CN104911135B - 一种海藻糖合酶生产菌株及其应用 - Google Patents

一种海藻糖合酶生产菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种海藻糖合酶生产菌株及其应用，属于生物工程和酶工程技术领域。本发明的海藻糖合酶生产菌为一株假单胞菌Pseudomonas sp.WSH15‑02，于2015年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2015227，是从淀粉加工厂附近土壤中经菌株富集、平板菌落特征初筛，采用摇瓶复筛，测定酶活力，经酶活测定，比较海藻糖合酶活性大小而得到。该菌生产的海藻糖合酶可以麦芽糖为底物催化生产海藻糖，具有不受底物浓度影响、温度范围广、没有副产物生成、反应方法简便、低能耗、物料成本低、高效等优点，底物转化率可达80％以上。该菌可用于生物制品、食品、药品、作物育种及精细化工等领域。

Description

一种海藻糖合酶生产菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种海藻糖合酶生产菌株及其应用，属于生物工程和酶工程技术领域。
背景技术
海藻糖(Trehalose，α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside)是由2个葡萄糖分子通过α,α-1,1糖苷键结合而成的非还原性双糖，化学性质非常稳定，广泛存在于自然界中。海藻糖无色无嗅，具有很强的热稳定性、酸稳定性和化学稳定性，使其具有保护生物细胞和生物活性物质在高温、脱水、冷冻、干旱、有毒试剂及高渗透压等不良环境条件下活性免遭破坏的功能，因此在作物育种、食品、药品、精细化工及生物制品等领域有着广泛的应用前景。并且大量研究结果表明，海藻糖是蛋白质、生物膜、医药制剂和动植物组织和器官的优质保护剂。20世纪90年代初，海藻糖的制备方法主要是提取法和微生物发酵法，随着一些可生成海藻糖的新型酶制剂的发现，酶催化法成为研究的热点。
海藻糖合酶是一类分子内转糖苷酶，能够把α,α-1,4糖苷键连接的麦芽糖一步转化为α,α-1,1糖苷键连接的海藻糖。海藻糖合酶在麦芽糖和海藻糖之间的转糖苷作用是一个可逆的过程，但大部分都倾向于海藻糖的生成反应。在不同来源的海藻糖合酶中，Thermobifida fuca的海藻糖合酶25℃时转化率约为60％；Picrophius torridus的海藻糖合酶20℃时转化率约为70％；1996年，Nishimoto等人从Thermus aquaticus ATCC 33923中分离到一种海藻糖合酶，以40％的麦芽糖为底物反应72h，转化率约为70％。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种海藻糖合酶生产菌株，所述菌株为假单胞菌Pseudomonas sp.WSH15-02，于2015年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2015227。
所述菌株是从淀粉加工厂附近土壤中经菌株富集、平板菌落特征初筛，采用一级发酵逐一摇瓶培养，经酶活测定，比较海藻糖合酶活性大小而得到。
本发明的第二个目的是提供一种利用所述菌株生产海藻糖的方法，所述方法是以该菌发酵所得海藻糖合酶为催化剂，以麦芽糖为底物，催化生产海藻糖。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：以终浓度为5％～40％(W/V)的麦芽糖为底物，按照10～20U/g麦芽糖的量加入所述菌株发酵得到的海藻糖合酶，在pH 7.0～8.0、30～50℃下反应8～12h。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，海藻糖合酶是本发明菌株经种子培养和液体深层发酵生产得到的海藻糖合酶的粗酶液或浓缩酶液。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，反应是在振荡条件下进行的。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，pH使用氢氧化钠水溶液进行调节。
本发明的第三个目的是提供一种利用所述假单胞菌生产海藻糖合酶的方法，所述方法以Pseudomonas sp.WSH15-02菌株为生产菌株，经种子培养和液体深层发酵得到海藻糖合酶。
所述种子培养，在本发明的一种实施方式中，其种子培养基配方为蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％、pH 7.0，培养条件为：30℃、摇瓶转速200rpm、培养10～14h。
所述液体深层发酵，在本发明的一种实施方式中，是在发酵培养基(麦芽糖2％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.2％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO40.05％，pH 7.0)中，于30℃、200rpm发酵2～3d。
本发明筛选得到了一株表达海藻糖合酶的假单胞菌。用该菌生产的海藻糖合酶催化麦芽糖生产海藻糖，具有不受底物浓度影响、温度范围广、没有副产物葡萄糖的生成、反应方法简便、低能耗、物料成本低、高效(反应8～12h即可)等优点，在较高底物浓度下仍能得到高底物转化率，可达80％，而且在高温50℃条件下仍能正常反应，可以避免糖类物质为底物容易导致的染菌现象，为工业化放大生产奠定基础。
生物材料保藏
一株假单胞菌，分类命名为假单胞菌WSH15-02 Pseudomonas sp.WSH15-02，于2015年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2015227。
具体实施方式
培养基：
(1)肉汤蛋白胨培养基：肉汤0.3％，蛋白胨0.5％，pH7.0；
(2)平板分离培养基：麦芽糖0.5％，糊精2％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.5％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO40.05％，NaCl 5％以上，CaCl20.1％，琼脂2％，pH7.0；
(3)发酵培养基(g/L)：麦芽糖2％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.2％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO40.05％，pH7.0；
(4)种子培养基(g/L)：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，pH 7.0。
实施例1菌株的筛选
从3个淀粉加工厂附近分别采集土样5份，共15份样品。用灭过菌的药匙取1g土样加入100mL肉汤蛋白胨液体培养基中，37℃、200rpm/min摇床培养36h，富集菌株；然后将富集后的菌液依次梯度稀释(10-1、10-2、……10-7，)涂布于含有平板分离培养基的海藻糖合酶筛选平板上，30℃培养箱中培养2d，挑取大小、形状、颜色不一的具有典型特征的单菌落在固体肉汤蛋白胨培养基上划线分离，再挑取单菌落进行分离纯化，反复3次，挑取典型单菌落在试管斜面上划线，30℃培养10～14h后于冰箱中4℃保存。
