CN103266152A - 一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，包括如下步骤：（1）将产酶菌株接种于发酵培养基中，培养30h～80h，制得发酵液；（2）将发酵液经菌体分离、菌体破壁、酶纯化，制得的海藻糖合成酶液；（3）进行交联包埋反应，制得固定化海藻糖合成酶；（4）将固定化海藻糖合成酶与麦芽糖底物溶液混合，经转化、分离，制得海藻糖。本发明转化率高、反应速度快、作用时间短、酶活稳定性及机械强度高的固定化海藻糖合成酶，从而提高了海藻糖的生产效率，降低了生产成本，缩短了生产周期。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，属于发酵工程及酶工程技术领域。
背景技术
海藻糖是由两个吡喃环葡萄糖分子以α,α-1,1键连接而成的非还原性双糖，海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下能稳定细胞膜和蛋白质的结构，有效地保护细胞膜和蛋白质分子不变性失活，从而维持生物体的生命过程和生物特征，因此海藻糖对生物体具有神奇的保护作用。因为海藻糖具有此独特功能，使其可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料，大大拓展了海藻糖作为天然食用甜味糖的功能。目前海藻糖广泛应用于食品、农业、医药等领域。
近年来，随着酶法制取海藻糖技术的兴起，寻求低成本、高产率的海藻糖制备工艺已成为国内外的研究热点。但目前海藻糖工业化生产过程中所用的酶多为游离酶，此酶具有不能回收、利用率低、难于分离纯化、使用成本高等缺点。
中国科技文献《海藻糖合成酶活性受固定化处理过程影响的研究》（冯金虎等发表于《微生物学通报》2003年06期）公开了采用多种固定化载体进行酶固定化研究，发现通过经戊二醛与壳聚糖交联后的载体与酶液作用，可吸附与海藻糖合成无关的杂酶和杂质，从而提高海藻糖合成酶的活性。通过比较固定化过程中与反应条件中多个因素的影响，得到了如下最佳作用条件：将酶液与经3%戊二醛交联18h后的滤纸作用18h，再与10%的淀粉溶液反应9h，与未经固定化作用比较，海藻糖的产率提高10倍，达到27.22g/L，转化率从5.33％提升到54.43%。
该文献对固化处理工艺进行了深入研究，提出了采用戊二醛与壳聚糖交联后再进行固定化载体进行酶固定化的方法，可以大幅提高海藻糖的产率和转化率，通过以淀粉为底物的转化后，转化率可达到54.43%，但仍然有大量原料未被利用。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法。
术语说明
U/g湿菌体：每克湿菌体经过破碎后得到的酶活单位。
一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，包括如下步骤：
（1）将产酶菌株接种于发酵培养基中，在温度28℃～33℃的条件下，培养30h～80h，制得发酵液；
上述发酵培养基组分如下，均为质量百分比：
麦芽糖1%～10%，蛋白胨0.4%～2%，牛肉膏0.2%～1%，KH2PO40.1%～1%，MgSO4·7H2O0.01%～0.12%，余量水，pH6.0～8.0；
上述产酶菌株选自热带假丝酵母（Candida tropicalis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、玫瑰微球菌（Kocuria roseus）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、灰色链霉菌（Streptomvces avermitilis）、玫瑰链霉菌（Streptomyces roseoflavus）、金黄色节杆菌（Arthrobacter aurescens）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）或腾冲嗜热杆菌（Thermoanaerobacter tengcongensis）；
（2）将步骤（1）制得的发酵液经菌体分离、菌体破壁、酶纯化，制得的海藻糖合成酶液的酶活为35U/g湿菌体～60U/g湿菌体；
（3）在戊二醛质量浓度为0.3%～1%，海藻糖合成酶液与壳聚糖凝胶的体积质量比为1:1～6:1、pH7.0～8.5、温度12℃～25℃的条件下，体积质量比单位为ml/g，进行交联包埋反应9h～20h，制得固定化海藻糖合成酶；
（4）将步骤（3）制得的固定化海藻糖合成酶与麦芽糖底物溶液混合，经转化、分离，制得海藻糖。
根据本发明优选的，所述步骤（1）中的产酶菌株选自恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）或大肠杆菌（Escherichia coli）。根据本发明最优选的，所述步骤（1）中的产酶菌株选自恶臭假单胞菌。
