNB2005100197839A CN200510019783A CN100415870C CN 100415870 C CN100415870 C CN 100415870C CN B2005100197839 A CNB2005100197839 A CN B2005100197839A CN 200510019783 A CN200510019783 A CN 200510019783A CN 100415870 C CN100415870 C CN 100415870C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacterial strain
- present
- acetaldehyde dehydrogenase
- extractum carnis
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种涅氏短状杆菌(Brachybacterium nesterenkovi)新菌株及其培养条件、生理生化特性和所产酶的制备方法。该方法为：配制土壤溶液，梯度稀释，取特定梯度的溶液200μl涂布到30μl牛肉膏培养基中，同时加入100μl～800μl乙醇诱导剂[12～14]，然后置于30℃～40℃下培养16h～48h，多次分离纯化培养；经镜检为单克隆菌株；经液体发酵，再对该发酵液超声波破碎，离心分离提纯后测其活性。本发明的有益效果在于：1.该菌株是一种可以产乙醛脱氢酶、乙醇脱氢酶等多种酶的菌株。2.菌株的培养条件简单易行，成本低廉，更有利于工业化生产。3.该菌株在37℃时活性较高，和人的体温相吻合，更有利于促使乙醇在人体内的代谢。
Description
技术领域
本发明涉及一种涅氏短状杆菌(Brachybacterium nesterenkovii)新菌株及其培养条件、生理生化特性和所产酶的制备方法。该新菌株已于2005年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 205113。
背景技术
涅氏短状杆菌(Brachybacterium)属首次发现于1988年(Collins M.D，Brown J，Jones D，et al.Brachybacterium faecium gene.Nov.，sp.nov.，a coryneform bacterium from poultry deep litter.Int.J.Syst.Bacteriol.，1988，38：45～48.)，目前国内尚无报道。Brachybacterium属目前发现并且已经定种的有11种，未定种的26种。定种的11种分别是B.alimentarium，B.conglomeratum，B.faecium，B.fresconis，B.nesterenkovii，B.paraconglomeratum，B.rhamnosum，B.sacelli，B.Tyrofermentans，Brachybacterium arcticum和B.muris，。其中最早发现的是B.faecium和于1992年首次报道B.nesterenkovii相比，B.nesterenkovii的细胞壁结构缺少肽聚糖，因此B.nesterenkovii具有更好的基因序列。另外，两者DNA-DNA杂交结果表明它们的同源性只有22％。国外B.nesterenkovii菌株是从奶酪中分离得到的(Gvozdyak O.R，Nogina T.M，Schumann P.，et al.Taxonmic study of the genus Brachybacterium：Brachybacterium nesterenkovii sp.nov.Int.J.Syst.Bacteriol.，1992，42：74～78.)。目前对于这种菌种的研究大多集中在基因和氨基酸序列的测定分析方面(Manabu Muto，Yoshiaki Hitomi.Acetaldehyde production by non-pathogenic Neisseria in human oral microflora：Implications for carcinogenesis in upper aerodigestive tract[J].International Journal of Cancer.2000，88(3)：342～350.)，而对于它的功能和应用尚未有过研究报道。
另一方面，乙醇在人体内的代谢主要靠体内的两种酶：一种是乙醇脱氢酶(AlcoholDehydrogenase，ADH)；另一种是乙醛脱氢酶(Aldehyde Dehydrogenase，ALDH)。前者使乙醇转化为乙醛，而后者则使乙醛转化为乙酸，最终分解为二氧化碳和水。一般来说，人体中都存在前一种酶，而且数量基本是相等的，但缺少后一种酶的人就比较多。ALDH的缺少，使乙醇不能被完全分解为水和二氧化碳，而是以乙醛的形式继续留在体内。目前，大量国内外的研究表明，乙醛在体内过度积累是醉酒的最主要原因。因此利用上述乙醛脱氢酶、乙醇脱氢酶的特性和功效开发有效的解酒药物具有较高的应用价值和市场前景。乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶虽可从一些动物的肝脏、胰腺等内脏进行提取，但提取过程较为复杂，成本高，不易规模化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是要培养筛选出一种涅氏短状杆菌(Brachybacteriumnesterenkovii)新菌株，并且应用该菌株产生和制备乙醛脱氢酶的方法。