将筛选到的菌株接种到发酵培养基中进行液体振荡培养，培养温度为30℃，摇床转速为200rpm，培养时间为2～3d。培养液经过12000rpm离心5min收集菌体，将菌体悬浮于pH7.0的20mmol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲液中，超声破碎10min，12000rpm离心10min收集上清进行酶活测定，用HPLC测定生成的海藻糖含量。选取酶活高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定的海藻糖合酶生产菌株。纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，4℃保藏。
最后，得到一株假单胞菌Pseudomonas sp.WSH15-02，将其于2015年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2015227。
实施例2发酵产酶
(1)发酵培养
将实施例1中筛选得到的产海藻糖合酶的菌株接种于种子培养基中，在30℃下培养10～14h后以5％的接种量转接至发酵培养基中，30℃恒温培养2～3d产酶。发酵液6000rpm/min离心15min，收集菌体，用20mmol/L、pH7.0的KH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗涤后离心，收集菌体，配成菌悬液，进行超声处理，超声破功率200W，超声时间2s，间隔3s，总超声时间10min，所得处理液10000rpm/min离心15min，上清液即为粗酶液。
(2)酶活测定
以麦芽糖为底物，用HPLC测定该酶的酶活。酶活测定体系为800μL(含终浓度为10％(W/V)的麦芽糖，20mmol/L的KH2PO4-Na2HPO4缓冲液，pH 7.0)，在35℃下加入400μL适当稀释的酶液反应30min后，沸水浴10min终止酶反应，10000rpm/min离心20min，用HPLC测定生成的海藻糖含量。该条件下每min生成1μmol海藻糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
实施例3粗酶液的浓缩
将实施例2中获得的发酵液6000rpm/min离心15min，收集菌体，用20mmol/L、pH7.0的KH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗涤后离心，收集菌体，加入1/10发酵液体积的缓冲液配成菌悬液，高压匀浆破壁，所得处理液10000rpm/min离心15min，上清液即为浓缩酶液。
实施例4酶法制备海藻糖
酶法生产工艺：
在反应器中投入用20mmol/L、pH 7.0的KH2PO4-Na2HPO4缓冲液配配制的终浓度为30％(W/V)的麦芽糖，加入15U/g麦芽糖实例3中获得的浓缩酶液，用20％的氢氧化钠水溶液将pH调节到7.0，在30℃，150rpm的水浴摇床中反应12小时。
HPLC检测产物：
取样煮沸10min灭酶，取上清液适度稀释后12000rpm离心10min，并进行HPLC分析。色谱条件如下：Hypersil NH2，(4.6×250)mm，填料粒径5μm；示差折光检测器；流动相：V(乙腈)：V(水)＝75:25；柱温40℃；进样量：10μL；流速0.8mL/min。
结果表明，海藻糖对底物麦芽糖的转化率达80.6％，并且无副产物葡萄糖生成。
实施例5酶法制备海藻糖
按以下方法生产海藻糖：
以终浓度为5％(W/V)的麦芽糖为底物，按照10U/g麦芽糖的量加入Pseudomonassp.WSH15-02菌株发酵生产得到的海藻糖合酶，在pH 7.5、40℃下反应8h。结果显示海藻糖对底物麦芽糖的转化率达80.4％，并且无副产物葡萄糖生成。
实施例6酶法制备海藻糖
按以下方法生产海藻糖：
以终浓度为40％(W/V)的麦芽糖为底物，按照20U/g麦芽糖的量加入Pseudomonassp.WSH15-02菌株发酵生产得到的海藻糖合酶，在pH 8.0、50℃下反应10h。结果显示海藻糖对底物麦芽糖的转化率达79.8％，并且无副产物葡萄糖生成。
本发明菌株生产的海藻糖合酶，反应效率高且不受底物浓度影响，8-12h即能达到80％的转化率，而且在高温下也能正常反应，可以避免采用糖类底物导致的容易染菌的问题，适合工业化应用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种海藻糖合酶生产菌株，其特征在于，所述菌株为Pseudomonas sp.WSH15-02，于2015年4月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2015227。
2.权利要求1所述海藻糖合酶生产菌株的应用方法。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法是利用Pseudomonas sp.WSH15-02生产海藻糖；所述方法是以Pseudomonas sp.WSH15-02菌发酵所得海藻糖合酶为催化剂，以麦芽糖为底物，催化生产海藻糖。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法包括：以终浓度为5％～40％(W/V)的麦芽糖为底物，按照10～20U/g麦芽糖的量加入Pseudomonas sp.WSH15-02菌株发酵得到的海藻糖合酶，在pH 7.0～8.0、30～50℃下反应8～12h。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述海藻糖合酶是Pseudomonassp.WSH15-02菌株经种子培养和液体深层发酵生产得到的海藻糖合酶的粗酶液或浓缩酶液。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反应是在振荡条件下进行的。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法是利用Pseudomonas sp.WSH15-02生产海藻糖合酶；所述方法以Pseudomonas sp.WSH15-02菌株为生产菌株，经种子培养和液体深层发酵得到海藻糖合酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子培养的种子培养基配方为蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％、pH 7.0，培养条件为：30℃、摇瓶转速200rpm、培养10～14h；所述液体深层发酵是在配方为：麦芽糖2％、蛋白胨0.5％、牛肉膏0.2％、K2HPO4 0.1％、NaH2PO4 0.1％、MgSO4 0.05％、pH 7.0的发酵培养基中，于30℃、200rpm发酵2～3d。
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