上述热带假丝酵母（Candida tropicalis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、玫瑰微球菌（Kocuria roseus）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、灰色链霉菌（Streptomvces avermitilis）、玫瑰链霉菌（Streptomyces roseoflavus）、金黄色节杆菌（Arthrobacter aurescens）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）或腾冲嗜热杆菌（Thermoanaerobacter tengcongensis）均可采用本领域已知的产海藻糖合成酶的菌株。如：玫瑰微球菌（Kocuria roseus）可采用《北京化工大学学报：自然科学版》2007年第1期中，名称为《固定化玫瑰微球菌发酵产海藻糖合成酶系》中公开的玫瑰微球菌；大肠杆菌（Escherichia coli）可采用公开号为CN102533801A（申请号201210008691.0），名称为《一种灰色链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用》的大肠杆菌，或者，采用公开号为CN102154327A（申请号201010614832.4），名称为《一种弯曲单孢菌海藻糖合成酶基因及其应用》的大肠杆菌。
根据本发明优选的，所述步骤（2）的具体步骤如下：
将发酵液在4℃条件下进行6000r/min冷冻离心10min～20min，收集湿菌体，用浓度1mol/L的磷酸钠缓冲液悬浮菌体，制成菌悬液，再采用高压均质机，在温度为4℃，破碎压强为140Mpa的条件下，进行菌体的破碎，4℃条件下6000r/min冷冻离心10min～20min后，收集所得的上清液即为粗酶液；
在搅拌状态下，将固体硫酸铵粉末加入粗酶液中至浓度达到25℃条件下硫酸铵饱和度的30%～50%，离心后取上清液，制得海藻糖合成酶液。该步骤可以除去大量杂蛋白质。
上述步骤（2）的菌体分离、菌体破壁、酶纯化也可采用本领域常用技术。
根据本发明优选的，所述步骤（3）中，条件如下：
在戊二醛质量浓度为0.5%～0.8%，海藻糖合成酶液与壳聚糖凝胶的体积质量比为1:1～6:1、pH7.8～8.2、温度14℃～25℃的条件下，体积质量比单位为ml/g，进行交联包埋反应13h～20h，制得固定化海藻糖合成酶；
根据本发明优选的，所述步骤（4）中的麦芽糖底物溶液为质量浓度10%～30%的麦芽糖溶液，溶液pH7.0～8.0。
根据本发明优选的，所述步骤（4）中固定化海藻糖合成酶与麦芽糖底物溶液混合的体积比为（4～8）：1。
根据本发明优选的，所述步骤（4）中的转化温度为38℃～45℃，转化时间20h～30h，转化过程中的搅拌速度为120r/min～200r/min。
根据本发明优选的，所述步骤（4）中的分离为用14目的滤网过滤分离。滤液即为海藻糖。
根据本发明优选的，所述步骤（4）还包括将分离后获得的固定化海藻糖合成酶经水浸泡清洗后，重复利用的步骤。
有益效果
1、本发明通过对菌种、发酵培养条件、培养基及酶固定化的条件进行筛选优化，获得了转化率高、反应速度快、作用时间短、酶活稳定性及机械强度高的固定化海藻糖合成酶，从而提高了海藻糖的生产效率，降低了生产成本，缩短了生产周期。
2、本发明通过采用麦芽糖作为生产海藻糖的底物，并进一步优化生产工艺中的条件，从而进一步提高了转化率，使转化率可达到70%以上。
3、由于本发明制得的固定化酶机械强度高，因此可以直接采用过滤法分离海藻糖，方法简单、大大降低了分离成本，并且固定化酶可以重复使用10～20，具有显著的经济效益和广阔的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
实施例1中的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）购自中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为AS1.01003。
实施例2中的热带假丝酵母（Candida tropicalis），购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为32594。
实施例3中的玫瑰微球菌（Kocuria roseus），来源于北京化工大学。该菌株记载于《固定化玫瑰微球菌发酵产海藻糖合成酶系》一文中，该论文发表于《北京化工大学学报：自然科学版》2007年第1期。
实施例4中的大肠杆菌（Escherichia coli）来源于广西大学，该菌株记载于专利文献《一种灰色链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用》中，公开号为CN102533801A（申请号201210008691.0）。