本发明是从土壤中筛选得到一种涅氏短状杆菌(Brachybacterium nesterenkovii 1#)新菌株，它具有保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M205113的样品特征。
该培养物已于2005年7月20日由中国典型培养物保藏中心收到，并登记入册。该培养物的存活性于2005年10月18日检测完毕，结果为存活。
本发明的涅氏短状杆菌新菌株其形态为短杆状，菌体呈浅黄色，大小为0.5～0.75×1.0～2.5μm，革兰氏染色呈阳性(见图1)，其透射电镜图(TEM)见图2、3；不产内生孢子也无运动性；同时该菌株能产过氧化氢酶、酯化酶：能够利用L-乳酸、乙酸、丙酮酸、α-酮基-戊二酸、D-半乳糖、龙胆二糖、α-D-葡萄糖，D-木糖等多种糖类物质能作为碳源，而苦杏仁苷、D-阿拉伯醇、纤维二糖、果糖海藻糖、D-半乳糖醛酸、m-肌醇、尿苷、D-阿洛酮糖、肌腺、腺苷和甘油等不能作为它的碳源；另外，L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺和丁二胺能作为它的氮源，而L-丝氨酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺不能作为它的氮源。
本发明应用该菌株产生和制备乙醛脱氢酶的方法为：
配制土壤溶液，梯度稀释，取稀释的土壤溶液200μl涂布到30μl牛肉膏培养基中，同时加入100μl～800μl乙醇诱导剂，然后置于30℃～40℃的温度下培养16h～48h(小时)，多次分离纯化培养；经镜检为单一菌株；然后经液体发酵，再对该发酵液超声波破碎，离心分离提纯后测其活性即成。
在上述培养条件下得到菌株产乙醛脱氢酶的活性最高可达到12.5U/ml。
上述方案中，超声波破碎的破碎功率p＝200w～800w，破碎时间t＝5min～25min；离心分离的转速N＝4000rpm，时间t＝5min～15min。稀释的土壤溶液浓度为10-5g/ml～10-3g/ml。分离纯化培养为3～6次。
本发明得到的菌株和国外已经报道过的B.nesterenkovii菌株在培养条件和来源上都不同，国外B.nesterenkovii菌株是从奶酪中分离得到的。而我们得到的菌株来源于微生物多样性很高的土壤，培养的工艺条件也较为简单易行。通过对本发明菌株生理生化特性的研究，该菌株还能产过氧化氢酶、酯化酶、乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，它们都是具有经济价值的酶且活性较高，因此该菌株具有较高的应用价值和市场前景，可以利用它开发解酒的药物或保健品。
本发明的有益效果在于：1、该菌株是一种能够产乙醛脱氢酶以及乙醇脱氢酶等多种酶的菌株。2、采用土壤微生物为原料培养菌株，培养方法简单易行，成本低廉，更有利于工业化生产。3、该菌株在37℃时活性较高，和人的体温相吻合，更有利于促使乙醇在人体内的代谢。
附图说明
图1为本发明革兰氏染色后菌株菌体形态放大图。
图2为本发明菌株放大17×1000倍的细胞结构透射电镜扫描图(TEM)。
图3为本发明菌株放大7.5×1000倍的内部结构透射电镜扫描图(TEM)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
称取5g NaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸馏水，16g～20g琼脂配制牛肉膏培养基；
配制1％(按重量计为0.01g土壤/ml水)的土壤溶液，梯度稀释，制取浓度为10-5g/ml的土壤溶液，取200μl稀释的土壤溶液加入到30ml牛肉膏培养基中，同时加入200μl～400μl的乙醇诱导剂，然后将此培养基于35℃～37℃温度下培养16h～36h；4～5次分离纯化培养，经镜检为单一菌株后于4℃斜面保藏。该菌株的生理生化特征请详见表1。
将筛选得到的菌种由斜面接到30ml(250ml三角瓶)含有5gNaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸馏水的发酵液中，加入200μl～400μl乙醇诱导剂，于35℃～37℃、150r/min下培养4d～6d(天)，得到我们所需要的乙醛脱氢酶，再对该发酵液破碎(p＝600w，t＝10min)、离心分离(N＝4000rpm，t＝5min～8min)提纯，测其活性，达12.5U/ml。
实施例2
称取：5g NaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸馏水，16g～20g琼脂配制牛肉膏培养基发酵液。
配制浓度为10-4g/ml的土壤溶液，取200μl加入到30ml牛肉膏培养基中，同时加入200μl～400μl的乙醇诱导剂，然后将此培养基于30℃～37℃培养16h～36h。按实施例1的方法进行液体发酵，再对该发酵液超声波破碎，离心分离提纯后测其活性。经镜检为单一菌株后测其菌株的产乙醛脱氢酶活性达8.3333U/ml。
实施例3
称取：5g NaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸馏水，16g～20g琼脂配制牛肉膏培养基发酵液。
配制浓度为10-4g/ml的土壤溶液，取200μl加入到30ml牛肉膏培养基中，同时加入200μl～400μl的乙醇诱导剂，然后将此培养基于30℃～37℃培养16h～36h。按实施例1的方法进行液体发酵，再对该发酵液超声波破碎，离心分离提纯后测其活性。经镜检为单一菌株后测其菌株的产乙醛脱氢酶活性达6.5789U/ml。
表1 涅氏短状杆菌生理生化特性
Claims (4)