实施例5和实施例6中的大肠杆菌（Escherichia coli）来源于广西大学，该菌株记载于专利文献《一种弯曲单孢菌海藻糖合成酶基因及其应用》中，公开号为CN102154327A（申请号201010614832.4）。
检测方法：
海藻糖含量检测方法按GB/T23529-2009，海藻糖国标中的高效液相色谱法检测。
转化率为海藻糖终产量与起始麦芽糖底物含量的比值，转化率的高低可以直接反应该海藻糖合成酶的应用效果的好坏。
实施例1
一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，包括如下步骤：
（1）将恶臭假单胞菌接种于发酵培养基中，在温度30℃的条件下，培养72h，制得发酵液；
上述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
麦芽糖2%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.3%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.05%，余量水，pH7.2；
（2）将步骤（1）制得的发酵液在4℃条件下进行6000r/min冷冻离心10min，收集湿菌体，用浓度1mol/L的磷酸钠缓冲液悬浮菌体，制成菌悬液，再采用高压均质机，在温度为4℃，破碎压强为140Mpa的条件下，进行菌体的破碎，4℃条件下6000r/min冷冻离心20min后，收集所得的上清液即为粗酶液；
在搅拌状态下，将固体硫酸铵粉末加入粗酶液中至浓度达到25℃条件下硫酸铵饱和度的40%，离心后取上清液，制得的海藻糖合成酶液的酶活为51.55U/g湿菌体；
（3）在戊二醛质量浓度为0.6%，海藻糖合成酶液与壳聚糖凝胶的体积质量比为1:1、pH8.0、温度14℃的条件下，体积质量比单位为ml/g，进行交联包埋反应15h，制得固定化海藻糖合成酶；
（4）配制质量浓度20%的麦芽糖溶液，调节pH7.8，制得麦芽糖底物溶液；
将步骤（3）制得的固定化海藻糖合成酶与麦芽糖底物溶液按6:1的体积比混合，经43℃、搅拌速度为140r/min的条件下转化22h、用14目的滤网过滤分离，滤液即为海藻糖，滤渣为固定化海藻糖合成酶，经清水浸泡4h后，重复利用。经检测，初次转化率为74%，固定化海藻糖合成酶重复利用10次后转化率为69%，固定化海藻糖合成酶重复利用20次后转化率为65%，平均每次生产时间为22小时，且重复生产20次的过程中，未染杂菌。
实施例2
一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，包括如下步骤：
（1）将热带假丝酵母接种于发酵培养基中，在温度28℃的条件下，培养70h，制得发酵液；
上述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
麦芽糖3%，蛋白胨0.6%，牛肉膏0.4%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.06%；余量水，pH6.0；
（2）将步骤（1）制得的发酵液在4℃条件下进行6000r/min冷冻离心20min，收集湿菌体，用浓度1mol/L的磷酸钠缓冲液悬浮菌体，制成菌悬液，再采用高压均质机，在温度为4℃，破碎压强为140Mpa的条件下，进行菌体的破碎，4℃条件下6000r/min冷冻离心10min后，收集所得的上清液即为粗酶液；
在搅拌状态下，将固体硫酸铵粉末加入粗酶液中至浓度达到25℃条件下硫酸铵饱和度的30%，离心后取上清液，制得的海藻糖合成酶液的酶活为54U/g湿菌体；
（3）在戊二醛质量浓度为0.5%，海藻糖合成酶液与壳聚糖凝胶的体积质量比为6:1、pH8.0、温度15℃的条件下，体积质量比单位为ml/g，进行交联包埋反应13h，制得固定化海藻糖合成酶；
（4）配制质量浓度10%的麦芽糖溶液，调节pH7.8，制得麦芽糖底物溶液；
将步骤（3）制得的固定化海藻糖合成酶与麦芽糖底物溶液按4:1的体积比混合，经43℃、搅拌速度为150r/min的条件下转化24h、用14目的滤网过滤分离，滤液即为海藻糖，滤渣为固定化海藻糖合成酶，经清水浸泡4h后，重复利用。
经检测，初次转化率为70%，固定化海藻糖合成酶重复利用10次后转化率为68%，固定化海藻糖合成酶重复利用20次后转化率为65%，平均每次生产时间为22小时，且重复生产20次的过程中，未染杂菌。
实施例3
一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，包括如下步骤：
（1）将玫瑰微球菌接种于发酵培养基中，在温度30℃的条件下，培养65h，制得发酵液；
上述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
麦芽糖2%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.06%，余量水，pH8.0；