1. 一种涅氏短状杆菌(Brachybacterium nesterenkovii)菌株，其保藏号为CCTCC NO：M205113。
2. 一种应用权利要求1所述的菌株制备乙醛脱氢酶的方法，其特征在于将所述的菌株进行液体发酵，再对该发酵液超声波破碎，离心分离提纯后测其活性即成。
3. 按权利要求2所述的制备乙醛脱氢酶的方法，其特征在于超声波破碎的破碎功率p＝200w～800w，破碎时间t＝5min～25min；离心分离的转速N＝4000rpm，时间t＝5min～15min。
4. 按权利要求2或3所述的制备乙醛脱氢酶的方法，其特征在于所述的液体发酵是将所述的菌株接种到30ml牛肉膏液体培养基，加入200μl～400μl乙醇诱导剂，于35℃～37℃、150r/min下培养4d～6d，得到所需要的乙醛脱氢酶，所述的牛肉膏液体培养基由5g NaCl、10g蛋白胨、3g牛肉膏、1000ml蒸馏水配制而成。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100197839A CN100415870C (zh) | 2005-11-11 | 2005-11-11 | 涅氏短状杆菌新菌株及其所产酶的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2005100197839A CN100415870C (zh) | 2005-11-11 | 2005-11-11 | 涅氏短状杆菌新菌株及其所产酶的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1793328A CN1793328A (zh) | 2006-06-28 |
| CN100415870C true CN100415870C (zh) | 2008-09-03 |
Family
ID=36804978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2005100197839A Expired - Fee Related CN100415870C (zh) | 2005-11-11 | 2005-11-11 | 涅氏短状杆菌新菌株及其所产酶的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100415870C (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101210250B (zh) * | 2007-12-24 | 2011-09-28 | 浙江大学 | 茶尺蠖乙醛脱氢酶基因adh及其应用 |
| CN108611302B (zh) * | 2018-05-14 | 2019-05-28 | 大江环境股份有限公司 | 一种包含涅氏短状杆菌的生物活性填料的应用 |
| CN108467845B (zh) * | 2018-05-14 | 2019-04-23 | 大江环境股份有限公司 | 一种包含涅氏短状杆菌的菌剂的应用 |
| CN108452667B (zh) * | 2018-05-14 | 2019-03-19 | 大江环境股份有限公司 | 一种包含涅氏短状杆菌的生物活性填料 |
| CN108570435A (zh) * | 2018-05-14 | 2018-09-25 | 清华大学 | 一株涅氏短状杆菌及其应用 |
| CN108531431B (zh) * | 2018-05-14 | 2019-08-13 | 中国科学院生态环境研究中心 | 一种包含涅氏短状杆菌的菌剂 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5437989A (en) * | 1992-12-30 | 1995-08-01 | Hoffmann-La Roche Inc. | Alcohol/aldehyde dehydrogenase from Gluconobacter oxydans DSM 4025 FERM BP-3812 |
-
2005
- 2005-11-11 CN CNB2005100197839A patent/CN100415870C/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5437989A (en) * | 1992-12-30 | 1995-08-01 | Hoffmann-La Roche Inc. | Alcohol/aldehyde dehydrogenase from Gluconobacter oxydans DSM 4025 FERM BP-3812 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BRACHYBACTERIUM FRESCONIS SP NOV ANDBRACHYBACTERIUM SACELLI SP NOV., ISOLATEDFROM DETERIORATED PARTS OF A MEDIEVAL WALLPAINTING OF THE CHAPEL OF CASTLEHERBERSTEIN(AUSTRIA). HEYRMAN J, ER AL.INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY,Vol.52 No.5. 2002 |