（2）将步骤（1）制得的发酵液在4℃条件下进行6000r/min冷冻离心15min，收集湿菌体，用浓度1mol/L的磷酸钠缓冲液悬浮菌体，制成菌悬液，再采用高压均质机，在温度为4℃，破碎压强为140Mpa的条件下，进行菌体的破碎，4℃条件下6000r/min冷冻离心15min后，收集所得的上清液即为粗酶液；
在搅拌状态下，将固体硫酸铵粉末加入粗酶液中至浓度达到25℃条件下硫酸铵饱和度的50%，离心后取上清液，制得的海藻糖合成酶液的酶活为45U/g湿菌体；
（3）在戊二醛质量浓度为0.5%，海藻糖合成酶液与壳聚糖凝胶的体积质量比为6:1、pH8.0、温度25℃的条件下，体积质量比单位为ml/g，进行交联包埋反应20h，制得固定化海藻糖合成酶；
（4）配制质量浓度25%的麦芽糖溶液，调节pH7.8，制得麦芽糖底物溶液；
将步骤（3）制得的固定化海藻糖合成酶与麦芽糖底物溶液按5:1的体积比混合，经48℃、搅拌速度为130r/min的条件下转化60h、用14目的滤网过滤分离，滤液即为海藻糖，滤渣为固定化海藻糖合成酶，经清水浸泡6h后，重复利用。
经检测，初次转化率为66%，固定化海藻糖合成酶重复利用10次后转化率为60%，固定化海藻糖合成酶重复利用20次后转化率为57%，平均每次生产时间为30小时，且重复生产20次的过程中，未染杂菌。
实施例4
如实施例3所述的利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，不同之处在于：
步骤（1）中的产酶菌株为大肠杆菌；
经检测，初次转化率为64%，固定化海藻糖合成酶重复利用10次后转化率为62%，固定化海藻糖合成酶重复利用20次后转化率为60%，平均每次生产时间为26小时，且重复生产20次的过程中，未染杂菌。
实施例5
如实施例3所述的利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，不同之处在于：
步骤（1）中的产酶菌株为大肠杆菌；
步骤（3）中，在戊二醛质量浓度为1%，海藻糖合成酶液与壳聚糖凝胶的体积质量比为1:1、pH8.0、温度12℃的条件下，体积质量比单位为ml/g，进行交联包埋反应9h，制得固定化海藻糖合成酶；
经检测，初次转化率为59%，固定化海藻糖合成酶重复利用10次后转化率为56%，固定化海藻糖合成酶重复利用20次后转化率为50%，平均每次生产时间为26小时，且重复生产20次的过程中，未染杂菌。
实施例6
如实施例5所述的利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，不同之处在于：
步骤（3）中，在戊二醛质量浓度为0.8%，海藻糖合成酶液与壳聚糖凝胶的体积质量比为2:1、pH8.0、温度25℃的条件下，体积质量比单位为ml/g，进行交联包埋反应15h，制得固定化海藻糖合成酶；
经检测，初次转化率为62%，固定化海藻糖合成酶重复利用10次后转化率为62%，固定化海藻糖合成酶重复利用20次后转化率为60%，平均每次生产时间为26小时，且重复生产20次的过程中，未染杂菌。
对比例1
如实施例1所述的利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，不同之处在于：
步骤（1）中的产酶菌株为海洋假单胞菌菌株P8005；
经检测，初次转化率为59%，固定化海藻糖合成酶重复利用10次后转化率为51%，固定化海藻糖合成酶重复利用20次后转化率为42%。
对比例2
如实施例1所述的利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，不同之处在于：
步骤（3）海藻糖合成酶的固定步骤采用《海藻糖合成酶活性受固定化处理过程影响的研究》（冯金虎等发表于《微生物学通报》2003年06期）中记载的方法，具体步骤如下：产酶菌种为微球菌，将酶液与3%戊二醛交联18h的载体反应18h，再与10%的淀粉溶液反应9h。
经检测，初次转化率为54%，固定化海藻糖合成酶重复利用10次后转化率为48%，固定化海藻糖合成酶重复利用20次后转化率为37%。
对比例3
如实施例5所述的利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，不同之处在于：
步骤（3）中，在戊二醛质量浓度为0.2%，海藻糖合成酶液与壳聚糖凝胶的体积质量比为7:1、pH6.5、温度10℃的条件下，体积质量比单位为ml/g，进行交联包埋反应8h，制得固定化海藻糖合成酶；
经检测，初次转化率为53%，固定化海藻糖合成酶重复利用10次后转化率为48%，固定化海藻糖合成酶重复利用20次后转化率为42%，平均每次生产时间为26小时，且重复生产20次的过程中，未染杂菌。
结果分析：
与对比例相比，利用本技术生产的固定化海藻糖合成酶，特别是在本发明所述的几类菌株作为产酶菌的条件下，转化率都在60%-70%范围内，因此转化率相对较高；酶活稳定性高、失活率低，重复利用20次之后，转化率依然达到60%左右，生产过程中也不会出现染杂菌的情况。在利用其他产酶菌在相同条件下进行生产海藻糖，重复利用的转化率有显著下降。因此，利用本技术生产的海藻糖合成酶具有较为明显的优点。