| BRACHYBACTERIUM FRESCONIS SP NOV ANDBRACHYBACTERIUM SACELLI SP NOV., ISOLATEDFROM DETERIORATED PARTS OF A MEDIEVAL WALLPAINTING OF THE CHAPEL OF CASTLEHERBERSTEIN(AUSTRIA). HEYRMAN J, ER AL.INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC AND EVOLUTIONARY,Vol.52 No.5. 2002 * |
| 嗜热厌氧产乙醇杆菌乙醇代谢途径的初步研究. 蒋宇等.南京师大学报（自然科学版），第28卷第3期. 2005 |
| 嗜热厌氧产乙醇杆菌乙醇代谢途径的初步研究. 蒋宇等.南京师大学报（自然科学版），第28卷第3期. 2005 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1793328A (zh) | 2006-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Park et al. | Optimization of submerged culture conditions for the mycelial growth and exo‐biopolymer production by Cordyceps militaris | |
| Bai et al. | Enhanced L-(+)-lactic acid production by an adapted strain of Rhizopus oryzae using corncob hydrolysate | |
| CN100396781C (zh) | 利用乳酸菌制备共轭亚油酸的方法 | |
| CN100415870C (zh) | 涅氏短状杆菌新菌株及其所产酶的制备方法 | |
| CN101381694B (zh) | 细菌纤维素产生菌及利用该菌株制备细菌纤维素的方法 | |
| CN102703339B (zh) | 高产精氨酸脱亚胺酶菌株及用它生产l-瓜氨酸的方法 | |
| CN103416223B (zh) | 一种提高北冬虫夏草发酵液中虫草素产量的方法 | |
| CN104762250B (zh) | 一种利用木质纤维素水解液生产益生菌的方法 | |
| CN101113410B (zh) | 一种高山被孢霉及其应用 | |
| CN103937691B (zh) | 一株产β‑果糖苷酶的米曲霉菌株及其培养方法与应用 | |
| CN103911315B (zh) | 一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用 | |
| CN100999750B (zh) | 一种微生物细胞生物转化对羟基苯甲醇合成天麻素的方法 | |
| CN104911135B (zh) | 一种海藻糖合酶生产菌株及其应用 | |
| CN102433288B (zh) | 一种产鸟氨酸的菌株及用该菌株生物合成鸟氨酸的方法 | |
| CN102533607B (zh) | 一株产β-半乳糖苷酶的菌株及用该酶生产低聚半乳糖的方法 | |
| CN102373166B (zh) | 高产聚-β-羟基丁酸的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）PX-95菌株及其用途 | |
| CN104745554B (zh) | 芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基及发酵方法 | |
| CN101805760A (zh) | 一种生产含有花生四烯酸的微生物油脂的方法 | |
| CN110283870A (zh) | 一种双菌株混合固态发酵玉米秸秆的方法 | |
| Lung et al. | Optimization of exopolysaccharide production from Armillaria mellea in submerged cultures | |
| CN100564515C (zh) | 一株博德特氏菌及其在制备胆固醇氧化酶及胆甾-4-烯-3-酮中的应用 | |
| CN104278070A (zh) | 一种提高桑黄液体发酵产物中麦角甾醇含量的方法 | |
| CN105112320B (zh) | 一种唐菖蒲伯克霍尔德菌株及其发酵生产碱性脂肪酶的方法 | |
| CN117417869B (zh) | 一株约氏黄杆菌w24h及其生产2,3-丁二醇的应用 | |
| CN105602856B (zh) | 黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Wuhan Tianyi Chemical Co., Ltd. Assignor: Wuhan Chemistry College Contract record no.: 2010420000159 Denomination of invention: Nie's brevibacterium new strain and process for preparing enzyme by it Granted publication date: 20080903 License type: Exclusive License Open date: 20060628 Record date: 20100913 |
|
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20080903 Termination date: 20091211 |