通过实施例5和实施例6和对比例3的结果可以发现，步骤（3）的工艺条件对固定化海藻糖合成酶的初次转化率及重复利用后的转化率也有较大影响。
Claims (10)
1.一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将产酶菌株接种于发酵培养基中，在温度28℃～33℃的条件下，培养30h～80h，制得发酵液；
上述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
麦芽糖1%～10%，蛋白胨0.4%～2%，牛肉膏0.2%～1%，KH2PO40.1%～1%，MgSO4·7H2O0.01%～0.12%，余量水，pH6.0～8.0；
上述产酶菌株选自热带假丝酵母（Candida tropicalis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、玫瑰微球菌（Kocuria roseus）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、灰色链霉菌（Streptomvces avermitilis）、玫瑰链霉菌（Streptomyces roseoflavus）、金黄色节杆菌（Arthrobacter aurescens）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）或腾冲嗜热杆菌（Thermoanaerobacter tengcongensis）之一；
（2）将步骤（1）制得的发酵液经菌体分离、菌体破壁、酶纯化，制得的海藻糖合成酶液的酶活为35U/g湿菌体～60U/g湿菌体；
（3）在戊二醛质量浓度为0.3%～1%，海藻糖合成酶液与壳聚糖凝胶的体积质量比为1:1～6:1、pH7.0～8.5、温度12℃～25℃的条件下，体积质量比单位为ml/g，进行交联包埋反应9h～20h，制得固定化海藻糖合成酶；
（4）将步骤（3）制得的固定化海藻糖合成酶与麦芽糖底物溶液混合，经转化、分离，制得海藻糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的产酶菌株选自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）或大肠杆菌（Escherichia coli）。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的产酶菌株选自恶臭假单胞菌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体步骤如下：
将发酵液在4℃条件下进行6000r/min冷冻离心10min～20min，收集湿菌体，用浓度1mol/L的磷酸钠缓冲液悬浮菌体，制成菌悬液，再采用高压均质机，在温度为4℃，破碎压强为140Mpa的条件下，进行菌体的破碎，4℃条件下6000r/min冷冻离心10min～20min后，收集所得的上清液即为粗酶液；
在搅拌状态下，将固体硫酸铵粉末加入粗酶液中至浓度达到25℃条件下硫酸铵饱和度的30%～50%，离心后取上清液，制得海藻糖合成酶液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，条件如下：
在戊二醛质量浓度为0.5%～0.8%，海藻糖合成酶液与壳聚糖凝胶的体积质量比为1:1～6:1、pH7.8～8.2、温度14℃～25℃的条件下，体积质量比单位为ml/g，进行交联包埋反应13h～20h，制得固定化海藻糖合成酶。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中的麦芽糖底物溶液为质量浓度10%～30%的麦芽糖溶液，溶液pH7.0～8.0。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中固定化海藻糖合成酶与麦芽糖底物溶液混合的体积比为（4～8）:1。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中的转化温度为38℃～45℃，转化时间20h～30h，转化过程中的搅拌速度为120r/min～200r/min。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中的分离为用14目的滤网过滤分离。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）还包括将分离后获得的固定化海藻糖合成酶经水浸泡清洗后，重复利用的步骤。
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